本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種流感病毒抗體、其制備方法及應(yīng)用，尤其涉及一種b型流感病毒廣譜中和抗體、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

流感病毒(influenzavirus)是引起流行性感冒的人畜共患傳染病病原，屬于正粘病毒科(orthomyxoviridae)，流感病毒屬。按照流感病毒核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原性的不同，流感病毒可分為a、b、c三型，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的牛流感病毒歸為了d型。

a型流感病毒可引起人、禽、哺乳動(dòng)物和蝙蝠等感染和發(fā)病，危害最為嚴(yán)重。根據(jù)病毒顆粒表面血凝素蛋白(hemagglutinin，ha)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，na)的不同，a型流感病毒可分為多個(gè)亞型，目前已發(fā)現(xiàn)的ha有18個(gè)亞型(h1-h18)，na有11個(gè)亞型。a型流感病毒容易發(fā)生抗原變異和漂移，曾四次引起世界性大流感，也是季節(jié)性流感的主要元兇。b型流感種系較少。自1940年首次分離后，b型流感病毒逐漸進(jìn)化成以b/victoria/2/1987為代表的b-victorialineage(bv)和以b/yamagata/16/1988(by)的兩個(gè)種系。截止目前為止，b型流感病毒僅為3個(gè)種系：現(xiàn)在流行的bv系、by系，以及在bv和by出現(xiàn)以前的b型流感毒株種系。

b型流感病毒的自然宿主主要是人，曾經(jīng)在海豹中檢測(cè)到。b型流感病毒的變異頻率和宿主范圍比a型流感病毒要低，要小，也從未造成過(guò)流感大流行。人們認(rèn)為b型流感病毒的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于a型流感病毒，這致使b型流感的研究也相應(yīng)較少。然而，近些年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，b型流感病毒在特定的情況下 所導(dǎo)致的疾病負(fù)擔(dān)甚至超過(guò)了a型流感病毒。原因在于b型流感多發(fā)于兒童和老年人。幼兒園或?qū)W校等人群密集環(huán)境因素使得b型流感在兒童間呈集體性暴發(fā)，兒童感染后常見(jiàn)的臨床癥狀為高燒、肌肉酸痛、咳嗽和頭痛等，如治療不及時(shí)，可在短時(shí)間內(nèi)引發(fā)肺炎、腦膜炎和心肌炎等癥狀。由于老年人抵抗力較低，感染b型流感后出現(xiàn)并發(fā)癥較多，致使病情嚴(yán)重，無(wú)疑增加了死亡率。在2013-2014年流感流行季節(jié)，在北美地區(qū)特別是美國(guó)爆發(fā)了大范圍的b型流感疫情，使得美國(guó)疾病預(yù)防控制中心提出了b型流感病毒的致病性不可低估的指導(dǎo)性意見(jiàn)。

疫苗接種是目前預(yù)防和控制流感的首選策略。臨床上經(jīng)常使用流感疫苗包括a型流感病毒中的h1n1亞型流感病毒、h3n2亞型流感病毒和一個(gè)種系b型流感病毒三種流感組份，為三價(jià)流感疫苗。近些年來(lái)，季節(jié)性流感疫苗又增加了一個(gè)種系的b型流感病毒組分，稱之為四價(jià)疫苗。流感疫苗候選毒株會(huì)隨著流行毒株的變化而更新，然而仍然趕不上季節(jié)性流感病毒變異的速度，更無(wú)法預(yù)防跨種傳播而來(lái)的禽流感和豬流感。簡(jiǎn)而言之，流感病毒的不可預(yù)測(cè)性及高度的變異性致使流感防控成為研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。這些無(wú)疑使得能預(yù)防多個(gè)亞型a型流感病毒或多個(gè)種系b型流感病毒的廣譜流感疫苗顯得尤為重要。研究學(xué)者嘗試了多種方法來(lái)開發(fā)廣譜流感疫苗，如表達(dá)高度保守的ha莖部區(qū)作為亞單位疫苗、或以形成納米顆粒的蛋白為骨架，遞呈ha莖部區(qū)的病毒樣顆粒疫苗等。此外，在廣譜流感疫苗的概念和基礎(chǔ)上，廣譜流感病毒中和抗體也逐漸成為流感預(yù)防和治療藥物的研究焦點(diǎn)和重點(diǎn)。

