技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于遞送生物活性物質(zhì)例如核酸、肽類(lèi)和蛋白質(zhì)的新的小分子綴合物。
背景技術(shù)：
：將核酸及其它基本上不透過(guò)細(xì)胞膜的化合物遞送入活細(xì)胞內(nèi)會(huì)受到細(xì)胞的復(fù)雜膜系統(tǒng)的高度限制。一種用于體內(nèi)遞送生物活性物質(zhì)如核酸的方法是將生物活性物質(zhì)連接在小的靶向分子或疏水分子如脂質(zhì)或甾醇上。然而觀察了這些綴合物的遞送和活性，這些方法中所需的生物活性物質(zhì)的劑量有障礙地較大，常導(dǎo)致體內(nèi)不期望的毒性作用。本文提供的是能夠與生物活性物質(zhì)綴合并成功介導(dǎo)所述生物活性物質(zhì)遞送入細(xì)胞內(nèi)的小分子化合物。令人驚訝地是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用本文所提供的新化合物時(shí)，足夠用于成功遞送的生物活性物質(zhì)的劑量顯著降低。因此，新的化合物提供了顯著限制體內(nèi)毒性的用于遞送生物活性物質(zhì)的有力工具。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(I)化合物其中Y是選自-(CH2)3-或-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-的連接基團(tuán)；R1是-(C1-6)烷基；-(CH2)-萘基；或者-(CH2)m-苯基，其中苯基是未取代的或者被獨(dú)立地選自下述的取代基取代最多四次：-NO2、-CN、鹵素、-O-(CH2)-苯基、-O-(C1-6)烷基，或者-C(O)-NH2；R2是氫；-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯環(huán)是未取代的或者獨(dú)立地被–O-(C1-4)烷基取代；-(CH2)k-C(O)-NH2；-(CH2)k-苯基；-(C1-6)烷基，其是未取代的或者被–S-CH3取代一次；R3是-NH-苯基，其中苯基基團(tuán)進(jìn)一步被獨(dú)立地選自下述的取代基取代：-(CH2)-OH；或-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)；k是1、2、3、4、5、6；m是1、2、3或4；n是0或1；且p是1-20的整數(shù)。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，式(I)化合物可具有如式(Ia)所示的特定構(gòu)型其中全部取代基R1、R2、R3和Y以及變量k、m、n和p具有上文所述的含義。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(I)或(Ia)化合物，其中Y是-(CH2)3-；且所有剩余取代基基團(tuán)具有上文所述的含義。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(I)或(Ia)化合物，其中Y是-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-；且全部取代基基團(tuán)具有上文所述的含義。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了式(I)或(Ia)化合物，其中Y是-(CH2)3-；R2是-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯環(huán)是未取代的或獨(dú)立地被–O-(C1-4)烷基取代；且R3是-NH-苯基，其中苯基基團(tuán)進(jìn)一步被-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)取代；n是0；且R1和k具有上文所述含義。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了式(I)或(Ia)化合物，其中Y是-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-；R2是-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯環(huán)是未取代的或獨(dú)立地被–O-(C1-4)烷基取代；且R3是-NH-苯基，其中苯基基團(tuán)進(jìn)一步被-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)取代；n是0；且R1、k和p具有上文所述含義。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“(C1-6)烷基”的含義是包含1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。優(yōu)選的C1-6烷基基團(tuán)包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、2-丁基等。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”的含義是氟、氯、溴或碘，優(yōu)選氟和氯。一般而言，本發(fā)明的化合物可以使用有機(jī)或藥物化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法獲得。更加特別地是，式(Ia)化合物，其中Y是-(CH2)3-且n＝0，可以使用化合物(A)作為起始原料獲得。(A)的合成如WO2001/070415中所述。將式(A)化合物進(jìn)一步在Huenig堿和乙酸乙酯(AcOET)的存在下反應(yīng)，隨后加入二氫呋喃-2,5-二酮的THF溶液，得到式(B)化合物將式(B)化合物進(jìn)一步與式(C)的胺反應(yīng)，得到式(Ia)化合物。式(I)或(Ia)化合物是用作生物活性物質(zhì)(如核酸、肽類(lèi)或蛋白質(zhì))上的配體，與其共價(jià)連接。優(yōu)選地，該共價(jià)鍵是通過(guò)生物活性物質(zhì)中適合的官能團(tuán)例如伯胺基團(tuán)與如上文所定義的R3的–O-C(O)-O-部分中活化的羰基基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)生。因此，本文提供包含式(I)或(Ia)化合物和生物活性物質(zhì)的綴合物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物活性物質(zhì)”是指包含小分子、肽類(lèi)(如穿透細(xì)胞的肽類(lèi))、蛋白質(zhì)、碳水化合物(包括單糖、寡糖和多糖)、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白質(zhì)；或與蛋白質(zhì)連接的小分子，糖蛋白、甾醇、核酸(DNA的任何形式，包括cDNA或RNA或其片段)、核苷酸、核苷、寡核苷酸(包括反義寡核苷酸類(lèi)、LNA和siRNA)、基因、脂質(zhì)、激素或其組合的無(wú)機(jī)或有機(jī)分子，當(dāng)其向包括但不限于鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物(包括人類(lèi))的動(dòng)物體內(nèi)施用時(shí)引發(fā)生物學(xué)作用。優(yōu)選地，所述生物活性物質(zhì)是肽類(lèi)或核酸。本文所用的優(yōu)選的核酸是siRNA。包含與生物活性物質(zhì)共價(jià)連接的本發(fā)明化合物的綴合物與單獨(dú)的所述生物活性物質(zhì)相比顯示出提高的被細(xì)胞吸收的能力。當(dāng)該綴合物遞送入細(xì)胞并運(yùn)送至溶酶體后，對(duì)應(yīng)的生物活性物質(zhì)經(jīng)酶裂解被釋放。該裂解優(yōu)選地當(dāng)二肽基序(優(yōu)選地包含如式(I)或(Ia)化合物中所存在的序列α-或β-(苯基)丙氨酸和賴(lài)氨酸)被引入該綴合物中時(shí)發(fā)生(參見(jiàn)流程1)。更加優(yōu)選地是，該綴合物包含二肽基序和間隔體，例如對(duì)氨基芐基氨基甲酸酯間隔體(BioconjugateChem.2002,13,855)，其當(dāng)二肽基序的C末端酰胺鍵裂解時(shí)自發(fā)地?cái)嗔眩缌鞒?中siRNA所例證。因此，該包含式(I)或(Ia)化合物的綴合物還涉及包含膽固醇綴合物的二肽。生物活性物質(zhì)從本發(fā)明包含二肽的膽固醇綴合物中的酶裂解是由細(xì)胞固有的蛋白酶類(lèi)催化。能夠裂解存在于式(I)或(Ia)化合物中的二肽基序的固有蛋白酶的一個(gè)實(shí)例是組織蛋白酶B。組織蛋白酶B是已知在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的溶酶體中普遍存在的半胱氨酸蛋白酶(BioconjugateChem.2002,13,855；J.Med.Chem.2005,48,1344；Nat.Biotechnology2003,21,778)。因此，上文所述的二肽基序也稱(chēng)為組織蛋白酶可裂解的二肽基序。因此，本發(fā)明還提供了將生物活性物質(zhì)遞送入細(xì)胞內(nèi)的方法，其中所述生物活性物質(zhì)可以隨后從該綴合物中釋放以呈現(xiàn)其治療活性。流程1在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，其提供了與生物活性化合物(優(yōu)選siRNA或肽部分)共價(jià)連接的式(I)或(Ia)化合物的綴合物。優(yōu)選地，所述肽部分是具有膜干擾特性的肽，例如穿透細(xì)胞的肽類(lèi)或兩親性肽類(lèi)。與生物活性物質(zhì)共價(jià)連接的式(I)或(Ia)的綴合物在本文分別稱(chēng)作式(II)或(IIa)。因此，在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式(II)化合物其中Ra是–(CH2)k-NH2；R1和k具有上文式(I)所述含義；且該生物活性物質(zhì)是核酸、蛋白質(zhì)或肽。在更加特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式(IIa)化合物其中Ra是–(CH2)k-NH2；R1和k具有上文式(I)所述含義；且該生物活性物質(zhì)是核酸、蛋白質(zhì)或肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在式(II)或(IIa)中的生物活性物質(zhì)是核酸，最優(yōu)選siRNA。在另一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在式(II)或(IIa)中的生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)或肽。式(II)或(IIa)化合物可以具有治療中有利的特性。因此，在其它實(shí)施方案中，提供了用作藥物的式(II)或(IIa)化合物。本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案是包含式(I)或(Ia)化合物與生物活性物質(zhì)共價(jià)連接的綴合物的藥物組合物。在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了包含式(IIa)化合物與可藥用賦形劑一起的藥物組合物。以下實(shí)施方案舉例說(shuō)明與siRNA共價(jià)連接的式(I)或(Ia)化合物的綴合物，因此式(II)或(IIa)化合物其中的生物活性物質(zhì)是siRNA。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施方案也可以應(yīng)用于其它生物活性物質(zhì)例如肽類(lèi)和蛋白質(zhì)。siRNA與式(I)或(Ia)化合物的共價(jià)連接是經(jīng)siRNA中適合的親核基團(tuán)(即伯胺基團(tuán))與所述式(I)或(Ia)化合物的R3中活化的–C(O)-基團(tuán)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。–C(O)-基團(tuán)的活化是通過(guò)對(duì)硝基苯氧基碳酸酯獲得，如下文流程2中所示。(流程2)對(duì)硝基苯基活化的碳酸酯可以例如與帶有己基氨基連接體的siRNA反應(yīng)形成氨基甲酸酯連接，從而得到siRNA綴合物。當(dāng)siRNA吸收入細(xì)胞內(nèi)并轉(zhuǎn)移至溶酶體后，其中生物活性物質(zhì)是siRNA的式(II)或(IIa)化合物被蛋白酶活性裂解，釋放siRNA，如流程2中所示。式(II)或(IIa)化合物的綴合物的膽固醇部分改變了siRNA的PK特性，由此全身給藥使得體內(nèi)基因沉默。流程3在一項(xiàng)實(shí)施方案中，其中生物活性物質(zhì)是siRNA的式(II)或(IIa)化合物是與遞送聚合物組合施用。遞送聚合物提供了破裂細(xì)胞膜并調(diào)節(jié)內(nèi)體釋放的手段。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述遞送聚合物和本發(fā)明的siRNA綴合物非共價(jià)連接且分別合成，并且可以在分開(kāi)的容器或單個(gè)容器中供給。用于寡核苷酸類(lèi)如siRNA的遞送聚合物是本領(lǐng)域熟知的。例如，Rozema等人，在美國(guó)專(zhuān)利出版物20040162260中例證了膜活化聚胺的可逆調(diào)節(jié)膜破裂活性的方法?？赡嬲{(diào)節(jié)提供了限制對(duì)靶細(xì)胞胞內(nèi)體的活性的方法，因此限制毒性。他們的方法依賴(lài)于聚胺上的胺與2-丙酸-3甲基馬來(lái)酸酐之間的反應(yīng)。該修飾通過(guò)伯胺轉(zhuǎn)化為包含羧基的基團(tuán)而將聚陽(yáng)離子轉(zhuǎn)化為聚陰離子，并可逆地抑制聚胺的膜活性。為了能夠?qū)⒑怂崤c遞送載體組合遞送，將核酸共價(jià)地連接在遞送聚合物上。在美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/307490中描述了新一代的遞送聚合物。其中，提供了膜活性聚胺，其包含由包含胺的單體、較低疏水性的單體和較高疏水性的單體隨機(jī)聚合形成的兩親性三元共聚物。該新一代的遞送聚合物不需要多核苷酸和聚合物通過(guò)共價(jià)連接或通過(guò)電荷-電荷互相作用進(jìn)行結(jié)合。用于與本發(fā)明的siRNA綴合物組合施用的遞送聚合物的非限定性的實(shí)例是膜活性聚胺和聚(乙烯基醚)(PBAVE)、動(dòng)態(tài)聚綴合物(DPC；Rozema等人2007)和如美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/307490中所公開(kāi)的改進(jìn)的DPC。在其它實(shí)施方案中，提供了用于體內(nèi)功能遞送的新的化學(xué)siRNA修飾模式。該新的化學(xué)siRNA修飾模式與表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的胞內(nèi)體/溶酶體內(nèi)保留的遞送載體一起尤其有用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)抗由定位于胞內(nèi)體/溶酶體內(nèi)的核酸酶如DNAseII降解的siRNA的穩(wěn)定化作用強(qiáng)烈地促進(jìn)了靶點(diǎn)敲減(knockdown)。該穩(wěn)定化可以直接影響siRNA釋放到細(xì)胞RNAi機(jī)制所處的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的量。僅有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的siRNA部分能觸發(fā)RNAi作用。當(dāng)沒(méi)有保護(hù)性遞送載體的siRNA直接施用進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)時(shí)，除了較差的藥代動(dòng)力學(xué)特性以外，siRNA在生物環(huán)境下對(duì)核酸酶敏感。因此，許多siRNA在細(xì)胞外的組織和血流中或在細(xì)胞吸收(胞內(nèi)體)后迅速降解。人們熟知，位于胞內(nèi)體/溶酶體區(qū)室內(nèi)的核酸酶是DNaseII。該酶在pH低于6-6.5時(shí)有活性，且在4.5-5范圍的pH下具有最強(qiáng)活性，反映了存在于胞內(nèi)體/溶酶體區(qū)室內(nèi)的酸性環(huán)境條件。隨后的由DNaseII引發(fā)的RNA降解路徑在體外已被鑒定，并在本發(fā)明中公開(kāi)：A.包含至少一個(gè)2’-OH核苷酸的RNA鏈經(jīng)環(huán)狀五價(jià)磷中間體迅速降解，產(chǎn)生在5’-裂解產(chǎn)物的2’-3’環(huán)狀磷酸酯。該五價(jià)中間體的形成可以被缺少2’-OH基團(tuán)的核苷酸類(lèi)例如2’-脫氧、2’-O-甲基(2’-OMe)或2’-脫氧-2’-氟(2’-F)核苷酸類(lèi)所抑制。B.此外，RNA以不依賴(lài)于5’-末端核苷酸上2’-修飾的5’-核酸外切路徑降解。該降解路徑可以被5’-末端的非核苷酸部分，例如膽固醇、氨基烷基連接體或在第一個(gè)核苷酸之間的鍵處的硫代磷酸酯所抑制。C.5’-磷酸酯還保護(hù)并減緩核酸外切裂解動(dòng)力學(xué)，但不能夠完全阻斷該路徑。這最可能是由于5’-磷酸酯被磷酸酶或穩(wěn)定性試驗(yàn)中所用的DNaseII酶制劑所固有的磷酸酶活性造成的裂解。D.最佳保護(hù)是用在鏈中缺少任何2’-OH核苷酸的寡核苷酸類(lèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)，用位于5’-端的2’-OMe核苷酸經(jīng)硫代硫酸酯(PTO)連接與第二個(gè)核苷酸連接開(kāi)始。其它末端非2’-OH核苷酸也可防止5’-外切降解，但與2’-OMe修飾相比程度較低。因此，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用以下設(shè)計(jì)時(shí)，siRNA可以顯著地被穩(wěn)定，其中用具有修飾模式的反義鏈來(lái)提供寡核苷酸：5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’和具有修飾模式5’-(Z3)ns-3’的有義鏈，其中w獨(dú)立地是5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯或H，Z1獨(dú)立地是2’-修飾的核苷。Z2獨(dú)立地是2’-脫氧核苷或2’-氟-修飾的核苷，Z3獨(dú)立地是2’-修飾的核苷，na是8-23且ns是8-25。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸是用具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈與具有修飾模式5’-(Z3)ns-3’的有義鏈提供，其中Z1是2’-氟-修飾的核苷或2脫氧核苷，且全部其他取代基以及變量na和ns具有上文所述含義。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸是用具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈與具有修飾模式5’-(Z3)ns-3’的有義鏈提供，其中Z3是2’-O-甲基修飾的核苷、2’-氟-修飾的核苷或2脫氧核苷，且全部其他取代基以及變量na和ns具有上文所述含義。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸是用具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈與具有修飾模式5’-(Z3)ns-3’的有義鏈提供，其中Z1是2’-氟-修飾的核苷或2脫氧核苷，且Z3是2’-O-甲基修飾的核苷、2’-氟-修飾的核苷或2脫氧核苷，且全部其他取代基以及變量na和ns具有上文所述含義。具有新的修飾模式的寡核苷酸類(lèi)的核酸序列中的核苷可以通過(guò)5’-3’磷酸二酯或5’-3’硫代磷酸酯鍵連接。如本文所用的"反義"鏈?zhǔn)桥c靶mRNA互補(bǔ)并且當(dāng)siRNA展開(kāi)時(shí)與該mRNA結(jié)合的siRNA鏈。所述包含新的修飾模式的siRNA的有義鏈與反義鏈互補(bǔ)。所述包含新的修飾模式的siRNA證明當(dāng)與如Rozema等人所例證的遞送聚合物(DynamicPolyConjugates(DPC；Rozema等人2007)共價(jià)連接時(shí)特別有利。使用本發(fā)明所述的siRNA修飾策略，作用的效能和持續(xù)時(shí)間可以顯著提高。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，當(dāng)與改變siRNA藥代動(dòng)力學(xué)特性的小分子例如膽固醇或本文所提供的式(I)和(Ia)化合物綴合時(shí)，所述包含新的修飾模式的siRNA尤其有用。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了小分子和寡核苷酸的綴合物，其中寡核苷酸具有以下修飾模式：具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈與具有修飾模式5’-(Z3)ns-的有義鏈，其中取代基以及變量na和ns具有上文所述含義。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述小分子是膽固醇。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述小分子是式(I)或(Ia)化合物，得到式(II)或(IIa)化合物。優(yōu)選地，所述siRNA綴合物是與遞送聚合物組合施用。適合的遞送聚合物如上文所述。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，當(dāng)與已知結(jié)合在能將綴合物內(nèi)化到細(xì)胞中的特定受體上的配體綴合時(shí)，所述包含新的修飾模式的siRNA尤其有用。特別是，在肝細(xì)胞上表達(dá)的唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)是熟知的能夠從循環(huán)系統(tǒng)中清除(胞吞或溶酶體降解)脫唾液酸化的蛋白質(zhì)的受體。已經(jīng)顯示，N-乙酰基-D-半乳糖胺對(duì)該受體具有高度的親合力，尤其是當(dāng)呈現(xiàn)多價(jià)和當(dāng)半乳糖殘基具有適合的間隔時(shí)(JBiolBhem,2001,276,37577)。