本發(fā)明涉及穿透細胞膜的新的肽(peptide)，所述新的肽能夠使得難以穿透真核細胞的細胞膜而傳遞至細胞內的物質通過多種結合向細胞內部傳遞，從在蜂毒素肽(melitin peptide)的細胞膜溶解作用中起到中樞作用的蜂毒素肽C-末端氨基酸序列，將類似的氨基酸序列從人類蛋白質的氨基酸序列中進行探索并開發(fā)。所開發(fā)的肽作為起到穿透細胞膜從而向細胞內部有效地傳遞多種生物活性物質的傳遞體的作用的肽，期待通過本發(fā)明使得難以向細胞內部傳遞從而無法用作有益于人類的物質且難以開發(fā)的多種生物活性物質有效地向生物體內傳遞，并且期待大有裨益于將其用于醫(yī)藥品、化妝品及功能性產品等對人類有益的產品的開發(fā)及利用。

背景技術：

真核細胞的細胞膜是一種單體，其由雙重脂質膜形成，對細胞內部物質進行保護，并對物質從外部流入或內部物質的移動進行控制。尤其，就類似于生物體內活性物質的核酸的親水性物質，或類似于蛋白質、肽的尺寸較大且具有表面電荷的分子的細胞內流入而言，不是與類似于細胞膜表面的受體的特定物質的組織化且體系化的機制幾乎不可能是廣為人知的。因此，至今開發(fā)的藥物的幾乎大部分以細胞表面的物質而非細胞內部物質作為開發(fā)對象，由此如果開發(fā)出能夠使得這樣的親水性物質或尺寸較大的物質有效地向細胞內部傳遞的傳遞體，則能夠以尚未開發(fā)的無數的細胞內物質為對象開發(fā)有用的新藥物或產品。

在細胞內部起到作用的無數的物質因缺乏或變形而無法正常發(fā)揮功能，治療這樣的疾病的最簡單接近的方法是重新補充不足且變形的生物體物質。但是因為細胞膜這樣的屏障，將尺寸較大的生物體分子向細胞內部傳遞時受到限制，由此對傳遞體開發(fā)的要求從很早開始就存在了，所述傳遞體能夠向細胞內部傳遞物質。以此背景為基礎所開發(fā)的細胞膜穿透肽是蛋白轉導域(protein transduction domain；PTD)或細胞穿透肽(Cell-penetrating peptides；CPPs)。

1988年存在HIV-1(Human immunodeficiency virus，type1；人類免疫缺陷病毒1型)Tat蛋白質能夠導入至哺乳類細胞的最初報告，針對將物質向細胞內部傳遞的傳遞體的研究得到了活躍地展開(文獻1)。之后將肽命名為PTD或CPPs，從而開發(fā)無數的新細胞膜穿透肽，所述肽由20個左右的較短氨基酸組成，能夠穿透細胞膜從而向細胞內部傳遞物質。作為代表性的PTD，有從HIV-1Tat蛋白質發(fā)現(xiàn)的Tat-PTD(文獻2、3)(Tat_49-57，序列：RKKKRRQRRR)、來自于果蠅觸角基因同源結構域(Antennapedia homeodomain)蛋白質的Antp(文獻4)(觸角足基因(Antennapedia)_43-58,序列：RQIKIWFQNRRMKWKK)、來自于HSV-1(Herpes simplex virus type1，單純皰疹病毒1型)VP22蛋白質的VP22(文獻5)(VP22_267-300，序列：DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE)、從人工序列開發(fā)的寡聚精氨酸(Poly-arginine)(R9，RRRRRRRRR)等，這些肽的共通的特征在于，以較高的比例構成有陽離子性氨基酸。

