技術(shù)背景

本發(fā)明的主題涉及附著于基質(zhì)的貼壁細胞的凍存及后續(xù)解凍的方法。還揭示了鑒定一種或多種胞外基質(zhì)(ecm)組分和/或基質(zhì)細胞蛋白的方法，所述胞外基質(zhì)組分和/或基質(zhì)細胞蛋白提高細胞在從凍存狀態(tài)解凍期間及之后的活力和滯留。

減少在研究中使用動物數(shù)量的持續(xù)需求驅(qū)動著基于細胞和基于組織的體外分析的發(fā)展，并提供關于各種化學制品、化合物和制劑的準確毒性數(shù)據(jù)。在2009年，歐盟禁止了使用動物來測試化妝品成分。這之后可能會禁止使用動物來測試其他類型化合物(包括藥物和家用化學制品)的毒性。

對于該需求，已采用通過將細胞和組織的溫度降至水的冰點以下進行的細胞和組織的凍存來保護和保存生物系統(tǒng)。細胞的凍存通常在懸浮形式中進行，并且對于細胞在固定基質(zhì)上的凍存的研究極少。因此，開發(fā)用于細胞懸液的常用的凍存方案也通常應用于固定基質(zhì)上的貼壁細胞，這常常導致凍存后細胞脫離和膜的破壞。只能通過使用合適的冷凍保護劑來使細胞在凍存處理中的凍融的嚴苛條件下存活。因此，冷凍生物學中的大多數(shù)研究著眼于尋找并測試新型冷凍保護劑。

然而，在凍融的嚴苛條件之后，對于ecm(天然或合成)的細胞貼附的滯留對于保存天然和工程改造的組織以及其它應用的如體外毒理學測試而言是至關重要的。貼壁機制的破壞不可避免地具有嚴重的后果；甚至對于貼壁機制的可逆作用也可能是災難性的，因為與基礎性的ecm的空間分離足以阻止再附著。

因此，需要用于貼壁細胞的改善的凍存方案。具體地說，希望在將附著于基質(zhì)的細胞從凍存狀態(tài)升溫后，獲得改善的細胞貼附和活力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文公開了一種用于附著于基質(zhì)的貼壁細胞的凍存方法，所述方法提高凍存細胞的細胞活力和滯留(retention)。所述方法包括：用至少一種ecm組分處理基質(zhì)和/或向所述基質(zhì)或細胞培養(yǎng)基添加至少一種基質(zhì)細胞蛋白，將細胞鋪板于經(jīng)處理的基質(zhì)上；和通過使細胞降溫至凍存溫度來在經(jīng)處理的基質(zhì)上凍存所述細胞。

還公開了鑒定一種或多種ecm組分和/或基質(zhì)細胞蛋白質(zhì)的方法，所述ecm組分和/或基質(zhì)細胞蛋白質(zhì)提高基質(zhì)上的細胞在從凍存狀態(tài)解凍后的活力和滯留。所述方法包括：選擇特定細胞類型的細胞；用一種或多種不同的ecm組分處理基質(zhì)和/或向所述基質(zhì)或細胞培養(yǎng)基添加一種或多種基質(zhì)細胞蛋白；將所述特定細胞類型的細胞鋪板于經(jīng)處理的基質(zhì)上；通過使細胞降溫至凍存溫度，在經(jīng)各種處理的基質(zhì)上凍存所述細胞；通過如下方式解凍所述細胞：將含有所述細胞的經(jīng)處理的基質(zhì)暴露于第一環(huán)境，所述第一環(huán)境具有高于所述凍存溫度的第一升溫溫度，使細胞從凍存溫度經(jīng)歷第一次升溫，然后，通過使所述細胞暴露于第二環(huán)境，所述第二環(huán)境具有高于第一升溫溫度的第二升溫溫度，使所述細胞從第一升溫溫度進一步升溫；評估解凍的細胞以確定細胞活力和滯留；和，鑒定一種或多種ecm組分和/或至少一種基質(zhì)細胞組分，所述ecm組分和/或基質(zhì)細胞組分能提高特定細胞類型的細胞在從凍存狀態(tài)解凍后的活力和滯留。

附圖說明

附圖1a和1b的柱狀圖說明在以各種降溫速率進行凍存后，ecm或組織培養(yǎng)物處理的塑料(tcp)上的貼壁牛角膜內(nèi)皮(bce)細胞的(a)細胞活力和(b)dna含量(％)(即細胞滯留)。

附圖2a-2d的柱狀圖說明在采用(a)單一和成對的ecm組分、(b)三種ecm組分的組、(c)四種ecm組分的組、和(d)五種ecm組分的組進行凍存后，貼壁bce細胞的細胞活力。

附圖3a-3d的柱狀圖說明在采用(a)單一和成對的ecm組分、(b)三種ecm組分的組、(c)四種ecm組分的組，和(d)五種ecm組分的組進行凍存后，貼壁bce細胞的dna含量(％)(即細胞滯留)。

附圖4a-4d的柱狀圖說明在采用(a)單一和成對的ecm組分、(b)三種ecm組分的組、(c)四種ecm組分的組、和(d)五種ecm組分的組進行凍存后，貼壁人間充質(zhì)干細胞(hmsc)的細胞活力。

附圖5a和5b的柱狀圖說明在通過單一快速解凍步驟或兩步法解凍方案進行凍存和解凍后，各種基質(zhì)上的貼壁hmsc的(a)細胞活力和(b)dna含量(％)(即細胞滯留)。

附圖6的柱狀圖說明在明膠上或ecm與層粘連蛋白、膠原i、膠原iii和膠原v的組合上，采用或不采用基質(zhì)細胞蛋白生腱蛋白x，進行凍存之后，貼壁hmsc的細胞活力。

具體實施方式

本文所使用的與數(shù)量相關使用的修飾語“約”包括所述的值，并且具有上下文描述的含意。例如，它至少包括與該具體數(shù)值的測量相關聯(lián)的誤差度。在使用范圍的情況下，修飾語“約”也應該被認為是公開了由兩個端點的絕對值定義的范圍。例如，“約2-約4”的范圍也公開了“2-4”的范圍。

除非在本文中另有明確說明，述及溫度(℃)時，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-4％。

除非在本文另有明確說明，述及細胞活力和細胞滯留或附著力(％)時，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-3％。

除非在本文另有明確說明，述及濃度(μg/ml)時，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-4％。

除非在本文另有明確說明，述及摩爾濃度(m)時，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-2％。

除非在本文另有明確說明，述及降溫速率(℃/分鐘)時，修飾語“約”是指所述值或值的范圍以及所述值或值范圍+/-1-3％。

如本文所用，術(shù)語“室溫”是指標準壓強下約為18℃到25℃的溫度。在不同的實施例中，室溫可能約為18℃、約為19℃、約為20℃、約為21℃、約為22℃、約為23℃、約為24℃，或約為25℃。

