本發(fā)明涉及具有改善的乙偶姻途徑的微生物。與未修飾的微生物相比，重組微生物被修飾以改善乙偶姻的生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了使用這種微生物生產(chǎn)乙偶姻的方法。
背景技術(shù)：
：通過兩種酶、即α-乙酰乳酸合酶和α-乙酰乳酸脫羧酶的作用，在細菌中由丙酮酸(pyruvate)形成乙偶姻，其也稱為3-羥基丁酮或乙酰甲基甲醇，α-乙酰乳酸合酶通過單一脫羧催化兩個丙酮酸分子的縮合以提供α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脫羧酶將最后一個丙酮酸分子脫羧化為乙偶姻(Juni，1952)。乙偶姻是一種通常用于食品行業(yè)的芳香劑(flavor)，其中因為它被認為是更安全的，所以它替代了丁二酮(Huang，2011)。乙偶姻在關(guān)于樹莓、草莓、香草、核桃、朗姆酒、黃油、奶油糖、焦糖、椰子、咖啡和水果香料的配方中被用作芳香劑成分。乙偶姻可被添加至酒精飲料和非酒精飲料、如奶油蘇打中。其黃油風(fēng)味非常適合冰淇淋、冰、糖果、烘焙食品、人造黃油、明膠甜點、白軟干酪、人造黃油和起酥油。乙偶姻也被化妝品行業(yè)作為芳香載體用于香水和香料(fragrance)中。最后，乙偶姻是香煙中最重要的化學(xué)添加劑之一，并且作為電子香煙中的芳香劑。乙偶姻還是甲基乙烯基酮(MVK)的前體，甲基乙烯基酮是有用的化學(xué)中間體。傳統(tǒng)的乙偶姻化學(xué)合成面臨石油缺乏和環(huán)境污染的缺點，而乙偶姻作為食品芳香劑的市場目前仍以每年5％至5.5％的速度增長，且預(yù)計在2018年將達到140億美元。在2018年，香料市場預(yù)計超過160億美元。過去只能通過傳統(tǒng)化學(xué)工藝生產(chǎn)的許多化學(xué)品現(xiàn)在具有使用可再生資源通過生物學(xué)方式產(chǎn)生的潛力(Danner和Braun，1999；Hatti-Kaul等，2007)。微生物生產(chǎn)乙偶姻是一個這樣的例子。如上所述，因為乙偶姻具有大量的工業(yè)應(yīng)用，并且微生物生產(chǎn)將減輕對用于平臺化學(xué)品生產(chǎn)的石油供應(yīng)的依賴性，所以對這種生物工藝的興趣顯著增加。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是用于這種生物工藝的特別合適的平臺(Nielsen2013)。關(guān)于乙偶姻的微生物生產(chǎn)，大多數(shù)研究使用微生物、例如光滑念珠菌(Candidaglabrata)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來生產(chǎn)乙偶姻(ShutoLi等，MicrobialCellFactories2014，13:55；SilbersackJ等，ApplMicrobiolBiotechnol.2006年12月，73(4):895-903)。因此，通過GRAS(即一般認為安全的)微生物生產(chǎn)乙偶姻是值得期望的。在本文中，酵母，更特別地釀酒酵母是一種合適的微生物。已知釀酒酵母天然生產(chǎn)乙偶姻，但是乙偶姻生產(chǎn)的產(chǎn)量和生產(chǎn)力差。乙醇生產(chǎn)確實是釀酒酵母中有效生產(chǎn)乙偶姻的最明顯的障礙，因為關(guān)鍵中間體丙酮酸優(yōu)先用于生產(chǎn)乙醇而非乙偶姻。因此，出于顯而易見的原因，通過微生物工藝，更具體地通過將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻來改善乙偶姻的生產(chǎn)，仍然是一個恒定的目標。更具體地，仍然需要具有提高的乙偶姻生產(chǎn)量，特別是與工業(yè)化要求相容的穩(wěn)定的重組微生物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及具有降低的丙酮酸脫羧酶活性的重組酵母，在該重組酵母的基因組中插入：-一種或多種編碼乙酰乳酸合酶的核酸或ALS，-一種或多種編碼乙酰乳酸脫羧酶的核酸或ALD，以及-一個或多個編碼NADH氧化酶的核酸(NOXE)的拷貝。根據(jù)一個具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含一個或多個選自包含下列式的組的DNA構(gòu)建體：(I)5'-[Gene1]x1-3’和5'-[Gene2]x2-3’和5'-[Gene3]x3-3’，(II)5'-[Gene1]x1-[Gene2]x2-3’和5'-[Gene3]x3-3’，(III)5'-[Gene1]x1-[Gene2]x2-[Gene3]x3-3'，及其組合，其中：-“Gene1”意為選自包含ALS、ALD或NOXE的組的核酸；-“Gene2”意為選自包含ALS、ALD或NOXE的組、但不同于Gene1的核酸；-“Gene3”意為選自包含ALS、ALD或NOXE的組、但不同于Gene1和Gene2的核酸；-“ALS”是編碼乙酰乳酸合酶的核酸；-“ALD”是編碼乙酰乳酸脫羧酶的核酸；-“NOXE”是編碼NADH氧化酶的核酸；-“x1”、“x2”和“x3”中的每一者各自獨立地表示0至50的整數(shù)、優(yōu)選0至20的整數(shù)，以及前提是所述重組酵母包含編碼ALS、ALD和NOXE中的每一者的至少一種核酸。優(yōu)選地，“x1”、“x2”和“x3”中的每一者各自獨立地表示從0至15的整數(shù)，其包括0至12的整數(shù)、更特別地從0至5的整數(shù)、特別是從0至3的整數(shù)、并且更好地表示等于1的整數(shù)。根據(jù)另一個具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少一個、優(yōu)選至少兩個相同或不同的具有上述式(II)的DNA構(gòu)建體，其中“Gene3”意為編碼NADH氧化酶的核酸。根據(jù)另一個具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少一個、優(yōu)選至少兩個相同或不同的具有式(IIa)的DNA構(gòu)建體，其中每個式(IIa)具有下式：(IIa)5'-[(prom5)y1-Gene1-term5]x5-[prom1-Gene1-term1]x1-[prom2-Gene2-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-Gene3-(term3)z2]x3-3'其中：-Gene1、Gene2、Gene3、“x1”、“x2”和“x3”如上定義的那樣；-“x5”表示等于0或1的整數(shù)；-“y1”、“y2”、“z1”和“z2”各自獨立地表示等于0或1的整數(shù)；-當所述重組酵母包含至少兩個具有式(IIa)的DNA構(gòu)建體時，則“x1”、“x2”、“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”可以相同或不同；-“prom1”是控制編碼gene1的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom2”是控制編碼gene2的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom3”是控制編碼gene3的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom5”是控制Gene1表達的調(diào)控序列，所述prom5與prom1相同或不同；-“term1”是終止編碼gene1的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term2”是終止編碼gene2的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term3”是終止編碼gene3的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term5”是終止Gene1表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述term5與term1相同或不同。根據(jù)另一個具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少一個、優(yōu)選至少兩個相同或不同的具有式(IIb)的DNA構(gòu)建體，其中每個式(IIb)具有下式：(IIb)5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3'其中：-ALS、ALD、NOXE、“x1”、“x2”、“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”如上定義的那樣；-當所述重組酵母包含至少兩個具有式(IIb)的DNA構(gòu)建體時，“x1”、“x2”、“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”可以相同或不同；-“prom1”是控制編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom2”是控制編碼乙酰乳酸脫羧酶的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom3”是控制編碼NADH氧化酶的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom5”是控制編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的調(diào)控序列，所述prom5與prom1相同或不同；-“term1”是終止編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term2”是終止編碼乙酰乳酸脫羧酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term3”是終止編碼NADH氧化酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；以及-“term5”是終止編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述term5與term1相同或不同。根據(jù)另一個具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少兩個具有式(II)、式(IIa)或式(IIb)的DNA構(gòu)建體，前提是NOXE的核酸的所有拷貝位于至少兩個具有式(II)、式(IIa)或式(IIb)的DNA構(gòu)建體中的一個DNA構(gòu)建體上。