與此不同地，主要由疏水性肽構成的細胞膜穿透肽也得到了開發(fā)，代表性的是MTS(文獻6)(Membrane-Translocating Sequence，膜上轉移序列)。MTS由來自于人類FGF-4(fibroblast growth factor,成纖維細胞生長因子)蛋白質的16個氨基酸組成，主要由疏水性氨基酸構成(序列：AAVALLPAVLLALLAP)。廣為人知的是，疏水性肽具有穿過構成細胞膜的雙重脂質膜內部的疏水性區(qū)域從而直接將物質向細胞質傳遞的機制。除此之外，從多種生物種的多種蛋白質開發(fā)細胞穿透肽，并且也設計(design)人工序列進行細胞膜穿透肽的開發(fā)。利用如此開發(fā)的無數種類的細胞膜穿透肽的效果使得蛋白質、核酸、化合物、金屬等多種物質向細胞內部傳遞，從而用于開發(fā)有用物質的研究持續(xù)進行中。但是作用機制仍然不明確，且針對向細胞內部傳遞后的傳遞體與傳遞物(cargo)的命運還需要更多的研究，利用細胞膜穿透肽的醫(yī)藥品開發(fā)未得到成功實現(xiàn)。

PTD從穿透細胞膜的功能性側面出發(fā)，大部分主要來自于類似于病毒(virus)或毒素(toxin)的必須穿透細胞膜才能發(fā)揮功能的物質而得到開發(fā)。但是，就來自于其他生物種而非人類的PTD而言，今后為了人類而開發(fā)類似于生物體內所適用的醫(yī)藥品的有益的物質時，也可能引起免疫反應或毒性等安全性問題。

蜂毒素(Melittin，Gene ID：406130)肽作為主要的毒性肽，其具有蜂毒(Apitoxin)組成物的50％以上，通過強烈的溶血作用表現(xiàn)毒性是廣為人知的。更為人知的是，更為具體的作用機制是，首先與細胞膜表面的多醣體或磷酸化部位結合后，使得N-末端疏水性肽部分滲透細胞膜雙重脂質膜，從而形成孔，并對細胞進行溶解。此外，與磷脂酶A2(Phospholipase A2)蛋白質結合，從而阻礙類似于Na+-K+-ATPase與H+-K+-ATPase的輸送泵，進而使得類似于Na+與Ca2+的離子的細胞內滲透增加。

利用蜂毒素的研究主要研究利用蜂毒素的毒性作用使得特定細胞靶向化并使其死亡的功能。Soman N.R.等進行了如下研究：向能夠使得癌細胞靶向化的全氟化碳(Perfluorocarbon)納米粒子結合蜂毒素，從而使得癌細胞靶向化進而使其死亡(文獻7)。

利用蜂毒素的細胞膜溶解功能的作為遺傳基因傳遞體的研究最近幾年也活躍地進行著。Schellinger J.G.等進行了如下研究：向HPMA(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide，N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺)結合多聚賴氨酸(poly-lysine)和蜂毒素肽，從而用作遺傳基因傳遞體(文獻8)。在此研究中，蜂毒素的使用目的在于，在細胞膜上穿孔，從而提高遺傳基因傳遞效率。美國專利申請US20120165393A1專利為如下發(fā)明：將針對去唾液酸糖蛋白(Asialoglycoprotein)受體的配體和結合有蜂毒素的融合蛋白質用作siRNA傳遞體，在此發(fā)明中，蜂毒素用作如下用途：與siRNA結合，從而穿透細胞膜(文獻9)。

通過本發(fā)明從包括蜂毒素肽C-末端的親水性氨基酸序列的12個氨基酸序列(序列號3)對類似的序列在人類蛋白質氨基酸序列中進行探索，從而最終開發(fā)最理想的LayN肽。LayN肽氨基酸序列來自于名為Layilin的人類蛋白質的氨基酸序列。

Layilin蛋白質作為起到玻尿酸受體的功能的細胞膜蛋白質，從N-末端向細胞外區(qū)域、跨膜區(qū)(transmembrane domain)(序列號5)、細胞質區(qū)域構成。LayN肽從來自于Layilin蛋白質的氨基酸序列257號至266號的10個氨基酸(序列號2)將259號半胱氨酸(cysteine)置換為絲氨酸(serine)的形態(tài)被確認為是最理想的序列(序列號1)。

