本發(fā)明涉及一種TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體，及其構(gòu)建方法，以及其在作為抗腫瘤藥物的靶向載體中的應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：目前對晚期腫瘤患者的治療以化療為主，但藥物的毒副作用限制了療效的進一步提高。新技術(shù)支持下的分子靶向治療是未來腫瘤藥物治療的發(fā)展趨勢。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體，及其構(gòu)建方法，以及其在作為抗腫瘤藥物的靶向載體中的應(yīng)用。本發(fā)明是在前期研究的基礎(chǔ)上，將具有促進核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的TAT肽序列和具有腫瘤靶向識別特性的RGD序列與前期研究證實能有效沉默KDR基因表達的siRNA序列（該siRNA序列如SEQIDNO.1所示；該前期研究成果的論文發(fā)表在微生物學(xué)雜志，2013，33（6）：37-42；2014InternationalWorkshoponBiology,ChemistryandMedicalEngineering,WuHan,China（EI、ISTP收錄）；臨床醫(yī)學(xué)工程，2012，19（10）：1664-1666；中國廠礦醫(yī)學(xué)，2009，6：644-646；中國組織工程與臨床康復(fù)雜志，2007，11（27）：5303-5306）結(jié)合，構(gòu)建更具有體內(nèi)生物利用度和腫瘤靶向性的siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺，可以有效地解決siRNA在體內(nèi)的非特異性分布、腫瘤靶向性較差的問題，具有更為顯著的腫瘤靶向性和抗腫瘤活性，為以KDRsiRNA為核心的生物治療藥物進一步應(yīng)用于腫瘤治療的探索提供堅實的實驗基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體，是在PGCL-TAT-KDRsiRNAGFP載體（PGCL-TAT-KDRsiRNAGFP載體的結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方法，公開在文獻“微生物學(xué)雜志，2013，33（6）：37-42；2014InternationalWorkshoponBiology,ChemistryandMedicalEngineering,WuHan,China（EI、ISTP收錄”中）上插入編碼3個串聯(lián)RGD-4C的2條寡核苷酸鏈而成的，所述編碼3個串聯(lián)RGD-4C的2條寡核苷酸鏈的核苷酸序列為：正義鏈序列（5'-3'）：CATGGTACCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCGGTGGAGGCGGGTCTTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCGGTGGAGGCGGGTCTTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCGGTGGAGGCGGGTCTAAGCTTCG；如SEQIDNO.2所示；其中，“GGTACC”為KpnⅠ的酶切位點，“AAGCTT”為HindⅢ的酶切位點；反義鏈序列（5'-3'）：GTAAAGCTTACGCTAACAGCGCCTCTAACGAAGACGCCACCTCCGCCCGAACGCTAACAGCGCCTCTAACGAAGACGCCACCTCCGCCCGAACGCTAACAGCGCCTCTAACGAAGACGCCACCTCCGCCCGAGGTACCGC；如SEQIDNO.3所示；其中，“AAGCTT”為HindⅢ的酶切位點，““GGTACC”為KpnⅠ的酶切位點。所述TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體的構(gòu)建方法，如下：（1）RGD-4C序列合成：將等摩爾的兩條寡核苷酸鏈（其上引入內(nèi)切酶位點KpnⅠ和HindⅢ）混合，95℃變性10min后置72℃退火過夜，獲得編碼3個串聯(lián)RGD-4C的雙鏈DNA；（2）pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA載體構(gòu)建：用KpnⅠ和HindⅢ分別對pGC/TATKDRsiRNA質(zhì)粒DNA和編碼3個串聯(lián)RGD-4C的雙鏈DNA進行雙酶切反應(yīng)，純化酶切產(chǎn)物；在T4連接酶作用下16℃連接過夜（10～14小時）；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，常規(guī)進行抗生素篩選；篩選陽性菌落，克隆PCR，即得。本發(fā)明的TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體，經(jīng)實驗證明，其具有更為顯著的腫瘤靶向性和抗腫瘤活性，將其作為抗腫瘤藥物的靶向載體，可以有效地解決siRNA在體內(nèi)的非特異性分布、腫瘤靶向性較差的問題。