本發(fā)明涉及一種化合物，具體涉及一種能夠抑制流感病毒pb2蛋白與rna帽結(jié)合的化合物。

背景技術(shù)：

流行性感冒在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致了很高的發(fā)病率和死亡率，被認(rèn)為是對人類來說最為重要的病毒威脅之一。接種疫苗是控制流感病毒傳播的主要途徑。然而，由于流感疫苗的制備存在諸多局限，例如在新爆發(fā)病毒的鑒定到疫苗的臨床應(yīng)用大約要有6個(gè)月的滯后。所以，抗病毒藥物是目前來說迫切需要的預(yù)防和治療流感的方法。兩類抗病毒藥物已批準(zhǔn)在臨床治療使用，即m2通道蛋白抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶(na)抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。然而，耐藥菌株的出現(xiàn)，如季節(jié)性h3n2，2009年甲型h1n1，h5n1和h7n9高致病性禽流感等，很大程度上削弱了這兩類藥物的臨床使用價(jià)值。所以，新開發(fā)的能夠在不同流感病毒亞型間提供交叉保護(hù)作用的抗病毒藥物備受關(guān)注。流感病毒蛋白的生物學(xué)和結(jié)構(gòu)功能學(xué)研究已在廣泛地開展，這也為新藥篩選提供了更多的靶點(diǎn)。需要特別指出的是，流感病毒rna聚合酶中相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)已被成功解析。由于這些蛋白在不同流感亞型之間相當(dāng)保守。因此，針對rna聚合酶的功能結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)抑或是篩選的藥物更有機(jī)會(huì)對流感產(chǎn)生廣譜的抗病毒效果。

流感病毒rna聚合酶由pa、pb1和pb2三個(gè)亞基組成，它們與核蛋白(np)一起形成的核糖核蛋白(rnp)負(fù)責(zé)催化病毒rna在宿主細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。在一個(gè)被稱為“偷帽”(cap-snatching)的過程中，病毒mrna的轉(zhuǎn)錄首先取決于pb2蛋白捕獲宿主mrna中的帽狀結(jié)構(gòu)，緊隨其后，pa蛋白能夠利用其核酸內(nèi)切酶活性剪切帽子結(jié)構(gòu)下游的rna序列。該序列則被當(dāng)作起始病毒mrna轉(zhuǎn)錄的引物。研究表明，pb2亞單位上的第318-483位氨基酸殘基形成了rna帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pb2cap-bindingdomain)。該功能結(jié)構(gòu)域可以通過5'帽子結(jié)構(gòu)識(shí)別并結(jié)合宿主mrna。由于pb2帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域不同于宿主細(xì)胞中其他蛋白與mrna帽的結(jié)合模式，這表明抑制pb2蛋白和帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合的藥物存在 很小的可能會(huì)影響到宿主細(xì)胞對帽子結(jié)構(gòu)的正常應(yīng)用。所以，pb2帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域是潛在的新型抗病毒藥物的篩選靶點(diǎn)。此外，相關(guān)研究已經(jīng)表明替換pb2帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)將顯著減少pb2帽結(jié)合活性以及整個(gè)rna聚合酶的活性。所以，由pb2帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域篩選而來的抗病毒藥物所誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥毒株的可能性會(huì)大大降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種能夠抑制流感病毒pb2蛋白與rna帽結(jié)合的化合物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種能夠抑制流感病毒pb2蛋白與rna帽結(jié)合的化合物，所述化合物為式(ⅰ)、式(ⅱ)或式(ⅲ)所示的化合物，所述式(ⅰ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

所述式(ⅱ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

所述式(ⅲ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

將上述所述式(ⅰ)所示的化合物命名為pb2-19，將上述所述式(ⅱ)所示的化合物命名為pb2-35，將上述所述式(ⅲ)所示的化合物命名為pb2-39。本發(fā)明所述式(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ)所示的化合物都能夠干擾rna帽與流感病 毒pb2帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。其中所述pb2-39是當(dāng)中最有效的流感病毒抑制劑。pb2-39能夠抑制多個(gè)亞型的流感病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，包括h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9和h9n2亞型。balb/c小鼠在感染致命劑量的流感病毒后接受pb2-39鼻腔給藥，能夠顯著提高的存活率并減少肺組織中的病毒量。

