關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明

按照nih合同號(hào)hhsn272200900036c在美國(guó)政府支持下做出本發(fā)明的多個(gè)方面，美國(guó)政府可能具有本發(fā)明中的某些權(quán)利。

對(duì)有關(guān)專利和專利申請(qǐng)的交叉引用

這是一篇專利合作條約申請(qǐng)并要求2014年11月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/079,027的權(quán)益。

發(fā)明背景

本發(fā)明涉及化合物、它們的制備方法、含有它們的組合物、以及它們作為疫苗佐劑和在多種障礙的治療中的治療用途。

先天性免疫系統(tǒng)通過(guò)有限數(shù)目的種系編碼的模式識(shí)別受體(prr)來(lái)識(shí)別微生物，所述模式識(shí)別受體具有許多重要特征。

toll-樣受體(tlr)是檢測(cè)病原體的大類別共有的高度保守的微生物組分的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的prr的家族。tlr在免疫細(xì)胞上表達(dá)，且在活化后動(dòng)員目的在于消除入侵病原體的防御機(jī)制。在超過(guò)10種已經(jīng)在人類中鑒別出的已知tlr中，有些似乎局限于細(xì)胞質(zhì)隔室并參與非自身核酸的檢測(cè)(tlr3、7、8和9)。參見，例如，akira等人,natrevimmunol2004,4,499-511;o'neill,等人,natrevimmunol2013,13,453-460。

tlr的活化調(diào)節(jié)導(dǎo)致炎癥性細(xì)胞因子/趨化因子和i型干擾素(ifnα/β)的表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞途徑，所述表達(dá)可以導(dǎo)致抗原特異性的體液應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的優(yōu)先增強(qiáng)。

tlr7和tlr8是定位在細(xì)胞的胞內(nèi)體隔室中的tlr亞組(tlr3、7、8和9)的成員。tlr7通過(guò)識(shí)別ssrna而在抗病毒防御中起到關(guān)鍵性作用(diebolds.s.等人,science,2004:303,1529-1531；和lundj.m.等人,pnas,2004:101,5598-5603)。tlr7在人中具有受限的表達(dá)模式，并主要由b細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pdc)表達(dá)，而且較少程度地由單核細(xì)胞表達(dá)。漿細(xì)胞樣dc是源自淋巴的樹突細(xì)胞的獨(dú)特群體(通常0.2-0.8%的外周血單核細(xì)胞(pbmc))，并且是主要的產(chǎn)生i型干擾素的細(xì)胞，所述細(xì)胞響應(yīng)于病毒性感染而分泌高水平的干擾素-α(ifnα)和干擾素-β(ifnβ)(liuy-j,annu.rev.immunol.,2005:23,275-306)。

已經(jīng)描述了可以在動(dòng)物中和在人中誘導(dǎo)細(xì)胞因子的tlr7的小分子激動(dòng)劑(takedak.等人,annu.rev.immunol.,2003:21,335-76)。tlr7激動(dòng)劑包括咪唑并喹啉化合物諸如咪喹莫特和瑞喹莫德、氧代腺嘌呤類似物以及核苷類似物諸如洛索立賓和7-硫雜-8-氧代鳥苷，其已知會(huì)誘導(dǎo)干擾素α。國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo2007/034882(pct/jp2006/318758;dainipponsumitomopharmaco.ltd./astrazenecaaktiebolag)公開了被鑒別為可用作藥物的某些腺嘌呤化合物。

已經(jīng)證實(shí)某些腺嘌呤衍生物化合物是人干擾素的誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)人干擾素的化合物可以用作疫苗佐劑，以及用于治療多種障礙，包括感染性疾病、哮喘、癌癥、炎性病癥和變應(yīng)性疾病。因而需要提供對(duì)tlr7/8具有選擇性和/或效能以及高相對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的化合物。

發(fā)明概述

在第一方面，提供了式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中；

r¹是丁氧基或甲基丁氧基；

r²是具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)：

其中n是具有5的值的整數(shù)；

het是含有5個(gè)碳原子和1個(gè)氮原子的6元飽和雜環(huán)，其中het在所述雜環(huán)的碳4位置處連接至-(ch2)n-基團(tuán)；且

r³是氫。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，r¹選自1-甲基丁氧基和(1s)-1-甲基丁氧基。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，r¹是1-甲基丁氧基。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，r¹是(1s)-1-甲基丁氧基。

本發(fā)明的另一個(gè)方面是式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中

r¹是(1s)-1-甲基丁氧基;

r²是具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)：

其中n是具有5的值的整數(shù)；

het是哌啶，其中het在所述雜環(huán)的碳4位置處連接至-(ch2)n-基團(tuán)；且

r³是氫。

本發(fā)明的另一個(gè)方面是化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用在治療中的式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)將式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用在治療中時(shí)，將它用作活性治療劑。

作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用在治療中的化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)將化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽用在治療中時(shí)，將它用作活性治療劑。

因此還提供了用于治療變應(yīng)性疾病或其它炎性病癥、感染性疾病或癌癥的式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

因此還提供了用于治療變應(yīng)性疾病或其它炎性病癥、感染性疾病或癌癥的化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

因此還提供了用于治療變應(yīng)性鼻炎的式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

還提供了用于治療變應(yīng)性鼻炎的化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

因此還提供了用于治療哮喘的式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

因此還提供了用于治療哮喘的化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種免疫原性組合物，其包含抗原或抗原組合物和式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種免疫原性組合物，其包含抗原或抗原組合物和化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種疫苗組合物，其包含抗原或抗原組合物和式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種疫苗組合物，其包含抗原或抗原組合物和化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療或預(yù)防疾病的方法，所述方法包括給遭受或易感疾病的人對(duì)象施用免疫原性組合物，其包含抗原或抗原組合物和式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療或預(yù)防疾病的方法，所述方法包括給遭受或易感疾病的人對(duì)象施用免疫原性組合物，其包含抗原或抗原組合物和化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療或預(yù)防疾病的方法，所述方法包括給遭受或易感疾病的患者人對(duì)象施用疫苗組合物，其包含抗原或抗原組合物和式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療或預(yù)防疾病的方法，所述方法包括給遭受或易感疾病的患者人對(duì)象施用疫苗組合物，其包含抗原或抗原組合物和化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備包含抗原或抗原組合物的免疫原性組合物的用途，所述免疫原性組合物用于治療或預(yù)防疾病。

進(jìn)一步提供了化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備包含抗原或抗原組合物的免疫原性組合物的用途，所述免疫原性組合物用于治療或預(yù)防疾病。

進(jìn)一步提供了式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備包含抗原或抗原組合物的疫苗組合物的用途，所述疫苗組合物用于治療或預(yù)防疾病。

進(jìn)一步提供了化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備包含抗原或抗原組合物的疫苗組合物的用途，所述疫苗組合物用于治療或預(yù)防疾病。

進(jìn)一步提供了式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療變應(yīng)性疾病或其它炎性病癥、感染性疾病或癌癥。

進(jìn)一步提供了化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療變應(yīng)性疾病或其它炎性病癥、感染性疾病或癌癥。

進(jìn)一步提供了式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療變應(yīng)性鼻炎。

進(jìn)一步提供了化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療變應(yīng)性鼻炎。

進(jìn)一步提供了式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療哮喘。

進(jìn)一步提供了化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療哮喘。

進(jìn)一步提供了一種治療變應(yīng)性疾病或其它炎性病癥、感染性疾病或癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的人對(duì)象施用治療有效量的式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療變應(yīng)性疾病或其它炎性病癥、感染性疾病或癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的人對(duì)象施用治療有效量的化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療變應(yīng)性鼻炎的方法，所述方法包括給有此需要的人對(duì)象施用治療有效量的式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療變應(yīng)性鼻炎的方法，所述方法包括給有此需要的人對(duì)象施用治療有效量的化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療哮喘的方法，所述方法包括給有此需要的人對(duì)象施用治療有效量的式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

進(jìn)一步提供了一種治療哮喘的方法，所述方法包括給有此需要的人對(duì)象施用治療有效量的化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合產(chǎn)品，其包含式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及至少一種其它治療活性劑。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合產(chǎn)品，其包含化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽以及至少一種其它治療活性劑。

進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，其包含式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。

進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，其包含化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽和一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。

還提供了一種用于制備藥物組合物的方法，所述方法包括將式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體混合。

還提供了一種用于制備藥物組合物的方法，所述方法包括將化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽與一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體混合。

通過(guò)本文描述的方法可以制備本發(fā)明的化合物及其鹽，所述方法構(gòu)成本發(fā)明的另一個(gè)方面。

因此，提供了一種用于制備式(i)的化合物或化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮的方法，所述方法包括將式(ii)的化合物去保護(hù)：

其中r¹和r²如在上文中關(guān)于式(i)的化合物所定義，且r⁴是c1-6烷基，和此后，如果需要的話，進(jìn)行以下任選步驟中的一個(gè)或多個(gè)：

(i)除去任何必要的保護(hù)基；

(ii)制備如此形成的化合物的鹽。

進(jìn)一步提供了一種用于制備式(i)的化合物或化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮的方法，所述方法包括，將式(ii)的化合物轉(zhuǎn)化成式(iip)的另一種化合物，和此后，如果需要的話，進(jìn)行以下任選步驟中的一個(gè)或多個(gè)：

(i)除去任何必要的保護(hù)基；

(ii)制備如此形成的化合物的鹽。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，也可以如下制備式(i)的化合物或化合物6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮：將式(iip)的化合物去保護(hù)：

其中r¹如在上文中關(guān)于式(i)的化合物所定義，r⁴如在上文中關(guān)于式(ii)的化合物所定義，且r^2p是受保護(hù)的r²基團(tuán)，其中所述保護(hù)基是合適的保護(hù)基，例如叔丁氧基羰基(boc)或芐氧羰基，和此后，如果需要的話，進(jìn)行以下任選步驟中的一個(gè)或多個(gè)：

(i)除去任何必要的保護(hù)基；

(ii)制備如此形成的化合物的鹽。

本發(fā)明涵蓋本文描述的實(shí)施方案和方面的所有組合。

附圖說(shuō)明

圖1圖示了用氧代腺嘌呤化合物3a-3g處理24小時(shí)的(a)hek293-htlr7和(b)hek293-htlr8細(xì)胞的nfkb應(yīng)答；(c)顯示了氧代腺嘌呤3a-3g的htlr7和htlr8ec50值。圖上帶圓圈的編號(hào)指示每種化合物的碳連接基長(zhǎng)度。

圖2顯示了用氧代腺嘌呤化合物3a-g刺激以后(a)hpbmc中的tnfα誘導(dǎo)和(b)mdc中的il-6表達(dá)。在來(lái)自三個(gè)不同健康供體的hpbmc中一式三份地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。帶圓圈的編號(hào)指示每種化合物的碳連接基長(zhǎng)度。