本方法涉及固定在基質(zhì)上的貼壁細胞的凍存(即通過冷凍保存)以及所述細胞的后續(xù)解凍，即從凍存溫度升溫，以用于各種應用，如體外毒理學測試。例如，術(shù)語“冷凍”是指低于水的冰點的溫度，即低于0℃。凍存通常包括將細胞冷凍至遠低于冰點的溫度，例如至-80℃或更低，更通常是至-130℃或更低?？墒褂萌魏伪绢I域從業(yè)人員已知的任何凍存方法，沒有限制。凍存溫度可低于-20℃，例如-80℃或更低，或者-130℃或更低。凍存溫度可約為-20℃至-200℃，約為-30℃至-175℃，約為-50℃至-160℃，約為-65℃至-150℃，約為-75℃至-135℃，約為-80℃至-130℃，約為-90℃至-125℃，或約為-100℃至-115℃。參見例如，armitage等，“降溫速率對冷凍細胞存活的影響在單層與懸液中不同”("theinfluenceofcoolingrateonsurvivaloffrozencellsdiffersinmonolayersandsuspensions")，cryo-letters17:213-218(1996)。

本方法經(jīng)設計以使細胞能在再升溫后立即使用，這消除了對細胞鋪板、擴增及再鋪板的需要。為此，已經(jīng)開發(fā)了用于將凍存的貼壁細胞從凍存溫度升溫的兩階段升溫方案。參見例如，campbell等，美國專利號6,596,531("campbell'531")，其通過引用全文納入本文，并顯示了貼壁細胞可在多孔板中以貼壁分化細胞單層的形式凍存。

本方法針對附著于基質(zhì)的貼壁細胞(例如bce細胞和hmsc)的凍存。參見例如，ji等，“貼壁人胚胎干細胞的凍存”("cryopreservationofadherenthumanembryonicstemcells")，biotechnologyandbioengineering88(3):299-312(2004)；katkov等，“完全解離的貼壁人誘導型多能干細胞的無dmso編程的的凍存”("dmso-freeprogrammedcryopreservationoffullydissociatedandadherenthumaninducedpluripotentstemcells")，stemcellsinternational2011,2011:981606.doi:10.4061/2011/981606，于2011年1月1日電子公開；以及xu等，“在凍存期間，滲透和冷激擊對貼壁人間充質(zhì)干細胞的影響”("effectsofosmoticandcoldshockonadherenthumanmesenchymalstemcellsduringcryopreservation")，j.biotech.162(2-3):224-231(2012)。

可使用任何合適的基質(zhì)，沒有限制。例如，可使細胞附著于組成具有多個孔的微滴定板(即多孔板)的表面的組織培養(yǎng)塑料(tcp)、膠原凝膠、天然基質(zhì)，或合成材料。對于基質(zhì)的細胞附著是本領域已知的。參見例如，campbell等，“用于凍存細胞的無血清溶液”("serumfreesolutionsforthecryopreservationofcells")，invitrocelldev.biol.,43:269-275(2007)；campbell等，“豬主動脈瓣膜小葉衍生肌成纖維細胞的凍存”("cryopreservationofporcineaorticheartvalveleaflet-derivedmyofibroblasts")，biopreservationandbiobanking，8(4):211-217(2010)；campbell等，“凍存后用海藻糖培養(yǎng)產(chǎn)生活性內(nèi)皮細胞”("culturingwithtrehaloseproducesviableendothelialcellsaftercryopreservation")，cryobiology，64(3):240-244(2012)；hornung等，“固定于結(jié)構(gòu)化玻璃和硅基質(zhì)上的錨定依賴性哺乳動物細胞的凍存”("cryopreservationofanchorage-dependentmammaliancellsfixedtostructuredglassandsiliconsubstrates")，cryobiology，33:260-70(1996)；mcgann等，“凍存期間細胞與細胞間和細胞與表面間的相互作用反應”("cell-to-cellandcell-to-surfaceinteractionsaffectresponsesduringcryopreservation")，transfusion，33(7):611(1993)；ohno，“一種原位冷凍錨定依賴性細胞的簡單方法”("asimplemethodforinsitufreezingofanchorage-dependentcells")，刊于:adoyle，jbgriffiths，dgnewell(編)，《細胞和組織培養(yǎng)：實驗步驟》(cellandtissueculture:laboratoryprocedures)，奇切斯特：約翰威力父子公司(johnwileyandsons)(1994)；pasch等，“懸液和單層角質(zhì)形成細胞的凍存中hes濃度的變化”("variationofthehesconcentrationforthecryopreservationofkeratinocytesinsuspensionsandinmonolayers")，cryobiology，41(2):89-96(2000)；以及pasch等，“單層角質(zhì)形成細胞的凍存”("cryopreservationofkeratinocytesinamonolayer")，cryobiology，39(2):158-168(1999)，上述每篇文獻均通過引用全文納入本文，并顯示貼壁細胞的成功活力和對于tcp的細胞附著。

本發(fā)明的方法涉及通過采用ecm或一種或多種ecm組分處理基質(zhì)來促進和提高細胞在凍存期間的活力和附著力。ecm是為組織提供結(jié)構(gòu)框架的動態(tài)結(jié)構(gòu)的小生境，也密切涉及細胞加工，例如信號轉(zhuǎn)導、分化、增殖、附著、極性及存活。參見例如，frantz等，“胞外基質(zhì)概況”("theextracellularmatrixataglance")，j.cellsci.，123:4196-4200(2010)，該文獻揭示了ecm在細胞的最終細胞健康中起到重要作用。

例如，短語“改善的細胞活力”或“改善的活力”是指細胞活力(％)至少為60％，例如80％或更高。改善的細胞活力(％)可以是65％或更高、67％或更高、70％或更高、73％或更高、75％或更高、77％或更高、80％或更高、83％或更高、85％或更高、87％或更高、90％或更高、93％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高，或99％或更高。同樣地，術(shù)語“細胞滯留”，“滯留”，“細胞附著”或“附著”是指，例如，dna含量的測量，其可用作細胞數(shù)量的指標。短語“改善的細胞滯留”、“改善的滯留”、“改善的細胞附著”或“改善的附著”是指，例如，至少為80％、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、87％或更多、89％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多，或99％或更多的dna的含量(％)。參見例如，malpique等，“貼壁細胞的凍存：提高解凍后細胞活力和功能的策略”("cryopreservationofadherentcells:strategiestoimprovecellviabilityandfunctionafterthawing")，tissueengineeringpartcmethods，15(3):373-386(2009)。

如附圖1說明，對于ecm而不是tcp的細胞的附著，提高了凍存期間和之后的細胞活力和滯留。完全形成和組織的ecm的存在提供了更近似于細胞的天然環(huán)境的表面。因此，細胞附著可能較少地受凍存過程影響。此外，ecm組合物可能影響細胞在凍存期間維持附著的能力。而且，通過采用ecm來凍存細胞，細胞所處的構(gòu)造可能更有利于其整體健康并且可能改善其應對冷凍溫度的耐受力和恢復力。