根據(jù)另一個具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少兩個、優(yōu)選嚴格兩個具有下式(IIc)和式(IId)的DNA構(gòu)建體：(IIc)5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3'；以及(IId)5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3'；其中：-ALS、ALD、NOXE；“prom1”、“prom2”、“prom3”、“prom5”、“term1”、“term2”、“term3”、“term5”；“x1”、“x2”和“x3”；和“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”如上定義的那樣；-式(IIc)和式(IId)中的每一者的“x1”至“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”相同或不同；以及-“x6”和“x7”表示0至50、優(yōu)選0至20、優(yōu)選0至12、更特別地2至5、優(yōu)選3至4的整數(shù)，且更好地等于3，前提是“x6”和“x7”中的一者表示0。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的重組酵母用于生產(chǎn)涵蓋甲基乙烯基酮的乙偶姻和/或其衍生物的用途。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)乙偶姻的方法，所述方法包含步驟：(a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的重組酵母；和(c)回收乙偶姻。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包含碳源，該碳源優(yōu)選地選自包含葡萄糖和蔗糖的組。附圖說明圖1示出重組酵母菌株中的代謝途徑，從而取代乙醇的生產(chǎn)而有利于乙偶姻的生產(chǎn)。具體實施方式定義本文所用的術(shù)語“微生物”是指未人工修飾的酵母。如果微生物提供遺傳元件以被整合至將表達該外來遺傳元件的微生物“受體”中，或者如果其用作遺傳構(gòu)建或蛋白質(zhì)表達的工具，則該微生物可以是“供體”。本發(fā)明的微生物選自表達乙偶姻生物合成基因的酵母。本文所用的術(shù)語“重組微生物”或“遺傳修飾的微生物”或“重組酵母”或“遺傳修飾的酵母”是指經(jīng)遺傳修飾或遺傳工程化的酵母。根據(jù)這些術(shù)語的通常含義，意為本發(fā)明的微生物在自然界中不存在，并且通過引入或通過刪除或通過修飾自然界中發(fā)現(xiàn)的等同微生物的遺傳元件而被修飾。還可以通過在特定選擇壓力下組合定向誘變和進化來強制形成和進化新的代謝途徑來修飾(參見例如WO2004/076659)。如果利用所有的允許基因在宿主微生物中表達的元件將這些基因?qū)胛⑸镏?，則微生物可以被修飾以表達外源基因?？梢孕揎椢⑸镆哉{(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達水平。用外源DNA修飾或“轉(zhuǎn)化”微生物(如酵母)是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)任務(wù)。特別地，根據(jù)本發(fā)明的微生物的遺傳修飾，更具體地，本文定義的遺傳修飾，可以通過使用如DiCarlo等(Nucl.AcidsRes.，第41卷，第7期，2013：4336-4343)所述的CRISPR-Cas系統(tǒng)來進行。術(shù)語“內(nèi)源基因”意為在野生型菌株中的任何遺傳修飾之前，該基因存在于微生物中。內(nèi)源基因可以通過除了內(nèi)源調(diào)控元件之外或代替內(nèi)源調(diào)控元件而導(dǎo)入異源序列，或通過將基因的一個或多個補充拷貝導(dǎo)入染色體或質(zhì)粒中來過表達。也可以修飾內(nèi)源基因以調(diào)節(jié)它們的表達和/或活性。例如，可以將突變導(dǎo)入編碼序列以修飾基因產(chǎn)物，或者可以除了內(nèi)源調(diào)控元件之外或代替內(nèi)源調(diào)控元件導(dǎo)入異源序列。內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致基因產(chǎn)物的活性的上調(diào)和/或增強，或者可替選地，導(dǎo)致內(nèi)源基因產(chǎn)物的活性的下調(diào)和/或減弱。增強內(nèi)源基因表達的另一種途徑是將基因的一個或多個補充拷貝導(dǎo)入染色體或質(zhì)粒上。術(shù)語“外源基因”是指通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將基因?qū)胛⑸镏?，而該基因不天然存在于野生型微生物中。如果利用所有的允許基因在宿主微生物中表達的元件將這些基因?qū)胛⑸镏校瑒t微生物可以表達外源基因。用外源DNA轉(zhuǎn)化微生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)任務(wù)。外源基因可以整合到宿主染色體中，或者在染色體外從質(zhì)?；蜉d體表達。其復(fù)制起點及其在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)方面不同的各種質(zhì)粒，在本領(lǐng)域中都是已知的。外源基因的序列可以適應(yīng)其在宿主微生物中的表達。實際上，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道密碼子使用偏性的概念以及如何在不修飾推導(dǎo)蛋白的情況下使核酸序列適應(yīng)特定的密碼子使用偏性。術(shù)語“異源基因”意為該基因來源于與表達它的受體微生物不同的微生物物種。它是指不天然存在于微生物中的基因。在本申請中，所有基因都用它們的通用名稱編號，并參考其核苷酸序列以及由此引起的其氨基酸序列。使用在已知基因的登記號中給出的編號，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定在其它生物體、細菌菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等中的等同基因。這種常規(guī)工作使用共有序列有利地進行，該共有序列可以通過與衍生自其他微生物的基因進行序列比對并設(shè)計簡并探針以克隆另一生物體中的相應(yīng)基因來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道調(diào)節(jié)特別是上調(diào)或下調(diào)內(nèi)源基因表達的不同方式。例如，一種增強內(nèi)源基因表達的途徑是將基因的一個或多個補充拷貝導(dǎo)入染色體或質(zhì)粒上。另一種途徑是用更強的啟動子替代基因的內(nèi)源啟動子。這些啟動子可以是同源的或異源的。已知允許在酵母中高水平表達的同源啟動子是在下列組中選擇的啟動子：ADH1、GPDH、TEF1、截短的HXT7、PFK1、FBA1、PGK1和TDH3等。在下文中更詳細地定義本發(fā)明中特別感興趣的啟動子。在酵母中，核酸表達構(gòu)建體優(yōu)選包含調(diào)控序列，例如啟動子序列和終止子序列，其與編碼各個所考慮基因的核酸序列可操作地連接，更具體地與編碼上述根據(jù)本發(fā)明的ALS、ALD和NOXE酶中的每一者的核酸序列可操作地連接。核酸表達構(gòu)建體還可以包含5'和/或3'識別序列和/或選擇標記。術(shù)語“過表達”是指與未修飾的微生物相比，基因或酶的表達增加。增加酶的表達通過增加編碼所述酶的基因的表達來獲得。增加基因的表達可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行。在這方面，可以特別引用在意欲過表達的核酸上游實施強啟動子，或在啟動子特別是強啟動子和終止子之間導(dǎo)入所述核酸的若干拷貝。酶的“活性”與術(shù)語“功能”互換使用，并且在本發(fā)明的上下文中指酶催化所需反應(yīng)的能力。術(shù)語酶的“降低的活性”或“減弱的活性”意為通過氨基酸序列中的突變獲得的蛋白質(zhì)的比催化活性降低、和/或通過核苷酸序列的突變或通過相應(yīng)同源基因的刪除獲得的細胞中蛋白質(zhì)的濃度降低。術(shù)語酶的“增強的活性”指酶的比催化活性增加和/或例如通過編碼酶的基因的過表達獲得的細胞中酶的量/可用性增加。術(shù)語“編碼(encoding)”或“編碼(coding)”是指多核苷酸通過轉(zhuǎn)錄和翻譯機制產(chǎn)生氨基酸序列的過程。編碼本發(fā)明中所考慮的酶的基因可以是外源的或內(nèi)源的?；虻摹皽p弱”意為基因以相比未修飾的微生物低的速率表達。減弱可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段和方法實現(xiàn)，并且包含通過同源重組獲得的基因刪除、通過將外部元件插入基因中的基因減弱或在弱啟動子下的基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道顯示不同強度的各種啟動子和用于弱基因表達的啟動子。在本發(fā)明中實施的方法優(yōu)選需要使用一種或多種染色體整合構(gòu)建體，用于將異源核苷酸序列穩(wěn)定地導(dǎo)入到染色體上的特定位置中或用于遺傳修飾的微生物細胞中一個或多個靶基因的功能性破壞。在一些實施方式中，靶基因的破壞阻止相關(guān)功能蛋白的表達。在一些實施方式中，靶基因的破壞導(dǎo)致從被破壞的基因表達非功能性蛋白。在本發(fā)明的實踐中可以改變的染色體整合構(gòu)建體的參數(shù)包括但不限于同源序列的長度、同源序列的核苷酸序列、整合序列的長度、整合序列的核苷酸序列和靶基因座的核苷酸序列。在一些實施方式中，每個同源序列的長度的有效范圍是20至5000個堿基對，優(yōu)選50至100個堿基對。在特定實施方式中，每個同源序列的長度為約50個堿基對。關(guān)于基因靶向所需的同源性長度的更多信息，參見D.Burke等，MethodsinyeastGenetics-AcoldspringharbourlaboratorycourseManual(2000)。在一些實施方式中，其中意欲插入上述DNA構(gòu)建體的被破壞的丙酮酸脫羧酶基因可有利地包含一種或多種可用于選擇轉(zhuǎn)化的微生物細胞的選擇性標記。優(yōu)選地，所述選擇性標記包含于根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中。在一些實施方式中，選擇性標記是抗生素抗性標記?？股乜剐詷擞浀恼f明性示例包括但不限于NAT1、AUR1-C、HPH、DSDA、KAN<R>和SHBLE基因產(chǎn)物。來自諾爾斯鏈霉菌(S.noursei)的NAT1基因產(chǎn)物賦予對諾爾斯菌素的抗性；來自釀酒酵母的AUR1-C基因產(chǎn)物賦予對短梗霉素A(AuerobasidinA，AbA)的抗性；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)的HPH基因產(chǎn)物賦予對潮霉素B的抗性；大腸桿菌(E.coli)的DSDA基因產(chǎn)物允許細胞在以D-絲氨酸作為唯一氮源的平板上生長；Tn903轉(zhuǎn)座子的KAN<R>基因賦予對G418的抗性；和來自印度斯坦鏈異壁菌(Streptoalloteichushindustanus)的SHBLE基因產(chǎn)物賦予對吉歐霉素(博萊霉素)的抗性。