圖3圖示了用氧代腺嘌呤3a-g刺激以后hpbmc中的ifnα誘導(dǎo)。

圖4圖示了來(lái)自用氧代腺嘌呤化合物3b、3f或3x或咪唑并喹啉crx642處理24小時(shí)的(a)hek293-htlr7和(b)hek293-htlr8細(xì)胞的nfkb應(yīng)答。

圖5圖示了通過(guò)用不同的氧代腺嘌呤化合物(3b、3f或3x)或咪唑并喹啉crx642或agp化合物crx601刺激來(lái)自人pbmc的tnfα誘導(dǎo)。

圖6圖示了通過(guò)用不同的氧代腺嘌呤化合物(3b、3f或3x)或agpcrx601或crx642(咪唑并喹啉)刺激在人pbmc中的ifn-α誘導(dǎo)。

圖7顯示了通過(guò)用不同的氧代腺嘌呤(3b、3f或3x)在不同劑量刺激，通過(guò)ics(細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子染色法，intracellularcytokinestaining)測(cè)量的來(lái)自三種不同供體的pdc中的ifnα誘導(dǎo)。

圖8a圖示了不同的氧代腺嘌呤(3b、3f或3x)或agpcrx601(tlr4激動(dòng)劑)或crx642(咪唑并喹啉)在人pbmc中的il-12p70誘導(dǎo)。圖8b圖示了與crx601(tlr4激動(dòng)劑)組合的不同氧代腺嘌呤(3b、3f、或3x)、或與crx601組合的crx642(咪唑并喹啉)在人pbmc中的il-12p70誘導(dǎo)。

圖9是顯示了氧代腺嘌呤化合物3x（一種根據(jù)式(i)的化合物）的合成的方案i。

發(fā)明詳述

本文描述了在c9位置被哌啶基烷基基團(tuán)取代且含有c2丁氧基或甲基丁氧基的氧代腺嘌呤化合物的合成。在用人tlr7或人tlr8轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞中和在人pbmc中的體外評(píng)價(jià)指示，通過(guò)改變碳連接基的長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)htlr7/8選擇性/效能和細(xì)胞因子誘導(dǎo)。另外，確定了甲基在c2-丁氧基的第一個(gè)碳上的引入(以提供甲基丁氧基)會(huì)影響tlr7和tlr8二者的活性。

已經(jīng)描述了tlr7和tlr9的寡核苷酸激動(dòng)劑、以及tlr7的基于嘌呤的小分子激動(dòng)劑，它們可以在動(dòng)物中和在人類中誘導(dǎo)來(lái)自這些細(xì)胞類型的干擾素α(takedak.等人,annu.rev.immunol.,2003:21,335-76)。tlr7激動(dòng)劑包括咪唑并喹啉化合物諸如咪喹莫特和瑞喹莫德、氧代腺嘌呤類似物以及核苷類似物諸如洛索立賓和7-硫雜-8-氧代鳥苷，其已知會(huì)誘導(dǎo)干擾素α。國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo2007/034882(pct/jp2006/318758;dainipponsumitomopharmaco.ltd./astrazenecaaktiebolag)公開了被鑒別為可用作藥物的某些腺嘌呤化合物。

在wo2010/018134(pct/ep2009/060267)中描述的某些腺嘌呤衍生物化合物已經(jīng)被證實(shí)是人干擾素的誘導(dǎo)物，且可能具有改善的特性(相對(duì)于人干擾素的某些其它已知誘導(dǎo)物而言)，例如增強(qiáng)的效能，且可能表現(xiàn)出相對(duì)于腫瘤壞死因子α(tnfα)而言增強(qiáng)的對(duì)ifnα的選擇性。例如，某些化合物指示相對(duì)于tnfα誘導(dǎo)對(duì)ifnα誘導(dǎo)的大于1000倍選擇性。誘導(dǎo)人干擾素的化合物可以用作疫苗佐劑。誘導(dǎo)人干擾素的化合物可用于治療多種障礙，包括感染性疾病、癌癥、炎性病癥和變應(yīng)性疾病。誘導(dǎo)人干擾素的化合物可用于治療變應(yīng)性鼻炎或哮喘。

以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且明白的術(shù)語(yǔ)描述本發(fā)明。為了易于提及，在下文中定義某些術(shù)語(yǔ)。但是，定義了某些術(shù)語(yǔ)的事實(shí)不應(yīng)當(dāng)視作指示：定義的術(shù)語(yǔ)以與普通含義不一致的方式使用，或者，可替換地，未定義的任何術(shù)語(yǔ)是不明確的或未在普通的和被接受的含義內(nèi)使用。相反，認(rèn)為在本文中使用的所有術(shù)語(yǔ)描述了本發(fā)明，使得普通技術(shù)人員可以明白本發(fā)明的范圍。下述定義意在澄清、而不是限制定義的術(shù)語(yǔ)。

對(duì)'烷基'的提及包括提及含有至多8個(gè)碳原子、例如至多6個(gè)碳原子、或至多4個(gè)碳原子、或至多2個(gè)碳原子、或1個(gè)碳原子的相應(yīng)烷基的直鏈和支鏈脂族異構(gòu)體。當(dāng)烷基是另一個(gè)基團(tuán)（例如烷基氨基或烷氧基）的一部分時(shí)，這樣對(duì)‘烷基’的提及也是適用的。這樣的烷基和含有烷基的基團(tuán)的例子是c1-8烷基、c1-6烷基、c1-6烷基氨基和c1-6烷氧基。

對(duì)‘雜環(huán)’或'雜環(huán)基'的提及表示含有5個(gè)碳原子和至少一個(gè)雜原子的單環(huán)飽和雜環(huán)脂族環(huán)，所述雜原子是氮、氧或硫。這樣的雜環(huán)包括哌啶或哌啶基，其中所述環(huán)含有5個(gè)碳原子和1個(gè)氮雜原子。

如本文中關(guān)于式i的化合物使用的，‘碳連接基’表示-(ch2)n-基團(tuán)，且可以可替代地被稱作‘烷基連接基’。因而，“五碳”連接基是-(ch2)5-。

貫穿本說(shuō)明書，使用普遍接受的嘌呤骨架的原子編號(hào)系統(tǒng)：

以下列表提供了本文中使用的某些縮寫的定義。所述列表不是窮盡性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)容易地明白下面未定義的縮寫的含義。

dcm二氯甲烷

dmfn,n-二甲基甲酰胺

dmso二甲亞砜

elisa酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

etoac乙酸乙酯

h小時(shí)

hcl鹽酸

et3n三乙胺

l升

lcms液相色譜法-質(zhì)譜法

mins分鐘

ms質(zhì)譜法

nfkb核因子κb

nmr核磁共振

ssnmr固態(tài)核磁共振

pbmc外周血單核細(xì)胞

pbs磷酸鹽緩沖鹽水

prr模式識(shí)別受體

rt室溫

stripped在減壓下除去溶劑

tfa三氟乙酸

tlrtoll-樣受體

rt室溫。

應(yīng)當(dāng)理解，本文中對(duì)本發(fā)明的化合物的提及是指作為游離堿或作為鹽（例如藥學(xué)上可接受的鹽）的式(i)的化合物。

式(i)的化合物的鹽包括藥學(xué)上可接受的鹽和可能不是藥學(xué)上可接受的、但是可用于制備式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽的鹽。鹽可以衍生自某些無(wú)機(jī)或有機(jī)酸或某些無(wú)機(jī)或有機(jī)堿。

本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括所有可能的化學(xué)計(jì)量和非化學(xué)計(jì)量形式的式(i)的化合物的鹽。

鹽的例子是藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽和堿加成鹽。關(guān)于合適的鹽的綜述，參見，例如，berge等人,j.pharm.sci.,66:1-19(1977)。

式(i)的化合物的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的例子包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽和苯磺酸鹽。

藥學(xué)上可接受的堿鹽的例子包括堿金屬鹽諸如鈉和鉀的鹽，和堿土金屬鹽諸如鈣和鎂的鹽。

使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，例如通過(guò)從溶液中沉淀、隨后過(guò)濾，或通過(guò)蒸發(fā)溶劑，可以形成鹽。

通常，藥學(xué)上可接受的酸加成鹽可以如下形成：任選地在合適的溶劑諸如有機(jī)溶劑中，使式(i)的化合物與合適的強(qiáng)酸(諸如氫溴酸、鹽酸、硫酸、對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸或萘磺酸)反應(yīng)以得到鹽，所述鹽通常例如通過(guò)結(jié)晶和過(guò)濾來(lái)分離。

應(yīng)當(dāng)理解，許多有機(jī)化合物可與溶劑形成絡(luò)合物，它們?cè)谒鋈軇┲邪l(fā)生反應(yīng)或從所述溶劑中沉淀或結(jié)晶。這些絡(luò)合物被稱為“溶劑合物”。例如，與水的絡(luò)合物被稱為“水合物”。具有高沸點(diǎn)的溶劑和/或具有形成氫鍵的高傾向性的溶劑(諸如水、乙醇、異丙醇和n-甲基吡咯烷酮)可用于形成溶劑合物。溶劑合物的鑒定方法包括、但不限于nmr和微量分析。本發(fā)明的化合物和鹽可以以溶劑合形式和未溶劑合形式存在。本文中使用的術(shù)語(yǔ)溶劑合物包括游離堿化合物及其任何鹽的溶劑合物。

本發(fā)明的某些化合物可以含有手性原子和/或重鍵，并因此可以以一種或多種立體異構(gòu)形式存在。本發(fā)明包括本發(fā)明的化合物的所有立體異構(gòu)體，包括光學(xué)異構(gòu)體，無(wú)論作為單獨(dú)的立體異構(gòu)體還是作為它們的混合物(包括外消旋修飾物)。任何立體異構(gòu)體可以含有小于10重量％（例如小于5重量％或小于0.5重量％）的任意其它立體異構(gòu)體。例如，任何光學(xué)異構(gòu)體可以含有小于10重量％（例如小于5重量％或小于0.5重量％）的它的對(duì)映體。

本發(fā)明的某些化合物可以以互變異構(gòu)形式存在。應(yīng)該理解，本發(fā)明包括本發(fā)明的化合物的所有互變異構(gòu)體，無(wú)論是作為單獨(dú)的互變異構(gòu)體還是作為其混合物，無(wú)論是否在本式中明確地指明。

本發(fā)明的化合物可以以結(jié)晶或或無(wú)定形形式存在。此外，本發(fā)明的化合物的某些晶型可以作為多晶型物存在，所有這些都被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對(duì)本發(fā)明的化合物的熱力學(xué)上最穩(wěn)定的一種或多種多晶型形式是特別有興趣的。