為了利用該高能效受體進(jìn)行受體介導(dǎo)的生物活性物質(zhì)的細(xì)胞吞噬，制備下文所示的合成配體以便與包含新的修飾模式的siRNA共價(jià)地連接。由于該類(lèi)型的細(xì)胞吞噬導(dǎo)致內(nèi)化物質(zhì)的溶酶體降解，所述siRNA必須按照其在溶酶體內(nèi)穩(wěn)定的方式制備，而這個(gè)問(wèn)題目前已由上文所概述的新的修飾模式解決。ASGPR的配體是經(jīng)由酰胺鍵與生物活性物質(zhì)連接。該酰胺鍵的形成可以在NHS化學(xué)輔助下進(jìn)行。在綴合反應(yīng)中所用的配體如下文所示(式III)。為了與ASGPR相互作用，O-乙酸酯基團(tuán)需要去除，如siRNA中所示(式IV)。在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了式IV化合物和寡核苷酸的綴合物，其中該寡核苷酸具有以下修飾模式：具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈與具有修飾模式5’-(Z3)ns-的有義鏈，其中取代基以及變量na和ns具有上文所述含義。所述綴合物也稱(chēng)為GalNAc棕櫚酰綴合物。優(yōu)選地，所述GalNAc棕櫚酰綴合物是與遞送聚合物組合施用。適合的遞送聚合物如上文所述。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于這些修飾模式，可裂解的連接體與穩(wěn)定連接的小分子配體相比證明是有利的。可能的可裂解連接體是如流程1中所舉例的二肽基序或包含含有2’-OH的核苷酸類(lèi)的可裂解RNA-連接體。該可裂解的RNA連接體在與具有如上文所述新的修飾模式(全部2’-修飾的siRNA)的siRNA組合時(shí)尤其有用。一般而言，核酸酶裂解位點(diǎn)可以由在有義鏈或反義鏈上的包含至少一個(gè)2’-OH的核苷酸的3’-或5’-突出部分引入。最終的活性siRNA物質(zhì)由細(xì)胞內(nèi)核酸酶處理產(chǎn)生。并且，使用由2’-OH核苷酸在堿基對(duì)區(qū)域內(nèi)實(shí)現(xiàn)的限定裂解位點(diǎn)是可能的。其可以使用至少一個(gè)與對(duì)應(yīng)鏈互補(bǔ)的2’-OH核苷酸或者通過(guò)引入至少一個(gè)錯(cuò)配的2’-OH核苷酸或包含至少一個(gè)2’-OH的核苷酸的發(fā)卡/突環(huán)來(lái)完成。與其它可裂解的連接體化學(xué)相反，通過(guò)引入2’-OH核苷酸的限定裂解位點(diǎn)的使用導(dǎo)致更加多方面的綴合方式。通過(guò)在siRNA的一條或兩條鏈上在3’和/或5’-末端或在雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)引入選擇性的裂解位點(diǎn)，可能產(chǎn)生多種綴合。因此，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了小分子和寡核苷酸的綴合物，其中a)小分子包括含有1-10個(gè)、優(yōu)選1-5、最優(yōu)選1-3個(gè)2’OH核苷酸的核苷酸連接體；b)寡核苷酸具有以下修飾模式：具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈與具有修飾模式5’-(Z3)ns-的有義鏈，其中取代基以及變量na和ns具有上文所述含義；并且c)該寡核苷酸與小分子的核苷酸連接體共價(jià)連接。核苷酸連接體在綴合物被內(nèi)化到胞內(nèi)體后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)核酸酶例如DNaseII裂解，因此釋放siRNA。優(yōu)選地，所述綴合物是與遞送聚合物組合施用。適合的遞送聚合物如上文所述。在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了式(V)化合物。該化合物包含膽固醇部分以及包含1-10個(gè)、優(yōu)選1-5、最優(yōu)選1-3個(gè)2’OH-核苷酸的核苷酸連接體。該核苷酸連接體是用于例如siRNA的寡核苷酸與式(V)化合物的共價(jià)連接。優(yōu)選地，所述寡核苷酸具有如上文所概括的新的修飾模式。因此在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，提供了式(V)化合物與寡核苷酸的綴合物，其中寡核苷酸與式(V)化合物的核苷酸連接體共價(jià)連接。該核苷酸連接體在式(V)化合物和寡核苷酸的綴合物被內(nèi)化入胞內(nèi)體后被細(xì)胞內(nèi)核酸酶例如DNaseII裂解，因此釋放siRNA。優(yōu)選地，所述式(V)化合物和寡核苷酸的綴合物是與遞送聚合體組合施用。適合的遞送聚合物如上文所述。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述遞送聚合物與本發(fā)明的式(V)化合物和寡核苷酸的綴合物不是共價(jià)連接，而是單獨(dú)合成并可以在分開(kāi)的容器或單個(gè)容器中提供。定義如本文所用的術(shù)語(yǔ)“小分子”是指合成的或在自然界發(fā)現(xiàn)的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，一般而言，具有低于10,000克/摩爾的分子量，任選地低于5,000克/摩爾，且任選地低于2,000克/摩爾。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽”是指由一個(gè)D-或L-氨基酸的α-羧基基團(tuán)與另一個(gè)D-或L-氨基酸的α-氨基基團(tuán)之間形成酰胺鍵所產(chǎn)生的任何聚合體化合物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”是指超過(guò)約50個(gè)殘基的特定序列的多肽類(lèi)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“二肽基序”是指包含由第一個(gè)D-或L-氨基酸的α或β氨基基團(tuán)與第二個(gè)D-或L-氨基酸的α-羧基基團(tuán)形成的酰胺鍵的任何基序。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指包含胺和羧基官能團(tuán)的任何分子。因此，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然、非天然和合成氨基酸。用于本發(fā)明的任何天然氨基酸以其常規(guī)縮寫(xiě)在本文表示。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“配體”是指能夠共價(jià)地或以其它化學(xué)方式與生物活性物質(zhì)結(jié)合的部分。在本發(fā)明上下文中術(shù)語(yǔ)“配體”優(yōu)選地是與生物活性物質(zhì)共價(jià)連接的式(I)或(Ia)化合物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物活性物質(zhì)”是指無(wú)機(jī)或有機(jī)分子，包含小分子、肽類(lèi)(如穿透細(xì)胞的肽類(lèi))、蛋白質(zhì)、碳水化合物(包括單糖、寡糖和多糖)、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白質(zhì)；或與蛋白質(zhì)連接的小分子，糖蛋白、甾醇、核酸(DNA的任何形式，包括cDNA或RNA或其片段)、核苷酸、核苷、寡核苷酸(包括反義寡核苷酸類(lèi)、LNA和siRNA)、基因、脂質(zhì)、激素或其組合的無(wú)機(jī)或有機(jī)分子，當(dāng)其向包括但不限于鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物(包括人類(lèi))的動(dòng)物體內(nèi)施用時(shí)引發(fā)生物學(xué)作用。優(yōu)選地，所述生物活性物質(zhì)是肽類(lèi)或核酸。本文所用的優(yōu)選的核酸是siRNA。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸”的含義是由核苷酸構(gòu)成的寡聚體或多聚體，例如脫氧核糖核苷酸類(lèi)或核糖核苷酸類(lèi)，或者經(jīng)合成制備的化合物(例如如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,948,902中所述的PNA和其中所引述的參考文獻(xiàn))，其可以與天然存在的核酸以與兩個(gè)天然存在的核酸類(lèi)似的序列特異性方式雜交，例如可以參與沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用。非天然存在的核酸類(lèi)是寡聚體或聚合物，其包含自然界沒(méi)有出現(xiàn)的核酸堿基序列，或者包含天然存在的核酸堿基、糖類(lèi)或糖間連接鍵的官能化等價(jià)物的物質(zhì)，例如肽核酸類(lèi)(PNA)、蘇糖核酸類(lèi)(TNA)、鎖核酸類(lèi)(LNA)或甘油核酸類(lèi)(GNA)。該術(shù)語(yǔ)包括含有天然存在的核酸核酸堿基腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的寡聚體，以及含有堿基類(lèi)似物或修飾的核酸堿基的寡聚體。核酸可以衍生自許多天然來(lái)源，例如病毒、細(xì)菌和真核DNA和RNA。其它核酸可以衍生自合成途徑，且包含制備用作研究試劑、診斷試劑或有效且明確的治療劑的任何多種寡核苷酸類(lèi)。該術(shù)語(yǔ)包括含有單鏈核酸或雙鏈核酸的寡聚體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“2’-修飾”是指β-D-核糖核苷或具有被H、F、O-CH3或本領(lǐng)域已知的其它取代基代替的2’-OH基團(tuán)的包含天然存在核堿基的β-D-核糖核苷。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“2’-OH-核苷酸”是指包含具有2’-OH基團(tuán)的天然存在的核酸堿基的β-D-核糖核苷。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“5’-磷酸酯”是指式-O-P(＝O)(OH)OH。在另一方面，該磷酸酯被修飾，其中O或OH基團(tuán)中的一個(gè)被S代替，在本文稱(chēng)作“5’-硫代磷酸酯”。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“硫代磷酸酯”是指核苷酸間的鍵，其中一個(gè)非橋聯(lián)的氧被硫代替。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“遞送聚合物”是指是用于生物活性物質(zhì)的功能遞送的聚合物。在本文的上下文中，該遞送聚合物是與綴合在本文所述化合物上的生物活性物質(zhì)共價(jià)連接或組合施用，并在內(nèi)化入細(xì)胞并吸收到胞內(nèi)體后介導(dǎo)胞內(nèi)體逃逸。本文的術(shù)語(yǔ)“聚合體”的含義是指由兩個(gè)或多個(gè)彼此以共價(jià)鍵結(jié)合的單體單元構(gòu)成的任何化合物，其中所述的單體單元可以是相同或不同的，因此該聚合物可以是同聚物或雜聚物。代表性的聚合物包括肽類(lèi)、多糖、核酸等，其中所述聚合物可以是天然存在的或合成的。該遞送聚合物非限定性的實(shí)例例如INTERNATIONALJOURNALOFPHARMACEUTICALRESEARCHANDDEVELOPMENT,2010年10月/第2卷/第8期/文章編號(hào)-2中所綜述。用于遞送核酸的遞送聚合物的非限定性實(shí)例如EP申請(qǐng)10165502.5和10191030.5、PCT出版物WO2008/0022309和US臨時(shí)申請(qǐng)61/307490和其引用的文獻(xiàn)所公開(kāi)；所述內(nèi)容全部引入本文作為參考。如本文所用的“藥物組合物”包含本發(fā)明的綴合物、藥學(xué)載體或稀釋劑和制劑必需的任何其它介質(zhì)或試劑。如本文所用的“藥學(xué)載體”包含任何以及全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲試劑和吸收延遲試劑，以及生理學(xué)相容的其它試劑。優(yōu)選地，所述載體是適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、胃腸外、脊椎或表皮施用(例如經(jīng)注射或輸注)。本發(fā)明的綴合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法施用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，給藥途徑和/或模式根據(jù)所需結(jié)果而不同。通過(guò)某些給藥途徑施用本發(fā)明的綴合物時(shí)，必須將該綴合物用阻止其失活的物質(zhì)包衣或者與其組合施用。例如，該綴合物可以在合適的載體或稀釋劑中向個(gè)體施用。可藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥學(xué)載體包括無(wú)菌的水溶液或分散劑和用于即時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散劑的無(wú)菌粉末。此類(lèi)用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域已知的。如本文所用的短語(yǔ)“胃腸外施用”的含義是除了腸內(nèi)和局部施用以外的給藥模式，通常是經(jīng)注射施用，且非限定性的包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。這些載體還包含佐劑，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過(guò)滅菌的方法(如上文所述)以及包含多種抗菌和抗真菌試劑(例如對(duì)羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)來(lái)確保防止微生物的存在。該組合物中還期望包含等滲試劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可注射藥物劑型的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠獲得。除了所選擇的給藥途徑外，可以以合適的水合形式使用的本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物是按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法配制成可藥用的劑型。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平根據(jù)要獲得的活性成分的量而不同，該活性成分的量是對(duì)特定患者、組合物和給藥模式而言有效產(chǎn)生所期望的治療反應(yīng)且對(duì)患者無(wú)毒的量。所選擇的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括本發(fā)明所用的特定組合物的活性、施用途徑、施用時(shí)間、所用特定化合物的排泄率、治療持續(xù)時(shí)間、與所用特定化合物組合使用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)、患者年齡、性別、體重、病癥、一般身體狀況和以前的病史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)熟知的因素。藥物組合物必須是無(wú)菌的且具有一定程度的流動(dòng)性，使得該組合物可以經(jīng)注射進(jìn)行遞送。除了水以外，載體優(yōu)選地是等滲的緩沖鹽水溶液。例如，可以通過(guò)使用例如卵磷脂的包衣、通過(guò)保持分散體系中所需的顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選地在組合物中包含等滲試劑，例如糖類(lèi)、多元醇如甘露醇或山梨醇以及氯化鈉。附圖說(shuō)明圖1顯示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA綴合物和遞送聚合物的體內(nèi)組合施用。圖2顯示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA綴合物和遞送聚合物的體內(nèi)組合施用。圖3顯示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA綴合物和遞送聚合物的體內(nèi)組合施用。圖4顯示了包含式(I)或(Ia)化合物的siRNA綴合物和遞送聚合物的體內(nèi)組合施用。圖5a顯示了帶有全部2’-修飾的反義鏈介導(dǎo)的siRNA的基因沉默。將COS7細(xì)胞用EGFP-定向的siRNA在3nM和psiCHECK2-AT進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。通過(guò)從報(bào)告基因構(gòu)建體檢測(cè)花蟲(chóng)(renilla)相對(duì)于熒火蟲(chóng)熒光素酶的活性來(lái)評(píng)價(jià)siRNA的敲減活性。siRNA通過(guò)未修飾的(2-19-2)參照siRNA的敲減活性進(jìn)行分類(lèi)。圖5b顯示了帶有全部2’-修飾的有義鏈介導(dǎo)的siRNA的基因沉默。將COS7細(xì)胞用EGFP-定向的siRNA在3nM和psiCHECK2-AT進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。通過(guò)從報(bào)告基因構(gòu)建體檢測(cè)熒光素酶表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)siRNA的敲減活性。siRNA通過(guò)未修飾的(2-19-2)參照siRNA的敲減活性進(jìn)行分類(lèi)。圖6a顯示了在非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)中靜脈注射多種與遞送聚合體共價(jià)連接的2’-修飾siRNA后血清FVII活性降低。圖6b顯示了在非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)中用與遞送聚合體共價(jià)綴合的2’-修飾siRNA處理后凝血酶原時(shí)間的發(fā)展。具體實(shí)施方式通過(guò)參考以下實(shí)施例能夠更加完全地理解本發(fā)明。但是，它們并不解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1步驟1:3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基胺該標(biāo)題胺是從其腈前體按照文獻(xiàn)方法[Lollo等人,WO2001/070415]制備。步驟2:N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基}-琥珀酰胺酸(succinamicacid)在一個(gè)2L的圓底燒瓶中，將3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙-1-胺(21.15g,47.7mmol,當(dāng)量：1.00)和Huenig堿(12.3g,16.6ml,95.3mmol,當(dāng)量：2.00)用AcOEt(845ml)合并，得到無(wú)色溶液。加入二氫呋喃-2,5-二酮(4.77g,47.7mmol,當(dāng)量：1.00)在THF(42ml)中的溶液，并將該反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜＝>白色混懸液。真空除去全部揮發(fā)物，將殘余物溶于CH2Cl2，并將有機(jī)層用NH4Cl和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干。將粗的產(chǎn)物溶于CH3CN/H2O，并凍干，得到29.8g標(biāo)題化合物，為松散粉末。MS(ISP):(M-H)542.5。步驟3:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-3-(4-硝基苯基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺在10mL圓底燒瓶中，將上文制備的4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酸(106mg,184μmol,當(dāng)量：1.00)、(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)己酰胺(132mg,184μmol,當(dāng)量：1.00)、HOAt(25.0mg,184μmol,當(dāng)量：1.00)和EDC鹽酸化物(35.3mg,184μmol,當(dāng)量：1.00)一起在CH2Cl2(1.8ml)中混合，得到黃色溶液。加入Huenig堿(47.5mg,64.2μl,368μmol,當(dāng)量：2.00)，并將該反應(yīng)物在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜。TLC指示起始原料消耗。真空除去全部揮發(fā)物，并將粗的產(chǎn)物經(jīng)快速色譜SiO2/7％MeOH/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液純化，得到128mg標(biāo)題化合物，為淺黃色固體。MS:預(yù)期質(zhì)量：1240.7552,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1240.7518。步驟4:在10mL圓底燒瓶中，將上文制備的N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-3-(4-硝基苯基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺(126mg,101μmol,當(dāng)量：1.00)和Huenig堿(39.3mg,53.2μl,304μmol,當(dāng)量：3.00)用CH2Cl2(1.4ml)和DMF(1.0ml)合并，得到黃色混懸液；加入二(4-硝基苯基)碳酸酯(46.3mg,152μmol,當(dāng)量：1.50)，并將該反應(yīng)進(jìn)行過(guò)夜。