在一些實施方式中，將本發(fā)明的遺傳修飾的微生物細胞分離后，刪除抗生素抗性標記。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在特定遺傳背景中選擇合適的標記。在一些實施方式中，選擇性標記在遺傳修飾的微生物細胞中挽救營養(yǎng)缺陷型(例如營養(yǎng)性營養(yǎng)缺陷型)。在這樣的實施方式中，親代微生物細胞包含在氨基酸或核苷酸生物合成途徑中起作用的一種或多種基因產(chǎn)物中的功能性破壞，例如，酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET15、TRP1、ADE2和URA3基因產(chǎn)物，其使得親代微生物細胞不能夠在沒有補充一種或多種營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中生長(營養(yǎng)缺陷型表型)。然后可以通過用編碼被破壞的基因產(chǎn)物的功能性拷貝的染色體整合轉(zhuǎn)化親代微生物細胞來挽救營養(yǎng)缺陷型表型(注意：基因的功能性拷貝可以源自近似種，例如克魯維酵母、假絲酵母等)，并且可以基于親代微生物細胞的營養(yǎng)缺陷型表型的喪失來選擇產(chǎn)生的遺傳修飾的微生物細胞。對于包含啟動子序列、編碼序列(例如酶編碼序列)或終止子序列的每種核酸序列，本文描述了參考序列。本說明還包括與參考核酸序列具有特定百分比的核酸同一性的核酸序列。對于每種或感興趣的氨基酸序列，本文描述了參考序列。本說明還包括與參考氨基酸序列具有特定百分比的氨基酸同一性的氨基酸序列(例如酶氨基酸序列)。出于顯而易見的原因，在所有當前的描述中，分別符合所考慮的核苷酸或氨基酸同一性的特定核酸序列或特定氨基酸序列應(yīng)進一步導(dǎo)致獲得顯示期望的生物活性的蛋白(或酶)。如本文所用，兩個核酸序列之間或兩個氨基酸序列之間的“同一性百分比”通過由比較窗口比較兩者的最佳比對序列來確定。因此，與參考序列(其不包括這些添加或這些缺失)相比，比較窗口中的核苷酸或氨基酸序列的部分可以包括添加或缺失(例如“空位”)，以便獲得兩個序列之間的最佳比對。同一性百分比的計算：通過確定可以在兩個比較的序列中注意到相同的核酸堿基或相同的氨基酸殘基的位置的數(shù)目，然后通過用可以在兩個核酸堿基之間或兩個氨基酸殘基之間觀察到同一性的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)，然后將該結(jié)果乘以100，以獲得兩個序列之間的核苷酸同一性百分比或兩個序列之間的氨基酸同一性百分比。序列最佳比對的比較可以使用已知算法通過計算機來進行。最優(yōu)選地，使用CLUSTALW軟件(版本1.82)確定序列同一性百分比，參數(shù)設(shè)置如下：(1)CPU模式＝ClustalWmp；(2)比對＝“全部”；(3)輸出格式＝“alnw/數(shù)”；(4)輸出命令＝“對齊的”；(5)顏色比對＝“無”；(6)KTUP(字長)＝“默認”；(7)窗口長度＝“默認”；(8)分數(shù)類型＝“百分比”；(9)TOPDIAG＝“默認”；(10)對空位＝“默認”；(11)進化樹/樹類型＝“無”；(12)模型＝“默認”；(13)起始空位＝“默認”；(14)終止空位＝“默認”；(15)空位延伸＝“默認”；(16)空位距離＝“默認”；(17)樹類型＝“進化分支樹”和(18)樹空位(GRAP)距離＝“隱藏”?！鞍l(fā)酵”或“培養(yǎng)”通常在具有適合于所培養(yǎng)微生物的適當培養(yǎng)基的發(fā)酵器中進行，其包含至少一種簡單碳源，以及如果必要的共底物。本文公開的微生物可以在用于從丙酮酸生產(chǎn)產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長。為了最大量生產(chǎn)乙偶姻，用作生產(chǎn)宿主的微生物菌株優(yōu)選具有高的碳水化合物利用率。這些特征可以通過誘變和選擇、遺傳工程賦予，或者可以是天然的。用于本發(fā)明細胞的發(fā)酵培養(yǎng)基或“培養(yǎng)基”可以包含至少約10g/L的葡萄糖。另外的碳底物可以包括但不限于單糖，例如果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，例如乳糖、麥芽糖、半乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉或纖維素或其混合物以及來自可再生原料的未純化混合物，例如奶酪乳清滲透玉米漿、甜菜糖蜜和大麥麥芽。其它碳底物可以包括甘油。因此，預(yù)期本發(fā)明中使用的碳源可以包括多種含碳底物，并且僅受生物體選擇的限制。盡管預(yù)期所有上述碳底物及其混合物都適用于本發(fā)明，但優(yōu)選的碳底物為葡萄糖、果糖和蔗糖，或這些與C5糖(例如木糖和/或阿拉伯糖)的混合物用于改性微生物使用C5糖，更特別地為葡萄糖。優(yōu)選的碳底物是蔗糖。根據(jù)一個具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的碳底物不包括木糖。除了合適的碳源外，發(fā)酵培養(yǎng)基可以含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于培養(yǎng)物的生長和促進生產(chǎn)所需產(chǎn)物必需的酶途徑的其它組分。此外，可以考慮適合于根據(jù)本發(fā)明的重組微生物生長的另外的遺傳修飾。為了防止乙偶姻向2,3-BDO的逃逸，涉及將乙偶姻還原成2,3-BDO的基因可以被滅活。在這方面，可以引用內(nèi)源性丁二醇脫氫酶bdh1和bdh2(特別地以EC編號1.1.1.4.已知)，但也可以引用內(nèi)源性醇脫氫酶adh1、adh3和adh4(特別地以EC編號1.1.1.1已知)。所述基因的滅活屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。已知弱酸的存在是生長的限制因素，并且經(jīng)常存在于纖維素或糖蜜衍生的介質(zhì)中。另外的遺傳修飾，如JEN1基因(或系統(tǒng)名稱：YKL217W或蛋白質(zhì)登錄號P36035(UniProtKBswiss-Prot))的破壞和/或HAA-1基因(系統(tǒng)名稱：YPR008W或登錄號Q12753(UniProtKBswiss-Prot))的過表達導(dǎo)致在所實施的培養(yǎng)基中改善菌株對弱酸的抗性。Jen1是負責(zé)在細胞中乳酸輸入的膜蛋白(CasalM，等(1999)，J.Bacteriol.，181(8)：2620-3)。HAA-1是一種轉(zhuǎn)錄激活劑，其控制負責(zé)對弱酸的抗性的膜應(yīng)激蛋白的表達。HAA-1的過表達增強了酵母對乙酸的抗性(Tanaka等(2012)ApplEnvironMicrobiol.，78(22)：8161-3)。JEN1基因的破壞和HAA-1基因的過表達屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識，并且可以特別地使用本文顯示的方法進行?？紤]到在下文中用于在酵母中合成乙偶姻的方程式，本發(fā)明中所考慮的條件必然是需氧條件。術(shù)語“需氧條件”是指培養(yǎng)基中足以使好氧或兼性厭氧微生物使用二氧基作為末端電子受體的氧濃度?！拔⑿柩鯒l件”是指其中氧濃度小于空氣中的氧濃度(即氧濃度高達6％O2)的培養(yǎng)基?！斑m當培養(yǎng)基”是指包含對于細胞的維持和/或生長必需的或有益的營養(yǎng)素的培養(yǎng)基(例如無菌的液體培養(yǎng)基)，例如碳源或碳底物；氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和磷酸銨；磷源，例如磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀；微量元素(例如金屬鹽)，例如鎂鹽、鈷鹽和/或錳鹽；以及生長因子，如氨基酸、維生素、生長促進劑等。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“碳源(carbonsource)”或“碳底物”或“碳源(sourceofcarbon)”表示本領(lǐng)域技術(shù)人員可用于支持微生物正常生長的任何碳源，包括己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、單糖、寡糖、二糖(如蔗糖、纖維二糖或麥芽糖)、糖蜜、淀粉或其衍生物、纖維素、半纖維素及其組合。根據(jù)本發(fā)明的重組酵母如上所述，本發(fā)明涉及具有降低的丙酮酸脫羧酶活性的重組酵母，在該重組酵母的基因組中插入：-一種或多種編碼乙酰乳酸合酶的核酸或ALS，-一種或多種編碼乙酰乳酸脫羧酶的核酸或ALD，以及-編碼NADH氧化酶的核酸(或NOXE)的一個或多個拷貝。如本文實施例中所示，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在丙酮酸脫羧酶活性已經(jīng)降低并且其已經(jīng)進一步整合允許表達合成乙偶姻所需的ALS酶和ALD酶的基因的重組酵母中，編碼NADH氧化酶的核酸的存在，有利地該核酸的多個拷貝的存在，不僅有助于穩(wěn)定所述重組酵母，而且允許顯著增強該菌株的生長以及顯著增加乙偶姻生產(chǎn)的產(chǎn)量。使用諸如釀酒酵母的克拉布特里(Crabtree)陽性酵母生物體，特別是重組的諸如釀酒酵母的酵母生物體來生產(chǎn)感興趣的代謝物是有利的，因為與細菌相比，酵母細胞具有在足量的糖(例如葡萄糖或蔗糖)存在下、在氧存在下進行發(fā)酵的能力。相比之下，細菌僅在厭氧條件下進行發(fā)酵。此外，與細菌的噬菌體相反，酵母生物體不受到病毒感染。此外，酵母生物體的培養(yǎng)很少受到非期望的微生物(例如細菌)的污染，因為酵母細胞導(dǎo)致其環(huán)境(例如，支持它們生長的培養(yǎng)基)快速酸化直至pH4。此外，酵母細胞不分泌許多不期望的代謝物，例如乳酸，乳酸在培養(yǎng)基中的存在是隨后純化感興趣的代謝物的實際障礙。此外，與細菌相比，酵母生物體，包括重組酵母生物體，具有更高的遺傳穩(wěn)定性。酵母中用于乙偶姻合成的方程式為：所述質(zhì)量方程式是可能的，因為釀酒酵母即使在氧的存在下也可發(fā)酵。考慮到上述方程式，對于200g葡萄糖的投入，乙偶姻的最大理論產(chǎn)量將是97.78g。如本文實施例所示，利用根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的乙偶姻的有效產(chǎn)量相對接近于該最大理論產(chǎn)量(高達83％)。根據(jù)發(fā)明人的知識，迄今為止從未在酵母中獲得這種產(chǎn)量。因此，在根據(jù)本發(fā)明的重組酵母中成功地達到具有高產(chǎn)量的乙偶姻的生產(chǎn)，為在酵母中工業(yè)生產(chǎn)乙偶姻鋪平了道路。令人驚奇的是，如本文實施例中所示，即使在高濃度的合成乙偶姻下，也沒有觀察到所產(chǎn)生的乙偶姻對酵母細胞的毒性。此外，合成的乙偶姻完全輸出到細胞外，因此大幅簡化了純化工藝。根據(jù)本發(fā)明的重組酵母中使用的NADH氧化酶(或NOXE)是非常特異性的“NADH-依賴性”酶，因為它不消耗任何碳化受體。