使用多種常規(guī)分析技術(shù)，包括、但不限于x-射線粉末衍射(xrpd)、紅外光譜法(ir)、拉曼光譜法、示差掃描量熱法(dsc)、熱重量分析法(tga)和固態(tài)核磁共振(ssnmr)，可以表征和區(qū)分本發(fā)明的化合物的多晶型形式。

從上述內(nèi)容應(yīng)該理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)包括式(i)的化合物及其鹽的水合物、異構(gòu)體和多晶型形式。

其中式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽具有潛在有益效果的疾病狀態(tài)的例子包括變應(yīng)性疾病和其它炎性病癥(例如變應(yīng)性鼻炎和哮喘)、感染性疾病和癌癥。式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也具有作為疫苗佐劑的潛在用途。

作為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以用作治療劑，單獨(dú)地或與其它化合物組合地用于治療和/或預(yù)防免疫介導(dǎo)的障礙，包括、但不限于炎性或變應(yīng)性疾病諸如哮喘、變應(yīng)性鼻炎和鼻結(jié)膜炎、食物過(guò)敏、超敏性肺病、嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎、遲發(fā)性超敏障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、胰腺炎、胃炎、結(jié)腸炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病、結(jié)節(jié)病、肺纖維化、呼吸窘迫綜合征、細(xì)支氣管炎、慢性阻塞性肺病、鼻竇炎、囊性纖維化、光線性角化病、皮膚發(fā)育異常、慢性蕁麻疹、濕疹和所有類型的皮炎。

本文中使用的疾病的預(yù)防表示，在對(duì)象已經(jīng)發(fā)生特定疾病之前，在所述對(duì)象中施用或使用化合物或組合物，以便減小所述對(duì)象發(fā)生所述疾病的機(jī)會(huì)或減輕所述對(duì)象將發(fā)生所述疾病的嚴(yán)重程度。因而，盡管預(yù)防可能不會(huì)阻止每位受治療的對(duì)象中的疾病發(fā)生，但是與未治療的對(duì)象的對(duì)照組相比，經(jīng)治療的對(duì)象的組中的疾病的發(fā)生或嚴(yán)重程度將得到改善。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以用于治療和/或預(yù)防針對(duì)呼吸道感染（包括、但不限于氣道病毒性惡化和扁桃體炎）的反應(yīng)。所述化合物也可以用于治療和/或預(yù)防自身免疫性疾病，包括、但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫?。╯j?egrensdisease）、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、皮肌炎、糖尿病、移植物排斥(包括移植物抗宿主病)、炎性腸?。ò?、但不限于克羅恩病(crohn’sdisease)和潰瘍性結(jié)腸炎）。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以用于治療感染性疾病，包括、但不限于由以下病毒引起的那些：肝炎病毒(例如乙肝病毒、丙肝病毒)、人免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒、皰疹病毒、呼吸道病毒(例如流感病毒、呼吸道合胞體病毒、鼻病毒、變性肺病毒(metapneumovirus)、副流感病毒、sars)和西尼羅病毒。式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以用于治療由例如細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物引起的微生物感染。這些包括、但不限于結(jié)核病、細(xì)菌性肺炎、曲霉病、組織胞漿菌病、念珠菌病、肺孢子蟲病、麻風(fēng)病、衣原體病、隱球菌病、隱孢子蟲病、弓形體病、利什曼原蟲病、瘧疾和錐蟲病。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以用于治療多種癌癥，尤其是治療已知對(duì)免疫療法有反應(yīng)的癌癥，包括、但不限于腎細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、黑素瘤、白血病、淋巴瘤和卵巢癌。

本文中使用的‘對(duì)象’包含哺乳動(dòng)物對(duì)象，且包括非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物對(duì)象、靈長(zhǎng)類對(duì)象和人對(duì)象。本文中使用的疾病的療法或治療表示能夠改善疾病的癥狀和/或延長(zhǎng)遭受疾病的對(duì)象的預(yù)期生命期望或無(wú)疾病存活的行動(dòng)。本文中對(duì)治療或療法的提及可以隨病癥延伸至用以減小對(duì)象將感染或發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)防性治療。

如在本文中提及的，式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可以用作治療劑。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可以配制成用于以任何方便方式施用的形式。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可以配制成例如經(jīng)口、局部、吸入、鼻內(nèi)、含服、胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi))或直腸施用的形式。一方面，式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽配制成經(jīng)口施用的形式。另一個(gè)方面，式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽配制成局部施用(例如鼻內(nèi)或吸入施用)的形式。

用于經(jīng)口施用的片劑和膠囊劑可含有常規(guī)賦形劑例如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、西黃蓍膠、淀粉膠漿、纖維素或聚乙烯吡咯烷酮)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素、糖、玉米淀粉、磷酸鈣或山梨醇)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙二醇或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉或淀粉羥基乙酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑可以按照本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)包衣。

經(jīng)口液體制劑可以呈例如水性或油性混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑的形式，或者可以以干產(chǎn)物存在，臨用前用水或其它合適溶媒配制。這類液體制劑可含有常規(guī)添加劑例如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/糖漿、明膠、羥甲基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化的可食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂、脫水山梨醇單油酸酯或阿拉伯膠)；非水性溶媒(其可包括食用油)(例如杏仁油、分餾椰子油、油酯、丙二醇或乙醇)；或防腐劑(例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)。如果合適的話，制劑也可含有緩沖鹽、矯味劑、著色劑和/或甜味劑(例如甘露醇)。

供鼻內(nèi)施用的組合物包括通過(guò)滴入或加壓泵施用至鼻的水性組合物。合適的組合物含有水作為用于此目的的稀釋劑或載體。用于施用至肺部或鼻的組合物可含有一種或多種賦形劑(例如一種或多種懸浮劑、一種或多種防腐劑、一種或多種表面活性劑、一種或多種張力調(diào)節(jié)劑、一種或多種共溶劑)，并且可包括控制組合物的ph的組分，例如緩沖系統(tǒng)。此外，所述組合物可含有其它賦形劑，例如抗氧化劑(例如焦亞硫酸鈉)和味道掩蔽劑。也可通過(guò)霧化將組合物施用至鼻或呼吸道的其它區(qū)域。

鼻內(nèi)組合物可使式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽能遞送到鼻腔的所有區(qū)域(靶組織)和此外，可允許式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與靶組織保持接觸較長(zhǎng)時(shí)間段。鼻內(nèi)組合物的合適施用方案將讓患者在清除鼻腔后通過(guò)鼻子緩慢吸入。在吸入期間，將所述組合物施用至一個(gè)鼻孔，而另一個(gè)則用手按住。然后對(duì)另一鼻孔重復(fù)該過(guò)程。通常，按照以上過(guò)程，每天1、2或3次，理想的是每天1次，給每個(gè)鼻孔施用一次或兩次噴霧。特別感興趣的是適用于每天一次施用的鼻內(nèi)組合物。

如果包括的話，懸浮劑通常以組合物總重量的0.1-5％(w/w)、例如1.5％至2.4％(w/w)的量存在。藥學(xué)上可接受的懸浮劑的例子包括、但不限于avicel^?(微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉)、羧甲基纖維素鈉、硅酸鎂鋁、西黃蓍膠、皂土、甲基纖維素、黃原膠、卡波普和聚乙二醇。

供肺部或鼻施用的組合物可含有一種或多種賦形劑，且可通過(guò)包括一種或多種防腐劑而防止微生物或真菌污染和生長(zhǎng)。藥學(xué)上可接受的抗微生物劑或防腐劑的例子包括、但不限于季銨化合物(例如苯扎氯銨、芐索氯銨、西三溴胺、西吡氯銨、勞拉氯銨和肉豆蔻基甲基吡啶鎓氯化物)、汞劑(例如硝酸苯汞、醋酸苯汞和硫柳汞)、醇試劑(例如氯丁醇、苯乙醇和苯甲醇)、抗細(xì)菌的酯類(例如對(duì)羥基苯甲酸酯類)、螯合劑例如乙二胺四乙酸二鈉(edta)和其它抗微生物劑例如氯己定、氯甲酚、山梨酸及其鹽(例如山梨酸鉀)和多粘菌素。藥學(xué)上可接受的抗真菌劑或防腐劑的例子包括、但不限于苯甲酸鈉、山梨酸、丙酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯。防腐劑，如果包括的話，其用量可占組合物總重量的0.001-1％(w/w)，例如0.015％至0.5％(w/w)。

組合物(例如其中至少一種化合物是在混懸液中)可包括一種或多種表面活性劑，其作用是促進(jìn)藥物顆粒在組合物水相中溶解。例如，所用的表面活性劑的用量是在混合期間不會(huì)導(dǎo)致發(fā)泡的量。藥學(xué)上可接受的表面活性劑的例子包括脂肪醇類、酯類和醚類，例如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(聚山梨酯80)、聚乙二醇酯和泊洛沙姆。表面活性劑的用量可占組合物總重量的約0.01-10％(w/w)，例如0.01-0.75％(w/w)，例如約0.5％(w/w)。

可包括一種或多種張力調(diào)節(jié)劑以達(dá)到體液(例如鼻腔液體)的張力，從而減少刺激水平。藥學(xué)上可接受的張力調(diào)節(jié)劑的例子包括、但不限于氯化鈉、右旋糖、木糖醇、氯化鈣、葡萄糖、甘油和山梨醇。張力調(diào)節(jié)劑，如果存在的話，其用量可占組合物總重量的0.1-10％(w/w)，例如4.5-5.5％(w/w)，例如約5.0％(w/w)。

可通過(guò)加入合適緩沖劑，使本發(fā)明組合物得到緩沖，所述緩沖劑例如檸檬酸鈉、檸檬酸、氨基丁三醇、磷酸鹽例如磷酸氫二鈉(例如十二水合物、七水合物、二水合物和無(wú)水形式)或磷酸鈉及其混合物。

緩沖劑，如果有的話，其用量可占組合物總重量的0.1-5％(w/w)，例如1-3％(w/w)。

味道掩蔽劑的例子包括三氯蔗糖、蔗糖、糖精或其鹽、果糖、右旋糖、甘油、玉米糖漿、天冬甜素、乙酰舒泛-k、木糖醇、山梨醇、赤蘚醇、甘草酸銨、奇甜蛋白、紐甜(neotame)、甘露醇、薄荷醇、桉葉油、樟腦、天然矯味劑、人工矯味劑及其組合。

可包括一種或多種共溶劑以幫助溶解藥物化合物和/或其它賦形劑。藥學(xué)上可接受的共溶劑的例子包括、但不限于丙二醇、二丙二醇、乙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇(例如peg300或peg400)和甲醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，共溶劑是丙二醇。

