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一種利用單鏈特異性核酸酶檢測microRNA含量的方法與流程

文檔序號:11838461閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種利用SSSN酶檢測待測樣本中是否含有目標(biāo)microRNA的方法,包括如下步驟:

1)制備目標(biāo)microRNA探針;

所述目標(biāo)microRNA探針為:NH2-A-B-生物素;

所述A為(CH2)n,其中,n為6-12的整數(shù);

所述B為與所述目標(biāo)microRNA反向互補(bǔ)的單鏈DNA分子;

2)將所述目標(biāo)microRNA探針、待測樣本、SSSN酶依次加入酶標(biāo)板各孔中,得到反應(yīng)后酶標(biāo)板;

3)通過化學(xué)發(fā)光法檢測所述反應(yīng)后酶標(biāo)板,確定待測樣本中是否含有目標(biāo)microRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:

所述目標(biāo)microRNA探針、待測樣本、SSSN酶依次加入酶標(biāo)板各孔中包括如下步驟:

A)將所述目標(biāo)microRNA探針固定到酶標(biāo)板各孔中,得到連接探針的酶標(biāo)板;

B)將所述待測樣本的RNA加入所述連接探針的酶標(biāo)板,進(jìn)行雜交反應(yīng),得到含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板;

C)將SSSN酶加入所述含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板各孔中,酶切反應(yīng),得到反應(yīng)后酶標(biāo)板。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于:

在步驟A和步驟C之間,還包括封閉所述連接探針的酶標(biāo)板的步驟。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:

步驟A中,所述酶標(biāo)板為馬來酸酐基團(tuán)修飾的酶標(biāo)板;

所述目標(biāo)microRNA探針通過酰胺反應(yīng)固定到酶標(biāo)板。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:

所述確定待測樣本中是否含有目標(biāo)microRNA的方法為:若所述待測樣本所在孔有熒光信號或熒光強(qiáng)度值,則所述待測樣本中或候選含有所述目標(biāo)microRNA;若所述待測樣本所在孔沒有熒光信號或熒光強(qiáng)度值,則所述待測樣本不含有或候選不含有所述目標(biāo)microRNA。

6.一種利用SSSN酶檢測待測樣本中目標(biāo)microRNA含量的方法,包括如下步驟:

1)制備目標(biāo)microRNA探針;

所述目標(biāo)microRNA探針為:NH2-A-B-生物素;

所述A為(CH2)n,其中,n為6-12的整數(shù);

所述B為與所述目標(biāo)microRNA反向互補(bǔ)的單鏈DNA分子;

2)將所述目標(biāo)microRNA探針、不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液、SSSN酶依次加入酶標(biāo)板各孔中,得到反應(yīng)后酶標(biāo)板;

3)通過化學(xué)發(fā)光法檢測所述反應(yīng)后酶標(biāo)板,得到不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液的熒光強(qiáng)度,根據(jù)所述不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液的濃度及各自對應(yīng)的熒光強(qiáng)度做標(biāo)準(zhǔn)曲線;

4)將所述待測樣本的RNA替換步驟2)中不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液,重復(fù)步驟2)和3),得到待測樣本的RNA對應(yīng)的熒光強(qiáng)度,將該熒光強(qiáng)度值代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計(jì)算得到待測樣本中目標(biāo)microRNA的含量。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于:所述SSSN酶為S1核酸酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法,其特征在于:所述(CH2)n為(CH2)6、(CH2)9、(CH2)12、(CH2)18或(CH2)24;

和/或,所述目標(biāo)microRNA具體為microRNA let-7a;

和/或,所述microRNA let-7a探針為NH2-(CH2)12-B-生物素,其中所述B為序列1所示的單鏈DNA分子;

和/或,所述microRNA let-7a的核苷酸序列具體為序列2。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法,其特征在于:所述待測樣本為離體血漿或離體血清或RNA溶液。

10.SSSN酶或S1核酸酶在檢測或輔助檢測microRNA中的應(yīng)用;

或權(quán)利要求1-9中任一所述方法中的探針。

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