因此，選擇的NADH氧化酶不直接干擾碳化代謝，但在生產(chǎn)水中補充NAD+庫。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母中使用的NADH氧化酶與上述現(xiàn)有技術(shù)文獻，特別是US2011/0124060和WO2013/076144中公開的“NADH-依賴性”酶顯著不同。根據(jù)某些實施方式，重組酵母可以包含一個或多個選自包含下式的組的DNA構(gòu)建體：(I)5'-[Gene1]x1-3’和5'-[Gene2]x2-3’和5'-[Gene3]x3-3’，(II)5'-[Gene1]x1-[Gene2]x2-3’和5'-[Gene3]x3-3’，(III)5'-[Gene1]x1-[Gene2]x2-[Gene3]x3-3'，及其組合，其中：-“Gene1”意為選自包含ALS、ALD或NOXE的組的核酸；-“Gene2”意為選自包含ALS、ALD或NOXE的組，但不同于Gene1的核酸；-“Gene3”意為選自包含ALS、ALD或NOXE的組，但不同于Gene1和Gene2的核酸；-“ALS”是編碼乙酰乳酸合酶的核酸；-“ALD”是編碼乙酰乳酸脫羧酶的核酸；-“NOXE”是編碼NADH氧化酶的核酸；-“x1”、“x2”和“x3”中的每一者各自獨立地表示0至50的整數(shù)，優(yōu)選0至20的整數(shù)，以及前提是所述重組酵母包含編碼ALS、ALD和NOXE中的每一者的至少一種核酸。優(yōu)選地，“x1”、“x2”和“x3”中的每一者各自獨立地表示從0至10的整數(shù)，更特別地從0至5的整數(shù)，特別是從0至3的整數(shù)，并且更好地表示等于1的整數(shù)。如本文所述，x1、x2和x3中的每一者可以具有選自包括0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的組中的值。在某些實施方式中，在上式(I)至式(III)的DNA構(gòu)建體中，整數(shù)“x1”、“x2”和/或“x3”中的一者或多者彼此獨立地具有2或大于2的值，則相關(guān)Gene1、Gene2和/或Gene3中的相應(yīng)基因的兩個或更多個拷貝中的每一者可以相同或不同。本文表1中描述了ALS、ALD和NOXE的各種不同序列。在選自上述式(I)至式(III)的DNA構(gòu)建體的示例性實施方式中，其中“x1”是等于2的整數(shù)且Gene1是編碼乙酰乳酸合酶的核酸(ALS)，則包含在所述DNA構(gòu)建體中的兩個編碼ALS的序列可以相同或不同。例如，根據(jù)該特定實施方式，其意為編碼乙酰乳酸合酶的核酸的第一拷貝可以是編碼ALS.Bs的核酸，并且編碼乙酰乳酸合酶的核酸的第二拷貝可以是編碼ALS.Pp的核酸。在根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的實施方式中，其中所述重組酵母包含選自包含式(I)至式(III)的DNA構(gòu)建體的組中的至少兩個DNA構(gòu)建體，每個DNA構(gòu)建體，更特別地其中包含的相關(guān)Gene1、Gene2和/或Gene3中的各個基因可以相同或不同。下文呈現(xiàn)了選自包含式(I)、式(II)和式(III)的DNA構(gòu)建體的組中的DNA構(gòu)建體的一些示例性實施方式。包含一個具有式(I)的DNA構(gòu)建體的重組酵母：(I)5'-[ALS]2-3’和5'-[ALD]2-3’和5'-[NOXE]3-3’，包含上述式(I)的DNA構(gòu)建體的重組酵母具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，并且具有已導(dǎo)入其基因組中的以下四種DNA亞構(gòu)建體(i)至DNA亞構(gòu)建體(iii)：(i)包含兩個彼此相同或不同的核酸的DNA亞構(gòu)建體，每個核酸編碼ALS，所述DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第一位置處被導(dǎo)入；(ii)包含兩個彼此相同或不同的核酸的DNA亞構(gòu)建體，每個核酸編碼ALD，所述DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第二位置處被導(dǎo)入，該第二位置不同于其中已插入包含編碼ALS的核酸的DNA亞構(gòu)建體的位置；以及(iii)包含三個彼此相同或不同的核酸的DNA亞構(gòu)建體，每個核酸編碼NOXE，所述DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第三位置處被導(dǎo)入，該第三位置不同于其中已插入包含編碼ALS的核酸的DNA亞構(gòu)建體的第一位置和其中已插入包含編碼ALD的核酸的DNA亞構(gòu)建體的第二位置。在一些實施方式中，所述特定重組酵母的所需的降低的丙酮酸脫羧酶活性可以通過在至少一個酵母pdc基因中插入至少一個DNA亞構(gòu)建體(i)至(iii)、或者其組合。包含一個具有式(II)的DNA構(gòu)建體的重組酵母：(II)5'-[ALS]2-[ALD]2-3’和5'-[NOXE]3-3’，包含具有上述式(II)的DNA構(gòu)建體的重組酵母具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，并且具有在其中已插入以下兩種DNA亞構(gòu)建體(A)和(B)的基因組，即：(A)第一DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]2-[ALD]2-3'，所述第一DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第一位置處被導(dǎo)入，且所述第一DNA亞構(gòu)建體包含：(i)兩個彼此相同或不同的核酸，每個核酸編碼ALS；和(ii)兩個彼此相同或不同的核酸，每個核酸編碼ALD；以及(B)第二DNA亞構(gòu)建體5'-[NOXE]3-3'，所述DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母基因組中的第二位置處被導(dǎo)入，該第二位置不同于其中已插入第一DNA亞構(gòu)建體的第一位置，所述第二DNA亞構(gòu)建體包含(iii)三個彼此相同或不同的核酸，每個核酸編碼NOXE。在某些實施方式中，所述特定重組酵母的所需的降低的丙酮酸脫羧酶活性可以通過在至少一個酵母pdc基因中插入第一DNA亞構(gòu)建體和/或第二DNA亞構(gòu)建體獲得。包含一個具有式(III)的DNA構(gòu)建體的重組酵母：(III)5'-[ALS]2-[ALD]2-[NOXE]3-3’，包含具有上述式(III)的DNA構(gòu)建體的重組酵母具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，并且具有在其中已插入位于所述重組酵母基因組的期望位置處的一個DNA構(gòu)建體的基因組，所述DNA構(gòu)建體包含：(i)兩個彼此相同或不同的核酸，每個核酸編碼ALS；(ii)兩個彼此相同或不同的核酸，每個核酸編碼ALD；和(iii)三個彼此相同或不同的核酸，每個核酸編碼NOXE。在某些實施方式中，所述特定重組酵母的所需的降低的丙酮酸脫羧酶活性可以通過在至少一個酵母pdc基因中插入所述DNA構(gòu)建體獲得。對于根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的上述三個示例性實施方式中的每一者，如上所述，當“x1”至“x3”各自獨立地表示具有2或大于2的值的整數(shù)時，則：-單個DNA構(gòu)建體內(nèi)的ALS的一個拷貝可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的ALS的另一個拷貝相同，或者可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的ALS的所有其他拷貝相同，或者所述ALS的一個拷貝可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的ALS的每個其他拷貝不同。-單個DNA構(gòu)建體內(nèi)的ALD的一個拷貝可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的ALD的另一個拷貝相同，或者可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的ALD的所有其他拷貝相同，或者所述ALD的一個拷貝可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的ALD的每個其他拷貝不同。-單個DNA構(gòu)建體內(nèi)的NOXE的一個拷貝可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的NOXE的另一個拷貝相同，或者可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的NOXE的所有其他拷貝相同，或者所述NOXE的一個拷貝可以與所述DNA構(gòu)建體中包含的NOXE的每個其他拷貝不同。包含一個具有式(III)的DNA構(gòu)建體和一個具有式(I)的DNA構(gòu)建體的重組酵母：(III)5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3’，和(I)5'-[ALS]0-3’和5'-[ALD]0-3’和5'-[NOXE]12-3’，得到的重組酵母具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，并且具有在其中已插入以下兩種DNA亞構(gòu)建體(A)和(B)的基因組，即：(A)第一DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'，所述第一DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第一位置處被導(dǎo)入，并且所述第一DNA亞構(gòu)建體包含：(i)一個編碼ALS的核酸；(ii)一個編碼ALD的核酸；和(iii)一個編碼NOXE的核酸；以及(B)第二DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]0-3’和5'-[ALD]0-3’和5'-[NOXE]12-3’，所述第二DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第二位置處被導(dǎo)入，并且所述第二DNA亞構(gòu)建體包含：(i)十二個編碼NOXE的核酸。