共溶劑，如果有的話，其用量可占組合物總重量的0.05-30％(w/w)，例如1-25％(w/w)，例如1-10％(w/w)。

供吸入施用的組合物包括通過(guò)加壓泵或吸入器(例如，貯庫(kù)干粉吸入器(reservoirdrypowderinhaler)、單位劑量干粉吸入器、預(yù)計(jì)量的多劑量干粉吸入器、鼻吸入器或加壓氣溶膠吸入器、霧化器或吹入器)施用至呼吸道的水性、有機(jī)或水性/有機(jī)混合物、干粉或結(jié)晶組合物。出于此目的合適的組合物含有水作為稀釋劑或載體，并且可與常規(guī)賦形劑一起提供，所述賦形劑例如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑等。水性組合物也可通過(guò)霧化施用至鼻和呼吸道的其它區(qū)域。這類組合物可以是從加壓包裝(例如計(jì)量劑量吸入器)遞送的含水溶液或混懸液或氣溶膠，并使用合適的液化推進(jìn)劑。

用于局部施用至鼻(例如用于治療鼻炎)或肺部的組合物，包括通過(guò)加壓泵遞送到鼻腔的加壓氣溶膠組合物和水性組合物。非加壓的并適于局部施用至鼻腔的組合物是特別感興趣的。合適的組合物含有水作為用于此目的的稀釋劑或載體。用于施用至肺部或鼻的水性組合物可與常規(guī)賦形劑一起提供，所述賦形劑例如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑等。水性組合物也可通過(guò)霧化施用至鼻。

流體分配器通?？捎糜趯⒘黧w組合物遞送到鼻腔。流體組合物可以是水性或非水性的，但通常是水性的。這樣的流體分配器可具有分配噴嘴或分配口，在使用者向流體分配器的泵裝置施加力以后，通過(guò)這些噴嘴或口分配計(jì)量劑量的流體組合物。這樣的流體分配器通常提供有多計(jì)量劑量的流體組合物的貯庫(kù)(reservoir)，在連續(xù)驅(qū)動(dòng)泵以后就可分配所述劑量。分配噴嘴或口可以構(gòu)造成用于插入到使用者鼻孔中，以用于將流體組合物噴霧分配到鼻腔中。在國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo2005/044354(glaxogrouplimited)中描述和說(shuō)明了上述類型的流體分配器。在一個(gè)實(shí)施方案中，流體分配器是wo2005/044354的圖30-40中說(shuō)明的通用型。

含有式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的水性組合物也可通過(guò)以下文獻(xiàn)所公開的泵遞送：國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo2007/138084(glaxogrouplimited)，例如如參考其圖22-46公開的，或wo2011/098451(glaxogrouplimited,gb0723418.0)，例如如參考其圖7-32公開的?？捎扇鐆o2011/098451的圖1-6公開的驅(qū)動(dòng)器來(lái)驅(qū)動(dòng)泵。

通過(guò)吸入而局部遞送到肺部的干粉組合物可以例如呈例如明膠的膠囊和藥筒(cartridge)，或例如層壓鋁箔的泡眼包裝形式，用于吸入器或吹入器。粉末混合組合物通常含有用于吸入式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的粉末混合物和合適的粉末基質(zhì)(載體/稀釋劑/賦形劑物質(zhì))例如單糖、二糖或多糖(例如乳糖或淀粉)。除藥物和載體之外，干粉組合物也可包括額外賦形劑(例如三元?jiǎng)?ternaryagent)例如糖酯例如纖維二糖八乙酸酯、硬脂酸鈣或硬脂酸鎂)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可將適用于吸入施用的組合物裝入安裝于合適的吸入裝置內(nèi)的藥物包裝（一個(gè)或多個(gè)）上提供的多個(gè)密封劑量容器中。所述容器可以是可破壞的、可撕開的或用其它方式可打開的，一次開一個(gè)，并且干粉組合物的劑量通過(guò)在吸入裝置接口管吸入施用，正如本領(lǐng)域已知的那樣。藥物包裝可以采用多種不同形式，例如盤狀或長(zhǎng)條狀。代表性的吸入裝置是由glaxosmithkline供應(yīng)市場(chǎng)的diskhaler^tm和diskus^tm裝置。

干粉可吸入組合物也可以以大量貯庫(kù)形式在吸入裝置中提供，所述裝置然后提供有計(jì)量裝置，用于計(jì)量從貯庫(kù)中至吸入通道的組合物劑量，在吸入通道中計(jì)量的劑量能通過(guò)患者在裝置接口管吸氣而被吸入。這種類型的示例性市售裝置是turbuhaler?(astrazeneca)、twisthaler?(schering)和clickhaler?(innovata.)。

干粉可吸入組合物的另一種遞送方法是組合物的計(jì)量劑量在膠囊劑中提供(每個(gè)膠囊一份劑量)，所述膠囊劑然后裝在吸入裝置中，通常按照患者的需要。該裝置具有工具以打破、刺穿或其它方法打開膠囊，使得當(dāng)患者在裝置接口管吸氣時(shí)劑量能夠被帶入至患者肺部。這類裝置的市售實(shí)例可提及rotahaler?(glaxosmithkline)和handihaler?(boehringeringelheim)。

適用于吸入的加壓氣溶膠組合物可以是混懸液或溶液并且可含有式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和合適的推進(jìn)劑例如碳氟化合物或含氫的含氯氟烴或其混合物，尤其是氫氟烷烴(hydrofluoroalkanes)，特別是1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷或其混合物。氣溶膠組合物可任選含有本領(lǐng)域眾所周知的額外組合物賦形劑，例如表面活性劑，例如油酸、卵磷脂或低聚乳酸或其衍生物，例如描述于wo94/21229和wo98/34596(minnesotaminingandmanufacturingcompany)中的那些；和共溶劑，例如乙醇。加壓組合物通常裝在罐(例如鋁罐)中，用閥(例如計(jì)量閥)密閉并裝入提供有接口管的驅(qū)動(dòng)器中。

軟膏、乳膏和凝膠可例如用水性或油性基質(zhì)配制并添加合適的增稠劑和/或膠凝劑和/或溶劑。這類基質(zhì)因此可例如包括水和/或油(例如液體石蠟或植物油例如花生油或蓖麻油)或溶劑(例如聚乙二醇)?？砂凑账龌|(zhì)的性質(zhì)使用的增稠劑和膠凝劑包括軟石蠟、硬脂酸鋁、鯨蠟硬脂醇、聚乙二醇、羊毛脂、蜂蠟、羧聚乙烯和纖維素衍生物、和/或單硬脂酸甘油酯和/或非離子型乳化劑。

洗劑可用水性或油性基質(zhì)配制并且通常也含一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑或增稠劑。

供外用的粉末可借助任何合適的粉末基質(zhì)例如滑石、乳糖或淀粉而形成。滴劑可用水性或非水基質(zhì)配制，其也含一種或多種分散劑、增溶劑、懸浮劑或防腐劑。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可通過(guò)例如將組合物放入貼劑或?qū)⒒钚越M分遞送到皮膚的其它裝置(例如加壓氣體裝置)中而配制成供透皮遞送用。

對(duì)于含服施用，所述組合物可以采用按照常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以配制成栓劑，例如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)例如可可脂或其它甘油酯。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以配制成通過(guò)快速濃注或連續(xù)輸注胃腸外施用，并且可呈單位劑型，例如作為安瓿、小瓶、小體積輸注或預(yù)裝填注射器，或可呈含有添加的防腐劑的多劑量容器。所述組合物可采用在水性或非水溶媒中的溶液、混懸液或乳液形式，并且可含有配制用試劑，例如抗氧化劑、緩沖劑、抗微生物劑和/或張力調(diào)節(jié)劑?？商鎿Q地，所述活性成分可以呈粉末形式，用于在臨用前用合適溶媒例如無(wú)菌、無(wú)熱原水配制?？赏ㄟ^(guò)將無(wú)菌粉末無(wú)菌灌裝到單個(gè)無(wú)菌容器中或通過(guò)將無(wú)菌溶液劑無(wú)菌灌裝到每個(gè)容器中并凍干，而制備干固體形式。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可作為佐劑與疫苗配制。這類組合物可含有抗體或抗體片段或抗原性成分，包括、但不限于蛋白質(zhì)、dna、活或死的細(xì)菌和/或病毒或病毒樣顆粒，以及具有佐劑活性的一種或多種成分，包括、但不限于鋁鹽、油和水乳劑、熱激蛋白、脂質(zhì)a制劑和衍生物、糖脂、其它tlr激動(dòng)劑諸如cpgdna或類似試劑、細(xì)胞因子諸如粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)或白介素-12(il-12)或類似試劑。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可以單獨(dú)使用或與其它治療劑聯(lián)合使用。式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽以及其它藥學(xué)活性劑可以一起施用或單獨(dú)施用，并且當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)，可以同時(shí)或以任何順序序貫施用。選擇式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及其它藥學(xué)活性劑的用量和相對(duì)施用時(shí)間，以達(dá)到所需聯(lián)合療效。式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與其它治療劑的聯(lián)合施用可以是如下聯(lián)合的：通過(guò)伴隨施用同時(shí)包括這兩種化合物的單個(gè)藥物組合物，或分別包括所述化合物中的一種的單獨(dú)的藥物組合物?？商鎿Q地，聯(lián)用可以序貫方式分別施用，其中先施用一種治療劑，再施用另一種或者反之亦然。這類序貫施用可以在時(shí)間上靠近或在時(shí)間上遠(yuǎn)離。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可與用于預(yù)防或治療病毒性感染的一種或多種試劑聯(lián)用。所述試劑的例子包括、但不限于：聚合酶抑制劑，例如公開于wo2004/037818-a1中的那些以及公開于wo2004/037818和wo2006/045613中的那些；jtk-003、jtk-019、nm-283、hcv-796、r-803、r1728、r1626、以及公開于wo2006/018725、wo2004/074270、wo2003/095441、us2005/0176701、wo2006/020082、wo2005/080388、wo2004/064925、wo2004/065367、wo2003/007945、wo02/04425、wo2005/014543、wo2003/000254、ep1065213、wo01/47883、wo2002/057287、wo2002/057245中的那些和類似試劑；復(fù)制抑制劑，例如阿昔洛韋、泛昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋、拉米夫定和類似試劑；蛋白酶抑制劑，例如hiv蛋白酶抑制劑沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、氨普那韋、呋山那韋、布瑞那韋、阿扎那韋、替拉那韋、帕利那韋、拉西那韋和hcv蛋白酶抑制劑biln2061、vx-950、sch503034；和類似試劑；核苷和核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如齊多夫定、去羥肌苷、拉米夫定、扎西他濱、阿巴卡韋、stavidine、阿德福韋、阿德福韋二匹伏酯、福齊夫定替酯、恩曲他濱、阿洛夫定(alovudine)、氨多索韋、艾夫他濱和類似試劑；非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(包括具有抗氧化活性的試劑，例如怡妙康(immunocal)、奧替普拉等)例如奈韋拉平、地拉韋啶、依法韋侖、洛韋胺、怡妙康、奧替普拉、卡普韋林、tmc-278、tmc-125、依曲韋林和類似試劑；侵入抑制劑，例如恩夫韋肽(t-20)、t-1249、pro-542、pro-140、tnx-355、bms-806、5-helix和類似試劑；整合酶抑制劑，例如l-870,180和類似試劑；出芽抑制劑，例如pa-344和pa-457和類似試劑；趨化因子受體抑制劑例如維立韋羅(sch-c)、sch-d、tak779、馬拉韋羅(uk-427,857)、tak449、以及公開于wo02/74769、wo2004/054974、wo2004/055012、wo2004/055010、wo2004/055016、wo2004/055011和wo2004/054581中的那些和類似試劑；神經(jīng)氨酸酶抑制劑，例如cs-8958、扎那米韋、奧塞米韋、培拉米韋和類似試劑；離子通道阻斷劑，例如金剛烷胺或金剛乙胺和類似試劑；和干擾rna和反義寡核苷酸和例如isis-14803和類似試劑；未確定作用機(jī)制的抗病毒劑，例如公開于wo2005/105761、wo2003/085375、wo2006/122011中的那些，利巴韋林和類似試劑。式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可與可用于預(yù)防或治療病毒性感染的一種或多種其它試劑(所述試劑例如免疫治療(例如干擾素或其它細(xì)胞因子/趨化因子、細(xì)胞因子/趨化因子受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子激動(dòng)劑或拮抗劑和類似試劑))和治療性疫苗、抗纖維化劑、抗炎劑例如皮質(zhì)類固醇或非甾體類抗炎劑(nsaid)和類似試劑聯(lián)用。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可與可用于預(yù)防或治療變應(yīng)性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病的一種或多種其它試劑聯(lián)用，所述試劑例如：抗原免疫治療劑、抗組胺劑、甾類、非甾體類抗炎藥(nsaid)、支氣管擴(kuò)張劑(例如β2激動(dòng)劑、腎上腺素能激動(dòng)劑、抗膽堿能劑、茶堿)、甲氨蝶呤、白三烯調(diào)節(jié)劑和類似試劑；單克隆抗體治療劑例如抗-免疫球蛋白e(ige)、抗-tnf、抗-il-5、抗-il-6、抗-il-12、抗-il-1和類似試劑；受體治療例如依那西普和類似試劑；抗原非特異性免疫治療劑(例如干擾素或其它細(xì)胞因子/趨化因子、細(xì)胞因子/趨化因子受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子激動(dòng)劑或拮抗劑、tlr激動(dòng)劑和類似試劑)。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽可與可用于預(yù)防或治療癌癥的一種或多種其它試劑聯(lián)用，所述試劑例如化療法例如烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗代謝物、抗有絲分裂藥、激酶抑制劑和類似試劑；單克隆抗體治療劑例如曲妥珠單抗、吉妥珠單抗和其它類似試劑；和激素治療劑例如他莫昔芬、戈舍瑞林和類似試劑。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物也可單獨(dú)使用或與在其它治療領(lǐng)域例如胃腸道疾病中的至少一種其它治療劑聯(lián)用。根據(jù)本發(fā)明的組合物也可與基因替代療法聯(lián)用。