ha是流感病毒的主要表面抗原，結(jié)合在ha受體結(jié)合部位或莖部區(qū)的抗體能有效抑制ha蛋白的受體結(jié)合和膜融合活性。目前，已有多個(gè)靶向ha頭部區(qū)的人源或鼠源單克隆抗體，其中11個(gè)抗體的抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)已解析。這類 抗體主要通過(guò)抑制病毒與受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。大多數(shù)為型特異性，也有一些廣譜型單克隆抗體，如可中和多個(gè)a型流感病毒亞型的廣譜中和抗體c05、f045-092、s139/1，以及中和多個(gè)b型流感病毒種系的cr8033和cr8071人源單克隆抗體。ha頭部的抗原變異較為頻繁，容易發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象，ha莖部區(qū)相對(duì)于頭部區(qū)更為保守，靶向ha莖部區(qū)的廣譜型抗體的研發(fā)更受青睞。近些年研發(fā)出較多靶向ha莖部區(qū)的單克隆抗體：如cr6261，f10，cr8020，fi6v3和6f12等。cr6261和f10可中和group1的a型流感病毒，cr8020可中和group2的a型流感病毒，而fi6v3甚至可中和所有亞型的ha，而cr9114抗體則是可中和a型流感病毒和b型流感病毒超級(jí)廣譜中和抗體。

常用的人源流感病毒中和抗體的篩選方法有噬菌體抗體庫(kù)展示篩選、單個(gè)b細(xì)胞測(cè)序技術(shù)、b細(xì)胞永生化和人源化小鼠雜交瘤細(xì)胞篩選等等，目前，已利用這些方法獲得了多種人源廣譜中和抗體，如c05、f045-092、cr6261、cr9114、cr8033、cr8071、f10和fi6v3等。而我們則利用高通量測(cè)序的方法獲得了一株a型流感病毒的廣譜中和抗體af4h1k1。這種方法利用患者或疫苗免疫個(gè)體的pbmc來(lái)構(gòu)建抗體文庫(kù)，采用二代高通量測(cè)序的方式獲得bcr文庫(kù)，通過(guò)分析感染或疫苗不同免疫時(shí)期的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的頻率變化來(lái)挑選，簡(jiǎn)化了抗體的篩選流程，為抗體藥物的研發(fā)提供了一個(gè)捷徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足及實(shí)際的需求，本發(fā)明提供了一種流感病毒抗體、其制備方法及應(yīng)用，特別是一種b型流感病毒廣譜中和抗體、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供的b型流感病毒廣譜中和抗體為流感的預(yù)防和治療提供了新的治療方法，為b型流感病毒感染診斷以及b型流感病毒表面抗原h(huán)a的檢測(cè)提供了新的選擇，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種b型流感病毒廣譜中和抗體，所述抗體為人源單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該抗體的輕鏈高變區(qū)cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seqidno.5、seqidno.6和seqidno.7所示；其重鏈高變區(qū)cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10所示。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，序列可以包含某些生物學(xué)功能等同的氨基酸或“保守性替代”，其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其經(jīng)基因工程改造以改進(jìn)cdr或含cdr抗體的特性。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前面所述的氨基酸序列如下：

seqidno.1：

diqltqspsflstsvgdrvtitcrashdiysylawyqqkpgkapklliyaastlqtgvpsrfsgsgfgteftltisslqpedfgtyycqqlrsypytfgqgtkleik。

seqidno.2：

qvqlvqsgselrrpgasvkisckasgytftdyamnwvrqvpgqglewvgwintdngnptyaeafagrfvfsldtsvstaylqisslkaddtavyfcaanwggyyydssvnsgggyfdnwgqgtlvtvfs。

seqidno.5：hdiysy。

seqidno.6：aas。

seqidno.7：qqlrsypyt。

seqidno.8：gytftdya。

seqidno.9：intdngnp。

seqidno.10：aanwggyyydssvnsgggyfdn。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體的輕鏈框架區(qū)fr1、fr2和fr3的氨基酸序列如seqidno.11、seqidno.12或seqidno.13所示；其重鏈框架區(qū)fr1、fr2和fr3的氨基酸序列如seqidno.14、seqidno.15或seqidno.16所示。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前面所述的氨基酸序列如下：