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9.US 20120165393A1(Arrowhead Madison Inc.)2011.12.15

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明以提供一種新的細胞膜穿透肽為課題，所述新的細胞膜穿透肽能夠使得生物活性物質向細胞內部傳遞，以便解決如下問題：多種生物活性物質難以穿透細胞膜而向細胞內部傳遞，因而使用率降低且不易開發(fā)，所述多種生物活性物質能夠在細胞內部起作用并發(fā)揮功能。通過本發(fā)明所開發(fā)的細胞膜穿透肽來自于構成人類蛋白質的氨基酸序列，期待在今后開發(fā)以人類為對象的醫(yī)藥品、化妝品等有用物質時，可以保證更高的安全性。

本發(fā)明的發(fā)明人通過肽的氨基酸序列探索開發(fā)新的細胞穿透性肽序列，所述肽具有穿透細胞膜的效能。本發(fā)明的課題解決方法如下。

蜂毒素肽是主要的肽，其具有鋒毒成分的50％以上。蜂毒素作為由26個氨基酸組成的肽，從N-末端20個氨基酸主要由疏水性氨基酸構成，C-末端6個氨基酸由親水性氨基酸構成。眾所周知，蜂毒素破壞紅血球細胞的細胞膜，從而通過溶血作用表現(xiàn)出毒性。眾所周知，主要的作用機制是與細胞膜表面的多醣體或磷酸化部位結合后，α-螺旋結構肽滲透雙重脂質膜，從而形成孔使得細胞溶解。本發(fā)明的發(fā)明人關注蜂毒素的其他機制所具有的與細胞膜結合從而滲透雙重脂質膜的功能。利用包括C-末端6個氨基酸的12個氨基酸，從人類蛋白質的氨基酸序列探索類似的序列，所述C-末端6個氨基酸在蜂毒素肽的溶血功能中起到最重要的作用。

如實施例1所述，通過NCBI(美國國家生物技術信息中心,National Center for Biotechnology Information，USA，http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST(局部序列排比檢索基本工具,Basic Local Alignment Search Tool)探索獲得了100個以上表現(xiàn)出67％以上的一致性的類似氨基酸序列，在這些候補物質中通過作為陽離子性氨基酸的精氨酸(arginine)、賴氨酸(lysine)和作為陰離子性氨基酸的天冬氨酸(aspartic acid)、谷氨基酸(glutamic acid)的含量和排列形態(tài)得到幾種候補序列。最終確認了其中細胞膜穿透效能最優(yōu)秀的肽的序列。

就最終得到的細胞膜穿透肽而言，探索結果為，從由以玻尿酸受體廣為人知的Layilin(Gene ID：143903)蛋白質的氨基酸序列257號至266號組成的10個氨基酸序列獲得，并且為了防止肽分子間二聚體形成，以用絲氨酸(serine)置換259號半胱氨酸(cysteine)的形態(tài)最終確定了細胞膜穿透肽序列，并命名為LayN肽(序列號1)。

根據LayN肽的氨基酸序列制成如下細胞穿透肽的序列式。

序列式：W-I-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(序列號4)

所述序列式根據LayN肽的基本結構且是以如下形態(tài)構成的序列：在此，X1可以是由作為Layilin蛋白質氨基酸序列的原型序列的半胱氨酸和置換其的氨基酸絲氨酸及分支不存在官能團的丙氨酸(alanine)構成的形態(tài)，并且X2至X6的氨基酸是由精氨酸(arginine)和賴氨酸(lysine)構成的陽離子性氨基酸形態(tài)，X7至X8的氨基酸是谷氨基酸(glutamic acid)、天冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酰胺(glutamine)、天冬酰胺(asparagine)等陰離子性氨基酸形態(tài)。

LayN細胞膜穿透肽與Layilin蛋白質的跨膜區(qū)(氨基酸236號至256號)結合，從而能夠用作模仿蜂毒素的功能的肽，所開發(fā)的細胞膜穿透肽的氨基酸能夠全部使用L形態(tài)和D形態(tài)的氨基酸，并且氨基酸系列的正方向及逆方向序列也具有細胞膜穿透效能。