本發(fā)明提供了上述所述的化合物在制備抗流感病毒的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型、乙型和丙型流感病毒中的至少一種。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種化合物，所述化合物為式(ⅰ)、式(ⅱ)或式(ⅲ)所示的化合物，所述化合物均能夠抑制流感病毒pb2蛋白與rna帽結(jié)合，具有抗流感病毒的功能。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中所述pb2-39的體外抗病毒效果；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中所述pb2-39的小鼠體內(nèi)抗病毒療效；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中所述pb2-19的小鼠體內(nèi)抗病毒效果。

具體實(shí)施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

1.材料和方法

1.1細(xì)胞、病毒

犬腎細(xì)胞(mdck)在包含有10％熱滅活胎牛血清(fbs)，50單位/毫升青霉素和50微克/毫升鏈霉素(p/s)的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。mdck在病毒感染后，在含有1微克/毫升的tpck胰蛋白酶但不含有胎牛血清的mem中培養(yǎng)。總共8株/6種亞型的流感病毒株，即a/hk/415742/09(h1n1)、a/hongkong/1/1968(h3n2)、a/shenzhen/406h/2006(h5n1_sz)、a/hongkong/156/97(h5n1_hk)、a/vietnam/1194/2004(h5n1_vn)、a/netherlands/219/2003(h7n7)、a/anhui/1/2013(h7n9)和a/hk/1073/1999(h9n2)分別在mdck細(xì)胞中增殖并在本研究中使用。病毒的滴度通過空斑試驗(yàn)(plaqueassay)測定后，分裝并保存在-80攝氏度。所有與活病毒相關(guān)試驗(yàn)是在生物安全2級(jí)或3級(jí)設(shè)施中進(jìn)行的。

1.2選擇性指數(shù)

選擇性指數(shù)(selectivityindex)是通過50％的細(xì)胞毒性濃度(cc50)除以50％的病毒抑制濃度(ic50)計(jì)算而來的，該指標(biāo)數(shù)值越高則指示該藥物有越好的臨床應(yīng)用前景。我們通過mtt法測定了本發(fā)明所述化合物的cc50，再通過空斑減數(shù)試驗(yàn)確定ic50值，最終得到了奔赴嗎所述化合物的選擇性指數(shù)。

1.3多周期病毒生長試驗(yàn)

mdck細(xì)胞在接種了感染復(fù)數(shù)(moi)為0.002的流感h1n1病毒后，在含有20μm的pb2-39以及1毫克/毫升tpck胰蛋白酶的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。感染后0、6、21、25、32、47和54小時(shí)后，收集病毒上清液并使用空斑法測定病毒滴度。

1.4交叉保護(hù)力試驗(yàn)

本發(fā)明所述化合物針對多個(gè)亞型的流感病毒，包括甲型h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9和h9n2的抗病毒效果也進(jìn)行了測試。簡單地說，mdck細(xì)胞在接種0.002個(gè)moi的流感病毒后1小時(shí)，用pbs洗凈，并將培養(yǎng)基置換成新鮮的含有不同濃度(20、5、1.25、0.31μm)本發(fā)明所述化合物的mem培養(yǎng)基。病毒接種24小時(shí)候后，收集細(xì)胞上清液，并采用反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-qpcr)技術(shù)測定病毒的滴度。

1.5本發(fā)明所述化合物體內(nèi)抗病毒療效評估

本實(shí)驗(yàn)采用6-8周齡的balb/c雌性小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。所有實(shí)驗(yàn)遵循生物安全3級(jí)動(dòng)物設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序并得到香港大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。麻醉后,共42只小鼠(14只/組)經(jīng)鼻腔接種一定劑量的流感病毒。藥物在病毒接種6小時(shí)后由鼻腔途徑給藥，每日2次，共3天。第一組的小鼠接受20微升1毫克/毫升的pb2-39(即2.5毫克/千克體重)。第二組的小鼠經(jīng)鼻腔接受20微升2.5毫克/毫升的扎那米韋作為陽性對照。最后一組小鼠經(jīng)鼻腔注射以20微升pbs作為陰性對照。動(dòng)物的生命體征總共監(jiān)測21天或直至死亡。在病毒接種后的第4天，隨機(jī)從每組小鼠中選取四只處死后收集肺部組織。一半的肺組織碾磨后取上清采用空斑法和rt-qpcr法測定病毒滴度，另一半肺組織立即被固定在10％福爾馬林中進(jìn)行的組織病理學(xué)分析。pb2-19在老鼠模型上的抗病毒效果評價(jià)采用與pb2-39完全相同的方法。不同的是，由于水溶解度的限制，pb2-19的用量為1毫克/千克體重。

