本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)的工具和方法，具體地說(shuō)，是基于模擬體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境的雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)工具和方法。
背景技術(shù)：
在生物學(xué)研究領(lǐng)域，通常利用生物力學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的方法和技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞，研究細(xì)胞的各種生長(zhǎng)變化及凋亡等過(guò)程，以探究生物細(xì)胞的演變。但是在現(xiàn)在的細(xì)胞培養(yǎng)存在一些缺陷，主要是體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境具有很大差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際人體表現(xiàn)差異巨大。比如，在肝纖維化的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中起重要作用的兩種細(xì)胞HSCs和EPCs，兩者在體內(nèi)環(huán)境中是緊密接觸、相互影響的，兩者間的相互作用不僅是分子水平的各種物質(zhì)相互影響，體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境也對(duì)其具有重要影響。
目前的細(xì)胞培養(yǎng)方法不能模擬這種獨(dú)特的體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境，也沒(méi)有與這種體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境相符的細(xì)胞培養(yǎng)工具，細(xì)胞不在這種獨(dú)特環(huán)境中生長(zhǎng)也就無(wú)法得出符合實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明要解決的正是利用生物力學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的方法和技術(shù)，對(duì)HSCs及骨髓來(lái)源EPCs共培養(yǎng)模型行切應(yīng)力處理，以模擬體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境，研究流體切應(yīng)力條件下，肝纖維化的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中起重要作用的兩種細(xì)胞HSCs及EPCs間的相互作用，使研究人員能夠以符合實(shí)際的生物力學(xué)角度的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果研究、揭示肝纖維化、門脈高壓癥的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸機(jī)制，進(jìn)而為臨床治療提供一種嶄新的思路。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服上述傳統(tǒng)技術(shù)的不足之處，提供一種基于模擬體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境的雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)措施來(lái)達(dá)到的：
雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)工具，其特征在于：包括孵育盒、盒蓋和細(xì)胞培養(yǎng)小室，所述細(xì)胞培養(yǎng)小室包括桶形的體部，所述體部的底部設(shè)有Biopore膜，所述體部的頂部設(shè)有伸向外周的懸掛齒，所述孵育盒上設(shè)有正置凹洞和倒置凹洞，所述正置凹洞的半徑大于細(xì)胞培養(yǎng)小室的體部半徑且小于懸掛齒最外端至體部中心的半徑；所述倒置凹洞半徑大于懸掛齒最外端至體部中心的半徑。細(xì)胞培養(yǎng)小室采用透明的Biopore膜，Biopore膜即聚碳酸酯通透膜，可直接透過(guò)膜觀察細(xì)胞；Biopore膜與細(xì)胞和熒光染色相容，方便用于SEM和TEM技術(shù)；Biopore膜經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)基處理有助于細(xì)胞的貼壁。與塑料培養(yǎng)板上的細(xì)胞相比較，生長(zhǎng)在插入式細(xì)胞培養(yǎng)小室中Biopore膜上的細(xì)胞更能代表其體內(nèi)狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)小室可以正置于正置凹洞中，或者將小室反轉(zhuǎn)，倒置于倒置凹洞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)小室上Biopore膜的雙面兩種細(xì)胞分層共同種植培養(yǎng)。