seqidno.11：diqltqspsflstsvgdrvtitcras。

seqidno.12：lawyqqkpgkapklliy。

seqidno.13：tlqtgvpsrfsgsgfgteftltisslqpedfgtyyc。

seqidno.14：qvqlvqsgselrrpgasvkisckas。

seqidno.15：mnwvrqvpgqglewvgw。

seqidno.16：tyaeafagrfvfsldtsvstaylqisslkaddtavyfc。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體為人源單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體或其衍生物。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的抗體或其抗原結(jié)合片段，能夠很好的中和yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，該抗體能抑制b型流感病毒凝集雞紅細(xì)胞的能力，是血凝抑制抗體；且所述抗體能抑制b型流感病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，抑制b型流感病毒感染小鼠引起的體重 下降，保護(hù)小鼠在b型流感病毒感染后仍有100％存活率，從而可以有效預(yù)防和治療由b型流感病毒引起的疾病。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種dna片段。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該dna片段編碼如第一方面所述的抗體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前面所描述的dna片段，包含重鏈可變區(qū)編碼序列和輕鏈可變區(qū)編碼序列；其編碼輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如seqidno.3和seqidno.4所示。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前面所述的核苷酸序列如下：

seqidno.3：

gacatccagttgacccagtctccatccttcctgtctacatctgtaggggacagagtcaccatcacttgccgggccagtcacgacatttacagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaactggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatttgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttggaacttattactgtcaacaacttaggagttacccgtacacttttggccaggggaccaaactggagatcaaa。

seqidno.4：

caggtgcagctggttcaatctgggtctgagttgaggaggcctggggcctcagtgaaaatttcgtgcaaggcttccggatacaccttcaccgactatgctatgaattgggtccgccaggtccctggacaaggtttggagtgggtgggatggatcaacaccgacaatgggaacccaacgtatgccgaggccttcgccggacggtttgtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagcctaaaggctgacgacactgccgtatacttttgtgcggccaattgg ggaggctattattatgatagttctgttaattccggcgggggctactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtcttctca。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，能夠有效地合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結(jié)合片段，前面所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)同樣適用該多核苷酸，在此不再贅述。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含至少一個(gè)拷貝的如第二方面所述的dna片段。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如第三方面所述的表達(dá)載體。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠利用前面所述的多核苷酸有效地合成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于b型流感病毒廣譜中和抗體或其抗原結(jié)合片段，前面所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)同樣適用該多核苷酸，在此不再贅述。

在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述b型流感病毒廣譜中和抗體的制備方法，包括如下步驟：

(1)分離季節(jié)性流感疫苗免疫者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，提取rna，反轉(zhuǎn)錄cdna；

(2)擴(kuò)增重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)序列，根據(jù)cdr豐度進(jìn)行挑選并合成；

(3)將合成的抗體片段構(gòu)建到表達(dá)載體中。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體的制備方法可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)進(jìn)行，在此不做特殊限制。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3)所述的載體為哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，優(yōu)選為 pcaggs哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。

考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對(duì)編碼上述抗體的基因序列進(jìn)行改造，獲得編碼具有相同功能的抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛(ài)性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達(dá)效率。

進(jìn)一步地，本發(fā)明將前面所述抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)進(jìn)行重組，可獲得分子量更小的單鏈抗體(scfv)，該抗體同樣能夠特異性識(shí)別b型流感病毒表面抗原h(huán)a。單鏈抗體穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用?？蓪⑸鲜鼍幋a抗體的基因、scfv基因克隆到表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，獲得所述抗體以及單鏈抗體。

此外，可將前面所述抗體的輕鏈可變區(qū)編碼基因和重鏈可變區(qū)編碼基因克隆到全抗表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)抗b型流感病毒的全抗免疫球蛋白。

利用血凝抑制試驗(yàn)，以及中和試驗(yàn)等方法對(duì)獲得的b型流感病毒抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明所述抗體針對(duì)b型流感病毒均有特異性結(jié)合，利用中和試驗(yàn)對(duì)所述抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明該抗體對(duì)yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒均具有較好的中和活性。

在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的b型流感病毒廣譜中和抗體，或如第二方面所述b型流感病毒廣譜中和抗體的dna片段，或如第三方面所述的表達(dá)載體，或如第四方面所述的宿主細(xì)胞在制備預(yù)防或治療由b型流感病毒引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物組合物包含前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段或前面所述的dna片段。

在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的b型流感病毒廣譜中和抗體在制備對(duì)多種系b型流感病毒的ha抗原具有親和力和中和活性的試劑中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明所述抗體能夠很好的中和yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，該抗體能抑制病毒凝集雞紅細(xì)胞的能力，是血凝抑制類抗體，其hi效價(jià)在0.24μg/ml-4.7μg/ml之間，其中和效價(jià)ic50在0.02μg/ml-1.21μg/ml之間；

(2)本發(fā)明所述抗體能夠抑制b型流感病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，抑制b型流感病毒感染后小鼠的體重下降，保護(hù)小鼠在b型流感病毒感染后仍有100％的存活率；