用于實施例的細胞膜穿透肽利用序列號1的LayN肽來確認，并且通過實施例能夠確認作為傳遞物(cargo)物質將蛋白質和核酸(siRNA)向細胞內部傳遞的效能。此外，在多種人類細胞株中確認肽的毒性，并在細胞毒性不存在問題的1.5μm以下的肽濃度中進行實施并確認。

通過本發(fā)明所開發(fā)的細胞穿透肽的目的在于，起到與傳遞物結合從而將該物質向細胞內部傳遞的傳遞體的功能，因此結合的傳遞物可以無特別限制地使用蛋白質、核酸、化合物、礦物等，傳遞物不與生物體內其他的載體或細胞膜受體發(fā)生反應，通過細胞穿透肽向細胞內部傳遞。

利用通過本發(fā)明所開發(fā)的新細胞膜穿透肽能夠對僅在細胞內部可以起作用，將具有功能的有用的生物活性物質有效地向細胞內部傳遞而因欠缺向細胞內部的傳遞方法沒能得到開發(fā)的無數有用的物質進行開發(fā)。此外，通過本發(fā)明所開發(fā)的肽作為來自于構成人類蛋白質的氨基酸序列的細胞膜穿透肽，在今后適用于人類的有用的產品與技術開發(fā)中保證安全性。

附圖說明

圖1是利用流式細胞分析儀(FACS)對細胞穿透肽LayN的細胞內穿透率與R9肽的細胞穿透率效能進行比較的試驗資料，A為無處理組，B為R9肽，C為LayN肽處理組。

圖2是利用流式細胞分析儀在粘附細胞HEK293細胞中確認根據細胞穿透肽LayN的濃度的細胞穿透率的試驗資料，A為無肽處理組，B為0.2μM濃度肽處理組，C為1.0μM濃度肽處理組。

圖3是利用流式細胞分析儀在懸浮細胞Jurkat T細胞中確認根據細胞穿透肽LayN的濃度的細胞穿透率的試驗資料，A為無肽處理組，B為0.2μM濃度肽處理組，C為1.0μM濃度肽處理組。

圖4是通過確認以在細胞穿透性肽LayN結合有β-半乳糖苷酶(Beta Galactosidase)蛋白質的形態(tài)向細胞內部傳遞的試驗，通過X-gal染色確認蛋白質傳遞效率的照片。圖A是結合于LayN肽的β-半乳糖苷酶融合蛋白質結構的模式圖，從N-末端按照用于精制的His-Tag(H6)、LayN肽、β-半乳糖苷酶順序得到結合。圖B是使得如上所制造的H6-LayN-β-Gal融合蛋白質以0.1至1.5μM濃度導入人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞后，通過X-gal染色確認蛋白質傳遞效能的資料。

圖5是使得細胞膜穿透肽LayN與LacZ siRNA通過靜電引力結合，從而確認在利用pcDNA3.1/LacZ載體(vector)使得形質轉換的人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞中阻礙LacZ遺傳基因表達的資料。圖A是LayN肽二聚體(LayN-D)與siRNA通過靜電引力結合的模式圖。圖B是確認在瓊脂糖凝膠(agarose gel)中根據siRNA與LayN肽二聚體的N/P比所結合的程度的資料，第一列表示DNA大小梯度標志物(DNA size ladder)，第二列表示作為僅處理siRNA的陰性對照組，不結合凝膠(gel)上的帶子的自由siRNA的大小和相對量。第三列至第六列是分別按照N/P比2.0、1.0、0.5、0.1進行混合時的資料。siRNA的量固定為50nM進行了使用。圖D是β-半乳糖苷酶分析資料，并且進行數值化后在C中示出。