一些實施方式涉及貼壁細胞在完全形成的ecm上的凍存。其他實施方式涉及采用某些ecm組分的貼壁細胞的凍存，以促進凍存期間細胞的附著，并且在細胞從凍存狀態(tài)重新升溫后在使用前為其提供更天然的環(huán)境。用ecm組分處理基質(zhì)可涉及將ecm組分被覆于細胞基質(zhì)上。

所述ecm組分可包括本領域已知的任何ecm組分。例如，本領域已知，細胞對ecm基質(zhì)的附著是通過接合復合物(粘著斑)介導的。這些接合復合物包括特異性粘附受體，其中許多屬于稱為整聯(lián)蛋白的同源基質(zhì)受體的大型超家族，其大部分識別它們結(jié)合的胞外蛋白中的arg-gly-asp(rgd)三肽序列。一些細胞在與膠原的結(jié)合中利用其他明顯無關的跨膜糖蛋白，并且許多細胞具有將細胞直接連接到ecm的完整的膜蛋白聚糖。參見例如，rixen等，“在體外i型和iv型膠原上，角膜內(nèi)皮細胞的附著與擴散：研究內(nèi)皮修復機制的模型”("adhesionandspreadingofcornealendothelialcellsoncollagentypeiandivinvitro:amodeltostudymechanismsofendothelialrepair")，res.exp.med.，190:203-211(1990)。

在培養(yǎng)條件下，各種細胞類型，例如牛角膜內(nèi)皮細胞，對于組織培養(yǎng)聚苯乙烯的最初附著，可能取決于細胞-粘附糖蛋白，例如纖連蛋白和/或玻連蛋白，對培養(yǎng)表面的吸附。參見例如，underwood等，“細胞-粘附蛋白玻連蛋白和纖連蛋白的生物活性的比較”("acomparisonofthebiologicalactivitiesofthecell-adhesiveproteinsvitronectinandfibronectin")，j.cell.sci.，93(pt.4):641-649(1989)。在細胞接種之前，所述細胞-粘附蛋白可以純化形式預被覆在聚合物上；它們也可以從用于補充培養(yǎng)基的血清吸附到培養(yǎng)表面上；或者，它們可由細胞合成并沉積到塑料表面上。

已經(jīng)報道內(nèi)源性蛋白質(zhì)至少部分地有助于在沒有血清來源的蛋白質(zhì)(例如纖連蛋白和玻連蛋白)的情況下將細胞附著于合成的基質(zhì)上。可以使用任何新鑒定的或眾所周知的內(nèi)源性蛋白質(zhì)和細胞粘附蛋白。參見例如，gordon等，“損傷期間細胞骨架的作用-誘導的角膜內(nèi)皮的細胞遷移”("roleofthecytoskeletonduringinjury-inducedcellmigrationincornealendothelium")，cellmotil.&cytoskeleton，6:47-57(1990)。蛋白聚糖介導的相互作用可促進附著細胞中肌動蛋白絲的組織。肌動蛋白的動態(tài)作用涉及肌動蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的作用，其調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的長度和締合，并且取決于球狀和絲狀肌動蛋白之間的平衡。這受到溫度、ph、離子強度和有機溶劑的存在的影響，所有這些都是凍存中的因素。因此，在本方法中，肌動蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)可用作ecm蛋白。

bce細胞生產(chǎn)許多ecm蛋白，以建立成熟的基質(zhì)，包括纖連蛋白、層粘連蛋白和i型、iii型、iv型和v型膠原。纖連蛋白和層粘連蛋白由分離的細胞和單層中的細胞差異表達。類似地，不同的膠原類型也不以與優(yōu)勢膠原iii等同的方式表達。參見例如，gospodarowicz等，“在培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細胞中鑒定和定位纖連蛋白：細胞表面極性和生理意義”("theidentificationandlocalizationoffibronectininculturedcornealendothelialcells:cellsurfacepolarityandphysiologicalimplications")，exp.eyeres.，29:485-509(1979)；gospodarowicz等，“在培養(yǎng)的血管和角膜內(nèi)皮細胞中生產(chǎn)和定位層粘連蛋白”("theproductionandlocalizationoflaminininculturedvascularandcornealendothelialcells"，j.cellphysiol.，107:171-183(1981)；及scheffer等，“由培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細胞合成的膠原的特征”("characterizationofcollagenssynthesizedbyculturedbovinecornealendothelialcells")，j.biol.chem.，256(7):3361-3365(1981)。例如，層粘連蛋白，在單層形成前大量產(chǎn)生，隨后蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降，并且可能不利于凍存期間的粘附，如纖連蛋白，其生成不隨細胞密度而變化。此外，可證明多種組分的組合是維持附著和活力的更好的基質(zhì)。例如，已顯示纖連蛋白有利于牛角膜內(nèi)皮細胞附著于基質(zhì)中的膠原。參見例如，scott等，“牛角膜內(nèi)皮細胞對膠原和其他亞內(nèi)皮組分的附著的研究”("investigationoftheattachmentofbovinecornealendothelialcellstocollagensandothercomponentsofthesubendothelium")，exp.cellres.，144:472-478(1983)。

hmsc也生產(chǎn)ecm蛋白，包括纖連蛋白、層粘連蛋白以及i型、iii型、iv型和v型膠原，并且可受到它們所在的ecm小生境的大幅影響。ecm組合物影響間充質(zhì)干細胞如何并且向什么譜系分化，當開發(fā)用于將在板上凍存的干細胞的ecm覆層時，需要考慮該方面。參見例如，singh等，“纖連蛋白和干細胞分化——來自軟骨形成的研究結(jié)果”("fibronectinandstemcelldifferentiation-lessonsfromchondrogenesis")，j.cellsci.，125:3703-3712(2012)。

基質(zhì)可用ecm組分處理，所述ecm組分包括：纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v中一種或多種。基質(zhì)可用濃度約為0.5－25μg/ml，例如約1－15μg/ml，或約1－10μg/ml的ecm組分處理?；|(zhì)可用ecm組分處理，所述ecm組分的濃度為約0.75－20μg/ml、約2－20μg/ml、約2－15μg/ml、約5－10μg/ml、約5－12μg/ml、約5－15μg/ml、約5－18μg/ml、約5－20μg/ml、約5－22μg/ml、約7－20μg/ml、約7－15μg/ml、約7－10μg/ml、約10－25μg/ml、約10－20μg/ml、約10－15μg/ml、約15－25μg/ml，或約15－20μg/ml。

當凍存的細胞是牛角膜內(nèi)皮細胞時，基質(zhì)可用ecm組分處理，所述ecm組分可包括：纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v中的一種、兩種、三種、四種、五種或六種。ecm組分的示例性組合包括：纖連蛋白、膠原i和膠原v；纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i和膠原iv；纖連蛋白、膠原iii、膠原iv和膠原v；或者膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v。