將該混合物倒在碎冰上，用AcOEt萃取兩次，用H2O洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干。用～10ml乙醚研磨，得到99mg標(biāo)題產(chǎn)物，為灰白色固體。MS:預(yù)期質(zhì)量：1405.7614,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1405.7518。按照以下方法制備用于步驟3的必需的二肽結(jié)構(gòu)單元：步驟a:(S)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(4-硝基-苯基)-丙?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸在25mL圓底燒瓶中該，將(S)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基-氨基)己酸(BioconjugateChem.2002,13,855-869,968mg,2.31mmol,當(dāng)量：1.00)溶于CH2Cl2(20ml)中，得到淺黃色溶液。加入Huenig堿(897mg,1.21ml,6.94mmol,當(dāng)量：3.00)和三甲基氯硅烷(528mg,621μl,4.86mmol,當(dāng)量：2.10)，并將該反應(yīng)混合物攪拌15分鐘。在第二個(gè)50mL圓底燒瓶中，將(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸(1g,2.31mmol,當(dāng)量：1.00)溶于DMF(20ml)中，得到無(wú)色溶液。加入Huenig堿(359mg,485μl,2.78mmol,當(dāng)量：1.20)和TPTU[125700-71-2](687mg,2.31mmol,當(dāng)量：1.00)，并將反應(yīng)混合物攪拌20′。加入裝有對(duì)應(yīng)的甲硅烷基酯單甲硅烷基胺的第一個(gè)燒瓶中的溶液，并該反應(yīng)物再另外攪拌3小時(shí)。將該混合物倒在碎冰/NH4Cl上，用AcOEt萃取兩次，用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干。快速色譜法SiO2/10％MeOH/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到1.38g標(biāo)題化合物，為褐色泡沫。MS(ISP):(M+H)833.5,(M+Na)855.4。步驟b:[(S)-1-((S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲酰基)-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲?；?-2-(4-硝基-苯基)-乙基]-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯在250mL梨形燒瓶中，將上文合成的(S)-2-((S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酰胺基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酸(1.38g,1.66mmol,當(dāng)量：1.00)、(4-氨基苯基)甲醇(204mg,1.66mmol,當(dāng)量：1.00)、HOAt(226mg,1.66mmol,當(dāng)量：1.00)和EDC鹽酸化物(318mg,1.66mmol,當(dāng)量：1.00)溶于CH2Cl2(16.6ml)中，得到黃色溶液。加入Huenig堿(428mg,579μl,3.31mmol,當(dāng)量：2.00)，并將該反應(yīng)進(jìn)行過(guò)夜。將該混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～7)上，用AcOEt萃取2次，用H2O洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干。將粗的產(chǎn)物用乙醚(1x50mL)研磨；濾出所得固體，并干燥，得到1.214g標(biāo)題化合物，為淺褐色固體。MS(ISP):(M+H)938.7。步驟c:(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-硝基-苯基)-丙?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺在50mL圓底燒瓶中，將上文制備的[(S)-1-((S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲?；?-2-(4-硝基-苯基)-乙基]-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(1.214g,1.29mmol,當(dāng)量：1.001)與THF(19ml)合并，得到褐色溶液。在0°，加入二乙胺(1.77g,2.49ml,24.2mmol,當(dāng)量：18.70)。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下攪拌3h，直至MS指示起始原料消失。真空蒸發(fā)全部揮發(fā)物；接著進(jìn)行快速色譜SiO2/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液＝>10％MeOH/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液，然后第二次快速色譜SiO2/5％MeOH/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到502mg標(biāo)題化合物，為淺褐色泡沫。MS:預(yù)期質(zhì)量：715.337,實(shí)測(cè)質(zhì)量：715.3362。實(shí)施例2O-芐基-N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-酪氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-芐基氧基-苯基)-丙酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-(芐基氧基)苯基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1466.8182,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1466.8136。實(shí)施例3N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-4-氰基-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-氰基-苯基)-丙?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-氰基苯基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1385.7716,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1385.7696。實(shí)施例43,4-二氯-N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(3,4-二氯-苯基)-丙?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(3,4-二氯苯基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1428.6984,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1428.695。實(shí)施例54-氯-N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-氯苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)-羰基氨基)-3-(4-氯苯基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1394.7373,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1394.7342。實(shí)施例64-{[(2S)-2-{[(2S)-2-[(4-{[3-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚-2-基]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基}氧基)丙基]氨基}-4-氧代丁?；?氨基]-3-(萘-1-基)丙酰基]氨基}-6-{[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]氨基}己?；鵠氨基}芐基4-硝基苯基碳酸酯(非優(yōu)選的命名)按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-((S)-2-氨基-3-萘-1-基-丙?；被?-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-1-基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1410.792,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1410.7918。實(shí)施例7N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-4-氟-L-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(4-氟-苯基)-丙?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)-己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1378.7669,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1378.7609。實(shí)施例8N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-2-氟-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(2-氟-苯基)-丙?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)-己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(2-氟苯基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1378.7669,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1378.7689。實(shí)施例9N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-3-氟-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-[(S)-2-氨基-3-(3-氟-苯基)-丙?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)-己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(3-氟苯基)丙酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1378.7669,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1378.7659。實(shí)施例10步驟1:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(4-氟苯基)-4-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-4-氧代丁-2-基)琥珀酰胺在10mL圓底燒瓶中，將上文制備的4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酸(109mg,188μmol,當(dāng)量：1.00)、(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺(132mg,188μmol,當(dāng)量：1.00)、HOAt(25.6mg,188μmol,當(dāng)量：1.00)和EDC鹽酸化物(36.1mg,188μmol,當(dāng)量：1.00)在CH2Cl2(2ml)中一起混合，得到黃色溶液。加入Huenig堿(48.7mg,64.1μl,377μmol,當(dāng)量：2.00)，并將該反應(yīng)物在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜。TLC指示起始原料消耗。真空除去全部揮發(fā)物，并將粗的產(chǎn)物經(jīng)快速色譜法SiO2/5％MeOH/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液純化，得到197mg標(biāo)題化合物，為灰白色固體。MS:預(yù)期質(zhì)量：1227.7763,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1227.7714。步驟2:4-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-4-(4-氟苯基)丁酰胺基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)己酰胺基)-芐基4-硝基苯基碳酸酯在10mL圓底燒瓶中，將上文制備的N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(4-氟苯基)-4-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-4-氧代丁-2-基)琥珀酰胺(196mg,160μmol,當(dāng)量：1.00)和Huenig堿(61.9mg,81.4μl,479μmol,當(dāng)量：3.00)用CH2Cl2(1.6ml)和DMF(0.8ml)合并，得到黃色混懸液；加入二(4-硝基苯基)碳酸酯(72.8mg,239μmol,當(dāng)量：1.50)，并將該反應(yīng)在環(huán)境溫度下進(jìn)行過(guò)夜。將該混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～6)上，用AcOEt萃取2次，用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干。用AcOEt/庚烷研磨后，得到123mg標(biāo)題化合物，為淺黃色固體。MS:預(yù)期質(zhì)量：1392.7825,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1392.7819。用于步驟1的必需的二肽結(jié)構(gòu)單元按照以下方法制備：步驟a:(S)-2-[(S)-3-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-(4-氟-苯基)-丁?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸在25mL圓底燒瓶中，將(S)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基-氨基)己酸(BioconjugateChem.2002,13,855-869,1040mg,2.48mmol,當(dāng)量：1.00)溶于CH2Cl2(12.5ml)中，得到淺黃色溶液。加入Huenig堿(961mg,1.27ml,7.44mmol,當(dāng)量：3.00)和三甲基氯硅烷(566mg,621μl,5.21mmol,當(dāng)量：2.10)，并將該反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌20分鐘。在第二個(gè)50mL圓底燒瓶中，將(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基-氨基)-4-(4-氟苯基)丁酸(1040mg,2.48mmol,當(dāng)量：1.00)溶于DMF(12.5ml)，得到無(wú)色溶液。加入Huenig堿(385mg,506μl,2.98mmol,當(dāng)量：1.20)和TPTU[125700-71-2](737mg,2.48mmol,當(dāng)量：1.00)，并將該反應(yīng)混合物攪拌15分鐘。加入裝有對(duì)應(yīng)的甲硅烷基酯單甲硅烷基胺的第一個(gè)燒瓶中的溶液，并將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下再另外攪拌3小時(shí)。將該混合物倒在碎冰/NH4Cl上，用AcOEt萃取兩次，用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干?？焖偕V法SiO2/5％MeOH/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到2.10g標(biāo)題化合物，為黃色泡沫。MS(ISP):(M+H)820.6。步驟b:{(S)-2-(4-氟-苯基)-1-[((S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲?；?-甲基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯在250mL梨形燒瓶中，將上文合成的{(S)-2-(4-氟-苯基)-1-[((S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲酰基)-甲基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(2.10g,2.56mmol,當(dāng)量：1.00)、(4-氨基苯基)甲醇(315mg,2.55mmol,當(dāng)量：1.00)、HOAt(349mg,2.56mmol,當(dāng)量：1.00)和EDC鹽酸化物(491mg,2.56mmol,當(dāng)量：1.00)溶于CH2Cl2(12.5ml)中。加入Huenig堿(662mg,871μl,5.21mmol,當(dāng)量：2.00)，并將該反應(yīng)進(jìn)行過(guò)夜。將該混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～7)上，用AcOEt萃取2次，用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干。將粗的產(chǎn)物用乙醚(1x50mL)研磨；濾出所得固體，并干燥，得到0.796g標(biāo)題化合物，為淺褐色固體。MS(ISP):(M+H)925.6。步驟c:(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁酰基氨基]-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺在50mL圓底燒瓶中，將上文制備的{(S)-2-(4-氟-苯基)-1-[((S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-5-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-戊基氨甲?；?-甲基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(793mg，857mol，當(dāng)量：1.001)與THF(12ml)合并，得到褐色溶液。在0°，加入二乙胺(1.13g,1.59ml,15.4mmol,當(dāng)量：18)。將反應(yīng)物在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜。將該混合物倒在碎冰/NH4Cl(pH～7)上，用AcOEt萃取2次，用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干。快速色譜SiO2/10％MeOH/0.1％NEt3在CH2Cl2中的溶液，得到500mg標(biāo)題化合物，為灰白色固體。MS:預(yù)期質(zhì)量：702.3581,實(shí)測(cè)質(zhì)量：702.3578。實(shí)施例114-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)己酰胺基)芐基4-硝基苯基碳酸酯按照與實(shí)施例10類(lèi)似的方法制備，但是在步驟1中用(S)-2-((S)-3-氨基-4-苯基丁酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-苯基丁酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1374.792,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1374.7877。實(shí)施例124-({N～2～-[(3S)-4-(4-氯苯基)-3-{[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠氨基}丁酰基]-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-L-賴(lài)氨?；鶀氨基)芐基4-硝基苯基碳酸酯按照與實(shí)施例10類(lèi)似的方法制備，但是在步驟1中用(S)-2-((S)-3-氨基-4-(4-氯苯基)丁酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)-二苯基甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(4-氯苯基)-丁酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS(ISP):(M+H)1409.9。實(shí)施例13N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-O-甲基-L-酪氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)-二苯基甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-甲氧基苯基)丙酸如上文實(shí)施例1的步驟a]–c]中所述制備。