本發(fā)明涉及一種產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate，CS)，是一類(lèi)D-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2-脫氧硫酸-D-半乳糖通過(guò)β-1,3糖苷鍵相結(jié)合的雙糖為基本單位，聚合而成的一類(lèi)大分子多糖，分子量在5-50kDa之間。根據(jù)CS的結(jié)構(gòu)、分子量的不同，可將CS劃分為A、B、C、D、E、F、H、K、L和M等類(lèi)別。常見(jiàn)的為CS A、B和C，CS A又稱(chēng)為4-硫酸軟骨素，硫酸基在氨基半乳糖的第4位碳上，CS C又稱(chēng)為6-硫酸軟骨素，硫酸基在氨基半乳糖的第6位碳上。CS B又稱(chēng)為硫酸皮膚素，與CS A互為異構(gòu)體。目前，小分子量CS在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要作用，因此制備低分子CS具有重要意義。

硫酸軟骨素裂解酶(Chondroitinase，ChSase)是一類(lèi)能將硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖及寡糖的裂解酶。ChSase根據(jù)其作用底物的不同分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等。普通變形桿菌Proteus vulgaris是ChSase ABC的主要來(lái)源，分為ChSase ABC I和ChSase ABC II，兩種酶對(duì)相同底物具有不同的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。ChSase ABCI基因含有3063bp的開(kāi)放閱讀框，其中含有72bp的前導(dǎo)肽序列，編碼成熟后將切去24個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽。ChSase ABC II的基因含有2973bp的開(kāi)放閱讀框。對(duì)ChSase ABC I的酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，對(duì)于不同的底物，ChSase ABC I的測(cè)定溫度為37℃，緩沖液為40mmol/l Tris-HCl(pH 8.0)并且ChSase ABC I比ChSase ABC II催化效率高。以CS A為底物時(shí)，ChSaseABC I比酶活為400U/mg，而ChSaseABC II比酶活為25U/mg；以CS B為底物時(shí)，ChSaseABC I比酶活為180U/mg，而ChSaseABC II為23U/mg。以透明質(zhì)酸為底物時(shí)，兩種酶的比酶活差不多，在3-5U/mg。

目前對(duì)于ChSase ABC的重組表達(dá)研究較少，Prabhakar等將cslABC重組到pET-28a載體中，僅得到少量可溶蛋白，大多以沉淀形式存在。高慧玲等建立了ChSase ABC I分泌型真核表達(dá)載體，結(jié)果以分泌形式表達(dá)。然而，已有報(bào)道李曄等人將P.vulgaris KCTC2579中的ChSase ABCI基因在Escherichia coli中得到可溶性表達(dá)，并通過(guò)MBP柱純化得到了與從P.vulgaris中分離一致的酶，還對(duì)重組酶進(jìn)行了酶活、比酶活和動(dòng)力學(xué)常數(shù)等測(cè)定。