作為一種優(yōu)選方案，所述孵育盒上的正置凹洞和倒置凹洞分別設(shè)有若干個(gè)。一個(gè)正置凹洞和一個(gè)倒置凹洞組成一組，孵育盒內(nèi)同時(shí)設(shè)置多組。一個(gè)孵育盒內(nèi)設(shè)置多組凹洞，方便同時(shí)進(jìn)行多組細(xì)胞培育，并使多組培育的細(xì)胞處于完全相同的培育環(huán)境中，方便觀察與比較細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及兩組細(xì)胞間相互影響。
雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟：
A.EPCs的單獨(dú)培養(yǎng)；
B.HSCs的單獨(dú)培養(yǎng)；
C.孵育盒預(yù)處理；
D.種植EPCs：將EGM-2完全培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽預(yù)熱，預(yù)熱后用酒精消毒轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)；將預(yù)處理好后的孵育盒置于超凈臺(tái)中，孵育盒中加入適量EGM-2完全培養(yǎng)液；吸取0.25％胰蛋白酶加入EPCs培養(yǎng)瓶中進(jìn)行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈單個(gè)分離狀態(tài)時(shí)轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，加EGM-2完全培養(yǎng)液終止消化，吹打至鏡下觀察細(xì)胞全部與培養(yǎng)瓶分離后，將EPCs細(xì)胞均勻接種到細(xì)胞培養(yǎng)小室的Biopore膜的底面；
E.在超凈臺(tái)中，將種植好EPCs的細(xì)胞培養(yǎng)小室倒置于孵育盒的倒置凹洞中，封閉孵育盒，靜置30分鐘；
F.種植HSCs：將細(xì)胞培養(yǎng)小室取出，將其正置于孵育盒的正置凹洞中；用DMEM高糖和EGM-2完全培養(yǎng)液吹打HSCs培養(yǎng)瓶中的HSCs細(xì)胞，將懸浮的HSCs細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)小室的Biopore膜的正面，蓋上盒蓋封閉孵育盒，靜置30分鐘；
G.將共培養(yǎng)EPCs和HSCs細(xì)胞的孵育盒作通氣處理后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，2-3天后換液；
F.換液后，顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，達(dá)到細(xì)胞集落相對(duì)密集，形態(tài)典型，細(xì)胞生長(zhǎng)良好的要求時(shí)，將共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)小室取出，固定于流槽上，置于雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下流6-24小時(shí)。
進(jìn)一步地說(shuō)，該方法中步驟A.EPCs的單獨(dú)培養(yǎng)包括以下步驟：
A1.EPCs原代培養(yǎng)；
A2.EPCs細(xì)胞傳代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)方法，該方法中步驟A1.EPCs原代培養(yǎng)包括以下步驟：
A1.1.SD大鼠頸椎脫臼處死，置入1000ml大燒杯內(nèi)，以75％的酒精浸泡15分鐘；
A1.2.將大鼠從酒精中取出置于托盤上，用高壓消毒處理好的剪刀、止血鉗無(wú)菌條件下取大鼠四肢，將取下的大鼠四肢置于含75％酒精的玻璃平皿內(nèi)浸泡后將其轉(zhuǎn)移入超凈臺(tái)內(nèi)；
A1.3.將用錫紙包裹的蛙板于超凈臺(tái)內(nèi)打開，大鼠四肢置于蛙板上；用剪刀、手術(shù)刀將大鼠四肢肌肉組織剔除，將剔出的大鼠四肢長(zhǎng)骨放入含1×PBS的玻璃平皿內(nèi)；
A1.4.去除長(zhǎng)骨兩端骨骺，置于另一玻璃平皿內(nèi)；
A1.5.用刻度吸管吸取PBS沖洗長(zhǎng)骨，后用注射器插入長(zhǎng)骨骨髓腔反復(fù)沖洗，至長(zhǎng)骨骨髓腔變白；
A1.6.將沖洗出的液體用膠頭滴管吹打混勻，置離心機(jī)1100rpm/min離心5分鐘；