MS(ISP):(M+H)1391.9。實(shí)施例14N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-D-苯丙氨酰基-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-D-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例1類(lèi)似的方法制備，但是在步驟3中用(R)-2-((R)-2-氨基-3-苯基-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-己酰胺代替(S)-2-((S)-2-氨基-3-(4-硝基苯基)-丙酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺，作為偶聯(lián)配體。該結(jié)構(gòu)單元是從(R)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-氨基己酸和(R)-2-氨基-6-((4-甲氧基苯基)-二苯基甲基氨基)己酸(參見(jiàn)BioconjugateChem.2002,13,885-869)按上文步驟a]–c]中所述方法合成。MS:預(yù)期質(zhì)量：1360.7763,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1360.7774。實(shí)施例154-({N～2～-[(3S)-3-{[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]氨基}-4-(4-氰基苯基)丁?；鵠-N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-L-賴(lài)氨?；鶀氨基)芐基4-硝基苯基碳酸酯按照與實(shí)施例10類(lèi)似的方法制備，但是在步驟1中用(S)-2-((S)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)丁酰胺基)-N-(4-(羥基甲基)苯基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基-甲基氨基)己酰胺代替(S)-2-[(S)-3-氨基-4-(4-氟-苯基)-丁?；被鵠-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺，作為偶聯(lián)配體。前者是從(S)-3-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-4-(4-氰基苯基)丁酸按上文步驟a]–c]中所述制備。MS:預(yù)期質(zhì)量：1399.7872,實(shí)測(cè)質(zhì)量：1399.7857。實(shí)施例16N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺步驟1:(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙酰基氨基)-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺結(jié)構(gòu)單元(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙?；被?-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺是按照與BioconjugateChem.,Vol.13,No.4,2002,855-869中所述類(lèi)似的方法制備。MS(ISP):(M+H)671.5步驟2:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-6-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺將TPTU[125700-71-2](233mg,784μmol,當(dāng)量：1.00)加入N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基}-琥珀酰胺酸(參見(jiàn)實(shí)施例1,步驟2)(426mg,0.784mmol,當(dāng)量：1.00)和Huenig堿(304mg,411μl,2.35mmol,當(dāng)量：3)在DMF(10ml)的溶液中。3分鐘后，加入(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙?；被?-6-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]-氨基}-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺(步驟1)，在t＝1h時(shí)，TLC顯示反應(yīng)完全。減壓除去溶劑。將剩余殘余物溶于乙酸乙酯中，并用NaHCO3半飽和溶液(1X)、鄰苯二甲酸氫鉀溶液0.05M(2X)、水(1X)和鹽水(1X)萃取。將有機(jī)萃取物用MgSO4干燥，并減壓濃縮。將粗的物質(zhì)經(jīng)快速色譜法純化，得到標(biāo)題產(chǎn)物(682mg,513,μmol)，為淺褐色固體。MS(ISP):(M+H)1196.8步驟3:將Huenig堿(465mg,629μl,3.6mmol,當(dāng)量：6)加入前述的醇(718mg,600μmol,當(dāng)量：1.00)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(548mg,1.8mmol,當(dāng)量：3)在THF(20ml)的溶液中。將該黃色溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。減壓除去溶劑。將剩余殘余物用乙醚研磨。經(jīng)過(guò)濾收集固體，用乙醚洗滌并減壓干燥，得到標(biāo)題化合物(800mg,529μmol)，為淺褐色固體。MS(ISP):(M+H)1361.9實(shí)施例17步驟1(S)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-苯基-丙?；被鵠-己酸將市場(chǎng)可獲得的L-Fmoc-Phe-OSu(0.969g,2.00mmol,當(dāng)量：1.00)懸浮于1,2-二甲氧基乙烷和水(17ml)的1:1v/v混合物中，并在0℃用L-正亮氨酸(0.275g,2.10mmoll,當(dāng)量：1.05)和NaHCO3(0.185g,2.20mmol,當(dāng)量：1.10)處理。移去冷卻浴，并將反應(yīng)在環(huán)境溫度下進(jìn)行14小時(shí)。將該混合物倒在碎冰/檸檬酸(pH～3)上，用乙酸乙酯萃取2次，用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，并蒸發(fā)至干?？焖偕V法SiO2/AcOEt純化，得到0.870mg標(biāo)題化合物，為白色固體。MS(ISP):(M+H)501.2。步驟2:{(S)-1-[(S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-戊基氨甲?；鵠-2-苯基-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯在梨形燒瓶中，將上文合成的(S)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基-羰基氨基)-3-苯基-丙?；被鵠-己酸(10.72g,21mmol,當(dāng)量：1.00)、(4-氨基苯基)甲醇(2.717g,22mmol,當(dāng)量：1.03)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)(7.994g,32mmol,當(dāng)量：1.50)溶于CH2Cl2(320ml)中，并在氬氣中攪拌過(guò)夜。將該混合物倒在碎冰/NH4Cl上，用AcOEt萃取2次，用H2O洗滌，用Na2SO4干燥，并將體積濃縮至～300ml。濾出沉淀，并干燥，得到5.25g標(biāo)題化合物，為淺褐色固體。MS(ISP):(M+H)606.3。步驟3:(S)-2-((S)-2-氨基-3-苯基-丙?；被?-己酸(4-羥基甲基-苯基)-酰胺在圓底燒瓶中,將上文制備的{(S)-1-[(S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲酰基)-戊基氨甲?；鵠-2-苯基-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(4.738g,7.822mmol,當(dāng)量：1.0)溶于CH2Cl2(28ml)。在0°，加入二乙胺(28ml,19.80g,271mmol,當(dāng)量：35)，并將該反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜。真空蒸發(fā)除去全部揮發(fā)物；然后進(jìn)行快速色譜SiO2/CH2Cl2/10％MeOH純化，接著從AcOEt中結(jié)晶，得到2.116g標(biāo)題化合物，為淺褐色晶體。MS(ISP):(M+H)384.2。步驟4N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-1-氧代己-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例16中步驟2類(lèi)似的方法制備。MS(ISP):(M+H)909.7(M+Na)931.8。步驟5N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-苯丙氨?；?N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-正賴(lài)氨酸酰胺按照與實(shí)施例16中步驟3類(lèi)似的方法制備。MS預(yù)期質(zhì)量：1073.6453,實(shí)測(cè)值1073.642實(shí)施例18N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-丙氨?；?N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加入2-氯三苯甲基樹(shù)脂中將2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(Novabiochem01-64-0114,100-200目)、1％DVB(18g,21.6mmol,當(dāng)量：1.00)在DCM/DMF＝1/1(300mL)中溶脹10分鐘。將該樹(shù)脂排干，并加入FMOC-4-氨基芐基醇(14.9g,43.2mmol,當(dāng)量：2)和吡啶(6.83g,6.99ml,86.4mmol,當(dāng)量：4)在DCM/DMF＝1/1(300mL)中的溶液。將該混合物振搖過(guò)夜。將樹(shù)脂排干，并用10％Huenig堿在甲醇中的溶液(300mL)封端。將該樹(shù)脂用DMF和DCM洗滌，并用HV干燥過(guò)夜，得到21.7g樹(shù)脂。載樣量測(cè)定為0.41mmoL/g。步驟2:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺將從步驟1中得到的樹(shù)脂(1g,410μmol,當(dāng)量：1.00)用DMF預(yù)洗滌(2X)，并用哌啶/DMF＝1/4(10mL)處理5和10分鐘。將該樹(shù)脂用DMF和IPA(3X10mL)輪流洗滌。將Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)、TPTU(487mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Huenig堿(636mg,859μl,4.92mmol,當(dāng)量：12)在DMF(10mL)中的溶液攪拌5分鐘，并隨后用樹(shù)脂振搖一小時(shí)。將該樹(shù)脂用DMF和異丙基醇(3X)輪流洗滌。然后進(jìn)行以下Fmoc裂解和隨后的Fmoc-Ala-OH(511mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基]-丙基}-琥珀酰胺酸(實(shí)施例1,步驟2)(892mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)的偶聯(lián)。將干燥的肽樹(shù)脂在TFA1％/DCM(2X20mL)中攪拌大約2X30分鐘。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并將樹(shù)脂用DCM洗滌。將濾液合并，并在真空下蒸發(fā)溶劑。將粗的物質(zhì)用乙醚研磨(2x)。經(jīng)快速色譜法純化后，得到產(chǎn)物(84mg,97.3μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：776.5452,實(shí)測(cè)值776.5455步驟3:在氬氣中將上文制備的醇N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺[RO5545270](70mg,90.1μmol,當(dāng)量：1.00)和二(4-硝基苯基)碳酸酯(137mg,450μmol,當(dāng)量：5)在室溫下溶于DMF(4ml)，并用Huenig堿(34.9mg,47.2μl,270μmol,當(dāng)量：3)處理，并將該混合物反應(yīng)過(guò)夜。真空除去溶劑。將所得固體用乙醚研磨。經(jīng)過(guò)濾收集固體，并用乙醚洗滌。將產(chǎn)物真空干燥，得到標(biāo)題化合物(84mg,80.2μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：941.5514,實(shí)測(cè)值941.5518實(shí)施例19N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-亮氨?；?N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-甲硫氨酸酰胺(methioninamide)步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備。步驟2N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-4-(甲硫基)-1-氧代丁-2-基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，使用Fmoc-Met-OH(609mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(208mg,210μmol)，為淺黃色固體。MS(ISP):(M+H)893.6183步驟3按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備。在硅膠上純化后，得到標(biāo)題化合物(161mg,137μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：1057.6174,實(shí)測(cè)值1057.6184實(shí)施例20N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-亮氨?；?N～1～-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-天冬酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備。步驟2(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-4-甲基戊酰胺基)-N1-(4-(羥基甲基)苯基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，使用Fmoc-Asn-OH(581mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(87mg,89.4μmol)，為淺黃色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：875.6136,實(shí)測(cè)值875.6133步驟3按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物。在硅膠純化后得到標(biāo)題化合物(87mg,89.4μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：1040.6198,實(shí)測(cè)值1040.6188實(shí)施例21N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-丙氨?；?N～1～-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-天冬酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備。步驟2(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)丙酰胺基)-N1-(4-(羥基甲基)苯基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，使用Fmoc-Asn-OH(581mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Fmoc-Ala-OH(511mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(140mg,159μmol)，為淺黃色固體。MS(ISP):(M+H)834.8(M+Na)856.7步驟3按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物。在硅膠純化后得到標(biāo)題化合物(169mg,152μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：998.5729,實(shí)測(cè)值998.5739實(shí)施例22N～2～-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-天冬酰胺?；?N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備步驟2(S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-N1-(2-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，使用Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Fmoc-Asn-OH(581mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(140mg,162μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：819.551,實(shí)測(cè)值819.5503步驟3:按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物(176mg,161μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：984.5572,實(shí)測(cè)值984.5489實(shí)施例23N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨?；?N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備。步驟2:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，使用Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Fmoc-Phe-OH(635mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(259mg,288μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：852.5765,實(shí)測(cè)值852.5754步驟3按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法獲得標(biāo)題化合物(280mg,247μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：1017.5827,實(shí)測(cè)值1017.5775實(shí)施例24N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-亮氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]甘氨酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備。步驟2N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-(2-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，使用Fmoc-Gly-OH(488mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(240mg,278μmol)，為淺黃色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：818.5921,實(shí)測(cè)值818.5921步驟3按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物。硅膠純化后得到產(chǎn)物(194mg,177μmol)，為淺黃色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：983.5983實(shí)測(cè)值983.6004實(shí)施例25N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-亮氨?；?N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-苯基丙氨酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備。