國(guó)內(nèi)對(duì)于ChSase ABC的發(fā)酵生產(chǎn)主要存在兩個(gè)方面的問(wèn)題：一、發(fā)酵生產(chǎn)ChSaseABC 的菌株多數(shù)為胞內(nèi)生產(chǎn)方式，且得到的酶活偏低，而破碎過(guò)程相對(duì)繁瑣同時(shí)不易破碎完全。二、ChSase ABC發(fā)酵生產(chǎn)后的分離純化也存在問(wèn)題，分離后的比酶活雖有一定程度的提高，但總酶活損失較大。因此，發(fā)現(xiàn)、篩選或構(gòu)建以分泌型生產(chǎn)ChSase ABC的菌株越來(lái)越重要，另外，優(yōu)化發(fā)酵條件、探索新型的分離純化方式，對(duì)于提高產(chǎn)量和酶活也至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的重組枯草芽孢桿菌，以pP43NMK為表達(dá)載體，在枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因，組成型表達(dá)硫酸軟骨素裂解酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因?yàn)閏slABC，其序列如SEQ ID NO.1所示。。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體上引入信號(hào)肽amyX。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在信號(hào)肽amyX的C端與基因cslABC起始密碼子之間加入6×His-tag標(biāo)簽，利用pP43NMK質(zhì)粒本身的RBS，將強(qiáng)組成型啟動(dòng)子與信號(hào)肽融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述強(qiáng)組成型啟動(dòng)子為P₄₃，或P_ppnk，或P_csfB。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以組成型啟動(dòng)子P₄₃啟動(dòng)編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因的表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌以pP43NMK骨架為表達(dá)載體，引入信號(hào)肽amyX，在信號(hào)肽C端與基因起始密碼子間加入6×His-tag標(biāo)簽，利用pP43NMK質(zhì)粒本身的RBS，同時(shí)采用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis WB600。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌是以pP43NMK為表達(dá)載體，利用質(zhì)粒上本身的啟動(dòng)子P₄₃和RBS，并在基因起始密碼子前加入信號(hào)肽amyX和6×His-tag標(biāo)簽，以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600為宿主，組成型表達(dá)編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供構(gòu)建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，其步驟如下：(1)構(gòu)建具有信號(hào)肽amyX的pP43NMK，(2)將編碼硫酸軟骨素裂解酶的基因cslABC插入所述質(zhì)粒，(3)在信號(hào)肽amyX的C端與基因起始密碼子間引入6×His-tag標(biāo)簽，(4)將P₄₃啟動(dòng)子與信號(hào)肽amyX融合，(5)在枯草芽孢桿菌表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是在信號(hào)肽amyX的基礎(chǔ)上，使用三種強(qiáng)組成型 啟動(dòng)子和強(qiáng)RBS，并在信號(hào)肽C端與基因起始密碼子之間加入6×His-tag標(biāo)簽，以pP43NMK骨架為表達(dá)載體，以Bacillus subtilis 168和Bacillus subtilis WB600為表達(dá)宿主，在質(zhì)粒上表達(dá)硫酸軟骨素裂解酶基因。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種應(yīng)用所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)硫酸軟骨素裂解酶的方法，所述方法是將重組芽孢桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃發(fā)酵48h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，碳源采用蔗糖。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，硫酸鉀3.9g/L，硫酸鎂1.5g/L，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0。

有益效果：本發(fā)明利用硫酸軟骨素裂解酶在枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)產(chǎn)裂解酶，具有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。首先，本發(fā)明過(guò)程中使用的宿主為食品級(jí)，可滿(mǎn)足醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全的要求，無(wú)內(nèi)毒素和病原感染的風(fēng)險(xiǎn)；其次，經(jīng)調(diào)控元件優(yōu)化后的硫酸軟骨素裂解酶表達(dá)系統(tǒng)，酶活有一定幅度的提高。本發(fā)明能夠使搖瓶上硫酸軟骨素裂解酶胞外粗酶活達(dá)1.02U/ml，3L發(fā)酵罐上胞外粗酶活達(dá)21.4U/ml，在工業(yè)上具有潛在而廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為PCR和凝膠核酸電泳鑒定3種重組質(zhì)粒P43-H6cslA1、Pppnk-H6cslA1、PcsfB-H6cslA1在B.subtilis 168和B.subtilis WB600中的構(gòu)建；泳道1-4：B.subtilis 168/P43-H6cslA1；泳道5-8：B.subtilis 168/Pppnk-H6cslA1；泳道9-12：B.subtilis 168/PcsfB-H6cslA1；泳道13-16：B.subtilis WB600/P43-H6cslA1；泳道17-20：B.subtilisWB600/Pppnk-H6cslA1；泳道21-24：B.subtilisWB600/PcsfB-H6cslA1；M：5000DL；

圖2所示為6株重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵第48h搖瓶上的胞外粗酶活；1.B.subtilis 168/P43-H6cslA1；2.B.subtilis 168/Pppnk-H6cslA1；3.B.subtilis 168/PcsfB-H6cslA1；4.B.subtilis WB600/P43-H6cslA1；5.B.subtilis WB600/Pppnk-H6cslA1；6.B.subtilis WB600/PcsfB-H6cslA1；7.B.subtilis 168；8.B.subtilis WB600；

圖3所示為3L罐上重組枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600/P43-H6cslA1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和胞外粗酶活隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)SEQ ID NO.1序列信息為來(lái)源于普通變形桿菌(Proteus vulgaris)的硫酸軟骨素裂解酶編碼基因cslABC編碼序列；