A1.7.棄上清，加PBS吹打均勻，置離心機(jī)1100rpm/min離心5分鐘；
A1.8.棄上清，加3mlPBS吹打均勻，吹打成單個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；
A1.9.取15ml離心管，底層加入梯度離心液4ml；將細(xì)胞懸液3ml加在梯度離心液上層，形成雙層液，兩層液體不能混合；置離心機(jī)梯度離心700g 23℃,離心25分鐘；
A1.10.取培養(yǎng)瓶，以Fn液打底后放于含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)；
A1.11.梯度離心結(jié)束后，吸取中間云霧狀乳白色層液體，置于離心管內(nèi)，加入PBS吹打均勻清洗兩次，第一次吹打清洗后置離心機(jī)1300rpm/min，離心5分鐘，第二次1100rpm/min，離心5分鐘；
A1.12.從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶吸走Fn液；在培養(yǎng)瓶側(cè)壁上標(biāo)明細(xì)胞名稱、傳代時(shí)間及操作者；
A1.13.將上述清洗離心結(jié)束后所得EPCs細(xì)胞用EGM-2培養(yǎng)液重懸后置入培養(yǎng)瓶，每瓶約4ml重懸液，放于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；
A1.14.培養(yǎng)4天后觀察換液。
進(jìn)一步地說(shuō)，該方法中步驟A2.EPCs細(xì)胞傳代包括以下步驟：
觀察EPCs細(xì)胞鋪滿至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的90％時(shí)進(jìn)行傳代：
A2.1.將EGM-2完全培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽預(yù)熱，預(yù)熱后用酒精消毒，然后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)；
A2.2.取出EPCs培養(yǎng)瓶，擰緊瓶蓋轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，棄培養(yǎng)液，用膠頭滴管吸取1×PBS入培養(yǎng)瓶，輕晃培養(yǎng)瓶后倒掉，重復(fù)兩次；
A2.3.吸取0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，顯微鏡下觀察EPCs細(xì)胞呈單個(gè)分離狀態(tài)時(shí)，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，加EGM-2完全培養(yǎng)液終止消化；
A2.4.吹打直至鏡下觀察EPCs細(xì)胞全部與培養(yǎng)瓶分離；
A2.5.將EPCs細(xì)胞均勻接種到另一培養(yǎng)瓶里；
A2.6.在培養(yǎng)瓶側(cè)壁上標(biāo)明細(xì)胞名稱、傳代時(shí)間及操作者；
A2.7.擰松瓶蓋放入含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
A2.8.待EPCs細(xì)胞鋪滿至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的90％時(shí)再次傳代。
進(jìn)一步地說(shuō)，該方法中步驟B.HSCs的單獨(dú)培養(yǎng)包括以下步驟：
B1.從液氮中復(fù)蘇的HSC-T6細(xì)胞株，將其取出后立即放置在37攝氏度水中待其融化；
B2.置離心機(jī)1000rpm/min，離心5分鐘，離心細(xì)胞取沉淀，加1×PBS洗1-2次；
B3.用DMEM高糖輕柔吹打細(xì)胞；
B4.將懸浮的細(xì)胞放置在HSCs培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；2-3天后換液或傳代。
進(jìn)一步地說(shuō)，該方法中步驟C.孵育盒預(yù)處理包括以下步驟：
用流動(dòng)的水將孵育盒洗凈，泡酸，按常規(guī)清洗步驟清洗后，置于75％酒精中，使用前取出，紫外線照1-2小時(shí)，備用。
泡酸時(shí)，如果是新配制的酸泡2到3個(gè)小時(shí)，舊酸則須多泡2-3個(gè)小時(shí)。
本發(fā)明中涉及材料說(shuō)明如下。
EGM-2完全培養(yǎng)液：將生長(zhǎng)因子依次加入500ml EBM培養(yǎng)液中，注意裝生長(zhǎng)因子的小管最好也用培養(yǎng)液清洗2次，最大程度的獲得生長(zhǎng)因子，加入25ml原裝胎牛血清后，再加入30ml hyclone胎牛血清，吹打混勻，分裝，存于-20℃。
Fn液：Fn即人纖維連接蛋白，F(xiàn)n液配制方法取5mg人纖維連接蛋白粉末，即FN，加入100ml高壓處理過(guò)的三蒸水，培養(yǎng)箱內(nèi)溫育20分鐘后，分裝存于-20℃。