本發(fā)明在另一個(gè)方面包括包含式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與至少一種其它治療活性劑的組合產(chǎn)品。

可方便地提供以上涉及到的組合產(chǎn)品，以用于藥物組合物的形式，因此包含如上定義的組合產(chǎn)品與其至少一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體的藥物組合物代表了本發(fā)明的另一個(gè)方面。

式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的治療有效量將取決于多種因素。例如，接受者對(duì)象的物種、年齡和體重、需要治療的準(zhǔn)確病癥及其嚴(yán)重性、組合物的性質(zhì)和施用途徑，都是要考慮的因素。治療有效量最終應(yīng)由主治醫(yī)師確定。無(wú)論如何，用于治療人類的本發(fā)明的化合物的有效量范圍通常應(yīng)當(dāng)是每天0.0001-100mg/kg接受者體重。更常用的有效量范圍應(yīng)是每天0.001-10mg/kg體重。因此，對(duì)于70kg成年人，每天實(shí)際用量的一個(gè)實(shí)例通常是7-700mg。對(duì)于鼻內(nèi)和吸入施用途徑，對(duì)于70kg成年人的典型劑量范圍應(yīng)當(dāng)是每天1微克至1mg。該用量可以以每天單劑量施用或者以每天多次(例如2、3、4、5次或以上)的分次劑量施用，使得總?cè)沼昧肯嗤Ｊ?i)的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的有效量可以按照式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽本身有效量的比例來(lái)確定。類似劑量應(yīng)當(dāng)適合用于治療本文所涉及的其它病癥。

式(i)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽也可以任何合適的頻率來(lái)施用，例如每周1-7次。準(zhǔn)確的施用方案當(dāng)然取決于例如以下因素：治療適應(yīng)癥、對(duì)象的年齡和狀況、以及所選具體施用途徑。

藥物組合物可以呈單位劑量形式，每個(gè)單位劑量含有預(yù)定量的活性成分。作為非限制性實(shí)例，這樣的單位可含有0.5mg至1g式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，這取決于所治療的病癥、施用途徑、以及患者的年齡、體重和狀況。優(yōu)選的單位劑量組合物是如本文上面所述的含有活性成分的日用劑量或亞劑量或其合適的部分的那些?？赏ㄟ^(guò)藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備這類藥物組合物。

因而進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，其包含式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。

也提供了制備這樣的藥物組合物的方法，所述方法包括將式(i)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體混合。

貫穿說(shuō)明書和隨后的權(quán)利要求書，除非上下文另外要求，否則詞語(yǔ)‘包含’和變體諸如‘包括’和‘含有’應(yīng)當(dāng)理解為暗示包括所述的整數(shù)或步驟或整數(shù)的集合，但是排除任意其它整數(shù)或步驟或整數(shù)或步驟的集合。

制備氧代腺嘌呤化合物及其鹽的方法描述在wo2010/018134中，其整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。本文描述了制備式(i)的化合物和制備6-氨基-9-[5-(4-哌啶基)戊基]-2-[(1s)-1-甲基丁基]氧基]-7,9-二氫-8h-嘌呤-8-酮或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，并構(gòu)成本發(fā)明的另一個(gè)方面。

實(shí)施例

實(shí)施例1：在9位處被取代的氧代腺嘌呤的合成

在tlr7和tlr8活化的情況下，已經(jīng)鑒別出天然的富含尿苷和/或鳥苷的病毒ssrna配體的小分子模擬物的幾種不同種類，包括1h-咪唑并[4,5-c]喹諾酮類和8-羥基腺嘌呤類。參見heil,等人,eur.j.immunol.2003,33,2987-2997;hemmi,等人,natimmunol2002,3,196-200;lee,等人,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2006,103,1828-1833;gerster,等人,j.med.chem.2005,48,3481-3491;hirota,等人,j.med.chem.2002,45,5419-5422。已經(jīng)進(jìn)行了氧代腺嘌呤中的構(gòu)效關(guān)系的幾種評(píng)價(jià)。參見isobe,等人,bioorganic&medicinalchemistry2003,11,3641-3647;kurimoto,等人,bioorganic&medicinalchemistry2003,11,5501-5508;kurimoto,等人,bioorganic&medicinalchemistry2004,12,1091-1099;isobe,等人,j.med.chem.2006,49,2088-2095;jin,等人,bioorganic&medicinalchemistryletters2006,16,4559-4563;pryde,等人,r.med.chem.commun.2011,2,185-189;kurimoto,等人,j.med.chem.2010,53,2964-2972.nakamura,等人,bioorganic&medicinalchemistryletters2013,23,669-672;weterings,等人,bioorganic&medicinalchemistryletters2009,19,2249-2251。

本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)在9位處被非芳族基團(tuán)取代的氧代腺嘌呤進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系研究。先前的研究已經(jīng)檢查了幾種9-烷基衍生物并提示，烷基(異丙基、丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基)在9位處的引入會(huì)導(dǎo)致弱的和減少的活性(hirota,等人,j.med.chem.2002,45,5419-5422;isobe,等人,j.med.chem.2006,49,2088-2095)。本研究聚焦于一系列七種式i的氧代腺嘌呤的合成和生物學(xué)評(píng)價(jià)：

其中r¹是正丁氧基，且其中r²是哌啶基烷基基團(tuán)，其中碳連接基的長(zhǎng)度范圍為0-6個(gè)碳：

針對(duì)tlr7/8選擇性和細(xì)胞因子誘導(dǎo)在體外評(píng)價(jià)了這些化合物(3a-g)?；衔?a不具有碳連接基(n=0)；3b具有單-碳連接基(n=1)；3c具有二-碳連接基(n=2)；3d具有三-碳連接基(n=3)；3e具有四-碳連接基(n=4)；3f具有五-碳連接基(n=5)且3g具有六-碳連接基(n=6)。

如在方案1中所示，通過(guò)共同的高級(jí)中間體(cai)6(tanji等人,science2013,339,1426-1429)，合成了9-哌啶基烷基氧代腺嘌呤3a-g。從商購(gòu)可得的二氯嘌呤7開始，在6個(gè)步驟中和以>50%總收率在多-10克規(guī)模容易地制備cai6(方案2)。在方案2中，將二氯嘌呤7保護(hù)為9-四氫吡喃基衍生物并通過(guò)在異丙醇中在60℃用2mnh3處理而在6-位處被取代，以86%收率產(chǎn)生2-氯腺嘌呤8。8與叔丁醇鈉在正丁醇中在100℃反應(yīng)，以85%收率產(chǎn)生官能化的腺嘌呤9。通過(guò)8-溴化、甲醇鹽的溴化物置換和三氟乙酸(tfa)的thp-去保護(hù)，在3個(gè)步驟中和以87%總收率將thp-保護(hù)的腺嘌呤9轉(zhuǎn)化成cai6。在有碳酸鉀在二甲基甲酰胺(dmf)中的溶液存在下用多種叔丁基氧基羰基(boc)-保護(hù)的n-哌啶基溴5b-g將cai6烷基化，隨后用4nhcl在二噁烷中的溶液進(jìn)行boc和甲基的酸性去保護(hù)，以41-84%收率產(chǎn)生期望的氧代腺嘌呤3b-g(方案1)。用溴化物5a對(duì)cai6的烷基化失敗，而是在有diad和pph3存在下使cai6與醇4a在70℃進(jìn)行mitsunobu反應(yīng)，隨后酸性去保護(hù)，以38%收率制備氧代腺嘌呤3a(方案1)。

方案1

化合物3a不具有碳連接基(n=0)；3b具有單-碳連接基(n=1)；3c具有二-碳連接基(n=2)；3d具有三-碳連接基(n=3)；3e具有四-碳連接基(n=4)；3f具有五-碳連接基(n=5)和3g具有六-碳連接基(n=6)。