包含兩個具有式(III)的DNA構(gòu)建體和一個具有式(I)的DNA構(gòu)建體的重組酵母：(III-1)5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'，(III-2)5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'，(I)5'-[ALS]0-3’和5'-[ALD]0-3’和5'-[NOXE]12-3’，得到的重組酵母具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，并且具有在其中已插入以下三種DNA亞構(gòu)建體(A)、(B)和(C)的基因組，即：(A)第一DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'，所述第一DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第一位置處被導(dǎo)入，并且所述第一DNA亞構(gòu)建體包含：(i)一個編碼ALS的核酸；(ii)一個編碼ALD的核酸；和(iii)一個編碼NOXE的核酸；(B)第二DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'，所述第二DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第二位置處被導(dǎo)入，并且所述第二DNA亞構(gòu)建體包含：(i)一個編碼ALS的核酸；(ii)一個編碼ALD的核酸；和(iii)一個編碼NOXE的核酸；以及(C)第三DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]0-3’和5'-[ALD]0-3’和5'-[NOXE]12-3’，所述第三DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第三位置處被導(dǎo)入，并且所述第三DNA亞構(gòu)建體包含：(i)十二個編碼NOXE的核酸。包含兩個具有式(II)的DNA構(gòu)建體和一個具有式(I)的DNA構(gòu)建體的重組酵母：(II-1)5'-[ALS]1-[ALD]1-3’和5'-[NOXE]0-3’，(II-2)5'-[ALS]1-[ALD]1-3’和5'-[NOXE]0-3’，(I)5'-[ALS]0-3’和5'-[ALD]0-3’和5'-[NOXE]12-3’，得到的重組酵母具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，并且具有在其中已插入以下三種DNA亞構(gòu)建體(A)、(B)和(C)的基因組，即：(A)第一DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]1-[ALD]1-3’和5'-[NOXE]0-3’，所述第一DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第一位置處被導(dǎo)入，并且所述第一DNA亞構(gòu)建體包含：(i)一個編碼ALS的核酸；和(ii)一個編碼ALD的核酸；(B)第二DNA亞構(gòu)建體5'-[ALS]1-[ALD]1-3’和5'-[NOXE]0-3’，所述第二DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第二位置處被導(dǎo)入，并且所述第二DNA亞構(gòu)建體包含：(i)一個編碼ALS的核酸；和(ii)一個編碼ALD的核酸；和以及(C)第三DNA亞構(gòu)建體5'-[NOXE]12-3’，所述DNA亞構(gòu)建體在所述重組酵母的基因組中的第三位置處被導(dǎo)入，該第三位置不同于其中已插入第一DNA亞構(gòu)建體的第一位置，并且所述第三DNA亞構(gòu)建體包含(iii)十二個彼此相同或不同的核酸，每個核酸編碼NOXE。在某些實施方式中，所述特定重組酵母的所需的降低的丙酮酸脫羧酶活性可以通過在至少一種酵母pdc基因中插入第一DNA亞構(gòu)建體和/或第二DNA亞構(gòu)建體獲得。根據(jù)某些具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少一個、優(yōu)選地至少兩個具有上述式(II)的DNA構(gòu)建體，其中“Gene3”意為編碼NADH氧化酶的核酸(或NOXE)。根據(jù)這些具體實施方式，Gene1和Gene2中的每種核酸必然意為選自包含ALS和ALD的組的核酸。在這些實施方式中，存在插入的ALS和ALD的至少一個拷貝。在其中僅一個具有式(II)的構(gòu)建體插入酵母基因組中的實施方式中，則Gene1和Gene2中的每種核酸必然意為選自包含ALS和ALD的組的核酸并且存在ALS和ALD中的每一者的一個拷貝。在其中兩個或更多個具有式(II)的構(gòu)建體的組插入酵母基因組中的實施方式中，則Gene1和Gene2中的每種核酸必然意為選自包含ALS和ALD的組的核酸并且在兩個或更多個具有式(II)的DNA構(gòu)建體的所述組中存在ALS和ALD中的每一者的至少一個拷貝。此外，當根據(jù)本發(fā)明的所述重組酵母包含至少兩個具有上式(II)的DNA構(gòu)建體時，則具有上述式(II)的所述DNA構(gòu)建體可以相同或不同。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少一個、優(yōu)選至少兩個相同或不同的具有式(IIa)的DNA構(gòu)建體，其中每個式(IIa)具有下式：(IIa)5'-[(prom5)y1-Gene1-term5]x5-[prom1-Gene1-term1]x1-[prom2-Gene2-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-Gene3-(term3)z2]x3-3'其中：-Gene1、Gene2和Gene3，“x1”、“x2”和“x3”如上定義的那樣；-“x5”表示等于0或1的整數(shù)；-“y1”、“y2”、“z1”和“z2”各自獨立地表示等于0或1的整數(shù)；-當所述重組酵母包含至少兩個式(IIa)的DNA構(gòu)建體時，則“x1”、“x2”、“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”可以相同或不同；-“prom1”是控制編碼gene1的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom2”是控制編碼gene2的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom3”是控制編碼gene3的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom5”是控制Gene1表達的調(diào)控序列，所述prom5與prom1相同或不同；-“term1”是終止編碼gene1的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term2”是終止編碼gene2的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term3”是終止編碼gene3的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；以及-“term5”是終止Gene1表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述term5與term1相同或不同。為了使特征“x5”和“y1”更加清晰，下文給出了例子以更詳細地說明相關(guān)的具體實施方式：·當“x5”是等于1的整數(shù)且“y1”表示等于0的整數(shù)時，則意味著所考慮的Gene1處于已插入所考慮的DNA構(gòu)建體的重組酵母的基因的啟動子的控制下；或者·當“x5”是等于1的整數(shù)且“y1”表示等于1的整數(shù)時，則意味著所考慮的Gene1處于啟動子“prom5”的控制下。關(guān)于這點，插入DNA構(gòu)建體的內(nèi)源基因、優(yōu)選pdc基因的啟動子的序列及其相關(guān)編碼區(qū)的序列被去除或至少被中斷。此外，特別地關(guān)于特征“y2”和“z2”，下文給出了例子以更詳細地說明相關(guān)的具體實施方式(當然，在下文的這些例子中，“x3”表示等于1或更大的整數(shù))：·當“y2”是等于0的整數(shù)時，則意味著所考慮的Gene3處于已插入所考慮的DNA構(gòu)建體的重組酵母的基因的啟動子的控制下；或者·當“y2”是等于1的整數(shù)時，則意味著所考慮的Gene3處于啟動子“prom3”的控制下。關(guān)于這點，插入DNA構(gòu)建體的內(nèi)源基因的啟動子的序列及其相關(guān)編碼區(qū)的序列被去除或至少被干擾?！ぎ敗皕2”是等于0的整數(shù)時，則意味著所考慮的Gene3連接到已插入所考慮的DNA構(gòu)建體的重組酵母的基因的轉(zhuǎn)錄終止子；或者·當“z2”是等于1的整數(shù)時，則意味著所考慮的Gene3連接到轉(zhuǎn)錄終止子“term3”。關(guān)于這點，插入DNA構(gòu)建體的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄終止子的序列及其相關(guān)編碼區(qū)的序列被去除或至少被干擾。關(guān)于“z1”，當其存在于本說明書中描述的式子中時，上述提到的“z2”加以必要的變更后應(yīng)用。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少一個、優(yōu)選至少兩個具有下式(IIb)的DNA構(gòu)建體：(IIb)5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3'其中：-ALS、ALD、NOXE，“x1”、“x2”、“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”如上定義的那樣；-當所述重組酵母包含至少兩個式(IIb)的DNA構(gòu)建體時，則“x1”、“x2”、“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”可以相同或不同；-“prom1”是控制編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom2”是控制編碼乙酰乳酸脫羧酶的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom3”是控制編碼NADH氧化酶的序列的表達的調(diào)控序列；-“prom5”是控制編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的調(diào)控序列，所述prom5與prom1相同或不同；-“term1”是終止編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term2”是終止編碼乙酰乳酸脫羧酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；-“term3”是終止編碼NADH氧化酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列；以及-“term5”是終止編碼乙酰乳酸合酶的序列的表達的轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述term5與term1相同或不同。