圖6是在細胞膜穿透肽LayN的各種細胞中確認根據濃度的毒性的資料。在人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞、人類宮頸癌細胞株HeLa細胞、人類急性淋巴性白血病細胞株Jurkat T細胞、人類角質形成細胞株HaCaT細胞中分別確認LayN肽的細胞毒性。各個細胞在96-孔板(well plate)分裂1x10⁴個細胞，進行16小時培養(yǎng)后，將LayN肽按照0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μM濃度處理后進行3小時額外培養(yǎng)，之后，利用WST-1試劑在420至480nm中測定吸光度，并進行了分析。

圖7是新開發(fā)的細胞膜穿透肽與傳遞物(cargo)結合從而穿透細胞膜的機制的模式圖。路徑A是吸附于細胞膜表面后通過內吞作用(endocytosis)向細胞內部傳遞的機制，路徑B是吸附于細胞膜后穿孔并直接向細胞質傳遞的機制的模式圖。

附圖標號

DNA，Deoxyribonucleic acid：脫氧核糖核酸

RNA，Ribonucleic acid：核糖核酸

LNA，Locked Nucleic Acid：鎖核酸

PNA，Peptide Nucleic Acid：肽核酸

FACS，F(xiàn)luorescence-activated cell sorting：流式細胞分析儀/熒光激活細胞分選技術

PTD，protein transduction domain：蛋白轉導域

CPPs，Cell-penetrating peptides：細胞穿透肽

具體實施方式

實施例1.利用BLAST探索進行有效的細胞穿透肽序列探索。

在蜂毒素肽的26個氨基酸序列中利用在與細胞膜的反應中起到決定性作用的C-末端部分的8個氨基酸序列，為了在來自于人類的蛋白質的氨基酸序列中探索類似的氨基酸序列，NCBI(美國國家生物技術信息中心,National Center for Biotechnology Information，USA，http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)進行了BLAST(局部序列排比檢索基本工具,Basic Local Alignment Search Tool)探索，并且能夠獲得100個以上表現(xiàn)出67％以上的一致性的序列。在這些候補物質中，通過作為陽離子性氨基酸的精氨酸(arginine)、賴氨酸(lysine)和作為陰離子性氨基酸的天冬氨酸(aspartic acid)、谷氨基酸(glutamic acid)的含量和排列形態(tài)得到幾種候補序列，并最終確認了其中細胞穿透效能最優(yōu)秀的LayN肽序列。

就最終獲得的LayN肽而言，探索結果為，從以玻尿酸受體廣為人知的Layilin(Ge ne ID：143903)蛋白質的257至266號之間的10個氨基酸序列獲得，并且為了防止肽分子間二聚體形成，以用絲氨酸(serine)置換259號半胱氨酸(cysteine)的形態(tài)最終確定了LayN肽序列。

實施例2.利用流式細胞分析儀確認LayN肽的細胞內穿透率。

在60mm培養(yǎng)皿中使得人類宮頸癌細胞株HeLa細胞分裂為5.5x10⁵個后，利用添加有10％胎牛血清和抗生素青霉素/鏈霉素(Penicillin/streptomycin)的DMEM(Dulbec co's Modified Eagle's Medium，杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基)培養(yǎng)基在37攝氏度、5％二氧化碳濃度的細胞培養(yǎng)器中進行24小時培養(yǎng)。去除培養(yǎng)基后，用磷酸緩沖液(PBS)清洗兩輪后，對去除胎牛血清的培養(yǎng)基中所準備的樣本進行了處理。樣本對在LayN肽和對照組R9肽(序列號8)各自的N-末端粘著有熒光物質異硫氰酸熒光素(FITC，F(xiàn)lu orescein isothiocyanate)的肽進行了合成，并進行了使用，并且分別以1.0μm濃度在細胞中進行了處理。在細胞中對所準備的樣本進行處理，進行3小時反應后，收獲細胞。細胞收獲后，進行胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)處理，在培養(yǎng)皿中去除后，利用15U/mL肝素(Heparin)溶液進行第三輪清洗后，最終使其懸浮于磷酸緩沖液，利用流式細胞分析儀FACSCalibur(BD公司)確認了細胞內傳遞程度。