方案2：共同的高級(jí)中間體6的合成

當(dāng)不可商購(gòu)得到時(shí)，通過(guò)使用appel條件(ph3p/cbr4)將對(duì)應(yīng)的醇溴化，以>90%收率制備溴化物(5b-d,f-g)。醇4f-g不是商購(gòu)可得的，并如下在3個(gè)步驟中從溴吡啶8制備：(i)使10與炔醇11f或11g交叉偶聯(lián)，(ii)在有5%rh/c催化劑存在下用氫還原12f和12g，和(iii)將胺基團(tuán)進(jìn)行boc保護(hù)(方案3)：

方案3：醇4f和4g的合成

。

實(shí)施例2：氧代腺嘌呤化合物3x的合成

制備另一種式i的氧代腺嘌呤(化合物3x)，其中：

其中r¹是(1s)-1-甲基丁氧基，且其中r²是哌啶基烷基基團(tuán)，其中碳連接基的長(zhǎng)度是5個(gè)碳?；衔?x：

氧代腺嘌呤和制備氧代腺嘌呤的方法也公開在wo2010/018134中，其內(nèi)容整體并入本文中。

氧代腺嘌呤3x的合成根據(jù)方案4(也參見圖20)并如下所述進(jìn)行。中間體化合物1、2、40、41、42和43另外描述在wo2010/018134中(如在wo2010/018134中使用的，在本文中使用這些中間體的相同編號(hào))。

方案4

如在方案4中所示，將4-溴吡啶鹽酸鹽a(2.5g)在1n氫氧化鈉(20ml)和乙酸乙酯(3x20ml)之間分配。將有機(jī)層分離，經(jīng)na2so4干燥并在真空下濃縮。將得到的油溶解在tea(2.6m)中并在氮?dú)庀旅摎狻＜尤?-戊炔-1-醇(1.1當(dāng)量)，隨后加入雙(三苯基膦)氯化鈀(ii)(0.01當(dāng)量)和碘化亞銅(i)(0.02當(dāng)量)，并將反應(yīng)混合物回流攪拌20min。水性后處理(乙酸乙酯/水)和硅膠上的色譜法(梯度為0-30%的乙酸乙酯在庚烷中的溶液)純化以82%收率得到b。將b溶解在乙酸(0.05m)中，并使用h-cube?連續(xù)流氫化反應(yīng)器(thalesnano)(20%pd(oh)2/c筒,100巴h2,90℃,1ml/min)將溶液氫化。

一旦氫化完成，將反應(yīng)混合物濃縮并在真空下干燥。將得到的粗制物溶解在ch2cl2(0.4m)中，并與et3n(1.5當(dāng)量)和二碳酸二叔丁酯(1.2當(dāng)量)在室溫反應(yīng)30min。水性后處理(ch2cl2/h2o)和通過(guò)硅膠上的色譜法(梯度為0-30%的乙酸乙酯在庚烷中的溶液)純化以后，以80%收率分離c：¹hnmr(400mhz,cdcl3)d4.06(s,2h),3.64(t,2h),2.66(t,2h),1.54-1.66(m,5h),1.45(s,9h),1.24-1.39(m,8h),1.08(m,2h)。

在0℃將cbr4(1.6當(dāng)量)和pph3(1.2當(dāng)量)緩慢地加入(放熱反應(yīng))c在ch2cl2中的溶液(0.45m)中。5分鐘以后，使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?，在室溫?cái)嚢?5min，濃縮，并通過(guò)硅膠上的色譜法(梯度為0-30%的乙酸乙酯在庚烷中的溶液)直接純化，以92%收率得到d。

將k2co3(325目,3.0當(dāng)量)加入43在dmf中的溶液(0.25m)中，并將反應(yīng)混合物聲處理幾秒以得到細(xì)混懸液，然后在60℃攪拌1h。冷卻至50℃以后，加入d(1.2當(dāng)量)，并將反應(yīng)混合物在50℃攪拌過(guò)夜。冷卻至室溫和水性后處理(乙酸乙酯/水)以后，將得到的粗制物通過(guò)硅膠上的色譜法(梯度為0-10%的甲醇在氯仿中的溶液)純化。

將純化的產(chǎn)物e溶解在甲醇(0.1m)中并與4n的hcl在二噁烷中的溶液(6.0當(dāng)量)在室溫反應(yīng)1h。將反應(yīng)混合物濃縮并在真空下干燥，并將殘余物通過(guò)硅膠上的色譜法(0-100%的chcl3/ch3oh/h2o90/10/0.5在chcl3/ch3oh/h2o85/15/1.0中的溶液)純化，以64%收率(2步)得到f。¹hnmr(400mhz,cd3od)γ5.14(m,1h),3.81(t,2h),3.36/3.32(m,4h),2.97(doft,2h),1.92(m,2h),1.75(p,2h),1.72(m,1h),1.57(m,2h)1.5-1.3(m,14h),0.95(t,3h)；[m+h]⁺的正性estof-ms計(jì)算值391.28222，實(shí)測(cè)391.0843。

實(shí)施例3–在方案4中顯示的中間體的制備

中間體化合物1、2、40、41、42和43(參見方案4和圖20)另外描述在wo2010/018134中；如在wo2010/018134中使用的，在本文中使用這些中間體的相同編號(hào)。lcmssystemsa-d如在wo2010/018134中所述。

中間體1:2,6-二氯-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤

向2,6-二氯嘌呤(25.0g)(可得自，例如，aldrich,uk)中加入乙酸乙酯(260ml)，隨后加入對(duì)甲苯磺酸(0.253g)。將混合物加熱至50℃，并然后加入3,4-二氫-2h-吡喃(16.8g)。然后將反應(yīng)混合物在50℃加熱4小時(shí)。將反應(yīng)混合物在真空中蒸發(fā)以得到作為黃色固體的2,6-二氯-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤(36.9g)。

¹hnmr(cdcl3):δ8.35(1h,s),5.77(1h,dd),4.20(1h,m),3.79(1h,m),2.20-1.65(6h,m)。

中間體2:2-氯-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺

將2,6-二氯-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤(36.9g)與2m的氨在異丙醇中的溶液(250ml)一起在50℃加熱5小時(shí)。在環(huán)境溫度靜置過(guò)夜以后，加入另一份量的2m的氨在異丙醇中的溶液(100ml)以打散得到的餅，并將反應(yīng)混合物加熱另外9小時(shí)，直到反應(yīng)完成。向反應(yīng)混合物中加入水(70ml)，并將黃色固體濾出。將固體用異丙醇:水(5:1(v/v),60ml)洗滌，并然后在抽吸下風(fēng)干以得到第一批。將濾液靜置過(guò)夜以后重新過(guò)濾以分離沉淀物，并將兩種固體在真空中干燥。第一批是純的，而第二批材料顯示非常少的雜質(zhì)(在第一批中未看到分離的寬信號(hào)3.5ppm)，但是在其它方面是相同的。固體第一批(28.4g)，固體第二批(3.42g)。

¹hnmr(cdcl3):8.01(¹h,s),5.98(²h,寬s),5.70(¹h,dd),4.16(¹h,m),3.78(¹h,m),2.15-1.60(⁶h,重疊m)。

中間體2(替代方法):2-氯-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺

向2,6-二氯嘌呤(25g)(可得自，例如，aldrich,uk)在干燥的乙酸乙酯(200ml)中的溶液中加入對(duì)甲苯磺酸一水合物(235mg)。將反應(yīng)物加熱至50℃并一次性加入3,4-二氫-2h-吡喃(18.1ml)。將反應(yīng)物在50℃攪拌1小時(shí)并在減壓下除去溶劑。這得到黃色固體。用附帶的冷凝器將該固體(~36g)在2.0m的氨在異丙醇中的溶液(460ml)中的混懸液在氮?dú)庀略?0℃加熱4小時(shí)。將反應(yīng)物倒入水(50ml)中并冷卻過(guò)夜。將沉淀物過(guò)濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(60℃)上干燥30分鐘，以得到作為灰白色固體的2-氯-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺，31g(93%,2步驟)。

(c10h12cln5o)⁺的ms計(jì)算值=254,256

ms實(shí)測(cè)(電噴射):(m)⁺=254,256(3:1)

¹hnmr((cd3)2so):δ8.43(¹h,s),7.82(²h,s),5.55(¹h,dd),4.00(¹h,m),3.69(¹h,m),2.21(¹h,m),1.95(²h,m),1.74(¹h,m),1.56(²h,m)。

中間體40:2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺

方法a：

在室溫將叔丁醇鈉(48.5g,505mmol)逐份加入(s)-2-戊醇(185ml)(可得自，例如，julichchiralsolutions,德國(guó))中攪拌直到均勻(注意反應(yīng)是放熱的)。加入2-氯-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(32g,126mmol)，并將反應(yīng)混合物在70℃加熱72小時(shí)。將反應(yīng)物冷卻至室溫，并在乙酸乙酯(500ml)和水(500ml)之間分配。

將有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液(100ml)洗滌、干燥(mgso4)、過(guò)濾并蒸發(fā)。將殘余物與乙醚一起研磨，并將固體材料過(guò)濾。將沉淀物用乙醚重新洗滌，并將濾液合并和蒸發(fā)。將粗制物質(zhì)(約30g)溶解在dmso:甲醇(1:1)中，并使用25-65%乙腈(+0.1%tfa)-水(+0.1%tfa)的梯度經(jīng)8個(gè)柱體積通過(guò)反相(c18)柱(330g)上的色譜法純化，將級(jí)分立即用飽和碳酸鈉水溶液中和。將適當(dāng)?shù)募?jí)分合并，并在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間分配。將有機(jī)相通過(guò)穿過(guò)疏水玻璃料進(jìn)行干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)以得到作為淡黃色泡沫的2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(14.97g)。

lcms(系統(tǒng)b):tret=2.21min;mh⁺306。

方法b：

在2升圓底燒瓶中將叔丁醇鈉(206g,2.144mol)加入(s)-2-戊醇(720ml,6.58mol)(可得自，例如，julichchiralsolutions,德國(guó))中。將混合物在50℃攪拌直到所有叔丁醇鈉已經(jīng)溶解。然后在5分鐘中分份加入2-氟-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(130g,548mmol)。