PBS是磷酸緩沖鹽溶液的簡(jiǎn)稱，一般的有活性的生物制劑都要用它來(lái)稀釋。1×PBS是1倍量的PBS。
0.25％胰蛋白酶即0.25％濃度胰蛋白酶溶液。
DMEM高糖是指高糖型DMEM培養(yǎng)基。DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的。DMEM與MEM比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型和低糖型。高糖型DMEM有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。
SD大鼠為大鼠的一個(gè)品系，其毛色白化，廣泛用于藥理、毒理、藥效及GLP實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明公開的HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)方法是采用特別設(shè)計(jì)的雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)工具才能實(shí)現(xiàn)的，以分層共培養(yǎng)工具的Biopore膜正反面接種不同的細(xì)胞，放置于相同的環(huán)境中，使兩種細(xì)胞在接近于正常組織環(huán)境中發(fā)生相互作用，從而觀察其生長(zhǎng)轉(zhuǎn)歸，對(duì)于揭示肝纖維化、門脈高壓癥的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸機(jī)制有重要啟示。
由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
本發(fā)明通過(guò)獨(dú)特雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)工具，構(gòu)建了Epc(內(nèi)皮祖細(xì)胞)和Hsc(肝形狀細(xì)胞)共培養(yǎng)用細(xì)胞培養(yǎng)小室以及與之配合的孵育盒，通過(guò)雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)方法解決了兩種細(xì)胞分層培育的難題。
1.孵育盒既能合適放置正置和倒置的細(xì)胞培養(yǎng)小室，避免了細(xì)胞污染；
2.分層共培養(yǎng)工具和分層共培養(yǎng)方法保證了細(xì)胞正常生長(zhǎng)所需的微環(huán)境；
3.孵育盒能同時(shí)放置多個(gè)小室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，最大程度的節(jié)約使用細(xì)胞和培養(yǎng)液；
4.分層共培養(yǎng)方法使不同處理因素的細(xì)胞，在相同實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最大程度地保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
附圖說(shuō)明
附圖1是本發(fā)明雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)工具的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：如附圖1所示，雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)工具，包括孵育盒1、盒蓋和細(xì)胞培養(yǎng)小室7，所述細(xì)胞培養(yǎng)小室7包括桶形的體部5，所述體部5的底部設(shè)有Biopore膜4，所述體部5的頂部設(shè)有伸向外周的懸掛齒6，所述孵育盒1上設(shè)有正置凹洞2和倒置凹洞3，所述正置凹洞2的半徑大于細(xì)胞培養(yǎng)小室7的體部5半徑且小于懸掛齒6最外端至體部5中心的半徑；所述倒置凹洞3半徑大于懸掛齒6最外端至體部5中心的半徑。細(xì)胞培養(yǎng)小室7采用透明的Biopore膜4，可直接透過(guò)膜觀察細(xì)胞；Biopore膜4與細(xì)胞和熒光染色相容，方便用于SEM和TEM技術(shù)；Biopore膜經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)基處理有助于細(xì)胞的貼壁。與塑料培養(yǎng)板上的細(xì)胞相比較，生長(zhǎng)在插入式細(xì)胞培養(yǎng)小室7中Biopore膜4上的細(xì)胞更能代表其體內(nèi)狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)小室7可以正置于正置凹洞2中，或者將小室反轉(zhuǎn)，倒置于倒置凹洞3內(nèi)，實(shí)現(xiàn)小室上Biopore膜的雙面兩種細(xì)胞分層共同種植培養(yǎng)。附圖中未示出盒蓋。