如圖1所示，能夠確認的是，LayN肽的細胞內傳遞效率(C)相比對照組R9肽(B)表現(xiàn)出更高的細胞內傳遞效能。

實施例3.利用流式細胞分析儀在粘附細胞HEK293細胞和懸浮細胞Jurkat T細胞中確認根據LayN肽的濃度的細胞內穿透率。

為了確認根據LayN肽的濃度的細胞內傳遞效能和在各種細胞中的傳遞效率，在作為代表性的粘附細胞的人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞和作為代表性的懸浮細胞的人類急性淋巴性白血病細胞株Jurkat T細胞中確認傳遞效率。

在60mm培養(yǎng)皿中對5.5x10⁵個的HEK293細胞和Jurkat T細胞分別進行分裂后，將添加有10％胎牛血清和抗生素青霉素/鏈霉素(Penicillin/streptomycin)的DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute，代指洛斯維〃帕克紀念研究所)培養(yǎng)基使用于各個細胞株并在37攝氏度、5％二氧化碳濃度的培養(yǎng)器中進行24小時培養(yǎng)。去除培養(yǎng)基后，用磷酸緩沖液(PBS)清洗兩輪后，對去除胎牛血清的培養(yǎng)基中所準備的樣本進行了處理。以0.2、1.0μm濃度對在N-末端結合有熒光物質FITC的LayN肽進行處理，并進行3小時培養(yǎng)，從而確認了細胞內傳遞。以與實施例2中所使用的方法相同的方法對樣本進行處理，并利用流式細胞分析儀進行了分析。

如圖2所示，能夠確認的是，在HEK293細胞中根據LayN肽的濃度細胞內傳遞效率增加，且如圖3中示，能夠確認的是，在Jurkat T細胞中也具有根據LayN肽的濃度細胞內傳遞效率增加的傾向。

實施例4.利用β-半乳糖苷酶(Beta Galactosidase)分析確認向細胞內部的蛋白質傳遞。

制造LayN-β-galactosidase(LayN-β-Gal)融合蛋白質

為了制造在細胞穿透性肽LayN(序列號1)結合有作為傳遞物質的β-半乳糖苷酶蛋白質的融合蛋白質，向pET28c載體導入用于表達LayN肽和β-半乳糖苷酶蛋白質的遺傳基因序列，從而制造用于表達LayN-β-Gal融合蛋白質的載體。為了易于融合蛋白質的精制，以使得His-Taq(H6)序列導入至N-末端的形態(tài)進行制造，并且如圖4所示，最終生成的融合蛋白質的結構是從N-末端H6-LayN-β-Gal形態(tài)。

將用于表達LayN-β-Gal的載體向BL21(DE3)pLysS大腸菌細胞株導入，從而制造得到形質轉換的細胞株后，表達蛋白質。用于蛋白質生產及精制的簡略的方法如下。

將形質轉換的BL21(DE3)pLysS大腸菌細胞在含有抗生素卡那霉素(Kanamycin)的5ml LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中進行接種，并在攝氏37度、250rpm下進行一次培養(yǎng)。利用紫外-可見光線分光器在600nm波長下以大約0.6光密度(Optical Density，O.D.)培養(yǎng)后，在含有抗生素卡那霉素(Kanamycin)的500ml LB培養(yǎng)基中以相同的條件進行培養(yǎng)。600nm波長下以大約0.7～0.8O.D.培養(yǎng)后，添加1mM IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)從而誘導目標蛋白質的過度表達。進行四小時培養(yǎng)后利用離心分離機收獲細胞，然后添加溶解溶液(Lysis bu ffer：6M urea，20mM Tris-HCl，pH8.0、500mM NaCl；裂解緩沖液：6M尿素，20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH8.0、500mM氯化鈉)，從而使用超聲波粉碎機來破損細胞。利用離心分離機只得到含有蛋白質的溶液部分，之后執(zhí)行精制過程。

利用HisTrap親和柱(column)從含有蛋白質的溶液得到目標蛋白質后，利用交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-25柱(column)置換為含有10％甘油(glycerol)的蛋白質保管溶液，從而以-80攝氏度保管后進行使用。