步驟2N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，使用Fmoc-Phe-OH(635mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)和Fmoc-Leu-OH(580mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(153mg,151μmol)，為淺黃色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：908.6391實(shí)測(cè)值908.637步驟3:按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物。在硅膠上純化后得到產(chǎn)物(117mg,98μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：1073.6453實(shí)測(cè)值1073.646實(shí)施例26N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨?；?N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-苯基丙氨酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法制備。步驟2N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，用Fmoc-Phe-OH(635mg,1.64mmol,當(dāng)量：4)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(240mg,204μmol)，為淺黃色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：942.6234實(shí)測(cè)值942.6218步驟3:按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物。在硅膠上純化后得到產(chǎn)物(190mg,154μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：1107.6296實(shí)測(cè)值1107.6287實(shí)施例27N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-亮氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-亮氨酰胺步驟1:將FMOC-4-氨基芐基醇加到2-氯三苯甲基樹(shù)脂中按照與實(shí)施例18中步驟1類(lèi)似的方法進(jìn)行。步驟2N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例18中步驟2類(lèi)似的方法制備，用Fmoc-Leu-OH(1.59g,4.5mmol,當(dāng)量：3)作為氨基酸。得到產(chǎn)物(254mg,284μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：874.6547實(shí)測(cè)值874.6527步驟3按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物。在硅膠上純化后得到產(chǎn)物(178mg,168μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：1039.6609實(shí)測(cè)值1039.6588實(shí)施例28N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-丙氨酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺步驟1{(S)-1-[(S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-乙基氨甲酰基]-乙基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯將Fmoc-Ala-Ala-OH(1g,2.61mmol,當(dāng)量：1.00)和(4-氨基苯基)甲醇(483mg,3.92mmol,當(dāng)量：1.5)在THF(20ml)中的溶液用EEDQ(970mg,3.92mmol,當(dāng)量：1.5)處理。將該溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。將該混合物用10％2-丙醇/乙酸乙酯(100mL)稀釋?zhuān)⒃撊芤河肒HSO45％/K2SO410％(2X)、水(1X)和鹽水(1X)洗滌，用MgSO4干燥，并真空蒸發(fā)。將殘余物在乙醚中超聲處理幾分鐘，并經(jīng)過(guò)濾收集固體，得到產(chǎn)物(1.27g,1.2mmol)，為淺褐色固體。MS(ISP):(M+H)488.3步驟2:(S)-2-氨基-N-[(S)-1-(4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-乙基]-丙酰胺按照與實(shí)施例1中步驟c類(lèi)似的方法制備該化合物，得到產(chǎn)物(245mg,877μmol)，為淺黃色固體。MS(ISP):(M+H)266.3,(M+Na)288.2(2M+H)531.3步驟3:N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(羥基甲基)苯基氨基)-1-氧代丙-2-基氨基)-1-氧代丙-2-基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例16中步驟2類(lèi)似的方法制備該化合物(165mg,198μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：790.5608,實(shí)測(cè)值790.5587步驟4按照與實(shí)施例18中步驟3類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物。在硅膠上純化后得到產(chǎn)物(99mg,98.4μmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：955.567,實(shí)測(cè)值955.5651實(shí)施例29N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁?；鵠-L-異亮氨酰基-N～1～-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-天冬酰胺步驟1(S)-2-[(2S,3S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-戊?；被鵠-琥珀酰胺酸將2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(5g,7.5mmol,當(dāng)量：1.00)在DCM中溶脹，并隨后用Fmoc-Asn(Trt)-OH(8.95g,15.0mmol,當(dāng)量：2)和Huenig堿(3.88g,5.1ml,30.0mmol,當(dāng)量：4)在DCM中的溶液處理過(guò)夜。將該樹(shù)脂用DCM洗滌，并用10％Huenig堿的甲醇溶液封端。按照標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方法進(jìn)行Fmoc-Ile-OH(5.3g,15.0mmol,當(dāng)量：2)與TPTU(4.46g,15.0mmol,當(dāng)量：2)和Huenig堿(3.88g,5.1ml,30.0mmol,當(dāng)量：4)的偶聯(lián)反應(yīng)。室溫下用TFA/水/三異丙基硅烷(95/2.5/2.5v/v/v)的組合試劑將產(chǎn)物從樹(shù)脂上切割持續(xù)兩小時(shí)。濾出樹(shù)脂，并將濾液減壓濃縮至少量體積。用乙醚研磨后，將產(chǎn)物過(guò)濾并真空干燥，得到產(chǎn)物(2.85g,5.79mmol)，為白色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：467.2056,實(shí)測(cè)值467.2056步驟2{(1S,2S)-1-[2-氨甲酰基-1-((S)-4-羥基甲基-苯基氨甲?；?-乙基氨甲酰基]-2-甲基-丁基}-氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯按照與實(shí)施例28中步驟1類(lèi)似的方法制備該化合物(620mg,336μmol)，為淺黃色固體。步驟3(S)-2-((2S,3S)-2-氨基-3-甲基-戊?；被?-N*1*-(4-羥基甲基-苯基)-琥珀酰胺按照與實(shí)施例1中步驟c類(lèi)似的方法制備該化合物(100mg,228μmol)，為淺黃色固體。步驟4(S)-2-((2S,3S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基)丙基氨基)-4-氧代丁酰胺基)-3-甲基戊酰胺基)-N1-(4-(羥基甲基)苯基)琥珀酰胺按照與實(shí)施例16中步驟2類(lèi)似的方法制備該化合物(89mg,91.4μmol)，為淺黃色固體。步驟5將上述步驟獲得的化合物按照類(lèi)似于實(shí)施例18中步驟3的反應(yīng)得到標(biāo)題化合物。在硅膠上純化后得到產(chǎn)物(42mg,36.3μmol)，為淺褐色固體。MS預(yù)期質(zhì)量：1040.6198,實(shí)測(cè)值1040.6177實(shí)施例30N-[4-({3-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]丙基}氨基)-4-氧代丁酰基]-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-D-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例16中步驟1類(lèi)似的方法從Fmoc-D-Lys(Boc)-OH開(kāi)始制備該化合物(158mg,116μmol)，為淺褐色固體。MS(ISP):(M+H)1362.8(M+Na)1383.8實(shí)施例31N-{15-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]-4,15-二氧代-8,11-二氧雜-5,14-二氮雜十五烷-1-?；鶀-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例16類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物，在合成方法的步驟2中使用膽固醇-寡-PEG衍生物。MS(ISP):(M+H)1479.8步驟2中必需的膽固醇-PEG中間體N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-琥珀酰胺酸按照以下制備：步驟a:{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基酯將氯甲酸膽固醇基酯(1g,2.23mmol)在25mL二氯甲烷中的溶液在攪拌中逐滴加入2,2'-(亞乙二氧基)二-(乙基胺)(495mg,3.34mmol)在75mL二氯甲烷的溶液中。將該反應(yīng)物在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)物用二氯甲烷稀釋?zhuān)⒂盟腿　⒂袡C(jī)萃取物用無(wú)水MgSO4二水合物干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。在氨基修飾的硅膠(洗脫劑：MeCl2->MeCl2/MeOH＝975:25v/v)上純化后，得到產(chǎn)物(615mg)，為白色蠟質(zhì)固體。MS(ISP):(M+H)561.5步驟b:N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-琥珀酰胺酸將來(lái)自步驟a中的胺(480mg,0.856mmol)和三乙胺(0.13mL,0.94mmol)溶于5mL二氯甲烷。將琥珀酸酐(90mg,0.9mmol)加入該溶液后，在室溫下攪拌過(guò)夜。TLC檢測(cè)顯示仍有部分起始原料。加入更多的琥珀酸酐(20mg,0.2mmol)。將該反應(yīng)物在室溫下再另外攪拌3小時(shí)后，將其用二氯甲烷稀釋?zhuān)⒂?％KHSO4/10％K2SO4混合物洗滌。將有機(jī)萃取物用無(wú)水MgSO4二水合物干燥，過(guò)濾并真空蒸發(fā)，得到所需酸(490mg,0.667mmol)。MS(ISP):(M+H)661.5實(shí)施例32N-{30-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]-4,30-二氧代-8,11,14,17,20,23,26-七氧雜-5,29-二氮雜三十烷-1-?；鶀-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例16類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物，在合成方法的步驟2中使用膽固醇-PEG衍生物。MS(ISP):(M+H)1699.9步驟2中必需的膽固醇-PEG中間體1-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]-1,27-二氧代-5,8,11,14,17,20,23-七氧雜-2,26-二氮雜三十烷-30-酸按照以下步驟制備：步驟a:[25-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚-2-基]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環(huán)戊二烯并[a]菲-3-基}氧基)-25-氧代-3,6,9,12,15,18,21-七氧雜-24-氮雜二十五烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯將氯甲酸膽固醇基酯(476mg,1.06mmol)和三乙胺(155uL,1.113mmol)溶于5mL二氯甲烷。隨后加入α-氨基-ω-boc-氨基-八(乙二醇)(497mg,1.06mmol)溶于1mL二氯甲烷中的溶液。將該溶液在室溫下攪拌過(guò)夜，并用二氯甲烷稀釋?zhuān)⒂肒HSO45％/K2SO410％水性混合物萃取。將有機(jī)萃取物用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾并真空蒸發(fā)。在硅膠上(洗脫劑：MeCl2/MeOH＝975:25->95:5v/v)純化后得到產(chǎn)物(530mg,0.571mmol)，為無(wú)色油狀物。MS(ISP):(M+NH4)898.7步驟b:1-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]-1,27-二氧代-5,8,11,14,17,20,23-七氧雜-2,26-二氮雜三十烷-30-酸將上述Boc衍生物(450mg,0.511mmol)溶于HCl4M在二噁烷的溶液(10.2mL,40.9mmol)中。將該溶液在室溫下攪拌40分鐘。真空除去溶劑，并將剩余白色固體溶于5mL二氯甲烷中，并用三乙胺(32uL,0.229mmol)和琥珀酸酐(11.5mg,0.114mmol)處理過(guò)夜。加入更多的琥珀酸酐(11mg,0.11mmol,0.2當(dāng)量)，并在60分鐘后，將該反應(yīng)物用二氯甲烷稀釋?zhuān)肒HSO45％/K2SO410％緩沖液洗滌。將有機(jī)萃取物用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)，得到390mg所需產(chǎn)物。MS(ISP):(M+H)881.7實(shí)施例33N-{66-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]-4,66-二氧代-8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62-十九氧雜-5,65-二氮雜六十六碳烷-1-酰基}-L-苯丙氨?；?N～6～-[(4-甲氧基苯基)(二苯基)甲基]-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-賴(lài)氨酰胺按照與實(shí)施例16類(lèi)似的方法制備標(biāo)題化合物，在合成方法的步驟2中使用膽固醇-PEG衍生物。MS(ISP):(M+H)2228.1步驟2中必需的膽固醇-PEG中間體1-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]-1,63-二氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-十九氧雜-2,62-二氮雜六十六烷-66-酸按照以下步驟制備：步驟a:(59-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57十九氧雜五十九烷-1-基)氨基甲酸(3β)-膽甾-5-烯-3-基酯將α,ω-二-氨基20(乙二醇)(538mg,0.6mmol)和三乙胺(92uL,0.66mmol)溶于15mL無(wú)水二氯甲烷中。室溫下逐滴加入氯甲酸膽固醇基酯(270mg,0.6mmol)在2mL無(wú)水二氯甲烷中的溶液。將該溶液攪拌過(guò)夜，隨后真空濃縮至少量體積，并直接在硅膠上純化(洗脫劑：MeCl2/MeOH＝95:5->9:4->4:1v/v)，得到產(chǎn)物(350mg,0.254mmol)，為蠟質(zhì)固體。MS(ISP):(M+H)1309.9步驟b:1-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]-1,63-二氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-十九氧雜-2,62-二氮雜六十六烷-66-酸將來(lái)自步驟a的胺(329mg,0.251mmol)、琥珀酸酐(26.4mg,0.264mmol)和三乙胺(40uL,0.286mmol)溶于5mL無(wú)水二氯甲烷中。加入更多的三乙胺(40uL,0.286mmol)后，將該溶液(pH>8)在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)物用二氯甲烷稀釋?zhuān)⒂肒HSO45％/K2SO410％水性混合物洗滌兩次。將有機(jī)萃取物用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)，得到產(chǎn)物(260mg,0.175mmol)，為無(wú)色蠟質(zhì)固體。MS(ISP):(M+NH4)1408.9實(shí)施例34:制備RNA綴合物的一般方法材料二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二異丙基乙基胺(DIPEA)和乙酸鈉溶液(3M,pH5.2)購(gòu)自SigmaAldrichChemieGmbH(Traufkirchen,德國(guó))。用于RP-HPLC的乙酸三乙銨(TEAA)(2.0M,pH7.0)和乙腈(ACN,HPLC質(zhì)量)購(gòu)自Biosolve(Valkenswaard,荷蘭)。乙醇(EtOH,分析純)購(gòu)自Merck(Darmstadt,德國(guó))。純水來(lái)自所使用的OptilabHF(MembraPure,德國(guó))系統(tǒng)。ResourceRPC3mL柱(10x0,64cm；15μm粒徑)購(gòu)自GEHealthcare(Freiburg,德國(guó))。HPLC純化是使用100系統(tǒng)(GEHealthcare)完成。氨基-修飾的RNA的合成在有義鏈的5′-末端帶有己基氨基連接體的RNA是按照標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺固相合成方法，以1215μmol的規(guī)模，使用Oligopilot100(GEHealthcare,Freiburg,德國(guó))和可控孔度玻璃作為固體載體(PrimeSynthesis,Aston,PA,USA)來(lái)制備。包含2′-O-甲基核苷酸類(lèi)的RNA是使用對(duì)應(yīng)的亞磷酰胺、2′-O-甲基亞磷酰胺和TFA-己基氨基連接體亞磷酰胺類(lèi)(Sigma-Aldrich,SAFC,Hamburg,德國(guó))來(lái)生成。切割和脫保護(hù)以及純化是由本領(lǐng)域已知的方法完成(WincottF.,等人,NAR1995,23,14,2677-84)。該氨基-修飾的RNA由陰離子交換HPLC(純度：96.1％)鑒定，并由ESI-MS驗(yàn)證同一性([M+H]1+計(jì)算值:6937.4；[M+H]1+實(shí)測(cè)質(zhì)量：6939.0。序列：5′-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3′；u、c:對(duì)應(yīng)RNA核苷酸的2′-O-甲基核苷酸，s:硫代磷酸酯。一般的實(shí)驗(yàn)性綴合方法將實(shí)施例1-33的標(biāo)題化合物按照以下方法與氨基-修飾的RNA偶聯(lián)：將在5’-末端帶有C-6氨基連接體的RNA(16.5mg,1當(dāng)量)溶于500μLDMSO和150μL水中。加入對(duì)硝基苯基碳酸酯衍生物(10當(dāng)量)溶于1mLDMSO中的溶液，然后加入8μLDIPEA。將反應(yīng)混合物在35℃下在黑暗中振搖，并用RP-HPLC(ResourceRPC3mL,緩沖劑：A:0.1MTEAA的水溶液,B:0.1MTEAA在95％ACN中的溶液,梯度：歷經(jīng)20個(gè)柱體積從3％B到100％B)進(jìn)行監(jiān)控。反應(yīng)完成時(shí)，用乙酸鈉(3M)在EtOH中的溶液于–20℃下沉淀RNA綴合物。例如在二肽基序中缺少M(fèi)MT保護(hù)基團(tuán)，對(duì)應(yīng)的綴合物使用上文所述的條件進(jìn)行純化。將純化的流分合并，并將該物質(zhì)用硫酸鈉/EtOH沉淀，得到所需的RNA綴合物。在二肽序列中包含MMT保護(hù)基團(tuán)的RNA綴合物按照下文所述的方法進(jìn)行進(jìn)一步處理。MMT裂解的一般方法將粗的RNA綴合物沉淀溶于500μL水和1.5mL乙酸鈉緩沖液(3M,pH5.2或0.1M,pH4.0)中。將該溶液在30℃振搖2天。該反應(yīng)混合物用RP-HPLC(ResourceRPC3mL,緩沖劑：A:0.1MTEAA的水溶液,B:0.1MTEAA在95％ACN中的溶液,梯度：3％B-100％B，20個(gè)柱體積)進(jìn)行監(jiān)控。