3小時(shí)以后，lcms分析指示起始原料的完全消耗，并將混合物倒入冰/水(3l)中，然后用甲基叔丁基醚萃取。這導(dǎo)致乳狀液形成，并將混合物穿過(guò)硅藻土過(guò)濾，并分離有機(jī)相。然后將水層用固體nacl處理，并然后用甲基叔丁基醚重萃取。將有機(jī)萃取物合并，并用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并然后蒸發(fā)以得到作為淡棕色膠狀物的2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(158.59g)。

lcms(系統(tǒng)d):tret=2.65min;mh⁺306。

中間體41:8-溴-2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺

在<5℃在氮?dú)夥障聦-溴琥珀酰亞胺(12.16g,68.3mmol)歷時(shí)5分鐘逐份加入2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(14.9g,48.8mmol)在氯仿(80ml)中的攪拌溶液中。將反應(yīng)混合物在<5℃攪拌5小時(shí)，然后用飽和碳酸氫鈉溶液(80ml)洗滌，然后用水(80ml)洗滌。將泡沫溶解在dcm(50ml)中，并用水(50ml)洗滌，然后用鹽水(50ml)洗滌。將合并的水相用dcm(50ml)洗滌。將合并的有機(jī)層穿過(guò)疏水玻璃料干燥，并將溶劑在真空中除去以得到作為橙色泡沫的8-溴-2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(18.5g)。

lcms(系統(tǒng)d):tret=3.06min;mh⁺384/386。

中間體42:2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-8-(甲氧基)-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺

將8-溴-2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(7.1g,18.48mmol)溶解在無(wú)水甲醇(70ml)中，并在氮?dú)夥障轮鸬渭尤爰状尖c(25%)在甲醇(8ml)中的溶液。在氮?dú)夥障聦⑷芤杭訜嶂猎?0℃回流4小時(shí)。加入另外的甲醇鈉在甲醇中的溶液(25%溶液,3ml)，并將反應(yīng)物在60℃攪拌另外16小時(shí)。加入另一部分甲醇鈉在甲醇中的溶液(25%溶液,5ml)，并將反應(yīng)物在90℃攪拌另外7小時(shí)。將溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去，并將粗產(chǎn)物在etoac(75ml)和飽和氯化銨溶液(75ml)之間分配。將有機(jī)層用鹽水(75ml)洗滌。將溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去以得到作為淡橙色泡沫的2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-8-(甲氧基)-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(6g)。

lcms(系統(tǒng)d):tret=3.08min;mh⁺336。

中間體43:2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-8-(甲氧基)-9h-嘌呤-6-胺三氟乙酸鹽

將2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-8-(甲氧基)-9-(四氫-2h-吡喃-2-基)-9h-嘌呤-6-胺(6g,17.89mmol)溶解在甲醇(50ml)中。逐滴加入三氟乙酸(20.67ml,268mmol)，并將混合物在氮?dú)夥障略?℃攪拌72小時(shí)。在真空中除去溶劑，并將得到的固體用乙酸乙酯洗滌和過(guò)濾。將濾液去除（stripped），并將殘余物用乙酸乙酯洗滌。將合并的固體殘余物在真空干燥箱中干燥2小時(shí)以得到作為灰白色固體的2-{[(1s)-1-甲基丁基]氧基}-8-(甲氧基)-9h-嘌呤-6-胺三氟乙酸鹽(5.3g)。

lcms(系統(tǒng)c):tret=0.76min;mh⁺252。

在氧代腺嘌呤的生產(chǎn)中可用作中間體的另外化合物的制備，以及另外氧代腺嘌呤化合物的制備，描述在wo2010/018134中，其整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

實(shí)施例4：使用冷凍保存的人外周血單核細(xì)胞(pbmc)誘導(dǎo)干擾素-α的測(cè)定

使用下述方法來(lái)試驗(yàn)氧代腺嘌呤化合物的體外生物活性。

化合物制備：

將化合物溶解在dmso中。用dmso制備系列2倍稀釋液，并將0.25μl分配進(jìn)384-孔透明greiner聚丙烯板中。

pbmc的制備

從健康人供體得到多達(dá)200ml的血液樣品。將25ml體積的全血覆蓋在leucosep管內(nèi)的15mlficoll梯度上面，并在1000g離心20min。將在血漿/histopaque界面處的帶中的細(xì)胞小心地取出，并用pbs洗滌2次(在400g離心5min以收獲)。將最終的沉淀物再懸浮于冷凍介質(zhì)(90%熱滅活的血清,10%dmso)中至4x10⁷個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。然后將再懸浮的細(xì)胞使用控速冰庫(kù)冷凍保存(冷凍)，并在-140℃儲(chǔ)存直到4個(gè)月。

溫育和干擾素-α測(cè)定

在即將測(cè)定之前，將幾個(gè)管形瓶的冷凍保存的(冷凍的)pbmc在水浴中在37℃快速解凍。制備所述細(xì)胞在錐蟲藍(lán)中的1:10稀釋液并計(jì)數(shù)。然后將pbmc在生長(zhǎng)培養(yǎng)基[含有10%胎牛血清(invitrogen)、青霉素+抗生蛋白鏈菌素(gibco目錄號(hào)25030-024,1:50)、l-谷氨酰胺2mm和1000單位/ml重組人ifn-γ(preprotech目錄號(hào)300-02)的rpmi1640]中稀釋至1x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度，并按50ul/孔分配至含有0.25μldmso或在0.25μldmso中的試驗(yàn)化合物的孔(在聚丙烯板中)中?；衔锏淖罡呓K濃度通常為50um或5um(以得到關(guān)于高活性化合物的曲線擬合)。將平板在5%co2中在37℃溫育24h。

使用多-異形體免疫測(cè)定來(lái)定量pbmc上清液中的ifn-α。將針對(duì)人ifn-α(目錄號(hào)31101,stratechscientific)的兔多克隆抗體在測(cè)定緩沖液(含有10%胎牛血清的rpmi1640,invitrogen)中1:10000稀釋，并將20μl加入msd(meso-scalediscovery,gaithersburg,md,usa)單個(gè)小斑點(diǎn)gar(山羊抗-兔抗體包被的)孔板的每個(gè)孔中。將平板在劇烈搖動(dòng)下在室溫溫育1小時(shí)。用pbs洗滌3次以后，將20μl細(xì)胞上清液加入平板的每個(gè)孔中。然后將平板在劇烈搖動(dòng)下在室溫溫育1小時(shí)。將一對(duì)針對(duì)ifn-α的單克隆抗體(目錄號(hào)21100和21112,stratechscientific)用sulfo-tag(tm)(msd)標(biāo)記，在測(cè)定緩沖液中1:1000稀釋，并將20μl加入平板的每個(gè)孔中。將平板在劇烈搖動(dòng)下在室溫進(jìn)一步溫育1小時(shí)。用pbs洗滌3次以后，將30μlx2t緩沖液(msd)加入每個(gè)孔，并在msdsector6000平板讀數(shù)器上讀出平板。

將數(shù)據(jù)歸一化至1um瑞喹莫德(n=16)和dmso(n=16)的內(nèi)部平板對(duì)照。在activitybase軟件中通過(guò)用irls(迭代重加權(quán)最小二乘法)進(jìn)行4-參數(shù)曲線擬合，從試驗(yàn)化合物的11-點(diǎn)2倍系列稀釋物導(dǎo)出pec50值。

實(shí)施例5：使用新鮮人外周血單核細(xì)胞(pbmc)誘導(dǎo)干擾素-α和tnf-α的測(cè)定

化合物制備

將化合物溶解在2%的甘油在水中的溶液中至在10μm開始的工作濃度，用5倍稀釋度系列稀釋至0.00013μm。將該化合物制品以10μl的體積加入96-孔平底平板中。將另外10μl介質(zhì)加入這些孔中，或者如果需要共刺激的話，加入另一種化合物制品。

pbmc的制備

將來(lái)自人供體的血液樣品收集進(jìn)肝素化的60cc注射器中，并分成在50ml圓錐形培養(yǎng)試管中的20ml等分試樣。然后將全血等分試樣用15mlpbs稀釋，然后鋪墊在15mlhistopaque(tm)下面。將樣品在不制動(dòng)的情況下在800g離心30min，并將血沉棕黃層界面小心地取出。將收集的細(xì)胞在1500rpm離心5分鐘，并將沉淀物再懸浮于10mlpbs中。將細(xì)胞合并，在pbs中進(jìn)一步洗滌2次，以從樣品除去所有的histopaque(tm)。最后一次洗滌以后，將合并的細(xì)胞在20ml完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充了10%v/v熱滅活的胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素g、100μg/ml鏈霉素、10mml-谷氨酰胺的rpmi1640)中培養(yǎng)，使用countess自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)器(invitrogen,lifetechnologies)計(jì)數(shù)，并稀釋以得到2.8x10⁶/ml的終濃度。將該細(xì)胞混懸液以180μl的體積加入含有化合物制品(參見上面)的培養(yǎng)板，得到200μl的總孔體積。

溫育和干擾素-α和tnf-α的測(cè)定

24小時(shí)溫育(37℃,95%空氣,5%co2)以后，將上清液小心地取出，并使用多路試劑盒(來(lái)自r&dsystems[bio-techne]的fluorokine(tm)多路試劑盒,minneapolis,mn)和人ifnαverikine(tm)elisa試劑盒(pestkabiomedicallaboratories,inc.,piscataway,nj)針對(duì)細(xì)胞因子/趨化因子誘導(dǎo)進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)施例6：使用來(lái)自特應(yīng)性志愿者的新鮮人外周血單核細(xì)胞(pbmc)的、變應(yīng)原驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞因子測(cè)定

開發(fā)了一個(gè)測(cè)定，其基于特應(yīng)性人供體衍生的外周血單核細(xì)胞(pbmc)與變應(yīng)原和試驗(yàn)化合物的共培養(yǎng)。培養(yǎng)5-6天以后，針對(duì)多種細(xì)胞因子測(cè)定細(xì)胞上清液。

化合物制備

將化合物溶解在dmso中，然后在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(補(bǔ)充了100u/ml青霉素g、100μg/ml鏈霉素、10mml-谷氨酰胺的rpmi1640培養(yǎng)基)中系列稀釋以得到在有0.04%dmso存在下的4倍所需濃度范圍。在所有濃度一式三份地測(cè)定每種化合物。

pbmc的制備

將來(lái)自已知對(duì)梯牧草（timothygrass）具有變應(yīng)性的志愿者的、去纖維蛋白的人血液在2500rpm離心15分鐘。將血清的上層收集并在56℃熱滅活30分鐘(hi-自體血清)。將細(xì)胞的下層再懸浮于50mlpbs(+ca+mg)中，將25ml稀釋的血液覆蓋在50ml管內(nèi)的20mllymphoprep(tm)上面，然后在室溫在2500rpm離心20分鐘。將在血清/lymphoprep(tm)界面處的帶小心地取出。將收集的細(xì)胞用pbs洗滌，并以4x10⁶/ml重新懸浮于含有hi-自體血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。將pbmc以0.4x10⁶個(gè)細(xì)胞/孔在有10ug/ml梯牧草抗原(alk-abello,丹麥)和適當(dāng)濃度的試驗(yàn)化合物存在下以200ul的總體積接種在平底96孔板中。