LayN-β-Gal融合蛋白質導入細胞內

在經過多聚賴氨酸D型(Poly-D-Lysine)處理的12-孔(well)培養(yǎng)皿中將人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞分別分裂為3x10⁴個后，利用添加有10％胎牛血清和抗生素青霉素/鏈霉素(Penicillin/streptomycin)的DMEM培養(yǎng)基，在37攝氏度、5％二氧化碳濃度的培養(yǎng)器中進行16小時培養(yǎng)。去除培養(yǎng)基后，用磷酸緩沖液清洗兩輪后，對樣本進行處理。樣本以無處理組，1.5μM濃度的對照組，0.1、0.5、1.0、1.5μM濃度的LayN-β-Gal蛋白質處理組進行準備并進行實驗。對照組使用融合蛋白質(A10-β-Gal)，所述融合蛋白質是將目標蛋白質的細胞內傳遞用的肽LayN肽置換為A10肽(序列號7)后制造而成。

處理樣本后，進行三小時培養(yǎng)后用磷酸緩沖液進行三次清洗后，添加固定液(2％甲醛(formaldehyde)，0.2％戊二醛(glutaraldehyde)，PBS)，從而進行10分鐘細胞固定。10分鐘后去除固定液并用磷酸緩沖液清洗后，添加X-gal染色溶液，并在37攝氏度下反應30分鐘。染色后用磷酸緩沖液清洗3次后，利用光學顯微鏡和CCD攝像機(charge-coupled-device camera，電荷耦合器攝像機)確認染色程度。

實驗結果如圖4所示，通過LayN肽的目標蛋白質的細胞內導入顯示出隨著濃度而增加的傾向，并且在不利用細胞穿透性肽而利用對照組肽A10的蛋白質中幾乎不能確認即使在1.5μm的高濃度中也向細胞內傳遞的形態(tài)。通過這樣的結果能夠確認，LayN肽使得傳遞物(cargo)蛋白質向細胞內傳遞。

實施例5.LayN二聚體的siRNA細胞內傳遞效率

為了確認通過LayN肽的核酸的細胞內傳遞效率，合成將LayN肽作為單體的連續(xù)的序列的二聚體LayN-D。通過靜電引力使得作為核酸的siRNA的陰電荷N與LayN-D肽的陽電荷P結合，從而向細胞內部傳遞。(圖5A)混合比率以使得陰電荷和陽電荷的比率N/P比不同的形式進行混合，從而作為傳遞樣本進行使用。

在瓊脂糖凝膠(agarose gel)上確認LayN-D肽與siRNA結合。

首先，確認LayN-D肽與siRNA的結合與否，并為了確認理想的結合比而如圖5-B一樣，在瓊脂糖凝膠上確認根據混合比的結合與否。為了賦予siRNA與LayN-D肽在N/P比上變化而固定siRNA的量，并使得LayN-D的量根據N/P比率按照siRNA濃度的0.5、1.0、2.0、5.0倍進行混合，從而在室溫下進行20分鐘反應后，在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳后，通過EtBr(溴化乙錠)進行染色并確認。實驗結果為，N/P比在1.0至2.0顯示出最理想的結合效率。

在LacZ遺傳基因形質轉換細胞中，通過LacZ siRNA傳遞確認表達阻礙效能

將包括表達β-半乳糖苷酶的LacZ遺傳基因的載體在人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞中進行形質轉換，從而利用LayN-D肽使得LacZ siRNA向細胞內部傳遞，從而通過阻礙β-半乳糖苷酶表達的實驗來確認siRNA傳遞效能。