2.結(jié)果

我們測定了本發(fā)明所述化合物的ic50和cc50，并通過cc50除以ic50計(jì)算選擇性指標(biāo)(selectivityindex)。一般來說，該指標(biāo)數(shù)值越高則指示該藥物有越好的臨床應(yīng)用前景。因?yàn)閜b2-19和pb2-39顯示出的選擇性指數(shù)高于100(表1)，所以我們在隨后的研究中對該兩個(gè)化合物詳細(xì)進(jìn)行了評價(jià)。

表1本發(fā)明所述化合物的選擇性指數(shù)結(jié)果

2.1pb2-39提供廣譜的抗甲型流感病毒作用

首先，我們測試了pb2-39在多周期病毒生長試驗(yàn)中的表現(xiàn)。如圖1a所示，該化合物顯示了明顯的抗流感病毒作用。針對h1n1亞型流感病毒，使用20μm的pb2-39能夠使上清液中的病毒滴度減少100-1000倍.由于pb2帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列在不同亞型的流感病毒之間高度保守，我們進(jìn)一步評估了pb2-39對h5n1、h7n7、h7n9、h9n2、h3n2亞型的毒株在細(xì)胞水平的抗病毒效果。如圖1b所示，pb2-39能夠以劑量依賴的方式抑制所有測試的流感毒株的復(fù)制。然而，不同亞型的病毒對pb2-39表現(xiàn)出不同的敏感性。

2.2pb2-39能夠在小鼠體內(nèi)抑制流感病毒生長

緊接著，我們評估了pb2-39在小鼠體內(nèi)的抗病毒效果。首先，我們測定了經(jīng)不同亞型流感病毒感染的小鼠在經(jīng)過pb2-39治療后的存活率。如圖2a所示，當(dāng)小鼠接種5個(gè)ld50(半數(shù)致死量)的h1n1病毒后，經(jīng)陰性對照pbs處理的小鼠全部死亡(存活率0％)，而經(jīng)陽性對照(扎那米韋)或者pb2-39治療的小鼠全部存活(存活率100％)；當(dāng)小鼠接種1個(gè)ld50的h5n1流感病毒后，經(jīng)陰性對照pbs處理的小鼠有一半死亡(存活率50％)，而經(jīng)陽性對照(扎那米韋)或者pb2-39治療的小鼠全部存活(存活率100％)；當(dāng)小鼠接種1個(gè)ld80的h7n9病毒后，經(jīng)陰性對照pbs處理的小鼠有80％死亡(存活率20％)，而經(jīng)陽性對照(扎那米韋)或者pb2-39治療的小鼠全部存活(存活率100％)。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，pb2-39能夠針對不同流感病毒的感染顯著提高小鼠的存活率。在感染過后的第4天，每個(gè)組中隨機(jī)挑選4只小鼠取肺并通過空斑試驗(yàn)測定肺組織 中的病毒含量。如圖2b結(jié)果表明，pb2-39的治療能夠顯著減少肺組織中的病毒量。此外，如圖2c所示的組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步表明，經(jīng)過pb2-39治療的小鼠，肺組織間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及肺泡損傷亦得到改善。我們的結(jié)果表明pb2-39能有效抑制流感病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制。

2.3pb2-19能夠在小鼠體內(nèi)抑制流感病毒生長

在此前的試驗(yàn)中，因?yàn)閜b2-19也顯示出較好的臨床應(yīng)用前景，即選擇性指數(shù)為273(表1),所以我們也評價(jià)了pb2-19在小鼠體內(nèi)的抗病毒效果。如圖3所示，采用的試驗(yàn)手段與pb2-39基本相同，不同的是，我們只評價(jià)了pb2-19針對h1n1流感病毒的體內(nèi)抗病毒效果。結(jié)果表明，當(dāng)小鼠接種1個(gè)ld60的h1n1病毒后，經(jīng)陰性對照pbs處理的小鼠有60％死亡(存活率40％)，而經(jīng)陽性對照(扎那米韋)或者pb2-19治療的小鼠全部存活(存活率100％)(圖3a)。此外，pb2-19也能夠有效得減少病毒在實(shí)驗(yàn)小鼠肺部的繁殖(圖3b)。組織病理學(xué)檢查的結(jié)果也支持pb2-19能夠提供體內(nèi)的抗流感病毒效果(圖3c)。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。