當凍存的細胞是人間充質(zhì)干細胞時，ecm組分可以是包括纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v的一種或多種蛋白質(zhì)。ecm組分的示例性組合可包括：纖連蛋白、膠原iv和/或膠原v；纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i和膠原v；膠原iv和膠原v；纖連蛋白、層粘連蛋白和膠原v；層粘連蛋白、膠原iv和膠原v；膠原iii、膠原iv和膠原v；以及層粘連蛋白、膠原iii和膠原v。

除了ecm組分外，可將基質(zhì)細胞蛋白添加至基質(zhì)，或可將它們添加至細胞培養(yǎng)基。近年來，已揭示基質(zhì)細胞蛋白的功能和重要性。雖然這些蛋白質(zhì)存在于ecm中，它們在維持基質(zhì)的結(jié)構(gòu)方面不起重要作用。相反，它們參與細胞功能的調(diào)節(jié)?；|(zhì)細胞蛋白通過與細胞表面受體、激素和其它效應分子(包括ecm)相互作用來調(diào)節(jié)細胞功能。它們分泌并存在于胞外環(huán)境中，但不像常規(guī)的ecm蛋白一樣起到結(jié)構(gòu)性作用。雖然在發(fā)育過程中更為顯著，但它們?nèi)匀淮嬖谟诔扇酥校貏e是在受傷部位。它們發(fā)揮各種各樣的功能，這由它們所在的環(huán)境決定。在本方法中，可以使用任何已知的基質(zhì)細胞蛋白或未來發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)細胞蛋白。參見例如，bornstein等，“基質(zhì)細胞蛋白：細胞功能的胞外調(diào)節(jié)劑”("matricellularproteins:extracellularmodulatorsofcellfunction")，curr.opin.cellbiol.，14:608-616(2002)；bornstein等，“基質(zhì)細胞蛋白：概述”("matricellularproteins:anoverview")，j.cellcommun.signal.，3:163-165(2009)；frangogiannis，“心臟適應和疾病中的基質(zhì)細胞蛋白”("matricellularproteinsincardiacadaptationanddisease")，physiol.rev.，92:635-688(2012)；morris等，“基質(zhì)細胞蛋白和生物材料”("matricellularproteinsandbiomaterials")，matrixbiol.mar.，pii:s0945-053x(14)00051-1.doi:10.1016/j.matbio.2014.03.002(2014)；roberts，“基質(zhì)細胞蛋白的新興功能”("emergingfunctionsofmatricellularproteins")，cellmol.lifesci.，68(19):3133-3136(2011)；wong等，“基質(zhì)細胞蛋白：啟動癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境”("matricellularproteins:primingthetumourmicroenvironmentforcancerdevelopmentandmetastasis")，brit.j.cancer，108:755-761(2013)。迄今為止的大多數(shù)研究已經(jīng)用敲除小鼠研究了基質(zhì)細胞蛋白的各種功能，而幾乎沒有體外評估這些蛋白的研究。

基質(zhì)細胞蛋白影響細胞行為的能力可被利用以促進細胞在體外系統(tǒng)的活力和附著力。同樣，基質(zhì)可用一種或多種基質(zhì)細胞蛋白，單獨或與ecm組分組合，來處理。也即，所述方法也可包括向細胞基質(zhì)或培養(yǎng)基添加基質(zhì)細胞蛋白。合適的基質(zhì)細胞蛋白包括血小板反應蛋白-1、生腱蛋白-c，生腱蛋白-x，sparc(分泌型蛋白，酸性且富含半胱氨酸)、骨膜素(periostin)、ccn-1，以及骨橋蛋白。

可使用濃度約為0－5μg/ml的基質(zhì)細胞蛋白?；|(zhì)細胞蛋白可以如下濃度使用：約0.25－5μg/ml、約0.5－5μg/ml、約0.75－5μg/ml、約1－5μg/ml、約2－5μg/ml、約3－5μg/ml、約4－5μg/ml、約0－4μg/ml、約0－3μg/ml、約0－2μg/ml、約0－1μg/ml、約0.5－4μg/ml、約0.5－3μg/ml、約1－4μg/ml、約1－3μg/ml，或約1－2μg/ml。

通過將細胞與二糖，如海藻糖，孵育，可在凍存前進一步保護細胞(campbell等，在保存前用糖處理細胞材料的方法(methodfortreatmentofcellularmaterialswithsugarspriortopreservation)，見于2007年9月18日出版的美國專利7,270,946)

通過在將細胞在冷凍至凍存溫度前使其與凍存組合物接觸，可在凍存期間進一步保護細胞與凍存組合物接觸是指使細胞以某種方式與凍存組合物接觸，從而在降溫至凍存溫度期間，細胞被凍存組合物保護。例如，可通過填充待保護的細胞的附著的板中合適的孔來使細胞與凍存組合物接觸。

也可使待凍存的細胞與冷凍相容的ph緩沖液接觸，所述ph緩沖液通常至少主要包含：堿性鹽溶液、能量源(例如葡萄糖)，以及能夠在降溫溫度下保持中性ph的緩沖劑。眾所周知的這樣的材料包括，例如杜爾貝科改良的伊格培養(yǎng)基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)(dmem)。該材料也可作為凍存組合物的一部分。參見例如，campbell等，“貼壁平滑肌和內(nèi)皮細胞與二糖一起凍存”("cryopreservationofadherentsmoothmuscleandendothelialcellswithdisaccharides")，刊于:katkovi.(編)，《凍存前沿》(currentfrontiersincryopreservation)，克羅地亞:科技公司(intech)(2012)；以及campbell等，“胰腺儲存解決方案的發(fā)展：供于低溫儲存后β細胞存活和代謝狀態(tài)的細胞保護補充劑的初步篩選”("developmentofpancreasstoragesolutions:initialscreeningofcytoprotectivesupplementsforβ-cellsurvivalandmetabolicstatusafterhypothermicstorage")，biopreservationandbiobanking，11(1):12-18(2013)。

凍存組合物可能包含本領域已知的任何冷凍保護性物質(zhì)。已知的冷凍保護劑化合物包括乙酰胺、瓊脂糖、藻酸鹽、l-苯胺、白蛋白、醋酸銨、丁二醇、硫酸軟骨素、氯仿、膽堿、右旋糖、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜(dmso)、赤藻糖醇、乙醇、乙二醇、甲酰胺、葡萄糖、甘油、α-甘油磷酸酯、甘油單乙酸酯、甘氨酸、羥乙基淀粉、肌醇、乳糖、氯化鎂、硫酸鎂、麥芽糖、甘露糖醇、甘露糖、甲醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲、苯酚、普朗尼克(pluronic)多元醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、丙二醇、吡啶n-氧化物、核糖、絲氨酸、溴化鈉、氯化鈉、碘化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉、山梨醇、蔗糖、海藻糖、三甘醇、三甲胺醋酸鹽、尿素、纈氨酸、木糖等。

冷凍保護劑化合物可存在于凍存組合物中，例如其含量是約0.05m－6m、約0.1－3m、約0.25－6m、約1－6m、約2－6m、約3－6m、約4－6m、約5－6m、約0.25－1m、約0.25－2m、約0.25－3m、約0.25－4m、約0.25－5m、約1－4m、約1－3m、約1－2m、約3－5m、約2－4m、約0.5－6m、約0.5－5m、約0.5－4m、約0.5－3m、約0.5－2m，或約0.5－1m。