MMT保護(hù)基團(tuán)完全裂解后，將RNA綴合物直接用上文所述的條件進(jìn)行純化。將純化的流分合并，并用硫酸鈉/EtOH將所需綴合物沉淀。合成缺少二肽基序的RNA綴合物作為對(duì)照。為此目的，將膽固醇通過(guò)文獻(xiàn)(NatureBiotech,2007,25,1149)中所述的連接體與5’-末端連接。該綴合物稱(chēng)作“非可裂解的”。全部RNA綴合物都用RPHPLC進(jìn)行純度分析，并由ESIMS(負(fù)離子模式)進(jìn)行驗(yàn)證。簡(jiǎn)言之，RP-HPLC是在裝有XBridgeC18柱(2.5x50mm,2.5μm粒徑,Waters,Eschborn,德國(guó))的DionexUltimate系統(tǒng)(Dionex,Idstein,德國(guó))上在柱溫為65℃下進(jìn)行。用100mM六氟異丙醇(HFIP)和16mM的三乙胺在1％甲醇中的溶液作為洗脫劑A和其在95％甲醇中的溶液作為洗脫劑B(1％B至18％B，在30分鐘內(nèi))進(jìn)行梯度洗脫。UV檢測(cè)在260nm下記錄。用于質(zhì)譜分析的是帶有微噴射源的ThermoFinniganLCQDecaXPESI-MS系統(tǒng)和離子阱檢測(cè)器在線(xiàn)與HPLC系統(tǒng)偶聯(lián)。具體的式(IIa)化合物的實(shí)例在表1中公開(kāi)。所得化合物被稱(chēng)作“包含二肽的膽固醇siRNA綴合物”，其中具體的包含二肽的膽固醇siRNA綴合物還被稱(chēng)為“標(biāo)題化合物實(shí)施例X-(NHC6)-(siRNA序列)”和“帶有實(shí)施例X的標(biāo)題化合物的siRNA”。siRNA制備反義序列:5′-uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU-3′u、c:對(duì)應(yīng)RNA核苷酸的2′-O-甲基核苷酸，s:硫代磷酸酯針對(duì)載脂蛋白BmRNA的包含二肽的膽固醇siRNA綴合物是通過(guò)將互補(bǔ)鏈的等摩爾溶液在退火緩沖液(20mM磷酸鈉,pH6.8；100mM氯化鈉)中混合，在水浴中于80-85℃下加熱3分鐘，并歷經(jīng)3-4小時(shí)時(shí)間冷卻至室溫而生成。雙鏈的形成通過(guò)非變性凝膠電泳來(lái)確認(rèn)。全部制備的包含二肽的膽固醇siRNA綴合物在表2中列出。表1:包含二肽的膽固醇siRNA綴合物(5’-3’)和分析數(shù)據(jù)。注意：小寫(xiě)字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；硫代磷酸酯連接用小寫(xiě)“s”符號(hào)表示。(NHC6)是在有義鏈的5’-末端引入的氨基己基連接體。注：上表中的TitlecompoundEx是指標(biāo)題化合物實(shí)施例號(hào)。表2:包含二肽的膽固醇siRNA綴合物。最后一條(SEQIDNO對(duì)266/154)代表缺少二肽基序的siRNA綴合物。注意：小寫(xiě)字母a,c,g,u是2’-O-甲基核苷酸；硫代磷酸酯連接用小寫(xiě)“s”符號(hào)表示。(NHC6)是在有義鏈的5’-末端引入的氨基己基連接體。實(shí)施例35:體內(nèi)試驗(yàn)包含二肽的膽固醇siRNA綴合物與遞送聚合物的體內(nèi)組合施用六至八周的老年小鼠(株系C57BL/6或ICR,～18-20g每只)獲自HarlanSpragueDawley(IndianapolisIN)。在注射前將小鼠圈養(yǎng)至少2天。用HarlanTeklad嚙齒類(lèi)膳食(Harlan,MadisonWI)進(jìn)行隨意進(jìn)食。將小鼠(每組n＝3)用0.2mL的遞送聚合物和0.2ml包含二肽的膽固醇siRNA綴合物的溶液注射。除非另外說(shuō)明，注射劑量是15mg/kg遞送聚合物和0.1mg/kg包含二肽的膽固醇siRNA綴合物。溶液通過(guò)輸注注射入尾部靜脈。注射后48小時(shí)，檢測(cè)ApoB水平，與按照下文方法用等滲葡萄糖處理的動(dòng)物進(jìn)行比較。血清ApoB水平測(cè)定在用下顎出血收集血清前將小鼠禁食4小時(shí)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)三明治ELISA方法測(cè)定血清ApoB蛋白水平。簡(jiǎn)言之，分別用多克隆山羊抗小鼠ApoB抗體和兔抗小鼠ApoB抗體(BiodesignInternational)作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體。然后使用HRP綴合的山羊抗兔IgG抗體(Sigma)來(lái)結(jié)合ApoB/抗體復(fù)合物。隨后用TecanSafire2(奧地利,歐洲)全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀在450nm下檢測(cè)四甲基-聯(lián)苯胺(TMB,Sigma)色度法的吸收率的變化。在圖1中，多種包含二肽的膽固醇siRNA綴合物與之前準(zhǔn)備的和膽固醇綴合但缺少可裂解基序的相同siRNA在本章節(jié)進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試。將該siRNA綴合物(SEQIDNO266/154對(duì),“非可裂解的對(duì)照物”)對(duì)血清ApoB水平的作用設(shè)為1，以評(píng)價(jià)相對(duì)于該非可裂解對(duì)照物的包含二肽的綴合物的影響。用對(duì)應(yīng)的D-氨基酸(帶有實(shí)施例14的標(biāo)題化合物的siRNA)代替最初使用的Phe-Lys基序(帶有實(shí)施例16的標(biāo)題化合物的siRNA)或者用非天然的對(duì)映異構(gòu)體(帶有實(shí)施例30的標(biāo)題化合物的siRNA)代替Lys，獲得ApoB水平不顯著地降低或相當(dāng)于非可裂解的對(duì)照物siRNA。用Gly(帶有實(shí)施例23的標(biāo)題化合物的siRNA)代替Lys或者用對(duì)甲氧基苯基丙氨酸(帶有實(shí)施例13的標(biāo)題化合物的siRNA)代替Phe，與帶有實(shí)施例16的標(biāo)題化合物的siRNA相比效能降低。其它包含二肽基序的siRNA綴合物顯示具有與原來(lái)包含Phe-Lys的綴合物相同的效能。圖2概括了與包含Phe-Lys基序的帶有實(shí)施例16的標(biāo)題化合物的siRNA相比效能相同或者效能提高的包含二肽的膽固醇siRNA綴合物。全部這些綴合物與“非可裂解的”膽固醇siRNA綴合物SEQIDNO266/154對(duì)相比顯著地更加有活性。效果最好的包含二肽的膽固醇siRNA綴合物在Phy-Lys基序中具有氟修飾的苯環(huán)(帶有實(shí)施例8的標(biāo)題化合物的siRNA、帶有實(shí)施例9的標(biāo)題化合物的siRNA)或者具有被β-苯丙氨酸取代的苯基丙氨酸(帶有實(shí)施例11的標(biāo)題化合物的siRNA)或其衍生物(帶有實(shí)施例10的標(biāo)題化合物的siRNA)。由于包含帶有由D-氨基酸構(gòu)成的二肽基序的膽固醇siRNA綴合物表現(xiàn)出與非可裂解的對(duì)照綴合物相同的效能，可以認(rèn)為，其它二肽序列實(shí)際上被體內(nèi)蛋白酶活性所裂解。但是，考慮到不同氨基酸及其類(lèi)似衍生物的寬泛的接受性，如文獻(xiàn)(BioconjugateChem.2002,13,855)中所提議，可能不止一種酶參與該裂解反應(yīng)。如圖3中所示，在siRNA和小分子配體膽固醇之間引入組織蛋白酶可裂解的二肽基序(在此情況下是Phe-Lys,帶有實(shí)施例16的標(biāo)題化合物的siRNA)，與直接的膽固醇siRNA綴合物(SEQIDNO266/154對(duì))相比，顯著提高了siRNA綴合物的效能。將膽固醇配體與二肽基序通過(guò)基于PEG的連接體進(jìn)一步間隔，隨著PEG連接體的長(zhǎng)度按比例地降低效能。在圖4中，聚合物的劑量保持恒定在15mg/kg。滴定siRNA的劑量并檢測(cè)對(duì)血清ApoB含量的影響。含有Phe-Lys(F-K)基序的包含二肽的膽固醇siRNA綴合物與缺少二肽序列的對(duì)照綴合物相比顯著地更有效。實(shí)施例36:2’-修飾的寡核糖核苷酸合成按照固相上的亞磷酰胺技術(shù)合成寡核糖核苷酸。根據(jù)規(guī)模，使用ABI394合成器(AppliedBiosystems)或AKTAoligopilot100(GEHealthcare,Freiburg,德國(guó))。合成是在用可控孔度玻璃(CPG,載樣量75μmol/g,獲自PrimeSynthesis,Aston,PA,美國(guó))制作的固體載體上進(jìn)行。全部2’-修飾的RNA亞磷酰胺以及輔助試劑購(gòu)自SAFC(Hamburg,德國(guó))。具體而言，使用以下2’-O-甲基亞磷酰胺類(lèi)：(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲?；?-2’-O-甲基-腺苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺、5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙?；?-2’-O-甲基-胞苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺、(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(異丁酰基)-2’-O-甲基-鳥(niǎo)苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-尿苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺。2’-脫氧基-2’-氟-亞磷酰胺帶有與2’-O-甲基RNA亞磷酰胺相同的保護(hù)基團(tuán)。將全部亞磷酰胺類(lèi)溶于無(wú)水乙腈(100mM)，并加入分子篩為了生成5’-磷酸酯，使用來(lái)自GlenResearch(Sterling,Virginia,USA)的2-[2-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)乙基磺?；鵠乙基-(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)-亞磷酰胺。為了在寡聚體的5’-末端引入C-6氨基連接體，使用來(lái)自ThermoFisherScientific(Milwaukee,Wisconsin,美國(guó))的6-(三氟乙?；被?-己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)-亞磷酰胺。5’-修飾的引入不進(jìn)行任何合成循環(huán)的修改。使用5-乙基硫代四唑(thiotetrazole)(ETT,500mM在乙腈中的溶液)作為活化劑溶液。偶聯(lián)時(shí)間為6分鐘。為了引入硫代磷酸酯連接，使用50mM的3-((二甲基氨基-亞甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT,獲自AMChemicals,Oceanside,CA,美國(guó))在無(wú)水乙腈/吡啶(1:1v/v)中的溶液。實(shí)施例37:結(jié)合于載體的寡聚體的切割與脫保護(hù)。固相合成結(jié)束后，將干燥的固體載體轉(zhuǎn)移至15mL試管中，并用濃氨水(Aldrich)在40℃下處理18小時(shí)。離心后，將上清轉(zhuǎn)移至新的試管中，并將CPG用氨水洗滌。將合并的溶液蒸發(fā)，并將固體殘余物在緩沖液A(見(jiàn)下文)中重構(gòu)。實(shí)施例38:寡核糖核苷酸的純化將粗的寡聚體通過(guò)陰離子交換HPLC用填充了SourceQ15(GEHelthcare)的柱子和AKTAExplorer系統(tǒng)(GEHelthcare)進(jìn)行純化。緩沖液A是10mM高氯酸鈉、20mMTris、1mMEDTA、pH7.4(Fluka,Buchs,瑞士)且包含20％乙腈，而緩沖液B除包含500mM高氯酸鈉以為與緩沖液A相同。使用22％B至42％B以32個(gè)柱體積(CV)梯度洗脫。記錄在280nm下的UV示蹤。將合適的流分合并，并用3MNaOAc、pH＝5.2和70％乙醇沉淀。最后，用70％乙醇洗滌該沉淀。實(shí)施例39:寡核糖核苷酸退火生成siRNA通過(guò)合并等摩爾的RNA溶液來(lái)混合互補(bǔ)的鏈。將該混合物凍干，并用合適體積的退火緩沖液(100mMNaCl,20mM磷酸鈉,pH6.8)重構(gòu)以達(dá)到期望濃度。將該溶液置于95℃水浴中，將其在3小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫。實(shí)施例40:缺少2’-OH殘基的siRNA的體外活性為了研究缺少任何2’-OH殘基的siRNA在體外是否顯示有效的敲減活性，我們檢測(cè)了一組帶有不同2’-修飾化學(xué)的靶向于EGFPmRNA的siRNA(SEQID對(duì)31/32至149/150，并參見(jiàn)例如表3)。使用psiCHECK2載體(Promega)在COS7細(xì)胞(DSMZ,Braunschweig,德國(guó),目錄號(hào)ACC-60)中用LuciferaseAssaySystem(Promega)篩選所述siRNA的有義和反義活性。為了滿(mǎn)足有義鏈和反義鏈所賦予的沉默活性，我們將每個(gè)相應(yīng)的19mer的靶位點(diǎn)序列作為不同的psiCHECK2構(gòu)建體(psiCHECK2-AT用于反義活性，psiCHECK2-ST用于有義活性)克隆到位于合成的花蟲(chóng)熒光素酶的3’到翻譯終止密碼子的多克隆區(qū)域。通過(guò)使用Lipofectamine2000(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,德國(guó),目錄號(hào)11668-019)，將COS7細(xì)胞與載體構(gòu)建體和3nM與克隆的靶位點(diǎn)互補(bǔ)的相應(yīng)siRNA共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)花蟲(chóng)熒光素酶活性測(cè)定成功的siRNA介導(dǎo)的沉默，所述花蟲(chóng)熒光素酶活性被標(biāo)準(zhǔn)化為螢火蟲(chóng)熒光素酶水平，以考察其轉(zhuǎn)染效率(反義活性參見(jiàn)圖5a，有義活性參見(jiàn)圖5b)。表3:用于確定依賴(lài)于2’-修飾的體外敲減活性的示例性siRNA序列和化學(xué)修飾。參考雙鏈和選擇對(duì)應(yīng)的修飾變體的實(shí)例用于此項(xiàng)研究。Xf是指核苷酸X的2’-氟修飾，小寫(xiě)字母是指2’-O-甲基修飾，下劃線(xiàn)的字母是指DNA核苷酸，全部其它大寫(xiě)字母是指核糖核苷酸類(lèi)。字母“p”是指5’-磷酸酯。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)最有效的修飾的siRNA(≥60％敲減)是以選擇的2’-氟/2’-O-甲基(2’F/2’-OMe)模式設(shè)計(jì)。在賦予反義鏈活性的同時(shí)，該化學(xué)修飾完全消除了對(duì)應(yīng)有義鏈的活性，如全部檢測(cè)的2’F/2’-OMe變體失去或最小化花蟲(chóng)熒光素酶活性所示。我們總結(jié)出，該2’F/2’-OMe模式提高了siRNA的預(yù)期的反義鏈活性，而且完全抑制了來(lái)自有義鏈的不期望的對(duì)靶點(diǎn)外的作用。這種設(shè)計(jì)對(duì)于siRNA特別有利，其符合保護(hù)對(duì)抗2’O-針對(duì)的核水解的需要。實(shí)施例41:通過(guò)體外試驗(yàn)檢測(cè)DNaseII敏感位點(diǎn)建立基于離子對(duì)(IP)反相(RP)高效液相色譜(HPLC)與電噴射離子化(ESI)質(zhì)譜(MS)或陰離子交換(AEX)-HPLC偶聯(lián)的方法，檢測(cè)所選的單鏈或雙鏈RNA的體外穩(wěn)定性。方法描述：為了穩(wěn)定性分析，將單鏈或雙鏈RNA的10μM溶液在37℃下在包含0.8或8個(gè)單位的DNaseII(來(lái)自牛脾臟，V型，SigmaAldrich)的5mM乙酸鈉緩沖溶液(PH4.5)中孵育。通過(guò)加入100mM乙酸三乙銨(TEAA)溶液來(lái)終止孵育反應(yīng)，將pH調(diào)至7，并使DNaseII酶滅活。通過(guò)與UV檢測(cè)器連接的LC/MS或通過(guò)帶有UV檢測(cè)器的AEX-HPLC完成分析。在260nm的UV檢測(cè)示蹤用于定量分析，MS數(shù)據(jù)用于確定RNA序列中的裂解位點(diǎn)。A.在65℃柱溫下使用WatersXBridgeC18柱(2.5x50mm,2.5μm粒徑)進(jìn)行IP-RP-HPLC。梯度洗脫是使用100mM六氟異丙醇(HFIP)和16mM三乙胺在1％甲醇中的溶液作為洗脫劑A和組合物A在95％甲醇中的溶液作為洗脫劑B。所用梯度是從1％B至18％B，在30分鐘內(nèi)。B.在50℃下在DionexDNAPac200柱(4x250mm)上使用含有10％ACN的pH＝11的20mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行AEX-HPLC。洗脫劑B包含1MNaBr在洗脫劑A中的溶液。梯度從25至62％B，在18分鐘內(nèi)。表4:雙鏈以及其他的完整鏈對(duì)抗DNaseII的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。注意：小寫(xiě)字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸類(lèi)；后面跟“f”的大寫(xiě)字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小寫(xiě)字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脫氧胸苷(3’-3’-連接)。硫代磷酸酯連接用小寫(xiě)符號(hào)“s”表示。dT是脫氧胸苷。(NHC6)是在有義鏈5’末端引入的氨基己基連接體。結(jié)論：A.包含至少一個(gè)2’-OH核苷酸的RNA鏈(例如SEQIDNO對(duì)157/158的兩條鏈)經(jīng)環(huán)狀五價(jià)中間體迅速降解，導(dǎo)致在5’-裂解產(chǎn)物的2’-3’環(huán)狀磷酸酯。該五價(jià)中間體的形成可以通過(guò)使用缺少2’-OH基團(tuán)(例如2’-脫氧基、2’-OMe或2’-F)的核苷酸來(lái)抑制。B.此外，RNA是經(jīng)5’-核酸外切途徑降解，其不依賴(lài)5’-末端核苷酸的2’-修飾。該降解途徑可以使用5’-末端非核苷酸部分來(lái)抑制，例如C6-氨基連接體(例如SEQIDNO對(duì)160/159中的SEQIDNO160或SEQIDNO對(duì)165/166中的SEQIDNO165)或者在第一個(gè)核苷酸間鍵的硫代磷酸酯(例如在SEQIDNO對(duì)160/159中的SEQIDNO160)。C.5’-磷酸酯基團(tuán)減緩了核酸外切的裂解動(dòng)力學(xué)，但不能完全阻止由此末端開(kāi)始的降解(例如在SEQIDNO對(duì)160/159中的SEQIDNO160)。這最有可能是由于經(jīng)由磷酸酶或DNaseII酶的固有磷酸酶活性的5’-磷酸酯裂解。D.對(duì)RNA鏈最好的保護(hù)是用在鏈中不包含2’-OH核苷酸的寡核苷酸類(lèi)進(jìn)行，從在5’-末端的2’-OMe核苷酸經(jīng)硫代磷酸酯鍵與第二個(gè)核苷酸連接開(kāi)始(例如在SEQIDNO對(duì)173/174中的SEQIDNO173)。其它末端非2’-OH的核苷酸類(lèi)還保護(hù)避免5’-外切降解，但相對(duì)于2’-OMe修飾而言程度較低(參見(jiàn)表9)。實(shí)施例42:在體內(nèi)試驗(yàn)中缺少2’-OH殘基的siRNA的敲減活性用注射了靶向于因子VII(FVII)的siRNA(SEQIDNO對(duì)179/166和180/168,見(jiàn)表5)且組合施用DPC-GalNac的小鼠來(lái)進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。表5a:siRNA序列的體內(nèi)試驗(yàn)。注意：小寫(xiě)字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；后面跟“f”的大寫(xiě)字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小寫(xiě)字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脫氧胸苷(3’-3’-連接)。硫代磷酸酯連接用小寫(xiě)“s”符號(hào)表示。dT是脫氧胸苷。(NHC6)是在有義鏈5’末端引入的氨基己基連接體。GalNAc是指式(IV)的結(jié)構(gòu)。在有義鏈和反義鏈上帶有可選的2’-OMe/2’-F模式的FVIIsiRNA是用在反義鏈上的5’-末端2’-OMe核苷酸和在有義鏈上的5’-末端2’-F鏈生成。兩個(gè)鏈均由inv(dT)在3’-末端突出位置進(jìn)行保護(hù)。該反義鏈帶有5’-磷酸酯基團(tuán)以保留siRNA的活性。有義鏈與GalNAc-棕櫚酰結(jié)構(gòu)在其5’末端綴合，用于通過(guò)唾液酸基糖蛋白受體靶向肝細(xì)胞。將siRNA(2.5mg/kg)與GalNAc靶向的PBAVE(15mg/kg)一起向小鼠組合施用。使用QuantiGene1.0branchedDNA(bDNA)AssayKit(Panomics,Fremont,Calif.,USA,目錄號(hào)QG0004)來(lái)完成來(lái)自肝勻漿的FVIImRNA檢測(cè)。將尸體解剖中的1-2g肝臟組織在液氮中速凍。將冷凍組織用研磨粉末化，并在干冰上蒸發(fā)。將15-25mg的組織轉(zhuǎn)移至冷卻的1.5mL的反應(yīng)試管中，加入1mL1:3預(yù)先在MilliQ水中稀釋的裂解混合物和3.3μL蛋白酶K(50μg/μL)，并將組織在30-50％功率下超聲處理(HD2070,Bandelin,柏林,德國(guó))幾秒鐘進(jìn)行裂解。將裂解物在-80℃下儲(chǔ)存直至進(jìn)行分析。為進(jìn)行mRNA分析，將裂解物解凍，并用蛋白酶K在熱攪拌器(Thermomixercomfort,Eppendorf,Hamburg,德國(guó))中于65℃以1000rpm消化15分鐘。