如附圖1所示，所述孵育盒1上的正置凹洞2和倒置凹洞3分別設(shè)有若干個(gè)。一個(gè)正置凹洞2和一個(gè)倒置凹洞3組成一組，孵育盒1內(nèi)同時(shí)設(shè)置多組。一個(gè)孵育盒1內(nèi)設(shè)置多組凹洞，方便同時(shí)進(jìn)行多組細(xì)胞培育，并使多組培育的細(xì)胞處于完全相同的培育環(huán)境中，方便觀察與比較細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及兩組細(xì)胞間相互影響。
實(shí)施例2：雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下HSCs與EPCs分層共培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟：
A.EPCs的單獨(dú)培養(yǎng)，包括A1.EPCs原代培養(yǎng)和A2.EPCs細(xì)胞傳代，
其中，步驟A1.EPCs原代培養(yǎng)包括：
A1.1.SD大鼠頸椎脫臼處死，置入1000ml大燒杯內(nèi)，以75％的酒精浸泡15分鐘；
A1.2.將大鼠從酒精中取出置于托盤上，用高壓消毒處理好的剪刀、止血鉗無(wú)菌條件下取大鼠四肢，將取下的大鼠四肢置于含75％酒精的玻璃平皿內(nèi)浸泡后將其轉(zhuǎn)移入超凈臺(tái)內(nèi)；
A1.3.將用錫紙包裹的蛙板于超凈臺(tái)內(nèi)打開，大鼠四肢置于蛙板上；用剪刀、手術(shù)刀將大鼠四肢肌肉組織剔除，將剔出的大鼠四肢長(zhǎng)骨放入含1×PBS的玻璃平皿內(nèi)；
A1.4.去除長(zhǎng)骨兩端骨骺，置于另一玻璃平皿內(nèi)；
A1.5.用刻度吸管吸取PBS沖洗長(zhǎng)骨，后用注射器插入長(zhǎng)骨骨髓腔反復(fù)沖洗，至長(zhǎng)骨骨髓腔變白；
A1.6.將沖洗出的液體用膠頭滴管吹打混勻，置離心機(jī)1100rpm/min離心5分鐘；
A1.7.棄上清，加PBS吹打均勻，置離心機(jī)1100rpm/min離心5分鐘；
A1.8.棄上清，加3mlPBS吹打均勻，吹打成單個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；
A1.9.取15ml離心管，底層加入梯度離心液4ml；將細(xì)胞懸液3ml加在梯度離心液上層，形成雙層液，兩層液體不能混合；置離心機(jī)梯度離心700g 23℃,離心25分鐘；
A1.10.取培養(yǎng)瓶，以Fn液打底后放于含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)；
A1.11.梯度離心結(jié)束后，吸取中間云霧狀乳白色層液體，置于離心管內(nèi)，加入PBS吹打均勻清洗兩次，第一次吹打清洗后置離心機(jī)1300rpm/min，離心5分鐘，第二次1100rpm/min，離心5分鐘；
A1.12.從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶吸走Fn液；在培養(yǎng)瓶側(cè)壁上標(biāo)明細(xì)胞名稱、傳代時(shí)間及操作者；
A1.13.將上述清洗離心結(jié)束后所得EPCs細(xì)胞用EGM-2培養(yǎng)液重懸后置入培養(yǎng)瓶，每瓶約4ml重懸液，放于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；
A1.14.培養(yǎng)4天后觀察換液。
步驟A2.EPCs細(xì)胞傳代包括：
觀察EPCs細(xì)胞鋪滿至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的90％時(shí)進(jìn)行傳代：
A2.1.將EGM-2完全培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽預(yù)熱，預(yù)熱后用酒精消毒，然后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)；
A2.2.取出EPCs培養(yǎng)瓶，擰緊瓶蓋轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，棄培養(yǎng)液，用膠頭滴管吸取1×PBS入培養(yǎng)瓶，輕晃培養(yǎng)瓶后倒掉，重復(fù)兩次；
A2.3.吸取0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，顯微鏡下觀察EPCs細(xì)胞呈單個(gè)分離狀態(tài)時(shí)，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，加EGM-2完全培養(yǎng)液終止消化；
A2.4.吹打直至鏡下觀察EPCs細(xì)胞全部與培養(yǎng)瓶分離；
A2.5.將EPCs細(xì)胞均勻接種到另一培養(yǎng)瓶里；
