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一種產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):11808675閱讀:來源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于,以pP43NMK為表達(dá)載體,在枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因,組成型表達(dá)硫酸軟骨素裂解酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于,所述編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因?yàn)閏slABC,其序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于,引入信號(hào)肽amyX。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于,在信號(hào)肽amyX的C端與基因cslABC起始密碼子之間加入6×His-tag標(biāo)簽,利用pP43NMK質(zhì)粒本身的RBS,將強(qiáng)組成型啟動(dòng)子與信號(hào)肽融合,構(gòu)建重組質(zhì)粒,在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組枯草芽孢桿菌,所述強(qiáng)組成型啟動(dòng)子為P43,或Pppnk,或PcsfB。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于,所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis WB600。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組枯草芽孢桿菌,其特征在于,以pP43NMK骨架為表達(dá)載體,在信號(hào)肽amyX的C端與基因起始密碼子間加入6×His-tag標(biāo)簽,以P43啟動(dòng)子組成型表達(dá)硫酸軟骨素裂解酶。

8.一種構(gòu)建權(quán)利要求7所述的重組枯草芽孢桿菌的方法,其特征在于,步驟如下:(1)構(gòu)建具有信號(hào)肽amyX的pP43NMK,(2)將編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因cslABC插入所述質(zhì)粒,(3)在信號(hào)肽amyX的C端與基因起始密碼子間引入6×His-tag標(biāo)簽,(4)將P43啟動(dòng)子與信號(hào)肽amyX融合,(5)將所得重組質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。

9.一種應(yīng)用權(quán)利要求1-7任一所述重組芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的方法,其特征在于,將重組芽孢桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,在37℃發(fā)酵48h。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:20g/L酵母粉,50g/L蔗糖,3.9g/L硫酸鉀,1.5g/L硫酸鎂,50mM磷酸鹽緩沖液,pH7.0。

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