用QuantiGene1.0bDNAAssayKit試劑根據(jù)生產(chǎn)商的推薦方法來(lái)測(cè)定FVII和GAPDHmRNA水平。用20μL裂解物和小鼠探針組來(lái)分析FVIImRNA表達(dá)。使用40μL裂解物和挪威鼠(rattusnorwegicus)的探針組分析GAPDHmRNA表達(dá)，顯示與小鼠(探針組序列見(jiàn)上文)交叉反應(yīng)。作為實(shí)驗(yàn)讀數(shù)，在實(shí)驗(yàn)的結(jié)尾用Victor2Light發(fā)光計(jì)數(shù)器(PerkinElmer,Wiesbaden,德國(guó))檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，作為相對(duì)光單位(RLU)。將來(lái)自相同裂解物的FVIImRNA信號(hào)除以GAPDHmRNA信號(hào)，數(shù)值以標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的FVIImRNA表達(dá)進(jìn)行報(bào)告。結(jié)果表明，在SEQIDNO對(duì)179/166給藥48小時(shí)后，79％FVIImRNA被敲減。相反，帶有siRNASEQIDNO對(duì)180/168的2’-OH核苷酸不顯示顯著的敲減(<25％)，如表5中所示。表5b:體內(nèi)敲減研究的結(jié)果SEQIDNO對(duì)179/166SEQIDNO對(duì)180/168時(shí)間[小時(shí)]剩余mRNA[％]剩余mRNA[％]18492683882453100482176實(shí)施例43:缺少2’-OH殘基的siRNA的組織分布使用WO2010043512所述的專(zhuān)用寡核苷酸檢測(cè)方法測(cè)定肝臟組織樣品中siRNA的濃度。siRNA定量分析基于與siRNA雙鏈的反義鏈互補(bǔ)的熒光(Atto-425)標(biāo)記PNA探針(Atto425-OO-GCAAAGGCGTGCCAACT,獲自Panagene公司,韓國(guó))的雜交，隨后經(jīng)AEX-HPLC分離。通過(guò)參照用于體內(nèi)試驗(yàn)的兩種FVIIsiRNA的系列稀釋液產(chǎn)生的外部標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(參見(jiàn)實(shí)施例42)，經(jīng)熒光檢測(cè)來(lái)完成定量。對(duì)于血漿樣品，將0.2-2μL注入HPLC系統(tǒng)，對(duì)于組織，將約1mg樣品注入HPLC系統(tǒng)。缺少2’-OH核苷酸的穩(wěn)定化的siRNA的肝臟組織分析顯示在肝臟中完整反義鏈為ug/g范圍的高濃度，但是～95％是以5’-脫磷酸化的失活形式存在(見(jiàn)表IR.04)。所得帶有末端2’-OMe核苷酸的RNA不傾向于在細(xì)胞質(zhì)中被磷酸激酶hClp1再次磷酸化(見(jiàn)下文)。相反，包含2’-OH的反義鏈的siRNA在組織中在給藥后的前6個(gè)小時(shí)內(nèi)完全降解。表6:不包含2’-OH核苷酸的穩(wěn)定化的siRNA的肝組織分析*BDL＝檢測(cè)限以下實(shí)施例44:帶有優(yōu)化5’-末端的siRNA的體外敲減活性進(jìn)行FVIIsiRNA的其它體外篩選是為了鑒別能夠在細(xì)胞內(nèi)在反義鏈的5’-末端(再次)磷酸化得到RNAi-有效物質(zhì)的siRNA。此次篩選的全部siRNA如表7中所示。可選的2’-OMe/2’-F修飾模式除了在反義鏈的5’-末端的前兩個(gè)核苷酸的多種修飾以外，與第一代設(shè)計(jì)(不含任何2’-OH殘基)相同。生成兩個(gè)反義鏈的5’-末端分別為2’-F或2’-脫氧基修飾的核苷酸與帶有或不帶有額外的5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯的不同組合的核苷酸。在轉(zhuǎn)染原代小鼠肝細(xì)胞(每孔30000個(gè)細(xì)胞；96孔板方式)后，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine2000，以劑量-響應(yīng)方式(24nM至0.00037nM，以4倍稀釋)篩選所有的siRNA，用于敲減活性測(cè)定。根據(jù)IC50值，兩個(gè)siRNA與親代雙螺旋(SEQIDNO對(duì)182/168)活性相當(dāng)；活性相當(dāng)?shù)膕iRNA:SEQIDNO對(duì)181/186和181/185)，一個(gè)具有5’-末端的2’-F和磷酸酯基團(tuán)，一個(gè)具有兩個(gè)5’-末端的2’-脫氧核苷酸和5’-硫代磷酸酯(參見(jiàn)表7的IC50值)。它們都比在第一次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用的具有末端2’-OMe核苷酸的siRNA(SEQIDNO對(duì)181/166)活性高約5-6倍。表7:IC50值注：其中的Sensestrandsequence是指有義鏈序列，Antisensestrandsequence是指反義鏈序列。實(shí)施例45:具有優(yōu)化的5’末端的siRNA的體外5’-磷酸化通過(guò)在HeLaS100細(xì)胞提取物中的hClp1評(píng)價(jià)所有在表7中列出的不具有5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯的siRNA的磷酸化。按照Weitzer和Martinez(S.Weitzer和J.Martinez.hClp1:anovelkinaserevitalizesRNAmetabolism.CellCycle6(17):2133-2137,2007)所述，從S100HeLa提取物分析5’-磷酸化。在包含5mMATP的S100HeLa提取物中的1μMsiRNA孵育后，通過(guò)注入5μL樣品溶液在變性條件下以IP-RP-HPLC或AEX-HPLC直接分析溶液。A.使用WatersXBridgeC18柱(2.5x50mm,2.5μm粒徑)在65℃柱溫下進(jìn)行IP-RP-HPLC。梯度洗脫是使用100mM六氟異丙醇(HFIP)和16mM三乙胺在1％甲醇中的溶液作為洗脫劑A和組合物A在95％甲醇中的溶液作為洗脫劑B。使用梯度從1％B至18％B，在30分鐘內(nèi)。B.AEX-HPLC是在DionexDNAPac200柱(4x250mm)在50℃下使用pH＝11的包含10％ACN的20mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行。洗脫劑B包含了在洗脫劑A中的1MNaBr。使用梯度從25-62％B，在18分鐘內(nèi)。使用以下方程(PA是峰面積)，根據(jù)在260nm的UV示蹤對(duì)siRNA的每條鏈計(jì)算5’-磷酸化的比率：％(5’-磷酸化)＝100*PA[5’-磷酸化的鏈]/(PA[5’-磷酸化的鏈]+PA[親本鏈])如表8所示，當(dāng)2’-OMe核苷酸位于5’-末端(SEQIDNO對(duì)181/196和SEQIDNO對(duì)181/195)時(shí)，siRNA的反義鏈不能被5’-磷酸化。相反，當(dāng)2’-F、2’-脫氧或2’-OH核苷酸摻入5’-末端(SEQIDNO對(duì)181/195、SEQIDNO對(duì)181/192、SEQIDNO對(duì)181/197、SEQIDNO對(duì)181/199和SEQIDNO對(duì)182/168)時(shí)，反義鏈容易5’-磷酸化。一旦通過(guò)合成引入的5’-磷酸酯/5’-PTO基團(tuán)在體內(nèi)例如通過(guò)磷酸酶切除后，在體外試驗(yàn)中具有與親本SEQIDNO對(duì)182/168(SEQIDNO對(duì)181/186和181/185)類(lèi)似活性的這兩個(gè)siRNA容易發(fā)生5’-磷酸化。表8:在S100HeLa細(xì)胞提取物中孵育4小時(shí)后的5’-磷酸化鏈的百分比。注意：小寫(xiě)字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸類(lèi)；后面跟“f”的大寫(xiě)字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。(invdT)代表反向脫氧胸苷(3’-3’-連接)。硫代磷酸酯連接用小寫(xiě)“s”符號(hào)表示。dT是脫氧胸苷。實(shí)施例46:具有優(yōu)化的5’末端的siRNA的體內(nèi)DNAseII-穩(wěn)定性如實(shí)施例41所述，篩選所有的反義鏈的DNAseII穩(wěn)定性。在siRNA中存在的與親本雙螺旋(SEQIDNO186和SEQIDNO對(duì)185)活性相當(dāng)?shù)膬蓚€(gè)反義鏈，一個(gè)具有5’-末端2’-F和磷酸酯基團(tuán)，一個(gè)具有兩個(gè)5’-末端2’-脫氧核苷酸和5’-硫代磷酸酯，對(duì)DNAseII切割穩(wěn)定(在20小時(shí)孵育后>70％的完整鏈)。表9:在20小時(shí)孵育后siRNA對(duì)DNAseII的體外穩(wěn)定性實(shí)施例47:具有優(yōu)化的5’末端的siRNA體內(nèi)敲減活性為了評(píng)價(jià)是否通過(guò)優(yōu)化5’末端得到的改善能夠轉(zhuǎn)移到體內(nèi)狀態(tài)，我們用選擇的siRNA的GalNAc-棕櫚酰綴合物進(jìn)行了進(jìn)一步的小鼠實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)表10)。如第一個(gè)小鼠實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例42，本專(zhuān)利申請(qǐng))所述，在同樣條件下施用siRNA。為了檢測(cè)FVII水平，按照標(biāo)準(zhǔn)程序，通過(guò)從下頜下取血到含有0.109mol/L檸檬酸鈉抗凝血?jiǎng)?1體積)的微量離心管來(lái)收集血液(9體積)，制備來(lái)自小鼠的血漿樣品。使用BIOPHENVII試劑盒(HyphenBioMed/Aniara,Mason,OH)，按照生產(chǎn)商的推薦方法，用生色法檢測(cè)血漿中的FVII活性。使用TecanSafire2微量板讀數(shù)器在405nm檢測(cè)色度法建立的吸光度。所研究的siRNA顯示了改善的體外活性，其與體外篩選結(jié)果非常相關(guān)。在給藥后48小時(shí)，兩個(gè)siRNA的血清FVII活性降低超過(guò)80％，與使用第一代DNaseII穩(wěn)定的siRNA設(shè)計(jì)所產(chǎn)生的降低49％進(jìn)行比較(參見(jiàn)表10)。該結(jié)果清楚地表明了反義鏈的5’-末端核苷酸的重要性，其能夠有效地被磷酸化，此時(shí)磷酸酶體內(nèi)裂解所合成的5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯基團(tuán)。當(dāng)?shù)谝淮O(shè)計(jì)所用的或文獻(xiàn)所描述的5’-末端2’-OMe核苷酸作為更有效的siRNA設(shè)計(jì)根據(jù)體外與標(biāo)準(zhǔn)siRNAs的比較時(shí)(Allersonetal.J.MedChem.2005,48,901-904)，合成的磷酸酯的體內(nèi)裂解能夠?qū)е孪鄳?yīng)的siRNA的效能的顯著下降。表10：具有優(yōu)化的5’末端的siRNA體內(nèi)敲減活性。注意：小寫(xiě)字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；后面跟“f”的大寫(xiě)字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小寫(xiě)字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脫氧胸苷(3’-3’-連接)。硫代磷酸酯連接用小寫(xiě)“s”符號(hào)表示。(NHC6)是在有義鏈5’末端引入的氨基己基連接體。GalNAc是指式(IV)的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例48：具有優(yōu)化的3’末端的siRNA體外敲減活性為了進(jìn)一步增加對(duì)DNaseII穩(wěn)定的siRNA的活性，進(jìn)行了對(duì)3’-突出部的SAR研究。將不同組合的在有義鏈或反義鏈的3’-突出部的invdT、dTinvdT或dTsdT應(yīng)用于Aha1-和EGFP-靶向的siRNA(分別參見(jiàn)表11和12)，配對(duì)比較在最有效的siRNA中3’末端的組成。在轉(zhuǎn)染原代小鼠肝細(xì)胞(每孔30000個(gè)細(xì)胞；96孔板方式)后，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine2000，以劑量-響應(yīng)方式(24nM至0.00037nM，以4倍稀釋)篩選所有的siRNA，用于敲減活性測(cè)定。表11：具有不同3’末端的EGFP-靶向的siRNA體外敲減活性。SEQIDNOSensestrandsequence(5′-3′)SEQIDNOAntisensestrandsequence(5′-3)IC50[nM]45GCUGGAGUUCGUGACCGCCdTdT46GGCGGUCACGAACUCCAGCdTdT1.0490212GcuGGAGuucGuGAccGccdTsdT225GGCGGUcACGAACUCcAGCdTsdT#N/A201gcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)221dGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfc(invdT)04377201gcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)214dGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT01479211gcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdT(invdT)223dGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdT(invdT)0.5833203gcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdTsdT214dGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT0.2166204GfcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)224pGfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfc(invdT)0.9100204GfcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)215pGfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT0.2241207GfcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdT(invdT)218pGfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdT(invdT)0.3474206GfcUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdTsdT215pGfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT0.2392205GfscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)220GfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfc(invdT)0.4251205GfscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)216GfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT0.2349210GfscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdT(invdT)222GfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdT(invdT)0.5230209GfscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdTsdT216GfsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT0.4937200gscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)217pdGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfc(invdT)0.2643200gscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCf(invdT)213pdGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT0.0936208gscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdT(invdT)219pdGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdT(invdT)0.3776202gscUfgGfaGfuUfcGfuGfaCfcGfcCfdTsdT213pdGsGfcGfgUfcAfcGfaAfcUfcCfaGfcdTsdT01569注：其中的Sensestrandsequence是指有義鏈序列，Antisensestrandsequence是指反義鏈序列。表12：具有不同3’末端的Aha1-靶向的siRNA體外敲減活性。SEQIDNOSensestrandsequence(5′-3′)SEQIDNOAntisensestrandsequence(5′-3)IC50[nM]157GGAuGAAGuGGAGAuuAGudTsdT158ACuAAUCUCcACUUcAUCCdTsdT0094234GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)246AfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfc(invdT)0081234GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)240AfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0036233GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdT(invdT)239AfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdT(invdT)0034236GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdTsdT240AfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0040231GfsgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)241pAfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfc(invdT)0037231GfsgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)267pAfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0030229GfsgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdT(invdT)268pAfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdT(invdT)0024228GfsgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdTsdT267pAfsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0021232ggAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)245dAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfc(invdT)0060232ggAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)238dAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0030237ggAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdT(invdT)244dAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdT(invdT)0045230ggAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdTsdT238dAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0025227gsgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)243pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfc(invdT)0045227gsggAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)266pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0015235gsgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdT(invdT)242pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdT(invdT)0039226gsgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUfdTsdT266pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT0014注：其中的Sensestrandsequence是指有義鏈序列，Antisensestrandsequence是指反義鏈序列。