冷凍保護劑組合物可能包含至少一種環(huán)己烷二醇(chd)化合物，例如順式或反式的1,3-環(huán)己烷二醇(1,3chd)或1,4－環(huán)己烷二醇(1,4chd)，或其外消旋混合物，作為冷凍保護劑化合物。

chd化合物可在凍存組合物中存在，例如其含量是約0.05－2m、約0.1－1m、約0.1－2m、約0.1－1m、約0.1－1.5m、約0.1－0.5m、約0.1－0.25m、約1－2m、約1.5－2m、約0.75－2m、約0.75－1.5m、約0.75－1m、約0.05－1m、約0.05－0.75m、約0.05－0.5m，或約0.05－0.1m。凍存組合物也可包含良好適用于細胞、組織和器官的儲存的溶液。溶液可包括上文討論過的緩沖液。例如，溶液可以是eurocollins溶液，所述溶液由右旋糖、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉以及氯化鉀組成。參見例如，taylor等，“作為冷凍保護劑的運載體溶液的unisol和euro-collins溶液的比較”("comparisonofunisolwitheuro-collinssolutionasavehiclesolutionforcryoprotectants")，transplantationproceedings，33:677-679(2001)。

凍存組合物可同時包含至少一種chd化合物和至少一種額外的冷凍保護劑化合物。

另外，凍存組合物也可包含抗冷凍蛋白質(zhì)/多肽(afp)或抗冷凍糖脂(afgl)。afp也包括抗冷凍糖蛋白(afgp)和昆蟲抗冷凍或“熱滯(thermalhysteresis)”蛋白(thp)。最近發(fā)現(xiàn)的afgl已在昆蟲和植物中觀察到。據(jù)信，天然產(chǎn)生的afp能夠結(jié)合于正在發(fā)展的冰晶體的棱柱面，從而改變它的形成。由于魚和昆蟲產(chǎn)生這些蛋白，這意味著它們冰點的下降，所以它們能夠在一般應會導致它們的體液被凍住的條件下存活。就此而言，本方法可使用任何新發(fā)現(xiàn)的或眾所周知的afp。參見例如，sicheri和yang，nature，375:427-431,(1995)，描述八種這樣的蛋白；devries，“抗冷凍糖肽和多肽：與冰和水的相互作用”("antifreezeandicenucleatorproteinsinterrestrialarthropods")，meth.enzymol.，127:293-303(1986)；duman，“陸地節(jié)肢動物的抗冰凍和冰核蛋白”("antifreezeandicenucleatorproteinsinterrestrialarthropods")，annualrev.physiol.，63:327-3257(2001)；holmstrup等，“在北極跳蟲onychiurusarcticus中的脫水和抗旱”("dehydrationandcoldhardinessinthearcticcollembolanonychiurusarcticus")，j.comp.physiol.b，168:197-203(1998)；kuiper等，“通過吸附冰來純化抗冷凍蛋白”("purificationofantifreezeproteinsbyadsorptiontoice")，biochem.biophys.res.commun.，300(3):64-68(2003)；miller等，“一些成年的和未成熟的昆蟲在內(nèi)陸阿拉斯加越冬的抗寒策略”("cold-hardinessstrategiesofsomeadultandimmatureinsectsoverwinteringininterioralaska")，comp.biochem.physiol.，73a:595-604(1982)；neven等，“昆蟲血淋巴脂蛋白冰核劑的純化和特征：磷脂酰肌醇和載脂蛋白在冰核活動中的重要性的證據(jù)”("purificationandcharacterizationofaninsecthemolymphlipoproteinicenucleator:evidencefortheimportanceofphosphatidylinositolandapolipoproteinintheicenucleatoractivity")，j.comp.physiol.b，159:71-82(1989)；sformo等，“阿拉斯加樹皮甲蟲的幼蟲中的深度過冷，玻璃化和-100℃的極限生存”("deepsupercooling,vitrificationandlimitedsurvivalto-100℃inthealaskanbeetlecucujusclavipespuniceuslarvae")，j.exp.biol.，213(3):502-509(2010)；storey等，“動物的耐寒性”("freezetoleranceinanimals")，physiol.rev.，68:27-84(1988)；storey等，“昆蟲中抗寒的生化適應”("biochemicaladaptationforcoldhardinessininsects")，phil.trans.r.soc.lond.，b326:635-54(1990)；walters等，“北極阿拉斯加石蠅(nemouraarctica)的耐寒性”("freezetoleranceinthearcticalaskastonefly,nemouraarctica")，j.exp.biol.，212:305-12(2009a)；walters等，“在耐寒的阿拉斯加甲蟲(upisceramboides)中冷凍保護劑的生物合成以及蘇糖醇的選擇性積累”("cryoprotectantbiosynthesisandtheselectiveaccumulationofthreitolinthefreezetolerantalaskanbeetle,upisceramboides")，j.biol.chem.，284:16822-16831(2009b)；walters等，“在耐寒的阿拉斯加甲蟲(upisceramboides)中的非蛋白的產(chǎn)生熱滯后的木甘聚糖防凍劑”("anon-proteinthermalhysteresis-producingxylomannanantifreezeinthefreeze-tolerantalaskanbeetle,upisceramboides")，proc.natl.acad.sci.，106,20210-20215(2009c)；walters等，“在不同的分類中發(fā)現(xiàn)與耐寒相關的產(chǎn)生熱滯后的木甘聚糖糖脂抗凍劑”("athermalhysteresis-producingxylomannanglycolipidantifreezeassociatedwithcoldtoleranceisfoundindiversetaxa")，j.comp.physiol.b.，181(5):631-40(2011)；wang等，“加拿大擬步甲蟲的抗凍蛋白增強彼此的活性”("antifreezeproteinsofthebeetledendroidescanadensisenhanceoneanother'sactivities")，biochemistry，44:10305-10312(2005)；worland等，“極地陸生節(jié)肢動物在零度溫度下的脫水應激”("desiccationstressatsubzerotemperaturesinpolarterrestrialarthropods")，j.insect.physiol.，49:193-203(2003)；zachariassen等，“昆蟲抗血清中的成核劑耐寒”("nucleatingagentsinthehaemolymphofinsectstoleranttofreezing")，nature，262:285-87(1976)；以及zachariassen，“昆蟲中耐寒性生理學”("physiologyofcoldtoleranceininsects")，physiol.rev.，65:799-832(1985)。

示例性afp包括afpi(i型afp)、afpiii(iii型afp)以及/或afgp。凍存組合物中存在的afp含量，例如，對每一種存在的afp而言，約為組合物的0.001－1mg/ml、約0.05－0.5mg/ml，或約0.1－0.75mg/ml。