(3)本發(fā)明所述抗體的獲得為b型流感的預(yù)防和治療提供了新的候選，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明制備的0809抗體的igg和fab經(jīng)superdextm20010/300gl分子篩層析純化結(jié)果；

圖2為本發(fā)明制備的抗體0809在balb/c體內(nèi)預(yù)防效力評(píng)估，其中，圖2(a)為小鼠感染病毒后的體重變化；圖2(b)為小鼠感染病毒后的存活率；

圖3為本發(fā)明制備的抗體0809在balb/c體內(nèi)抑制病毒復(fù)制的評(píng)估，其中，圖3(a)為攻毒后3天的肺部病毒滴度；圖3(b)為攻毒后5天的肺部病毒滴度。

下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡(jiǎn)易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為 準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，需要說(shuō)明的是下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。另外，如果沒(méi)有明確說(shuō)明，在下面的實(shí)施例中所采用的所有試劑均為市場(chǎng)上可以購(gòu)得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，對(duì)于沒(méi)有列出的反應(yīng)條件，也均為本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的。

實(shí)施例1抗體的制備

b型流感病毒廣譜中和抗體的制備方法，包括如下步驟：

(1)在志愿者接種季節(jié)性流感疫苗后的0天和7天采集外周血中的pbmc，提取rna，反轉(zhuǎn)錄cdna；

(2)擴(kuò)增出重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)序列，將擴(kuò)增的目的片段利用miseq2x300bp進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析；

(3)以cdr豐度為主要參數(shù)挑選免疫者免疫7天后的高頻可變區(qū)序列，并通過(guò)重鏈輕鏈配對(duì)算法計(jì)算自然配對(duì)的幾率，接著挑選出cdr1、cdr2和cdr3的高頻出現(xiàn)的vh和vl序列加上各自的恒定區(qū)進(jìn)行合成；

所述輕鏈可變區(qū)(vl)的核苷酸序列為：

gacatccagttgacccagtctccatccttcctgtctacatctgtaggggacagagtcaccatcacttgccgggccagtcacgacatttacagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaactggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatttgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttggaacttattactgtcaacaacttaggagttacccgtacacttttggccaggg gaccaaactggagatcaaa；

所述重鏈可變區(qū)(vh)的核苷酸序列為：

caggtgcagctggttcaatctgggtctgagttgaggaggcctggggcctcagtgaaaatttcgtgcaaggcttccggatacaccttcaccgactatgctatgaattgggtccgccaggtccctggacaaggtttggagtgggtgggatggatcaacaccgacaatgggaacccaacgtatgccgaggccttcgccggacggtttgtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagcctaaaggctgacgacactgccgtatacttttgtgcggccaattggggaggctattattatgatagttctgttaattccggcgggggctactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtcttctca。

(4)以igg和fab形式，在n端加入對(duì)應(yīng)的重鏈和輕鏈的分泌信號(hào)肽后，將抗體片段構(gòu)建到pcaggs哺乳動(dòng)物表達(dá)載體；

(5)將插入重鏈和輕鏈序列的pcaggs表達(dá)載體，通過(guò)pei轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞進(jìn)行大量表達(dá)，并進(jìn)行純化；

(6)在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后96h后收獲293t上清，而后，經(jīng)過(guò)離心、0.22μm的濾膜過(guò)濾，親和層析純化和分子篩層析純化獲得純度較高的fab或者igg。純化后的抗體，經(jīng)elisa檢測(cè)，獲得具有b型流感病毒結(jié)合活性的一株單克隆抗體，命名為0809。0809經(jīng)superdextm75hiload20/16075pg分子篩層析純化的結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，通過(guò)純化后都能得到單一所要抗體的igg或fab的形式。

實(shí)施例2抗原抗體親和力測(cè)試

利用表面等離子共振技術(shù)，將0809的fab(10μg/ml)形式通過(guò)氨基偶聯(lián)的作用固定到cm5芯片上，固定值達(dá)到500ru，流動(dòng)相抗原蛋白b型流感病毒 ha按2倍比稀釋(濃度范圍1μm-100μm)。選取kinject模式進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，機(jī)器流速30μl/min，進(jìn)樣時(shí)間1-2min，解離時(shí)間2-6min。而后，利用biaevaluation軟件計(jì)算親和力，表1示出了0809fab與各種系b型流感病毒ha的親和力測(cè)定結(jié)果。由表1可以看出，0809與b型流感病毒yamagata和victoria種系的ha結(jié)合解離模式幾乎都是快結(jié)合快解離，親和力大小分別為4.11nm和7.63nm。