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：（1）在國內(nèi)率先將KDR基因的RNA干擾序列以TAT和RGD的復(fù)合體形式建立RNA干擾的技術(shù)平臺，填補國內(nèi)空白；TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體能更有效地抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤組織生長，且無毒副作用。（2）該技術(shù)平臺用于腫瘤細胞及其裸鼠模型的靶治療研究，能有效地抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤組織生長，具有siRNA在體內(nèi)的特異性分布、腫瘤靶向性的特點，且無毒副作用。附圖說明圖1：TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體構(gòu)建示意圖。圖2：A549細胞KDRmRNA表達水平。圖3：A549細胞KDR蛋白表達水平。圖4：TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體抑制A549細胞增殖。圖5：TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體誘導(dǎo)A549細胞凋亡，其中，圖5A：雙色法流式細胞儀檢測結(jié)果；圖5B：雙色法流式細胞儀檢測的統(tǒng)計結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。實施例1TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體的構(gòu)建（1）RGD-4C序列設(shè)計和合成：設(shè)計和合成編碼3個串聯(lián)RGD-4C（CDCRGDCFCGGGGS）的兩條寡核苷酸鏈。在正義鏈和反義鏈的兩端分別引入內(nèi)切酶位點KpnⅠ和HindⅢ，如下：正義鏈序列（5'-3'）：CATGGTACCTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCGGTGGAGGCGGGTCTTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCGGTGGAGGCGGGTCTTGCGATTGTCGCGGAGATTGCTTCTGCGGTGGAGGCGGGTCTAAGCTTCG；反義鏈序列（5'-3'）：GTAAAGCTTACGCTAACAGCGCCTCTAACGAAGACGCCACCTCCGCCCGAACGCTAACAGCGCCTCTAACGAAGACGCCACCTCCGCCCGAACGCTAACAGCGCCTCTAACGAAGACGCCACCTCCGCCCGAGGTACCGC。將等摩爾兩條寡核苷酸鏈混合，95℃變性10min后置72℃退火過夜，獲得編碼3個串聯(lián)RGD-4C的雙鏈DNA。（2）pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA載體構(gòu)建用KpnⅠ和HindⅢ分別對pGC/TATKDRsiRNA質(zhì)粒DNA和編碼3個串聯(lián)RGD-4C的雙鏈DNA進行雙酶切反應(yīng)，純化酶切產(chǎn)物。在T4連接酶作用下16℃連接過夜（12小時）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，常規(guī)進行抗生素篩選。陽性菌落經(jīng)克隆PCR鑒定后送檢測序。測序結(jié)果經(jīng)Blast比對，重組載體中的RGD序列與設(shè)計一致，證明pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA重組載體構(gòu)建成功，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。實施例2TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對A549細胞KDR基因表達的影響將pGC/TAT-KDRsiRNA重組病毒、pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA重組病毒，以及等量PBS感染后的三組A549細胞培養(yǎng)至貼壁率達到80%后，分別提取細胞總RNA和總蛋白，應(yīng)用Real-timePCR和Westernblot檢測A549細胞中KDR的表達水平。Real-timePCR結(jié)果顯示，pGC/TAT-KDRsiRNA感染組和pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA感染組的KDRmRNA表達水平與對照組相比均顯著下降，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。且pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA感染組與pGC/TAT-KDRsiRNA感染組相比，也有顯著性差異（p<0.01），見圖2。Westernblot結(jié)果顯示，與未感染組相比，pGC/TAT-KDRsiRNA組和pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA組KDR蛋白表達水平也顯著下降。