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少兩個具有式(II)、式(IIa)或式(IIb)的DNA構(gòu)建體，前提是NOXE核酸的所有拷貝位于所述至少兩個具有式(II)、式(IIa)或式(IIb)的DNA構(gòu)建體中的一個DNA構(gòu)建體上。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含至少兩個、優(yōu)選嚴格兩個具有下式(IIc)和式(IId)的DNA構(gòu)建體：(IIc)5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3'；以及(IId)5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3’和5’-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3'；其中：-ALS、ALD、NOXE，“prom1”、“prom2”、“prom3”、“prom5”、“term1”、“term2”、“term3”、“term5”，“x1”、“x2”、“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”如上定義的那樣；以及-式(IIc)和式(IId)中的每一者的“x1”至“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”相同或不同；以及-“x6”和“x7”表示0至50、優(yōu)選0至20、優(yōu)選0至12、更特別地2至5、優(yōu)選3至4、且更好地等于3的整數(shù)，前提是“x6”和“x7”中的一者表示0。有利地，具有式(I)至(III)的DNA構(gòu)建體的5'-中的第一gene1優(yōu)選是由編碼ALS的核酸表示的基因，更具體地，所述第一gene1處于已插入所考慮的DNA構(gòu)建體的重組酵母的基因的啟動子的控制下。更具體地，對于具有式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IId)的DNA構(gòu)建體，“x5”有利地表示等于1的整數(shù)且“y1”表示等于0的整數(shù)?？紤]到根據(jù)本發(fā)明的上述DNA構(gòu)建體和DNA亞構(gòu)建體的復(fù)雜性，強調(diào)的是：·關(guān)于本發(fā)明的一種DNA構(gòu)建體，當“x1”、“x2”和/或“x3”表示大于或等于2的整數(shù)時，則：oGene1、Gene2和/或Gene3中相關(guān)核酸的每個拷貝可以相同或不同；和/或oGene1、Gene2和/或Gene3中相關(guān)核酸的每個拷貝的啟動子和/或終止子可以相同或不同；·當重組酵母包含至少兩個DNA構(gòu)建體時，所述至少兩個DNA構(gòu)建體在以下方面可以相同或不同：(i)它們的通式，因為DNA構(gòu)建體可以以選自包括式(I)至(III)的組的式子為特征；(ii)“x1”至“x3”和“x5”至“x7”、“y1”、“y2”、“z1”和/或“z2”的值；(iii)關(guān)于同一基因的啟動子的性質(zhì)；(iv)關(guān)于同一基因的終止子的性質(zhì)；和/或(v)相同基因本身的性質(zhì)，因為ALS、ALD和NOXE可衍生自屬于不同屬的生物體，如下文的表1特別地示出。用于實現(xiàn)如上定義的DNA構(gòu)建體的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以有利地參考Shao等(NucleicAcidsResearch，2009，第37卷，第2期：e16)和Shao等(MethodsinEnzymology，2012ElsevierInc.，第517卷：203)描述的方法，最終僅有微小的變異，并且在下文的實施例中更具體地展開。降低的丙酮酸脫羧酶活性酵母中的內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶活性將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛，然后通過乙酸酯將其轉(zhuǎn)化為乙醇或乙酰-CoA。如前所述，本發(fā)明涉及具有降低的丙酮酸脫羧酶活性的重組酵母，該重組酵母的基因組中已插入特定的DNA構(gòu)建體。根據(jù)一個具體實施方式，重組酵母的特征在于可以關(guān)閉一種或多種內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶編碼基因的事實。根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的丙酮酸脫羧酶活性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法降低。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的丙酮酸脫羧酶活性可以例如通過以下來降低：(i)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在所述至少一種編碼丙酮酸脫羧酶的基因中插入至少一個外源DNA構(gòu)建體，來破壞至少一種編碼丙酮酸脫羧酶的基因；(ii)減少丙酮酸脫羧酶轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)中的突變；(iii)起始密碼子中的突變，特別是通過用GUG替換AUG；(iv)改變活性的編碼序列中的突變；(v)改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的編碼序列中的突變、插入或缺失；和(vi)改變丙酮酸脫羧酶mRNA半衰期的突變。關(guān)于第一選擇(i)，實施用于破壞所考慮的pdc基因的DNA構(gòu)建體可以是不同于如前所述的根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的外源DNA構(gòu)建體、根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體、或其組合。此外，如上所述，根據(jù)本發(fā)明的式(I)和(II)的DNA構(gòu)建體各自由兩個或更多個DNA亞構(gòu)建體組成。因此，根據(jù)具體的實施變型，通過在所述基因中插入至少一種根據(jù)本發(fā)明的式(I)和(II)的DNA構(gòu)建體的至少一個DNA亞構(gòu)建體，破壞至少一種編碼丙酮酸脫羧酶的基因，可以減少根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的丙酮酸脫羧酶活性。優(yōu)選地，內(nèi)源性丙酮酸脫羧酶活性可以通過破壞至少一種pdc基因而降低。實際上，酵母可以具有一種或多種編碼丙酮酸脫羧酶的基因。例如，在乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)中有一種編碼丙酮酸脫羧酶的基因，而在釀酒酵母中有三種由PDC1、PCD5和PDC6基因以及丙酮酸脫羧酶調(diào)節(jié)基因PDC2編碼的丙酮酸脫羧酶同功酶。優(yōu)選地，如下文所定義，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以是重組酵母(Saccharomyces)屬，優(yōu)選重組釀酒酵母種。在這方面，根據(jù)第一變型，丙酮酸脫羧酶活性可以通過破壞至少一種pdc基因，優(yōu)選至少兩種pdc基因，更特別是僅兩種pdc基因而降低。此外，被破壞的pdc基因可以選自由pdc1、pdc5、pdc6及其混合物組成的組，優(yōu)選由pdc1和pdc6組成的組。優(yōu)選地，當重組酵母屬于酵母屬時，丙酮酸脫羧酶活性可以通過破壞至少兩種pdc基因而降低，該至少兩種pdc基因優(yōu)選選自由pdc1、pdc5、pdc6及其組合組成的組，更具體地選自由pdc1和pdc6組成的組。實際上，對酵母屬、優(yōu)選釀酒酵母種中的三種pdc基因的干擾顯著地降低了菌株生長，使其不與任何工業(yè)應(yīng)用相容。根據(jù)特定的變型，在酵母屬、優(yōu)選釀酒酵母種中，僅pdc1和pdc6基因被破壞，且pdc5的表達被減弱。用于減弱特定基因表達所實施的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以有利地參考本領(lǐng)域熟知的任何方法。有利地，為了減弱pdc5的表達，pdc5的轉(zhuǎn)錄可以置于弱啟動子的控制下，例如特別是RPLA1、URA3、MET25、HIS3、TRP1、GAP1、NUP57或TFC1，優(yōu)選RPLA1(＝序列SEQIDN°37)。用于測量丙酮酸脫羧酶的活性水平實施的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以有利地參考Wang等(Biochemistry，2001，40：1755-1763)描述的方法。乙酰乳酸合酶乙酰乳酸合酶(ALS)(也稱為乙酰羥酸合酶(acetohydroxyacidsynthase)(AHAS)、α-乙酰羥酸合成酶、α-乙酰羥酸合酶、α-乙酰乳酸合酶、α-乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸合酶(acetohydroxyacidsynthase)、乙酰乳酸丙酮酸-裂合酶(羧化)、乙酰乳酸合成酶)是催化支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)合成中的第一步的蛋白質(zhì)。ALS是特異性參與涉及將兩個丙酮酸分子轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸分子和二氧化碳的化學(xué)反應(yīng)的酶。該反應(yīng)使用焦磷酸硫胺素以連接兩個丙酮酸分子。實施以測量乙酰乳酸合酶的活性水平的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以有利地參考Poulsen等(Eur.J.Biochem.185，1989：433-439)描述的方法。本發(fā)明中優(yōu)選的乙酰乳酸合酶以EC編號2.2.1.6已知。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，編碼乙酰乳酸合酶或ALS的核酸可以是優(yōu)選選自包含枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、煙草(Nicotianatabacum)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)及其混合物、并且優(yōu)選包含煙草和多粘類芽孢桿菌的組的核酸。根據(jù)又一優(yōu)選的實施方式，編碼乙酰乳酸合酶或ALS的核酸可以是選自由與核酸序列SEQIDNO:1、3和5具有至少65％、優(yōu)選至少80％核酸同一性的序列組成的組的核酸。