一旦細胞已經(jīng)接觸了凍存組合物，細胞即可隨后被冷凍用于凍存。用于凍存的降溫可用任何方式進行，并且可以使用任何上述以外的物質(zhì)。

例如，用于凍存的降溫(冷凍)方案可以是任何合適的類型。本領域技術(shù)人員熟知多種類型的降溫方案。降溫方案可包括以連續(xù)速率降溫的方式從冰成核點降至-80℃或任何上述的降溫溫度，降溫速率取決于冷凍的細胞/組織的特性。例如，降溫速率可以是每分鐘約-0.1℃至約-10℃，或每分鐘約-1℃至約-2℃。降溫速率可以是每分鐘約-0.1℃至-9℃、每分鐘約-0.1℃至-8℃、每分鐘約-0.1℃至-7℃、每分鐘約-0.1℃至-6℃、每分鐘約-0.1℃至-5℃、每分鐘約-0.1℃至-4℃、每分鐘約-0.1℃至-3℃、每分鐘約-0.1℃至-2℃、每分鐘約-0.1℃至-1℃、每分鐘約-0.1℃至-0.5℃、每分鐘約-1℃至-2℃、每分鐘約-1℃至-3℃、每分鐘約-1℃至-4℃、每分鐘約-1℃至-5℃、每分鐘約-1℃至-6℃、每分鐘約-1℃至-7℃、每分鐘約-1℃至-8℃、每分鐘約-1℃至-9℃、每分鐘約-1℃至-10℃、每分鐘約-2℃至-3℃、每分鐘約-2℃至-5℃、每分鐘約-2℃至-7℃、每分鐘約-2℃至-8℃、每分鐘約-2℃至-20℃、每分鐘約-4℃至-10℃、每分鐘約-4℃至-8℃、每分鐘約-4℃至-6℃、每分鐘約-6℃至-10℃、每分鐘約-6℃至-9℃、每分鐘約-6℃至-8℃、每分鐘約-6℃至-7℃、每分鐘約-7℃至-10℃、每分鐘約-7℃至-9℃、每分鐘約-7℃至-8℃、每分鐘約-8℃至-9℃，或每分鐘約-9℃至-10℃。一旦細胞以該連續(xù)降溫速率方式降溫至約-40℃至-80℃或更低，即可將它們轉(zhuǎn)移到液氮或液氮的汽相中以進一步降溫至凍存溫度，凍存溫度通常低于冷凍溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。在進一步降溫至凍存溫度前，可使細胞降溫至約-40℃至-75℃、約-45℃至-70℃、約-50℃至-60℃、約-55℃至-60℃、約-70℃至-80℃、約-75℃至-80℃、約-40℃至-45℃、約-40℃至-50℃、約-40℃至-60℃、約-50℃至-70℃，或約-50℃至-80℃。

升溫方案可包括兩步升溫法。在兩步升溫方案中，可將凍存的細胞(凍存在凍存溫度)從凍存冰箱中移出。兩步方案的第一步中，使凍存細胞在第一環(huán)境中經(jīng)歷第一次緩慢的升溫。該環(huán)境不需要經(jīng)受任何特殊的處理或具有任何具體的修飾，并且可以使用任何環(huán)境。該環(huán)境可以是氣體氣氛，例如空氣。為了實現(xiàn)第一階段的緩慢升溫，可使該環(huán)境處于高于凍存溫度的第一升溫溫度。第一升溫溫度可以接近室溫。例如，可以使用30℃或更低，例如約15℃至30℃、約20℃至25℃，或者約為20℃至30℃的溫度。

兩步升溫步驟中的第二個步驟包括在第二升溫溫度的第二環(huán)境中快速解凍細胞，第二升溫溫度高于第一升溫步驟中所使用的升溫溫度。第二升溫溫度可以是32℃或更高、約32℃至50℃、約35℃至45℃、約40℃至50℃、約45℃至50℃、約32℃至40℃、約35℃至40℃，或約37℃。同樣，任何合適的環(huán)境，例如氣體(空氣)、液體或流化床可用作第二環(huán)境。例如，可以使用升溫溫度的水浴來實現(xiàn)該快速解凍。

附圖5說明兩步升溫策略改善了細胞活力和附著。ecm蛋白的添加促進了細胞活力和附著，并且有效的ecm組合可取決于細胞類型。兩步升溫策略可應用于像貼壁細胞一樣在固體基質(zhì)上凍存的所有細胞類型。

某些ecm組分和/或ecm組分的某些組合可增強一種類型細胞的活力和滯留，但不能增強另一種類型的細胞。因此，本發(fā)明主題還涉及鑒定一種或多種ecm組分的方法，所述ecm組分能夠改善細胞在從凍存狀態(tài)解凍后在基質(zhì)上細胞活力和滯留。該方法涉及，首先選擇一種特定細胞類型的細胞，例如bce細胞或人間充質(zhì)干細胞。方法還包括鑒定已知與所選細胞類型相關聯(lián)或由所選細胞類型生成的ecm組分?；蛘?，在缺乏與所選細胞類型相關聯(lián)的特定ecm組分的現(xiàn)有知識的情況下，可篩選已知的ecm組分。然后，可用ecm組分和ecm組分的各種組合處理基質(zhì)，并且將所選細胞類型的細胞鋪板于各種經(jīng)處理的基質(zhì)上，然后如上所述，將細胞在經(jīng)處理的基質(zhì)上凍存并隨后解凍。一旦細胞已經(jīng)解凍，即可評估細胞的活力和滯留，以鑒定何種ecm組分或ecm組分的組合導致為60％或更高，例如80％或更高的細胞活力(％)，以及所選細胞類型的至少80％的dna含量(％)?？梢愿鶕?jù)任何已知的方法來評估細胞活力和滯留。已知的用于測量細胞活力(％)的方法包括活力實驗，例如基于熒光的實驗。已知的測量dna含量(％)的方法包括用于提供細胞數(shù)量準確測量結(jié)果的細胞增殖實驗。

也可以鑒定與特定細胞類型的ecm組分協(xié)作最好的冷凍保護劑，因為冷凍保護劑化合物的選擇可影響凍存后的細胞活力和滯留。例如，甘油和dmso促進體外微管的組裝，然而其他冷凍保護劑，例如丙二醇，而不是dmso，在卵母細胞中解聚肌動蛋白。參見例如，vincent等，“在兔胚胎單細胞凍存期間冷凍保護劑對肌動蛋白絲的影響”("effectsofcryoprotectantsonactinfilamentsduringthecryopreservationofone-cellrabbitembryos")，cryobiology，27:9-23(1990)。在一些細胞中，dmso導致應力纖維的解體以及胞內(nèi)肌動蛋白束的形成。所以，凍存附著于基質(zhì)的細胞的重要方面是在冷凍和解凍的嚴苛條件后細胞保留在基質(zhì)上的能力。

實施例在下文中列出，并且說明可用于實施具體實施方式中的不同方法和條件。對本領域技術(shù)人員來說多種替代方式、改進和變化方式是顯而易見的。因此，實施例僅僅是說明性的而不是限制性的。