表1.0809fab與各種系b型流感病毒ha的親和力測(cè)定

實(shí)施例3抗體的血凝抑制(hi)試驗(yàn)與中和試驗(yàn)

血凝抑制試驗(yàn)：采用固定病毒稀釋抗體的方法，將0809igg抗體稀釋液同4個(gè)血凝單位的b型流感病毒在室溫下作用30min，而后加入同病毒液同等體積的1％雞紅細(xì)胞，表2示出了0809igg與各種系b型流感病毒的血凝抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0809igg是血凝抑制性抗體，對(duì)不同種系的b型流感病毒均有較高的血凝抑制活性，hi效價(jià)在0.24μg/ml-4.7μg/ml之間。

中和試驗(yàn)：采用固定病毒稀釋抗體的方法，將0809igg抗體稀釋液同等體積的200tcid50不同b型流感病毒毒株混合在一起，室溫放置1h。而后將病毒抗體混合液接種96孔板的細(xì)胞，100μl/孔。放置37℃作用1h后，將上清去掉，用dmem洗滌三次，而后加入含有0.5μg/ml胰酶的dmem維持液。放在37℃ 培養(yǎng)72h。每天觀察并記錄細(xì)胞病變(cpe)，并在最后一天，利用血凝的方法檢測(cè)每孔細(xì)胞上清的血凝活性，以此來(lái)判斷有無(wú)病毒復(fù)制，以及抗體的中和效果，表2示出了0809igg與各種系b型流感病毒的中和活性。結(jié)果表明0809igg對(duì)不同種系的b型流感病毒均有較高的中和活性，ic50在0.02μg/ml-1.21μg/ml之間。

表2.0809igg與各種系b型流感病毒血凝抑制活性和中和活性測(cè)定

實(shí)施例4體內(nèi)抗體預(yù)防效果

(1)預(yù)防實(shí)驗(yàn)

小鼠尾靜脈注射0809igg抗體，劑量分別為15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg和1mg/kg。同時(shí)設(shè)定無(wú)關(guān)抗體igg為對(duì)照組，劑量為10mg/kg?？贵w注射24h后干冰麻醉小鼠，滴鼻感染小鼠適應(yīng)毒b/lee/1940。每組15只，其中5只用來(lái) 檢測(cè)感染后3天肺中病毒滴度，5只用來(lái)檢測(cè)感染后5天肺中的病毒滴度，剩下5只用來(lái)觀察感染后14天內(nèi)小鼠的體重變化及生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0809給藥劑量為1mg/kg時(shí)，同高劑量一樣(15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)，能抑制病毒感染引起的體重降低，如圖2(a)，并能提供100％的保護(hù)，見(jiàn)圖2(b)。0809抗體四個(gè)劑量組(15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、1mg/kg)均能100％保護(hù)小鼠，因此在圖2(b)中顯示代表這四組的小鼠存活曲線完全重疊在一起。

(2)肺中病毒滴度的測(cè)定

感染后3天和5天的小鼠肺組織勻漿機(jī)磨成勻漿后，2000rpm，4℃，10min離心，取離心后的上清，按10倍倍比稀釋后加入pbs洗兩次的96孔板培養(yǎng)的mdck細(xì)胞，每孔100μl，每個(gè)梯度3個(gè)復(fù)孔。37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，每天觀察細(xì)胞病變，并與第3天測(cè)定血凝試驗(yàn)結(jié)果，用reed-muench方法計(jì)算肺的tcid50。結(jié)果表明，在感染后3天(圖3(a))，0809igg能夠中和小鼠體的b/lee/1940病毒，抑制病毒在小鼠肺內(nèi)的復(fù)制，15mg/kg、10mg/kg和5mg/kg組同陰性抗體對(duì)照組(10mg/kg劑量)相比，差異極其顯著(***p<0.001)，而1mg/kg劑量，差異也顯著(*p<0.05)。在感染后5天(圖3(b))，15mg/kg、10mg/kg和5mg/kg的0809igg處理組小鼠的肺部病毒已經(jīng)完全清除，而1mg/kg組還有些許病毒，但是同陰性抗體組相比，病毒滴度還是有所降低，差異顯著(*p<0.05)。

通過(guò)上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明所述抗體能夠很好的中和yamagata種系、victoria種系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，該抗體能抑制b型流感病毒凝集雞紅細(xì)胞的能力，是血凝抑制抗體；且所述抗體能抑制b型流感病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，抑制b型流感病毒感染小鼠引起的體重下降，保護(hù)小鼠在b型流感病毒感染后仍有100％存活率，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說(shuō)明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。