溫育和細(xì)胞因子測(cè)定

將平板在37℃在5%co2中溫育直到6天。將來(lái)自每個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)基收獲并在分析之前在-20℃儲(chǔ)存。使用mesoscalediscovery?10斑點(diǎn)平板針對(duì)人th1/th2細(xì)胞因子檢測(cè)上清液中的細(xì)胞因子和趨化因子。

實(shí)施例7：氧代腺嘌呤3a-3g的tlr7/8活性

使用被htlr7或htlr8且被nfκbseap(分泌的胚性堿性磷酸酶)報(bào)道基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞，通過(guò)報(bào)道基因測(cè)定來(lái)評(píng)估氧代腺嘌呤3a-g的人(h)tlr7/8活性。

表達(dá)人tlr7或tlr8和nfκb應(yīng)答性seap報(bào)道基因的hek293細(xì)胞得自invivogen(sandiego,ca)。將這些細(xì)胞維持在dulbecco氏改良的伊格爾培養(yǎng)基(dmem)(invitrogen,grandisland,ny)、10%胎牛血清(fbs)(sigma,st.louis,missouri)和選擇抗生素(invitrogen和invivogen)的培養(yǎng)基中。將穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞以1^e5/孔鋪板在96-孔平底培養(yǎng)板中并用一定劑量范圍的化合物水性制劑刺激24h，所述水性制劑在200μm開始，用2倍稀釋度系列稀釋至0.012μm(除非制劑條件需要更低的開始濃度)。收獲培養(yǎng)物上清液，并使用比色測(cè)量seap檢測(cè)試劑盒quanti-blue(invivogen的商標(biāo))針對(duì)nfκb活化進(jìn)行測(cè)定。

所述測(cè)定測(cè)量在tlr7或tlr8特異性的活化以后nfκb介導(dǎo)的seap產(chǎn)生。氧代腺嘌呤3a-g的htlr7和htlr8特異性和效能(ec50)顯示在圖1a-c中。

應(yīng)當(dāng)指出，hek測(cè)定對(duì)于評(píng)價(jià)tlr7而言不是最佳的，因?yàn)榻?jīng)由nfκb(導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo))和irf7途徑(導(dǎo)致ifn誘導(dǎo))和hek系統(tǒng)的tlr7信號(hào)僅僅測(cè)量tlr7信號(hào)傳遞的nfκb側(cè)。氧代腺嘌呤3a對(duì)htlr7或htlr8是無(wú)活性的，但是其它氧代腺嘌呤3b-g都是有活性的。盡管將連接基長(zhǎng)度增加至超過(guò)1個(gè)碳會(huì)增加htlr7效能，但是在該測(cè)定中沒(méi)有觀察到碳連接基長(zhǎng)度和htlr7效能之間的線性關(guān)系。5-碳連接基氧代腺嘌呤3f是所述系列中最有效的htlr7激動(dòng)劑(參見圖1c)，而1-碳連接基氧代腺嘌呤3b是所述系列中最有效的htlr8激動(dòng)劑，且htlr8效能隨著碳連接基增長(zhǎng)而顯著下降。

用較高劑量的氧代腺嘌呤3e-g刺激以后觀察到的htlr8活性的損失提示在hek293-htlr8細(xì)胞中的可能細(xì)胞毒性。使用live/dead(tm)可固定的aqua染色來(lái)評(píng)價(jià)在用氧代腺嘌呤3e-g進(jìn)行hek293-htlr8刺激以后的潛在細(xì)胞死亡。在氧代腺嘌呤3e-g的較高劑量觀察到顯著細(xì)胞毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。用較短碳連接基氧代腺嘌呤3b-d刺激24小時(shí)以后沒(méi)有觀察到該細(xì)胞毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。

接下來(lái)使用細(xì)胞因子elisa和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ics)評(píng)價(jià)用氧代腺嘌呤3e-g刺激24小時(shí)以后人外周血單核細(xì)胞(hpbmc)中的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。tnfα的誘導(dǎo)顯示在圖2a中。觀察到tnfα分泌隨著碳長(zhǎng)度遞增的明顯增加，對(duì)于五碳連接基觀察到最大tnfα分泌。

還使用ics來(lái)檢查不同細(xì)胞子集的活化狀態(tài)和細(xì)胞因子貢獻(xiàn)。當(dāng)對(duì)比il-6(圖2b)、tnfα和ifnγ誘導(dǎo)時(shí)，在髓樣樹突細(xì)胞(mdc)中觀察到類似的模式。這些數(shù)據(jù)一起強(qiáng)烈地提示，隨著碳連接基增加至五碳促炎性細(xì)胞因子的增加。6-碳連接基氧代腺嘌呤3g誘導(dǎo)比3f更少的tnfα，但是比4-碳連接基氧代腺嘌呤3e更多。

還評(píng)價(jià)了在用氧代腺嘌呤3a-g刺激后來(lái)自hpbmc的ifnα的誘導(dǎo)。鑒于在碳連接基長(zhǎng)度與用氧代腺嘌呤3a-g在hek293系統(tǒng)中得到的htlr7ed50值(其指示tlr7信號(hào)傳遞的nfκb側(cè))之間觀察到的非線性關(guān)系，預(yù)期來(lái)自hpbmc的ifnα誘導(dǎo)更能代表這些化合物的htlr7活性。對(duì)于化合物3a-g，觀察到ifnα表達(dá)的獨(dú)特模式(圖3)。

除了無(wú)活性的氧代腺嘌呤3a以外，化合物3a-g中的每一種在100μm劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出從峰至底的鐘形劑量響應(yīng)曲線。具有遞增碳連接基長(zhǎng)度的氧代腺嘌呤是遞增更有效的ifnα誘導(dǎo)物，如實(shí)現(xiàn)最大ifnα應(yīng)答所需的較低劑量所指示的，但是較高的氧代腺嘌呤濃度與劑量響應(yīng)性的ifnα減少有關(guān)。并行地，相同細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的tnfα水平以劑量依賴性的方式增加。pdc是負(fù)責(zé)>90%的ifnα分泌的原代細(xì)胞類型，因此經(jīng)由調(diào)節(jié)性反饋回路抑制tlr7-irf7信號(hào)傳遞途徑以限制ifnα的活化量級(jí)或細(xì)胞類型特異性的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(aicd)可能負(fù)責(zé)在該研究中觀察到的獨(dú)特細(xì)胞因子模式。

為了評(píng)價(jià)這些假設(shè)，用不同劑量的3b(1-碳連接基)或3f(5-碳連接基)刺激hpbmc，并通過(guò)膜聯(lián)蛋白-v染色針對(duì)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞。3f與pdc中膜聯(lián)蛋白-v染色的劑量依賴性增加有關(guān)，但是在mdc中無(wú)關(guān)。相反，僅最高劑量的3b(10mm)在pdc和mdc子集中與膜聯(lián)蛋白-v陽(yáng)性細(xì)胞有關(guān)。這種觀察到的細(xì)胞類型特異性的細(xì)胞凋亡與劑量依賴性的ifnα和tnfα誘導(dǎo)曲線相關(guān)。

為了進(jìn)一步證實(shí)pdc細(xì)胞凋亡對(duì)ifnα誘導(dǎo)的影響，在hpbmc中評(píng)價(jià)了等摩爾量的3b和3f的共刺激。如預(yù)期的，高劑量(~0.3μm)的3f和3b的組合與單獨(dú)的3b相比減小了ifnα峰，而較低劑量的3f和3b(~0.003μm)的組合沒(méi)有改變單獨(dú)3f的ifnα峰應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊@些結(jié)果證實(shí)，使碳連接基從1個(gè)增加至5個(gè)碳會(huì)增加來(lái)自pdc的ifnα誘導(dǎo)的效能，但是也會(huì)降低細(xì)胞凋亡的劑量閾值，同時(shí)使來(lái)自mdc的tnfα誘導(dǎo)在較大程度上不改變。

總之，研究了在9位處被哌啶基烷基基團(tuán)取代的7種氧代腺嘌呤(3a-3g)的構(gòu)效關(guān)系。htlr7和htlr8活性需要最小1-碳連接基。5-碳連接基氧代腺嘌呤是最有效的htlr7激動(dòng)劑，而1-碳連接基是所述系列的最有效的htlr8激動(dòng)劑。在hpbmc中的促炎性細(xì)胞因子和ifnα誘導(dǎo)隨著碳長(zhǎng)度增加直到5個(gè)碳而增加，其中5-碳連接基氧代腺嘌呤是最有效的細(xì)胞因子誘導(dǎo)物。這些結(jié)果指示，使用微小結(jié)構(gòu)修飾可能調(diào)節(jié)在n-9處具有非芳族基團(tuán)的氧代腺嘌呤系列中的htlr7/8活性和細(xì)胞因子誘導(dǎo)。

實(shí)施例8：化合物3x的tlr7和tlr8特異性和效能

與研究的其它氧代腺嘌呤相比，證實(shí)了化合物3x具有改善的tlr7效能和tlr7-偏倚激動(dòng)劑活性。

與氧代腺嘌呤3b相比，化合物3f和3x分別具有高50和100倍的tlr7效能(圖4a)和較低的tlr8活性(圖4b)。通過(guò)對(duì)比3f和3x，可以看到c2取代基的影響：在c2-丁氧基鏈的第一個(gè)碳上引入(s)-甲基會(huì)增加tlr7和tlr8活性。

當(dāng)在hpbmc中針對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，化合物3f和3x表現(xiàn)出高效能(較低ed50)和tnf-α應(yīng)答(圖5)。對(duì)于其它促炎細(xì)胞因子觀察到相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

如基于在hek293測(cè)定中關(guān)于化合物3f和3x觀察到的低tlr7ed50所預(yù)期的，兩種氧代腺嘌呤在非常低的劑量(~1nm范圍)誘導(dǎo)ifn-α(圖6)。

圖7顯示了通過(guò)ics測(cè)量的氧代腺嘌呤的ifn-α誘導(dǎo)。通過(guò)ifn-α陽(yáng)性的總活pdc細(xì)胞的百分比來(lái)分析細(xì)胞因子誘導(dǎo)。使用的劑量是360皮摩爾、11納摩爾、330納摩爾和10微摩爾。

如以前用其它氧代腺嘌呤(參見wo2010/018134)觀察到的，與咪唑并喹啉化合物crx642(參見wo2010/048520;pct/us2009/061867;us8,624,029)和crx601的組合相比，與針對(duì)il12-p70的agpcrx601的協(xié)同作用是相對(duì)低的。但是，化合物3x和3f在寬劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出與crx601的協(xié)同作用(圖8a和8b)。

表2總結(jié)了上面討論的數(shù)據(jù)。因?yàn)樗牡蛅lr7ed50和高相對(duì)ifn-α和il-12p70誘導(dǎo)而注意到化合物3x。

表2

*至****：最低至最高細(xì)胞因子誘導(dǎo)水平；。