利用pcDNA3.1/LacZ載體的人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞的形質轉換

在經過多聚賴氨酸D型(Poly-D-Lysine)處理的24-孔培養(yǎng)皿中將人類胚胎腎臟細胞株HEK293細胞分別分裂為3x10⁴個后，利用添加有10％胎牛血清和抗生素青霉素/鏈霉素(Penicillin/streptomycin)的DMEM培養(yǎng)基在37攝氏度、5％二氧化碳濃度的培養(yǎng)器中進行18小時培養(yǎng)。去除培養(yǎng)基后，用磷酸緩沖液清洗后，在未添加血清的培養(yǎng)基中進行6小時額外培養(yǎng)。利用脂質體2000(Lipofectamine2000)(Life Technologie s公司)試劑對用于LacZ表達的載體pcDNA3.1/LacZ載體，以及用作對照組(mock)的pcDNA3.1載體分別在細胞中進行處理并導入，并進行4小時培養(yǎng)從而進行形質轉換。

LayN-D肽與siRNA復合體的細胞內導入。

在得到形質轉換的HEK293細胞中按照幾種N/P比混合LayN-D肽與LacZ siRNA，從而在細胞中進行處理。處理樣本如圖5-C至D所示，制造1.形質轉換陰性對照組、2.50nM siRNA陰性對照組、3.siRNA/脂質體轉染(Lipofectamine)陽性對照組、4.N/P(siRNA/LayN-D)＝1.0、5.N/P(siRNA/LayN-D)＝0.5樣本組并進行使用。將各個樣本在細胞中進行處理，從而進行3小時培養(yǎng)，用添加有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對培養(yǎng)基進行交換后，在進行48小時的額外培養(yǎng)后收獲細胞。

利用β-半乳糖苷酶分析的siRNA傳遞中其他的LacZ表達阻礙效能

細胞收獲后，利用RIPA溶液(50mM Tris-HCl，pH7.4、1％Np-40，0.5％Na-deoxych olate，0.1％SDS，150mM NaCl，2mM EDTA，50mM NaF，1mM PMSF，0.5μg/ml Leupeptin，0.5μg/ml Aprotinin，1mg/ml Pepstatin，0.2mM Na₃VO₄；50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH7.4、1％乙基苯基聚乙二醇，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％十二烷基硫酸鈉，150mM氯化鈉，2mM乙二胺四乙酸，50mM氟化鈉，1mM苯甲基磺酰氟，0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽，0.5μg/ml抑肽酶，1mg/ml胃蛋白酶抑制劑，0.2mM釩酸鈉)使得細胞溶解，并在離心分離后得到含有蛋白質的上清液。對同量的1xβ-gal染色溶液進行處理后，在37攝氏度下進行10分鐘反應，并在590nm中測定吸光度，從而制成圖表(圖5-C、D)。

如圖5-C、D所示，按照N/P比1:2(0.5)處理siRNA和LayN-D肽時，可表現(xiàn)出和通過陽性對照組脂質體轉染(Lipofectamine)處理的siRNA傳遞效率類似或稍好的結果，通過這樣的結果，能夠確認通過LayN肽的細胞內核酸傳遞效能。

實施例6.在利用WST-1試劑的多種細胞株中LayN肽的細胞毒性

為了確認LayN肽本身的細胞毒性，在人類宮頸癌細胞株HeLa、人類胚胎腎臟細胞株HEK293、人類角質形成細胞株HaCaT、急性淋巴性白血病細胞株Jurkat T等多種人類細胞株中確認LayN肽的細胞毒性。

在96-孔培養(yǎng)燒瓶(flask)中對1x10⁴個中的每個細胞分別使用添加有10％胎牛血清和抗生素青霉素/鏈霉素(Penicillin/streptomycin)的DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基在37攝氏度、5％二氧化碳濃度的培養(yǎng)器中進行16小時培養(yǎng)。如圖6所示，培養(yǎng)后，在0.05至2.0μm濃度范圍內對LayN肽進行處理后，進行3小時額外培養(yǎng)，并利用確認細胞增殖的試劑WST-1試劑(Roche公司)在420～480nm下測定吸光度。

如圖6所示，可以確認在各個細胞株中，細胞毒性在大約1.0μm表現(xiàn)出10％左右的細胞毒性，在1.5μm濃度中表現(xiàn)出20％左右的細胞毒性。以此結果為基礎，用于本發(fā)明的實施例以1.5μm濃度以下的LayN肽濃度進行處理。