(2)SEQ ID NO.2序列信息為枯草芽孢桿菌組成型啟動(dòng)子P₄₃的基因序列；

(3)SEQ ID NO.3序列信息為枯草芽孢桿菌組成型啟動(dòng)子P_ppnk的基因序列；

(4)SEQ ID NO.4序列信息為枯草芽孢桿菌組成型啟動(dòng)子P_csfB的基因序列；

(5)SEQ ID NO.5序列信息為信號(hào)肽amyX的基因序列。

酶活測(cè)定方法：以硫酸軟骨素A(CSA)為底物，濃度為1mg/ml，用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶解底物。酶活測(cè)定的反應(yīng)體系為250μl，加入50μl粗酶液和200μl硫酸軟骨素底物溶液。在37℃反應(yīng)4min后，加入2ml的5M HCl終止反應(yīng)。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定在232nm處的吸光值。酶活單位定義為：1mL酶液每分鐘內(nèi)增加0.2OD為1個(gè)酶活單位。

實(shí)施例1重組質(zhì)粒P43-H6cslA1、Pppnk-H6cslA1、PcsfB-H6cslA1的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物AmyX-F和AmyX-R，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取序列如SEQ ID NO.5所示信號(hào)肽amyX。

設(shè)計(jì)引物CSL-F2和CSL-R2，以P.vulgaris ATCC6896的基因組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取硫酸軟骨素裂解酶基因cslABC(SEQ ID NO.1所示)。

啟動(dòng)子P_ppnk和P_csfB來(lái)源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168，B.subtilis 168菌株接種于5ml LB液體培養(yǎng)基，在37℃200rpm培養(yǎng)16h。收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取B.subtilis 168菌株的基因組DNA。根據(jù)已公布的基因組信息序列，分別設(shè)計(jì)引物Pppnk-F/Pppnk-R、PcsfB-F/PcsfB-R，以提取的B.subtilis 168基因組為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取啟動(dòng)子P_ppnk和P_csfB。

根據(jù)pP43NMK質(zhì)粒圖譜，設(shè)計(jì)引物P43-F和P43-R，以pP43NMK質(zhì)粒為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取啟動(dòng)子P₄₃。

在擴(kuò)增三個(gè)強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P₄₃、P_ppnk和P_csfB的上游引物P43-F、Pppnk-F和PcsfB-F的5’端引入BamHI限制性酶切位點(diǎn)，在下游引物P43-R、Pppnk-R和PcsfB-R的5’端引入RBS序列(AAGAGAGGAATGTACAC)；在擴(kuò)增信號(hào)肽amyX的上游引物AmyX-F的5’端引入RBS序列，在下游引物AmyX-R的5’端引入6×His-tag序列(CACCACCACCACCACCAC)；在擴(kuò)增硫酸軟骨素裂解酶基因cslABC的上游引物CSL-F2的5’端引入6×His-tag序列，在下游引物CSL-R2的5’端引入XhoI限制性酶切位點(diǎn)。

引物信息如下：5’-3’方向

AmyX-F：AAGAGAGGAATGTACACATGGTCAGCATCCGCCGCAG

AmyX-R：CCAATGTCATGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATGATTTCCTTTTGTTCAGC

Pppnk-F：CGCGGATCCCGATAATATTGGCGTCTGAGTGC

Pppnk-R：GTGTACATTCCTCTCTTTCTCTCATTATACGATTCAATATGAAAAATG

PcsfB-F：CGCGGATCCAGGTGGAGAAGATGGACGAAACAG

PcsfB-R：GTGTACATTCCTCTCTTCTCAGTTTTAATATTATTATCTACTACGTTCAATC

P43-F：CGCGGATCCTGATAGGTGGTATGTTTTCG

P43-R：GTGTACATTCCTCTCTTACC

CSL-F2：CAAAAGGAAATCATGCACCACCACCACCACCACATGACATTGGCTATTATCAG

CSL-R2：CCGCTCGAGTCAAGGGAGTGGCGAGAGTT

將擴(kuò)增獲取的三個(gè)啟動(dòng)子分別與信號(hào)肽通過(guò)RBS序列作為重疊區(qū)域進(jìn)行融合PCR，再與cslABC基因通過(guò)6×His-tag序列作為重疊區(qū)域進(jìn)行融合PCR，分別獲得P₄₃-amyX-cslABC、P_ppnk-amyX-cslABC、P_csfB-amyX-cslABC片段，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物與質(zhì)粒pP43-D質(zhì)粒(Production of specific-molecular-weight hyaluronan by metabolically engineered Bacillus subtilis 168，Metabolic Engineering，2016年1月公開(kāi))進(jìn)行BamHI和XhoI雙酶切，體系50μL：45μL片段或質(zhì)粒，5μL 10×Green buffer，2.5μLBamHI酶，2.5μLXhoI酶。37℃酶切30min后將片段柱純化。酶切后的質(zhì)粒經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標(biāo)條帶。回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體系10μL：1μL雙切的載體，4μL雙切的目的片段，5μLSolution I連接酶，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確，P43-H6cslA1、Pppnk-H6cslA1、PcsfB-H6cslA1質(zhì)粒構(gòu)建成功。