實施例

實施例1-在ecm對比tcp上的細胞凍存的細胞活力與滯留

分化的細胞系，bce細胞(bce細胞系，atcc#crl-2048)維持在37℃、5％二氧化碳下的杜爾貝科改良的伊格培養(yǎng)基(dmem)中，dmem具有10％胎牛血清(fcs)、1.0mm丙酮酸鈉，以及4mm谷氨酰胺，以及青霉素(100u)/鏈霉素(100μg/ml)。bce細胞鋪板于組織培養(yǎng)塑料上或天然bce細胞衍生的ecm上。為了制得ecm，將bce細胞以接近融合密度(50,000個細胞/孔)鋪板于96孔板中，并在具有10％fcs和82μg/ml抗壞血酸磷酸鎂(購自日本和光純藥工業(yè)株式會社(wakochemical))的dmem中置留6天。細胞培養(yǎng)基中的抗壞血酸促進ecm的沉積和形成。6天以后，通過加入水中的25mmnh4oh溶液，之后水洗3次，移出細胞。參見例如，roemer等，“炎性細胞介導的間質(zhì)胞外基質(zhì)的損傷的體外實驗系統(tǒng)”("invitroassaysystemsforinflammatorycell-mediateddamagetointerstitialextracellularmatrix")，invitrotoxicol.，7(2):75-81(1994)。

隨后使鋪板的bce細胞隨后暴露于2mdmso，并通過如下方式凍存：將板置于冰上并用0.5m甘露醇預處理細胞以使細胞準備好暴露至預期在添加冷凍保護劑(例如2mdmso)時使用的高滲環(huán)境。在添加終濃度的冷凍保護劑后，以可控速率使板降溫至-80℃，然后置于-130℃。使用以下可控降溫速率：-0.2℃/分鐘，-1.0℃/分鐘，-10.0℃/分鐘，和修改的-1.0℃/分鐘，該概況(mp)包括在成核步驟中。在至少儲存24小時之后，根據(jù)campbell'531(同上)中的兩步升溫方案，將板升溫。首先，將板置于-20℃，30分鐘，然后將板置于37℃以快速解凍。一旦板解凍(無可見冰)，就將其置于冰上，并用加有10％fcs的dmem中的0.5m甘露醇反復洗滌孔。在用加有10％fcs的dmem另外洗滌后，細胞在37℃于dmem(10％fcs)中放置1小時，回收，然后評估細胞活力和滯留。解凍后，分別使用alamar指示劑和實驗來評估細胞的活力和細胞滯留。

用alamar非侵入性代謝指示劑(購自德雷克診斷公司(trekdiagnostics))檢測細胞活力。alamar指示劑是測量細胞內(nèi)氧化/還原反應的熒光染料，因此指示細胞在暴露于冷凍保護劑后的整體活力。alamar指示劑可用熒光或吸光度讀取。凍存后，向留在200μl的dmem(10％fcs)中的細胞添加體積為20μl的alamar指示劑，并將板在37℃孵育3小時。在熒光酶標儀(購自分子儀器公司(moleculardevices))上以544nm的激發(fā)波長和590nm的發(fā)射波長讀取alamar指示劑的熒光值。數(shù)據(jù)相對于未處理的對照進行標準化。這些值表示為9-12個重復的平均值(+/-sem)。

通過實驗(購自分子探針公司(molecularprobes))測量每個孔中細胞的dna含量，來評估在凍存(即細胞保留)后，微量滴定板的孔中剩下的細胞的比例。dna含量用作細胞數(shù)量的指標。實驗使用熒光染料來標記核酸，然后使用熒光酶標儀以485nm的激發(fā)波長和538nm的發(fā)射波長進行測量。rna酶a(購自西格瑪公司(sigma))也用于消除個體細胞內(nèi)rna的可變量，從而提供對于dna含量的直接測量。數(shù)據(jù)相對于未處理的對照細胞進行標準化，并且表示9-12個重復的平均值(+/-sem)。

如附圖1中說明的，無關于所用的降溫速率，將細胞鋪板于其本身天然的ecm上而不是tcp上時，細胞活力顯著提高(p<0.001)。除了-10.0℃/分鐘，對于所有降溫速率的細胞滯留，鋪板于ecm上均等同或優(yōu)于鋪板于tcp上的細胞。然而，在-10.0℃/分鐘的降溫速率下，鋪板于其ecm上的細胞比鋪板于tcp上的細胞就細胞滯留而言有顯著改善(p<0.0001)。附圖1說明相較于較高的降溫速率，較低的降溫速率普遍提供更好的活力和附著(p<0.001)。盡管在所有降溫速率進行凍存的過程中，ecm的存在均改善細胞活力，但是在以較高降溫速率進行凍存的過程中，ecm的存在增強了細胞滯留。在較低的降溫速率下，鋪板于ecm和tcp上細胞的細胞滯留是等同的。一種可能的解釋是存在于細胞培養(yǎng)基中所用的血清中的ecm蛋白(例如玻連蛋白)，產(chǎn)生基礎的基質(zhì)，由此提供在凍存期間供于細胞錨著的框架。由于這種可能性，后續(xù)的實施例(2－4)是在無血清的條件下實施的。

完全形成和組織的ecm的存在提供更近似于細胞的天然環(huán)境的表面。因此，細胞附著可能較少地受凍存步驟影響。此外，ecm組合物可能影響細胞在凍存期間維持附著的能力。而且，通過ecm來凍存細胞，細胞所處的構(gòu)造可能更有利于其整體健康并且可能改善其應對冷凍溫度的耐受力和恢復力。

實施例2-用ecm組分的不同組合凍存的bce細胞的活力和滯留

bce細胞(bce細胞系，atcc#crl-2048)保存在37℃、5％二氧化碳下的杜爾貝科改良的伊格培養(yǎng)基(dmem)中，dmem具有10％胎牛血清(fcs)、1.0mm丙酮酸鈉，以及4mm谷氨酰胺，和青霉素(100u)/鏈霉素(100μg/ml)。

確定ecm組分——纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v——的最佳濃度，然后以單一組分或與一種或多種其它組分的組合形式進行評估。ecm蛋白從商業(yè)來源獲得，并且在鋪板細胞之前，使用濃度約為1－10μg/ml的ecm蛋白處理微量滴定板。在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中，用各種濃度的ecm蛋白處理各孔，并在37℃放置2小時，然后根據(jù)本領域已知的方法，在37℃用1％牛血清白蛋白(bsa)孵育1小時，以封閉未被占據(jù)的結(jié)合位點。參見例如，underwood，“胞外基質(zhì)分子對牛內(nèi)皮細胞體外性能的影響”("theeffectofextracellularmatrixmoleculesontheinvitrobehaviorofbovineendothelialcells")，exp.cell.res.，205:311-319(1993)?？子脽o血清培養(yǎng)基漂洗，然后置于培養(yǎng)基中，直到接種細胞。