A2.6.在培養(yǎng)瓶側(cè)壁上標(biāo)明細(xì)胞名稱、傳代時(shí)間及操作者；
A2.7.擰松瓶蓋放入含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
A2.8.待EPCs細(xì)胞鋪滿至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的90％時(shí)再次傳代。
B.HSCs的單獨(dú)培養(yǎng)，包括以下步驟：
B1.從液氮中復(fù)蘇的HSC-T6細(xì)胞株，將其取出后立即放置在37攝氏度水中待其融化；HSC-T6細(xì)胞株可以購(gòu)自湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。
B2.置離心機(jī)1000rpm/min，離心5分鐘，離心細(xì)胞取沉淀，加1×PBS洗1-2次；
B3.用DMEM高糖輕柔吹打細(xì)胞；
B4.將懸浮的細(xì)胞放置在HSCs培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；2-3天后換液或傳代。
C.孵育盒預(yù)處理，包括以下步驟：
用流動(dòng)的水將孵育盒洗凈，泡酸，按常規(guī)清洗步驟清洗后，置于75％酒精中，使用前取出，紫外線照1-2小時(shí)，備用。泡酸時(shí)，如果是新配制的酸泡2到3個(gè)小時(shí)，舊酸則須多泡2-3個(gè)小時(shí)。
D.種植EPCs：將EGM-2完全培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶和1×PBS置于37℃水浴槽預(yù)熱，預(yù)熱后用酒精消毒轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)；將預(yù)處理好后的孵育盒置于超凈臺(tái)中，孵育盒中加入適量EGM-2完全培養(yǎng)液；吸取0.25％胰蛋白酶加入EPCs培養(yǎng)瓶中進(jìn)行消化，30秒后倒掉胰蛋白酶，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈單個(gè)分離狀態(tài)時(shí)轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，加EGM-2完全培養(yǎng)液終止消化，吹打至鏡下觀察細(xì)胞全部與培養(yǎng)瓶分離后，將EPCs細(xì)胞均勻接種到細(xì)胞培養(yǎng)小室的Biopore膜的底面；
E.在超凈臺(tái)中，將種植好EPCs的細(xì)胞培養(yǎng)小室倒置于孵育盒的倒置凹洞中，封閉孵育盒，靜置30分鐘；
F.種植HSCs：將細(xì)胞培養(yǎng)小室取出，將其正置于孵育盒的正置凹洞中；用DMEM高糖和EGM-2完全培養(yǎng)液吹打HSCs培養(yǎng)瓶中的HSCs細(xì)胞，將懸浮的HSCs細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)小室的Biopore膜的正面，蓋上盒蓋封閉孵育盒，靜置30分鐘；
G.將共培養(yǎng)EPCs和HSCs細(xì)胞的孵育盒作通氣處理后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，2-3天后換液；
F.換液后，顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，達(dá)到細(xì)胞集落相對(duì)密集，形態(tài)典型，細(xì)胞生長(zhǎng)良好的要求時(shí)，將共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)小室取出，固定于流槽上，置于雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下流6-24小時(shí)。
按照不同的實(shí)驗(yàn)要求，置于雙層流動(dòng)腔系統(tǒng)力學(xué)微環(huán)境下流6-24小時(shí)后，就可以檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。本發(fā)明公開的試驗(yàn)方法能夠?qū)崿F(xiàn)模擬體內(nèi)力學(xué)微環(huán)境，研究流體切應(yīng)力條件下，肝纖維化的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中起重要作用的兩種細(xì)胞HSCs及EPCs間的相互作用，使研究人員能夠以符合實(shí)際的生物力學(xué)角度的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果研究、揭示肝纖維化、門脈高壓癥的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸機(jī)制，進(jìn)而為臨床治療提供一種嶄新的思路。