上述構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化B.subtilis 168和B.subtilis WB600宿主，獲得6個(gè)重組枯草芽孢桿菌菌株：B.subtilis 168/P43-H6cslA1；B.subtilis 168/Pppnk-H6cslA1；B.subtilis 168/PcsfB-H6cslA1；B.subtilis WB600/P43-H6cslA1；B.subtilis WB600/Pppnk-H6cslA1；B.subtilis WB600/PcsfB-H6cslA1。

實(shí)施例2 6株重組枯草芽孢桿菌的搖瓶培養(yǎng)及酶活測(cè)定

分別挑取上述構(gòu)建的6個(gè)重組枯草芽孢桿菌菌株及對(duì)照菌B.subtilis 168和B.subtilisWB600，單克隆接種于5mL LB培養(yǎng)基，置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)。16h后按10％的接種量轉(zhuǎn)接于250mL三角搖瓶，培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為25mL，置于200rpm 37℃培養(yǎng)48h。

各取8個(gè)搖瓶中第48h發(fā)酵液樣品在5000×g，4℃離心5min，保留上清，測(cè)定上清中的粗酶酶活。從附圖2看出，使用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子、強(qiáng)RBS并加入組氨酸標(biāo)簽時(shí)，6株重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/P43-H6cslA1；B.subtilis 168/Pppnk-H6cslA1；B.subtilis 168/PcsfB-H6cslA1；B.subtilis WB600/P43-H6cslA1；B.subtilis WB600/Pppnk-H6cslA1；B.subtilis WB600/PcsfB-H6cslA1在發(fā)酵第48h所產(chǎn)裂解酶的胞外粗酶活分別為0.42U/ml，0.47U/ml，0.26U/ml，1.02U/ml，0.82U/ml，0.51U/ml，而對(duì)照菌B.subtilis 168和B.subtilis WB600 的48h發(fā)酵上清中均未檢測(cè)到硫酸軟骨素裂解酶酶活。

實(shí)施例3重組枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600/P43-H6cslA1的3L罐培養(yǎng)

挑取重組枯草芽孢桿菌菌株B.subtilis WB600/P43-H6cslA1，單克隆接種于 15mL LB培養(yǎng)基，置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)。16h后按10％的接種量轉(zhuǎn)接于250ml三角瓶，裝液量為150mL，繼續(xù)置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)作為種子液。16h后按10％的接種量轉(zhuǎn)接于3L發(fā)酵罐，裝液量為1.5L，37℃恒溫培養(yǎng)，通氣量為2vvm，通過(guò)5M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH維持在7.0。前4h攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，之后變?yōu)?00rpm。第7h待初糖耗盡開(kāi)始補(bǔ)料，第7-9h補(bǔ)料為10g/L/h，第10-12h補(bǔ)料為15g/L/h，第13-24h補(bǔ)料為8g/L/h，第25h以后至發(fā)酵結(jié)束補(bǔ)料均為5g/L/h，發(fā)酵時(shí)間為60h。取樣時(shí)間為第2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h，30h，36h，42h，48h，54h，60h，分別測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)取樣樣品的細(xì)胞光密度和胞外粗酶活。測(cè)定細(xì)胞光密度時(shí)，取1ml發(fā)酵液，8000×g離心10min，除去上清，將菌體用1ml ddH₂O重懸，以ddH₂O調(diào)零，在600nm處測(cè)定細(xì)胞密度OD₆₀₀。胞外粗酶活按照實(shí)施例2中所述實(shí)施。從附圖3中看出，菌體隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，到24h時(shí)菌體量達(dá)到最大，OD₆₀₀約為40。酶活呈持續(xù)增加狀態(tài)，但與菌體生長(zhǎng)非偶聯(lián)，當(dāng)菌體量恒定時(shí)，胞外酶活仍上升，在第48h時(shí)達(dá)到最大，為21.4U/ml。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。