且后者下降更為顯著，與前者相比也有顯著性差異（p<0.01），見圖3。提示pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA組與pGC/TAT-KDRsiRNA組相比有更強的抑制A549細胞KDR基因表達的作用。實施例3TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對A549細胞增殖的影響MTT比色法檢測pGC/TAT-RGDKDRsiRNA慢病毒載體在抑制A549細胞生長中的作用。圖4可見，pGC/TAT-KDRsiRNA組和pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組對A549細胞增殖具有抑制作用，隨著培養(yǎng)時間越長，抑制作用越明顯，具有對時間的依賴性。此外，pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組在培養(yǎng)3天后的抑制作用較pGC/TAT-KDRsiRNA組更為顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。提示TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體具有較強的抑制A549細胞增殖的抑制作用。實施例4TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對A549細胞凋亡的影響雙色法流式細胞儀檢測TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體是否具有誘導(dǎo)A549細胞凋亡的作用。圖5可見，pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組細胞凋亡率為（52.79±4.39）%，而pGC/TAT-KDRsiRNA組的細胞凋亡率僅為（24.36±1.37）%，兩者有顯著性差異（p<0.01）。提示TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體具有較強的誘導(dǎo)A549細胞凋亡的作用。實施例5TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對A549細胞侵襲力的影響在Transwel上室中加入50μL的1:30Matrigel，然后每孔加入無菌水200μL，在無菌工作臺里面放置2d，直到Transwell內(nèi)的水干掉。在24孔板中預(yù)熱Transwell至37℃，每個Transwell加入200μLinvasionbuffer，37℃培養(yǎng)1h。培養(yǎng)細胞80%融合，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，trypsin-EDTA消化細胞，離心后收集細胞。移棄Transwell上腔的invasionbuffer，通過間隙加入800μLfibronectinsolution到下腔。在上腔內(nèi)加入200μL的細胞懸液，避免產(chǎn)生氣泡，使細胞均勻地布滿在filter上，37℃培養(yǎng)箱中放置36~48h。甲醛固定蘇木素、伊紅對比染色。顯微鏡下計數(shù)細胞，計數(shù)8個高倍視野（×200）下穿過濾膜的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。結(jié)果顯示（表1），與對照組相比，pGC/TAT-KDRsiRNA組和pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組通過基質(zhì)膠到達濾膜底層的A549細胞數(shù)目明顯減少，細胞的侵襲率顯著下降，分別是42.23%和17.76%。特別是pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組的侵襲率下降更顯著，與pGC/TAT-KDRsiRNA組有顯著差異（p<0.01）。提示pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組具有更強的抑制A549細胞體外侵襲的能力。表1各組細胞的侵襲率對照組pGC/TAT-KDRsiRNA組pGC/TAT-RGD-KDRsiRNA組細胞數(shù)（202.67±8.50）（85.59±6.03）（36.0±5.29）細胞的侵襲率（%）100%42.23%*17.76%*/**注：*pGC/TAT-KDRsiRNA組、pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組與對照組相比，p<0.01；**pGC/TAT-RGDKDRsiRNA組與pGC/TAT-KDRsiRNA組相比，p<0.01。實施例6TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤組織生長實驗和毒副作用研究1．裸鼠移植瘤模型制備人肺癌A549細胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的高糖RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，取對數(shù)增長期細胞，制成單細胞懸液。