如本文所述，與參考核酸序列具有至少65％核苷酸同一性的核酸序列包括與所述參考核酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的核苷酸同一性的核酸序列。如本文所述，與參考核酸序列具有至少80％核苷酸同一性的核酸序列包括與所述參考核酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的核苷酸同一性的核酸序列。根據(jù)另一個具體實施方式，編碼乙酰乳酸合酶的核酸可以是編碼選自由與序列SEQIDNO:2、5和6具有至少65％、優(yōu)選至少80％同一性的序列組成的組的氨基酸序列的核酸。如本文所述，與參考氨基酸序列具有至少65％氨基酸同一性的氨基酸序列包括與所述參考氨基酸序列具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的氨基酸同一性的氨基酸序列。如本文所述，與參考氨基酸序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列包括與所述參考氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的氨基酸同一性的氨基酸序列。如上所述，本發(fā)明中ALS的表達水平由至少一個啟動子和至少一個終止子調(diào)控，如下文更詳細定義的，其分別存在于編碼ALS的核酸序列的5’位和3’位。乙酰乳酸脫羧酶乙酰乳酸脫羧酶(ALD)(也稱為α-乙酰乳酸脫羧酶、(S)-2-羥基-2-甲基-3-氧-丁酸羧基裂解酶、(S)-2-羥基-2-甲基-3-氧-丁酸羧基裂解酶[(R)-2-乙偶姻形成]或(S)-2-羥基-2-甲基-3-氧-丁酸羧基裂合酶[(3R)-3-羥基-2-丁酮形成])屬于裂解酶家族，更確切地屬于羧基裂解酶家族，其裂解碳-碳鍵并參與丁酸酯代謝和c5-支化二元酸代謝。ALD是特異性參與涉及將α-乙酰乳酸分子轉(zhuǎn)化為乙偶姻(acetoine)分子和二氧化碳的化學(xué)反應(yīng)的酶。實施以測量乙酰乳酸脫羧酶的活性水平的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以有利地參考Dulieu等(EnzymeandMicrobialTechnology25，1999：537-542)描述的方法。本發(fā)明中優(yōu)選的乙酰乳酸脫羧酶以EC編號4.1.1.5已知。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，編碼乙酰乳酸脫羧酶或ALD的核酸可以是選自包含短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)及其混合物的組、并且優(yōu)選包含短芽孢桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌的組的核酸。根據(jù)又一優(yōu)選的實施方式，編碼乙酰乳酸脫羧酶或ALD的核酸可以是選自由與核酸序列SEQIDNO:7、9和11具有至少36％、優(yōu)選至少80％核酸同一性的序列組成的組的核酸。如本文所述，與參考核酸序列具有至少36％核苷酸同一性的核酸序列包括與所述參考核酸序列具有至少37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的核苷酸同一性的核酸序列。根據(jù)另一個具體實施方式，編碼乙酰乳酸脫羧酶的核酸可以是編碼選自由與序列SEQIDNO:8、10和12具有至少36％、優(yōu)選至少80％同一性的序列組成的組的氨基酸序列的核酸。如本文所述，與參考氨基酸序列具有至少36％氨基酸同一性的氨基酸序列包括與所述參考氨基酸序列具有至少37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的氨基酸同一性的氨基酸序列。如上所述，本發(fā)明中ALD的表達水平由至少一個啟動子和至少一個終止子調(diào)控，如下文更詳細定義的，其分別存在于編碼ALD的核酸序列的5’和3’位。NADH氧化酶至少一種pdc基因的失活或活性降低使酵母中的乙醇發(fā)酵途徑失活或降低。因此，這誘導(dǎo)了不平衡的氧化還原狀態(tài)，其不被ALS和ALD的表達所緩解。實際上，從葡萄糖到2個丙酮酸的途徑產(chǎn)生2個NADH等價物，而2個丙酮酸到乙偶姻的轉(zhuǎn)化并未將NADH再生為NAD+(參見圖1)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在特定表達水平下形成細菌水的NADH氧化酶(在本說明書中也稱為NOXE氧化酶或NOXE)不僅能夠平衡氧化還原狀態(tài)(其能夠提高該菌株的穩(wěn)定性)，而且能夠增強該菌株的生長并進一步改善乙偶姻的產(chǎn)量。形成細菌水的NADH氧化酶是催化以下反應(yīng)的酶：2NADH+1/2O2→2NAD++H2O在本發(fā)明中優(yōu)選的形成水的NADH氧化酶以EC編號1.6.3.1和1.6.99.3已知(也稱為NAD(P)H氧化酶(H(2)O(2)形成)、雙氧化酶、NAD(P)H氧化酶、ThOX、THOX2、甲狀腺NADPH氧化酶、甲狀腺氧化酶、甲狀腺氧化酶2(EC1.6.3.1)和NADH脫氫酶、β-NADH二核苷酸脫氫酶、細胞色素c還原酶、硫辛酰胺脫氫酶、二氫輔脫氫酶I脫氫酶、二氫煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、二磷酸膽堿酯酶、DPNH硫辛酰胺脫氫酶、NADH硫辛酰胺脫氫酶、NADH氫化酶、NADH氧化還原酶、NADH-甲萘醌氧化還原酶、NADH：細胞色素c氧化還原酶、還原二磷酸吡啶核苷酸硫辛酰胺脫氫酶、1型脫氫酶、I型脫氫酶(EC1.6.99.3))?？梢栽诒景l(fā)明中考慮的形成水的NADH氧化酶特別地描述在WO2006/134277中。實施以測量根據(jù)本發(fā)明的NADH氧化酶的活性水平的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以有利地參考LopezDEFELIPE等(InternationalDailyJournal，2001，第11卷：37-44(ISSN0958-6946))描述的方法。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，編碼NADH氧化酶或NOXE的核酸可以是選自包含肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、乳酸乳球菌、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)及其混合物的組、并且優(yōu)選包含肺炎鏈球菌的組的核酸。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，編碼NADH氧化酶或NOXE的核酸可以是選自由與核酸序列SEQIDNO:21、23、25和27具有至少78％、優(yōu)選至少80％核酸同一性的序列組成的組的核酸。如本文所述，與參考核酸序列具有至少78％核苷酸同一性的核酸序列包括與所述參考核酸序列具有至少79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的核苷酸同一性的核酸序列。根據(jù)另一個具體實施方式，編碼NADH氧化酶的核酸可以是編碼選自由與序列SEQIDNO:22、24、26和28具有至少78％、優(yōu)選至少80％同一性的序列組成的組的氨基酸序列的核酸。如本文所述，與參考氨基酸序列具有至少78％氨基酸同一性的氨基酸序列包括與所述參考氨基酸序列具有至少79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的氨基酸同一性的氨基酸序列。如上所述，本發(fā)明中NADH氧化酶的表達水平通過至少一個啟動子和至少一個終止子調(diào)控，如下文更詳細的定義的，其分別存在于編碼NADH氧化酶的核酸序列的5’位和3’位。另外，上述有利的技術(shù)效果與所述NADH氧化酶的表達水平相關(guān)。實際上，并且如其從后面的實施例中顯現(xiàn)的，不僅只存在NADH氧化酶是重要的，而且NADH氧化酶表達的水平對于乙偶姻生產(chǎn)也極為重要。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母具有降低的丙酮酸脫羧酶活性，并且在該重組酵母的基因組中已特別插入編碼NADH氧化酶或NOXE的核酸的一個或多個拷貝。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以特別包含編碼NADH氧化酶的核酸的1至20個拷貝。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以包含編碼NADH氧化酶的核酸的1至12個、特別是2至5個、優(yōu)選3至4個、更好地等于3個的拷貝。根據(jù)一個具體實施方式，可以將包含至少一個NOXE基因的式(I)至(III)的DNA構(gòu)建體插入所述重組酵母的內(nèi)源URA3基因中。鑒于上述，編碼乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脫羧酶和NADH氧化酶的每種核酸處于啟動子和終止子的控制下，以避免不需要的調(diào)控，特別是如下文所定義的。啟動子出于顯而易見的原因，編碼乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脫羧酶和NADH氧化酶的每種核酸處于相同或不同的啟動子的控制下。所述允許給定基因的組成型過表達的相同或不同的啟動子可以在文獻(velculescu等，(1997)Cell88，243-251)中找到。在本發(fā)明中更特別令人感興趣的啟動子可以選自包含以下的組：·來自編碼醇脫氫酶的基因的pADH1(ADH1基因＝序列SEQIDN°32)，·來自編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因的pTDH3(TDH3基因＝序列SEQIDN°39)，·來自編碼翻譯延長因子EF-1α的基因的pTEF2.K1(TEF2基因＝序列SEQIDN°30)，·來自編碼甘油酸磷酸變位酶的基因的pGPM1(GPM1基因＝序列SEQIDN°33)，·來自編碼丙酮酸脫羧酶的基因的pPDC1(PDC1基因＝序列SEQIDN°35)，·來自編碼烯醇酶II的基因的pENO2(ENO2基因＝序列SEQIDN°29)，·來自編碼翻譯延長因子eEF1B的γ亞基的基因的pTEF3(TEF3基因＝序列SEQIDN°31)，·來自編碼果糖-1,6-二磷酸醛縮酶II的基因的pFBA1(FBA1基因＝序列SEQIDN°34)，·來自編碼3-磷酸甘油酸激酶的基因的pPGK1(PGK1基因＝序列SEQIDN°36)，·來自編碼丙酮酸激酶的基因的pPYK1(PYK1基因＝序列SEQIDN°49)，·來自編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的pTPI1(TPI1基因＝序列SEQIDN°50)，或·來自編碼翻譯延長因子EF-1α的基因的pTEF1(TEF1基因＝序列SEQIDN°38)。