如實施例1中所述，凍存細胞，隨后解凍。如實施例1中，使用alamar指示劑和實驗來評估細胞活力和滯留。用兩種冷凍保護劑，dmso和1,2-丙二醇(pd)進行凍存后細胞活力和持續(xù)細胞附著的評估。以80,000細胞/孔的細胞密度將細胞鋪板于用不同ecm組合處理的孔中。附圖2和3中所示結(jié)果獲自以單層形式采用載劑溶液hepes緩沖鹽水(hbsi)(275mmnacl，25mmhepes)中的2.0mdmso凍存的細胞。使用pd作為冷凍保護劑，使用不同ecm組合觀察到相似結(jié)果。

如附圖2和3所示，ecm組分的幾種組合表現(xiàn)出極好的活力和附著。細胞活力和百分比指示細胞數(shù)量的dna含量是基于與處理的細胞同時鋪板的分開的未處理的對照細胞計算的。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析沒有鑒定出任何一種ecm組分組合是最顯著的。相反，認為幾組ecm組合顯著優(yōu)于其余組，并且取決于所使用的冷凍保護劑(p<0.01)。注意到的趨勢包括，更好的活力和附著隨著更復雜的ecm組分混合物(4種或更多)出現(xiàn)。附圖2說明了在凍存和后續(xù)的解凍后，ecm蛋白對顯著提高細胞活力。對于活力而言，最佳組合包括纖連蛋白和膠原i，或?qū)τ诟街?，包括纖連蛋白和膠原v，其中層粘連蛋白至少有助于改善bce細胞的活力和附著。4種ecm組分的幾種組合(f+l+ci+civ、f+ciii+civ+cv，以及ci+ciii+civ+cv)導致近乎100％細胞在凍存后存活并附著。

附圖3說明，甚至是單一ecm蛋白的存在都能改善細胞在單獨的tcp上的附著。對于所有測試的ecm組合，包括由bce細胞產(chǎn)生的基質(zhì)，細胞附著>80％。通過用至少一種ecm組分凍存細胞，觀察到細胞附著的總體改善。

實施例3-用ecm組分的不同組合凍存的hmsc的細胞活力和滯留

將源于人骨髓的間充質(zhì)干細胞維持在37℃、5％二氧化碳下的dmem/f12培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基具有10％fcs、非必需氨基酸，2mmglutamax，以及青霉素(50u)/鏈霉素(50μg/ml)。

初始實驗評估ecm組分——纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原i、膠原iii、膠原iv和膠原v——以分別確定最佳濃度。然后，使用就個體蛋白質(zhì)建立的濃度研究蛋白質(zhì)對?；谟蓚€體蛋白質(zhì)和不同的蛋白質(zhì)對獲得的結(jié)果來選擇并研究三種或四種蛋白質(zhì)的進一步組合。ecm蛋白從商業(yè)來源獲得，并且在鋪板細胞之前，使用濃度約為1－10μg/ml的ecm蛋白處理微量滴定板。在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中，用不同濃度的ecm蛋白處理單個孔，并在37℃放置2小時，然后在37℃用1％牛血清白蛋白(bsa)孵育1小時，以封閉未被占據(jù)的結(jié)合位點?？子脽o血清培養(yǎng)基漂洗，然后留置于培養(yǎng)基中，直到鋪板細胞。

如實施例1中所述，凍存細胞，隨后解凍。解凍后，檢測并比較附著于tcp或明膠(其常規(guī)用于hmsc的常規(guī)生長和維持)上的細胞的活力，以確定哪些ecm組分在凍存期間為細胞的持續(xù)活力和附著提供最多支持。在這些實驗中，細胞活力百分比是基于凍存前每個孔中的細胞的活力來計算的。如實施例1中所述，使用alamar指示劑和實驗來評價細胞活力和滯留。

雖然顯現(xiàn)的是多于一種的ecm蛋白的組合能改善bce細胞的細胞活力，但對于hmsc而言并不一定是這種情況。單個ecm組分將hmsc的活力改善至與2種或更多ecm組分的組合相似的程度。4種或更多種ecm蛋白的組合對bce細胞而言效果最好，但hmsc對于產(chǎn)生最佳活力的組合有明確的偏好。ecm組分的兩種組合產(chǎn)生大于70％的活力，兩種組合為f+l+ci+cv和civ+cv。另一組組合產(chǎn)生大于60％的活力，并且包括：f+l+cv、l+civ+cv、ciii+civ+cv、f+l+civ+cv、f+ci+civ+cv、f+ciii+civ+cv和l+ci+ciii+cv。有趣的是，通常用于hmsc細胞培養(yǎng)的明膠沒有促進凍存和解凍后的細胞活力。這說明為特定細胞類型建立的基質(zhì)處理方法不一定適用于凍存。這也在包括基質(zhì)細胞蛋白時觀察到(參見實施例4)。一般來說，至少一種ecm蛋白的存在能改善凍存后hmsc的活力。那些表現(xiàn)出最佳活力的組合趨于在其混合物中包括纖連蛋白、膠原iv和/或膠原v。

實施例4-用基質(zhì)細胞蛋白，生腱蛋白x凍存后hmsc的活力

源于人骨髓的間充質(zhì)干細胞鋪板于明膠或?qū)诱尺B蛋白、膠原i、膠原iii和膠原v的ecm組合上。附圖6所示樣品，在細胞鋪板時，包含濃度為500ng/ml的細胞間質(zhì)蛋白，生腱蛋白x。細胞凍存在含有2.5％硫酸軟骨素的1mdmso中，隨后解凍，如實施例1所述。解凍后，測量細胞活力，并相對于未處理的對照進行標準化。相較于ecm單獨存在的情況(57％)，生腱蛋白x的添加促進細胞活力的改善(100％)，并且在ecm±生腱蛋白x上的hmsc的整體活力優(yōu)于細胞在明膠上鋪板時的情況(p<0.05，附圖1)。有趣的是，與ecm組合相比，生腱蛋白x與明膠一起使用時沒有顯示出任何改善，可能是因為明膠是膠原的加工形式，而組合中使用的ecm組分都作為天然蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這進一步強調(diào)，為特定細胞類型培養(yǎng)建立的基質(zhì)處理方法不一定在貼壁細胞凍存期間起作用。

本文所示分化細胞系和間充質(zhì)干細胞的結(jié)果說明，ecm組分的添加能改善活力，并維持凍存后細胞貼附于多孔板的附著。觀察到兩種類型細胞間的差異，這強調(diào)了ecm可在體外和體內(nèi)細胞的健康和維持中起關鍵作用。這對干細胞尤為重要，因為ecm可影響其分化能力以及它們將分化為何種細胞譜系。這些結(jié)果也說明ecm的組合物影響所述細胞及其作為貼壁群體在凍存中存活的能力。

應理解以上內(nèi)容的各種變形以及其他特征和功能或其變形，可與許多其他不同的系統(tǒng)或應用結(jié)合。本領域技術(shù)人員也可進行各種目前未預見或未預料到的替代方案、變形、變化或改進，它們也包括在所附權(quán)利要求書中。