調(diào)整瘤細胞濃度為2×106/ml，80只小鼠每只背側(cè)腰肋部皮下注射瘤細胞0.1ml。游標卡尺測量腫瘤最大的長徑和垂直的短徑（mm），分別用a和b表示，按公式V（mm3）=（π/6）×a×b2計算腫瘤體積，以瘤體積達到50～70mm為成瘤標準。2．實驗分組、治療和血、尿生化分析隨機抽取30只荷瘤鼠用于本實驗。將30只荷瘤鼠隨機分為3組，每組10只：①TAT-RGD-KDRsiRNA實驗組；②RGD-KDRsiRNA組；③對照組。各組小鼠每次注射50μg，隔日1次，共7次。3．對移植性腫瘤抑制作用的研究14天后稱重并處死動物，稱體重。解剖剝離瘤塊，稱瘤重，按平均瘤重計算抑瘤率。抑瘤率（%）=[（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重]×100%。結(jié)果：1．TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對裸鼠移植瘤模型體重的影響對照組荷瘤鼠生長狀態(tài)良好，體重增長正常，而TAT-RGD-KDRsiRNA組和RGD-KDRsiRNA組體重增高不如對照組明顯，且TAT-RGD-KDRsiRNA組與RGD-KDRsiRNA組相比，體重增高更不明顯，提示本研究構(gòu)建的TAT-RGD-KDRsiRNA載體能夠更有效地抑制荷瘤鼠的生長（見表2）。表2TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對裸鼠移植瘤模型體重的影響組別樣本數(shù)給藥前小鼠體重（g）給藥后小鼠體重（g）TAT-RGD-KDRsiRNA組10/1018.7±0.1723.1±5.4*.**RGD-KDRsiRNA組10/918.7±0.3025.4±2.1*正常對照組10/1018.9±0.2029.3±2.7注:*與正常對照組相比,P<0.01；**與RGD-KDRsiRNA組相比,P<0.052．TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對皮下移植瘤生長的影響TAT-RGD-KDRsiRNA組和RGD-KDRsiRNA組瘤體增長緩慢，腫瘤重量明顯小于對照組，且TAT-RGD-KDRsiRNA組的瘤體增長速度明顯低于RGD-KDRsiRNA組緩慢（見表3），提示TAT-RGD-KDRsiRNA組具有更為明顯的抗腫瘤作用。表3TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對皮下移植瘤生長的影響組別樣本數(shù)瘤重（g）抑制率（%）TAT-RGD-KDRsiRNA組10/100.56±0.3158.5%*.**RGD-KDRsiRNA組10/100.93±0.2933.1%*正常對照組10/101.35±0.27注:*與正常對照組相比,P<0.01；**與RGD-KDRsiRNA組相比,P<0.01實施例7TAT-RGD-KDRsiRNA慢病毒載體對裸鼠移植瘤模型的毒副作用實驗隨機抽取30只荷瘤鼠用于本實驗。將30只荷瘤鼠隨機分為3組，每組10只：①TAT-RGD-KDRsiRNA實驗組；②RGD-KDRsiRNA組；③對照組。各組小鼠每次注射50μg，隔日1次，共7次。定期留取尿液和血樣，進行生化學(xué)分析，觀察對臟器的毒副作用。TAT-RGD-KDRsiRNA組處理的裸鼠移植瘤模型與正常對照組相比尿肌酐、尿素、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶差異無統(tǒng)計學(xué)意義；肝腎功能差異無統(tǒng)計學(xué)意義；血紅細胞、白細胞、血紅蛋白、血小板差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示TAT-RGD-KDRsiRNA對裸鼠移植瘤模型重要臟器無明顯影響。SEQUENCELISTING<110>沈陽醫(yī)學(xué)院<120>一種TAT-RGD-KDRsiRNA融合基因載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用<130><160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>55<212>DNA<213>人工序列<400>1tcctggagaatcagacgacatcaagagtgtcgtctgattctccaggttttttttc55<210>2<211>143<212>DNA<213>人工序列<400>2catggtacctgcgattgtcgcggagattgcttctgcggtggaggcgggtcttgcgattgt60cgcggagattgcttctgcggtggaggcgggtcttgcgattgtcgcggagattgcttctgc120ggtggaggcgggtctaagcttcg143<210>3<211>140<212>DNA<213>人工序列<400>3gtaaagcttacgctaacagcgcctctaacgaagacgccacctccgcccgaacgctaacag60cgcctctaacgaagacgccacctccgcccgaacgctaacagcgcctctaacgaagacgcc120acctccgcccgaggtaccgc140當前第1頁1 2 3