發(fā)現(xiàn)在反義鏈上具有兩個(gè)核苷酸dTsdT-突出部的siRNA比在反義鏈3’-端只有一個(gè)invdT突出部(而且有義鏈相同)的siRNA的效果更好。更有利的是與使用作為3’突出部的單個(gè)invdT-突出部修飾的有義鏈進(jìn)行組合。實(shí)施例49：在非人的靈長(zhǎng)類(lèi)中siRNA的體內(nèi)敲減活性制備DPC和給藥DPC的制備如下：通過(guò)將聚合物“149RAFT”與所示的靶向于凝血因子VII(siF7)的siRNA以4:1重量比(聚合物:siRNA)通過(guò)二硫鍵共價(jià)連接，隨后用2:1重量比的CDM-PEG:CDM-NAG混合物以7x重量比(CDM:聚合物)修飾聚合物-siRNA綴合物。對(duì)獼猴施用1mg/kgDPC(聚合物重量)和0.25mg/kg的所示siRNA。一只動(dòng)物接受包含siF7SEQIDNO對(duì)151/152的DPC，兩只動(dòng)物接受包含siF7SEQIDNO對(duì)253/254),#1和#2)的DPC，兩只動(dòng)物接受包含SEQIDNO對(duì)251/255,#1和#2)的DPC。將F7值根據(jù)兩個(gè)給藥前的值的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。接受包含SEQIDNO對(duì)253/254或SEQIDNO對(duì)251/255的DPC的動(dòng)物具有比接受SEQIDNO對(duì)251/252的動(dòng)物更高的F7敲減水平和更長(zhǎng)的PT。DPC注射程序?qū)τ诿總€(gè)注射程序，向動(dòng)物給予包含氯胺酮(最多7mg/kg)和右美托咪定(最多0.03mg/kg)的組合的IM注射，并移至操作房。在操作房中，將動(dòng)物置于水套加熱板上，并對(duì)注射部位剃毛和消毒。將靜脈導(dǎo)管(20-22號(hào))插入體靜脈(頭部或小隱靜脈)，歷經(jīng)1-2分鐘緩慢注入DPC溶液(2ml/kg)。在注射程序期間和之后使用脈搏血氧計(jì)監(jiān)測(cè)心率和氧飽和度。每個(gè)注射程序花費(fèi)約20分鐘完成。在注射后移去導(dǎo)管，并輕柔按壓穿刺部位。將動(dòng)物放回它們的籠子，給予IM注射逆轉(zhuǎn)藥物阿替美唑(0.10-0.15mg/kg)。監(jiān)測(cè)動(dòng)物直到它們恢復(fù)正?；顒?dòng)。血液收集程序獲得血樣(1-5ml)用于測(cè)定基因抑制(F7活性，凝血時(shí)間)、血液化學(xué)和肝損傷標(biāo)記物(CBC、化學(xué)清單、ALT、細(xì)胞因子、補(bǔ)體)。對(duì)于每個(gè)注射程序，向動(dòng)物給予包含氯胺酮(最多7mg/kg)和右美托咪定(最多0.03mg/kg)的組合的IM注射。在鎮(zhèn)靜后，將動(dòng)物移到便攜式操作臺(tái)上，使用22號(hào)針頭和注射器從股靜脈收集血液。在收集血樣后立即對(duì)穿刺部位按壓，并將血液分到適宜的樣品管中，用于各項(xiàng)血液測(cè)試。接著對(duì)動(dòng)物給予IM注射逆轉(zhuǎn)藥物阿替美唑(0.10-0.15mg/kg)，并放回它們的籠子。在任何30天的時(shí)期內(nèi)抽取不超過(guò)20％的總血液體積的量(估計(jì)的血液體積＝60ml/kg)。每個(gè)血液收集程序花費(fèi)約10分鐘完成。因子VII(F7)活性測(cè)定通過(guò)將全血填充入血清分離管并使血液在室溫下凝固至少20分鐘來(lái)制備非人的靈長(zhǎng)類(lèi)的血樣。在凝固后，血液管在9000rpm離心3分鐘，等分到微量離心管中，儲(chǔ)存在-20℃直到使用。血清中的F7活性用生色方法來(lái)測(cè)定，按照生產(chǎn)商的推薦使用BIOPHENVII試劑盒(HyphenBioMed/Aniara,Mason,OH)。使用TecanSafire2微量板讀數(shù)器在405nm檢測(cè)色度法建立的吸光度。凝血實(shí)驗(yàn)(凝血酶原時(shí)間、部分凝血酶原時(shí)間和纖維蛋白原)通過(guò)將全血完全充滿(mǎn)檸檬酸鈉管(BDVacutainer)并輕柔混合以防止凝塊形成來(lái)制備非人的靈長(zhǎng)類(lèi)的血樣。將管子在1小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移到臨床實(shí)驗(yàn)室，并在收集時(shí)間后的4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行凝血實(shí)驗(yàn)。表13：用于NHP實(shí)驗(yàn)的FVIISiRNA。注意：小寫(xiě)字母a、c、g、u是2’-O-甲基核苷酸；后面跟“f”的大寫(xiě)字母A、C、G、U是指2’-氟核苷酸。小寫(xiě)字母“p”是指5’-磷酸酯。(invdT)代表反向脫氧胸苷(3’-3’-連接)。硫代磷酸酯連接用小寫(xiě)“s”符號(hào)表示。dT是脫氧胸苷。從兩條鏈上都是單個(gè)核苷酸(invdT)-3’-突出部變?yōu)椴粚?duì)稱(chēng)的siRNA設(shè)計(jì)，其具有在有義鏈上的3’-(invdT)突出部和在反義鏈上的dTsdT突出部，但是恒定的修飾方式導(dǎo)致在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中更有效的血清FVII下降和該效果的顯著延長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間(參見(jiàn)圖6a)。該結(jié)果得到了預(yù)期的生物學(xué)后果的支持，即，對(duì)于相應(yīng)于因子7的降低程度的凝血酶原時(shí)間產(chǎn)生了更顯著的作用(參見(jiàn)圖6b)。實(shí)施例50：具有可裂解的RNA連接體的siRNA的體內(nèi)敲減活性在表14中，以相同的序列背景在小鼠中使用膽固醇或GalNAc-棕櫚酰siRNA綴合物比較基于血清的FVII蛋白抑制的體內(nèi)效能。該體內(nèi)試驗(yàn)如實(shí)施例42所述進(jìn)行。不包含2’-OH核苷酸的膽固醇綴合的siRNA相比GalNAc-棕櫚酰綴合的產(chǎn)品(SEQIDNO對(duì)179/166對(duì)比179/190，SEQIDNO對(duì)257/264對(duì)比SEQIDNO對(duì)179/262，SEQIDNO對(duì)257/263對(duì)比SEQIDNO對(duì)179/163，和SEQIDNO對(duì)257/166對(duì)比SEQIDNO對(duì)179/166)的FVII抑制大幅度降低。與包含2’-OH的siRNA相反，所述膽固醇綴合物導(dǎo)致相對(duì)于GalNAc-棕櫚酰衍生物更高的FVII抑制(SEQIDNO對(duì)180/168對(duì)比SEQIDNO對(duì)258/168)。在所述體內(nèi)試驗(yàn)中使用的小分子配體GalNAc-棕櫚酰和膽固醇通過(guò)非可裂解的連接體連接到有義鏈的5’-末端。在有義鏈具有2’-OH核苷酸的情況下，配體仍然是可被核酸酶裂解的(例如，在胞內(nèi)體或溶酶體區(qū)室中的DNaseII)。所述裂解反應(yīng)釋放出游離的siRNA，其接著通過(guò)遞送聚合物干擾胞內(nèi)體的活性而釋放到細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)于在有義鏈中缺乏2’-OH核苷酸的siRNA，配體穩(wěn)定地連接在雙鏈上，因?yàn)闆](méi)有酶促(核酸酶/蛋白酶/酯酶等)或化學(xué)機(jī)制觸發(fā)配體的裂解。因此，由于親脂性膽固醇配體與膜的相互作用，非常穩(wěn)定的膽固醇綴合的siRNA能夠包埋在細(xì)胞膜中。甚至在組織中高濃度的siRNA都不足以有效地將siRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。相反，親脂性較低的GalNAc-棕櫚酰綴合的siRNA能夠釋放到細(xì)胞質(zhì)中，因?yàn)槠渑c細(xì)胞膜的相互作用顯著的較少。由于此原因，非可裂解的GalNAc-棕櫚酰siRNA綴合物比膽固醇綴合的相同siRNA更為有效。開(kāi)發(fā)可裂解的連接體結(jié)構(gòu)能夠幫助防止膜包埋穩(wěn)定綴合的膽固醇siRNA的問(wèn)題。使用二硫鍵連接體化學(xué)被描述為有吸引力的引入限定裂解位點(diǎn)的方法，但是裂解更有可能限制在細(xì)胞的特定細(xì)胞器的還原環(huán)境中(PNAS,2006,103,13872)。由于預(yù)期在胞內(nèi)體/溶酶體區(qū)室中裂解會(huì)減慢，大多數(shù)膽固醇-二硫鍵綴合的siRNA仍然能夠被包埋在膜中，如對(duì)非可裂解的膽固醇綴合物所述。表14除了建立二硫鍵可裂解連接體化學(xué)外，另一種可能性是通過(guò)在某些位置使用2’-OH核苷酸產(chǎn)生限定的裂解位點(diǎn)。在所選的位置引入2’-OH核苷酸是實(shí)現(xiàn)從RNA鏈上切除綴合物的新方法。能夠通過(guò)在RNA鏈的3’-或5’-端用至少一個(gè)2’-OH核苷酸加入單鏈突出部，或者在siRNA的雙鏈區(qū)域內(nèi)使用2’-OH核苷酸而實(shí)施2’-OH核苷酸。在胞內(nèi)體/溶酶體中存在的核酸酶活性選擇性地在所述位置進(jìn)行裂解。在第一代設(shè)計(jì)中，膽固醇與有義鏈通過(guò)包含5’-端的3個(gè)2’-OH核苷酸(AUC)的單鏈突出部而連接。膽固醇綴合的siRNA與多種可裂解的連接體化學(xué)的比較顯示于表15。所有的siRNA具有相同的序列背景，僅僅是連接體改變了。將膽固醇與有義鏈通過(guò)由5’-端的3個(gè)2’-OH核苷酸(AUC)構(gòu)成的單鏈突出部連接。當(dāng)與遞送聚合物組合施用時(shí)，該siRNA(SEQIDNO對(duì)260/263)導(dǎo)致小鼠血清的FVII下調(diào)77％，而具有穩(wěn)定連接的膽固醇的相同siRNA(SEQIDNO對(duì)257/263)僅60％。具有通過(guò)根據(jù)式Ia的連接體連接到有義鏈(SEQIDNO對(duì)261/263)的5’-端的siRNA與膽固醇綴合物導(dǎo)致了血清的FVII活性下降93％。所有結(jié)果通過(guò)在小鼠中組合施用15mg/kg的遞送聚合物和2.5mg/kg膽固醇綴合的siRNA而獲得。表15：對(duì)于綴合膽固醇的siRNA的不同連接體化學(xué)的體內(nèi)比較這些結(jié)果說(shuō)明，使用可裂解的連接體改善了不包含2’-OH核苷酸的siRNA的體內(nèi)效能?？闪呀獾倪B接體可以由包含2’-OH的核苷酸、二肽裂解基序或二硫鍵連接體構(gòu)成。所有的可裂解連接體結(jié)構(gòu)都在施用膽固醇綴合的siRNA與減緩胞內(nèi)體釋放的遞送聚合物的組合中改善了體內(nèi)效能。實(shí)施例51：具有可裂解的連接體的siRNA的體外血清穩(wěn)定性在體外穩(wěn)定性試驗(yàn)中評(píng)價(jià)可裂解的連接體的穩(wěn)定性。將膽固醇綴合的有義鏈在90％小鼠血清中在37℃下孵育不同的時(shí)間點(diǎn)。通過(guò)加入蛋白酶K在包含十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩沖液中的溶液來(lái)中止孵育反應(yīng)。該處理降解了所有的蛋白質(zhì)和酶，但沒(méi)有干擾RNA鏈的完整性。將25μL的該溶液直接注入連接了UV檢測(cè)器(260nm)的AEX-HPLC系統(tǒng)。AEX-HPLC在DionexDNAPac200柱(4x250mm)上在75℃使用包含50％ACN的20mMTris緩沖液(pH＝8)進(jìn)行。800mMNaBr在洗脫劑B中的溶液用作洗脫鹽。使用梯度25-62％B，在18分鐘內(nèi)。包含膽固醇的單鏈RNA從HPLC柱上作為260nm下的最寬峰洗脫。在切掉膽固醇后，在較低的保留時(shí)間處觀察到尖銳的對(duì)稱(chēng)峰。膽固醇的裂解速率按照下面的方程測(cè)定(PA＝峰面積):％(游離RNA)＝100*PA[游離RNA]/(PA[游離RNA]+PA[膽固醇綴合的RNA])體外顯示，3個(gè)核苷酸(AUC)-突出部在少于1小時(shí)內(nèi)在90％小鼠血清中被定量地裂解。所述裂解發(fā)生在突出部的3’到這兩個(gè)嘧啶核苷酸處，導(dǎo)致兩個(gè)不同的裂解代謝物(總結(jié)代謝物的峰面積，用于數(shù)據(jù)評(píng)價(jià))。相反，包含根據(jù)式Ia的連接體、二硫鍵和穩(wěn)定連接的膽固醇的二肽在小鼠血清中完全穩(wěn)定。實(shí)施例52：具有可裂解的連接體的siRNA的組織分布使用WO2010043512所述的專(zhuān)用寡核苷酸檢測(cè)方法測(cè)定肝臟組織樣品中siRNA的濃度。簡(jiǎn)言之，siRNA定量分析基于與siRNA雙鏈的有義鏈互補(bǔ)的熒光(Atto-425)標(biāo)記的PNA探針(Atto425-OO-TGAGTTGGCACGCCTTT,獲自Panagene公司,韓國(guó))的雜交，隨后經(jīng)AEX-HPLC分離。通過(guò)參照用于體內(nèi)試驗(yàn)的兩種FVIIsiRNA的系列稀釋液產(chǎn)生的外部標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(參見(jiàn)實(shí)施例42)，經(jīng)熒光檢測(cè)來(lái)完成定量。對(duì)于血漿樣品，將0.2-2μL注入HPLC系統(tǒng)，對(duì)于組織，將約1mg樣品注入HPLC系統(tǒng)。在表16中顯示了肝組織分析的結(jié)果。在分析siRNA含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)肝組織中存在有義鏈，當(dāng)使用二肽連接體基序或在3個(gè)核苷酸的5’-突出部具有未修飾的連接體序列AUC時(shí)，有義鏈定量地從膽固醇脫離。相反，在肝中僅有15％的二硫鍵連接的siRNA在給藥后最初48小時(shí)內(nèi)從膽固醇上脫離，并且穩(wěn)定連接的膽固醇沒(méi)有從siRNA上脫離。當(dāng)比較不含膽固醇的siRNA在肝組織中的絕對(duì)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于二硫鍵連接體和RNAAUC-連接體而言，該量是相似的，完全符合給藥后48小時(shí)的相同的FVII血清活性。二肽連接的膽固醇siRNA得到較低的FVII活性，完全符合所釋放的不含膽固醇的siRNA的較高的量.遞送到肝臟的在有義鏈上具有(AUC)-連接體的膽固醇siRNA綴合物的總量與穩(wěn)定連接或二硫鍵連接的膽固醇相比低約6倍，與二肽綴合的膽固醇siRNA相比低約3倍。這種降低的組織存在可以歸因于以下事實(shí)：AUC-連接體不僅是細(xì)胞內(nèi)核酸酶的底物，而且是循環(huán)系統(tǒng)中存在的核酸酶的底物，如與小鼠血清體外孵育所顯示的那樣。當(dāng)膽固醇配體已經(jīng)在循環(huán)系統(tǒng)中從siRNA上切除后，所得siRNA傾向于腎清除并且被快速地排泄到尿液中，而不是遞送到組織中。表16：在下面的表中，總結(jié)了在實(shí)施例中使用的siRNA：表17：核心序列表18：核心序列和修飾序列的列表實(shí)施方案：1.式(I)化合物其中Y是選自-(CH2)3-或-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-的連接基團(tuán)；R1是-(C1-6)烷基；-(CH2)-萘基；或者-(CH2)m-苯基，其中苯基是未取代的或者被獨(dú)立地選自下述的取代基取代最多四次：-NO2、-CN、鹵素、-O-(CH2)-苯基、-O-(C1-6)烷基，或者-C(O)-NH2；R2是氫；-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯環(huán)是未取代的或者獨(dú)立地被–O-(C1-4)烷基取代；-(CH2)k-C(O)-NH2；-(CH2)k-苯基；-(C1-6)烷基，其是未取代的或者被–S-CH3取代一次；R3是-NH-苯基，其中苯基基團(tuán)進(jìn)一步被獨(dú)立地選自下述的取代基取代：-(CH2)-OH；或-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)；k是1、2、3、4、5、6；m是1、2、3或4；n是0或1；且p是1-20的整數(shù)。2.如實(shí)施方案1所述的化合物，其具有如式(Ia)所示的構(gòu)型3.如實(shí)施方案1或2中任一項(xiàng)所述的化合物，其中Y是-(CH2)3-。4.如實(shí)施方案3所述的化合物，其中Y是-(CH2)3-；R2是-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯環(huán)是未取代的或獨(dú)立地被–O-(C1-4)烷基取代；且R3是-NH-苯基，其中苯基基團(tuán)進(jìn)一步被-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)取代；n是0；且R1和k具有上文所述含義。5.如實(shí)施方案1或2中任一項(xiàng)所述的化合物，其中Y是-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-。6.如實(shí)施方案5所述的化合物，其中Y是-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-；R2是-(CH2)k-N-C(Ph)3，其中苯環(huán)是未取代的或獨(dú)立地被–O-(C1-4)烷基取代；且R3是-NH-苯基，其中苯基基團(tuán)進(jìn)一步被-(CH2)-O-C(O)-O-(4-硝基-苯基)取代；n是0；且R1、k和p具有上文所述含義。7.如實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)所述的化合物作為生物活性化合物的配體的用途，其中所述配體是與生物活性化合物共價(jià)連接。8.如實(shí)施方案7中所述的用途，其中所述生物活性化合物是肽。9.如實(shí)施方案7中所述的用途，其中所述生物活性化合物是核酸。10.式(II)化合物，其中Ra是–(CH2)k-NH2；R1和k具有上文式(I)所述含義；且該生物活性物質(zhì)是核酸、蛋白質(zhì)或肽。11.如實(shí)施方案10所述化合物，其具有式(IIa)所示的構(gòu)型其中Ra是–(CH2)k-NH2；R1和k具有上文式(I)所述含義；且該生物活性物質(zhì)是核酸、蛋白質(zhì)或肽。12.如實(shí)施方案10或11中任一項(xiàng)所述的化合物，其中生物活性化合物是蛋白質(zhì)或肽。13.如實(shí)施方案10或11中任一項(xiàng)所述的化合物，其中生物活性化合物是核酸。14.如實(shí)施方案13中所述化合物，其中核酸是寡核苷酸，其包含具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈和具有修飾模式5’-(Z3)ns-3’的有義鏈，其中w獨(dú)立地是5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯或H，Z1獨(dú)立地是2’-修飾的核苷，Z2獨(dú)立地是2’-脫氧核苷或2’-氟-修飾的核苷，Z3獨(dú)立地是2’-修飾的核苷，na是8-23且ns是8-25。15.如實(shí)施方案13或14中任一項(xiàng)所述的化合物，其中核酸是siRNA。16.如實(shí)施方案13-15中任一項(xiàng)所述的化合物，其中核酸是與遞送聚合物共價(jià)連接。17.包含如實(shí)施方案10-16中任一項(xiàng)所述的化合物的藥物組合物。18.如實(shí)施方案10-16中任一項(xiàng)所述的化合物在體內(nèi)遞送生物活性化合物中的用途。19.如實(shí)施方案10-15中任一項(xiàng)所述的化合物在體內(nèi)遞送生物活性化合物中的用途，其中綴合物是與遞送聚合物組合施用。20.寡核苷酸，包含具有修飾模式5’-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3’的反義鏈和具有修飾模式5’-(Z3)ns-3’的有義鏈，其中w獨(dú)立地是5’-磷酸酯或5’-硫代磷酸酯或H，Z1獨(dú)立地是2’-修飾的核苷，Z2獨(dú)立地是2’-脫氧核苷或2’-氟-修飾的核苷，Z3獨(dú)立地是2’-修飾的核苷，na是8-23且ns是8-25。21.如實(shí)施方案20所述的寡核苷酸，其中Z1是2’-氟-修飾的核苷或2脫氧核苷，且全部其他取代基以及變量na和ns具有上文所述含義。22.如實(shí)施方案20或21中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中Z3是2’-O-甲基修飾的核苷、2’-氟-修飾的核苷或2脫氧核苷，且全部其他取代基以及變量na和ns具有上文所述含義。23.如實(shí)施方案20-23中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其與遞送聚合物共價(jià)連接。24.包含如實(shí)施方案20-23中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸和膽固醇的綴合物。25.包含如實(shí)施方案20-23中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸和式(IV)化合物的綴合物26.小分子和如實(shí)施方案20-23中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸的綴合物，其中小分子包括含有1-10個(gè)2’OH-核苷酸的核苷酸連接體；并且所述寡核苷酸與小分子的核苷酸連接體共價(jià)連接。27.如實(shí)施方案26所述的綴合物，其中小分子是膽固醇或式(V)化合物其中R是包含1-10個(gè)2’OH-核苷酸的核苷酸連接體。28.包含如實(shí)施方案20-23中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸或如實(shí)施方案24-27中任一項(xiàng)所述的綴合物的藥物組合物。29.基本上如上文所述的化合物、用途和方法。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3