此外，來自其他密切相關(guān)的酵母(來自酵母屬的其他酵母或來自其他屬，如假絲酵母屬(Candida)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母屬(Kluveromyces)的酵母)的同源啟動子也可以用作啟動子。也可以使用如在Blazeck&Alper(2013)Biotechnol.J.846-58中描述的合成啟動子。更具體地，所述相同或不同的啟動子可以優(yōu)選地特征在于選自由與核酸序列SEQIDNO:29至39、49和50具有至少80％核酸同一性的序列組成的組的核酸序列。根據(jù)一個具體實施方式，編碼乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脫羧酶和NADH氧化酶的每種核酸處于相同或不同的轉(zhuǎn)錄終止子的控制下，所述轉(zhuǎn)錄終止子的特征在于選自由與核酸序列SEQIDNO:40至48具有至少80％核酸同一性的序列組成的組的核酸序列。終止子由于顯而易見的原因，編碼乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脫羧酶和NADH氧化酶的每種核酸與相同或不同的轉(zhuǎn)錄終止子(其在本文中也可以稱為“終止子”)連接。所述相同或不同的轉(zhuǎn)錄終止子可以在文獻(Yamanishi等，(2013)ACSsynthesisbiology2，337-347)中找到。在本發(fā)明中更特別令人感興趣的終止子可以選自包含以下的組：·來自編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的tTPI1(TPI1基因＝序列SEQIDN°44)，·來自編碼O-乙酰高絲氨酸-O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶的基因的tMET25(Met25基因＝序列SEQIDN°45)，·來自編碼醇脫氫酶的基因的tADH1(ADH1基因＝序列SEQIDN°43)，·來自編碼烯醇酶II的基因的tENO2(ENO2基因＝序列SEQIDN°46)，·來自編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶、同工酶2的基因的tTDH2(TDH2基因＝序列SEQIDN°40)，·來自編碼3-磷酸甘油酸激酶的基因的tPGK1(PGK1基因＝序列SEQIDN°48)，·tCYC1(＝序列SEQIDN°41)，·tMET3(＝序列SEQIDN°47)，和·tTDH3(＝序列SEQIDN°42)，和·tDIT1(＝序列SEQIDN°43)。更特別地，所述相同或不同的終止子可優(yōu)選地特征在于選自由與序列SEQIDNO:32至40和43具有至少80％的同一性的序列組成的組的核酸序列。重組酵母通常，酵母可以快速生長，并且相比細菌可以以更高的密度培養(yǎng)，并且在工業(yè)環(huán)境中不需要無菌環(huán)境。此外，與細菌細胞相比，酵母細胞可以更容易地從培養(yǎng)基中分離，大大簡化了產(chǎn)物提取和純化的工藝。優(yōu)選地，本發(fā)明的酵母可選自屬：酵母屬、假絲酵母屬、阿舒囊霉屬(Ashbya)、德克酵母屬(Dekkera)、畢赤酵母屬(漢遜酵母屬(Hansenula))、德巴利氏酵母屬、棒孢酵母屬(Clavispora)、洛德酵母屬(Lodderomyces)、耶羅威亞酵母屬(Yarrowia)、接合酵母屬(Zigosaccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、克魯維酵母屬、酒香酵母屬(Brettanomycces)、隱球菌屬(Cryptococcus)或馬拉色氏菌屬(Malassezia)。更優(yōu)選地，所述酵母可以是酵母屬、德克酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、有孢圓酵母屬、接合酵母屬或酒香酵母屬的克拉布特里陽性酵母。更優(yōu)選地，所述酵母可以是來自物種：釀酒酵母、布拉氏酵母(Saccharomycesboulardii)、道氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、貝酵母(Saccharomycesbayanus)或拜耳接合酵母(Zigosaccharomycesbailii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、布魯塞爾德克酵母(Dekkerabrucelensis)、間型德克酵母(Dekkeraintermedia)、卡斯酒香酵母(Brettanomyccescustersii)、間型酒香酵母(Brettanomyccesintermedius)、耐熱克魯維酵母(Kluyveromycesthemotolerens)、球有孢圓酵母(Torulasporaglobosa)、光滑有孢圓酵母(Torulasporaglabrata)。更優(yōu)選地，重組酵母可以屬于酵母屬，并且優(yōu)選屬于釀酒酵母種。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母具有丙酮酸脫羧酶活性，其通過插入至少一個選自包含式(I)至(III)的組的DNA構(gòu)建體而降低，優(yōu)選插入僅包含至少一個編碼ALS和/或ALD的核酸的所述DNA構(gòu)建體的至少一個而降低。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，重組酵母可以是重組釀酒酵母且丙酮酸脫羧酶活性通過僅兩種pdc基因的破壞而降低。更優(yōu)選地，所述被破壞的pdc基因可以選自由pdc1、pdc5、pdc6及其混合物組成、優(yōu)選由pdc1和pdc6組成的組。實施以將特定DNA構(gòu)建體插入基因、更特別地丙酮酸脫羧酶基因中的方法屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識。在下文實施例中更詳細地描述了相關(guān)的方法。最優(yōu)選的實施方式有利地，編碼在本發(fā)明中實施的酶的核酸有利地選自ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.L1、ALD.Ea、NOXE.spn、NOXE.L1及其混合物。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的特征可在于其屬于酵母屬，特別是釀酒酵母種，其中通過破壞至少兩種pdc基因，特別是通過破壞pdc1和pdc6基因來降低內(nèi)源丙酮酸脫羧酶活性，其中：-通過插入具有下式(IIe)的DNA構(gòu)建體，pdc基因之一、優(yōu)選pdc1基因被破壞：5'-[(prom5)y1-ALS.Bs-term5]x5-[prom1-ALS.Bs-term1]x1-[prom2-ALD.L1-(term2)z1]x2-3'(IIe)，以及-通過插入具有下式(IIf’)的DNA構(gòu)建體，不同于上述被破壞的pdc基因的至少另一種pdc基因，優(yōu)選pdc6基因被破壞：5'-[(prom5)y1-ALS.Pp-term5]x5-[prom1-ALS.Pp-term1]x1-[prom2-ALD.Ea-(term2)z1]x2-3'(IIf’)并且，其中具有下式(IIf”)的DNA構(gòu)建體被插入URA3基因中：5'-[(prom3)y2-NOXE.L1-(term3)z2]x3-3'(IIf”)，其中：-prom1、prom2、prom3、prom5、term1、term2、term3、term5、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”如上所定義的那樣，且ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.Ll、ALD.Ea和NOXE.L1如下文表1中所定義的那樣，-“x1”、“x2”和“x3”中的每一者各自獨立地表示0至50、優(yōu)選0至20、優(yōu)選0至10、更特別是0至3、特別是等于1的整數(shù)；-“x3”表示0至50、優(yōu)選0至20、優(yōu)選0至12、更特別是2至5、優(yōu)選3至4、更優(yōu)選等于3的整數(shù)，前提是所述重組酵母包含編碼ALS、ALD和NOXE中的每一者的至少一種核酸，更特別地，前提是式(IIe)和(IIf’)的各個DNA構(gòu)建體各自包含編碼ALS和ALD中的每一者的的至少一種核酸。鑒于上述并且盡管隱含地公開，但是在式(IIe)和(IIf’)的每者之間規(guī)定：-“x1”至“x3”、“x5”、“y1”、“y2”、“z1”和“z2”；和/或-所考慮的基因的核酸的每個拷貝的啟動子和/或終止子可以相同或不同。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母特征可在于其屬于酵母屬，特別是釀酒酵母種，其中通過破壞至少兩種pdc基因，特別是通過破壞pdc1和pdc6基因來降低內(nèi)源丙酮酸脫羧酶活性，其中：-通過插入具有下式(IIg)的DNA構(gòu)建體，pdc基因之一、優(yōu)選pdc1基因被破壞：5’-[ALS.Bs-tTDH2]1-[pENO2-ALD.Ll-tCYC1]1-3’(IIg)，-通過插入具有下式(IIh’)的DNA構(gòu)建體，不同于上述被破壞的pdc基因的至少另一種pdc基因，優(yōu)選pdc6基因被破壞：5’-[pADH1-ALS.Pp-tDPI1]1-[pTDH3-ALD.Ea-tMET25]1-3’a(IIh’)并且，其中具有下式(IIh”)的DNA構(gòu)建體被插入URA3基因中：5’-[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1]12-3’(IIh”)其中：-具有式(IIg)的DNA構(gòu)建體的“ALS.Bs”基因處于其中插入有所述具有式(IIg)的DNA構(gòu)建體的pdc基因的啟動子的控制下，-pENO2、pADH1、pTDH3、tTDH2、tCYC1、tDPI1、tMET25和tPGK1如本說明書中所定義的那樣，更特別是在下文序列表中，-ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.L1、ALD.Ea和NOXE.L1如下文表1中所定義的那樣且更特別是在下文序列表中。根據(jù)具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母可以進一步被修飾以優(yōu)化乙偶姻生產(chǎn)。使用替代糖源：直接使用替代糖源、如淀粉進一步需要在酵母中過表達外源α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(buscke等，biosourcetechnology2013)。糖輸入-改進C5糖輸入通過重組微生物輸入戊糖是工業(yè)工藝的主要問題，因為C5糖是水解的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的主要成分。釀酒酵母的天然菌株與許多其它類型的酵母一樣，不能利用木糖或阿拉伯糖作為發(fā)酵底物(Hahn-Hagerdal等，2007；Jin等，2004)。有趣的是，盡管木糖不是天然底物，但釀酒酵母卻能夠攝取木糖(Hamacher等，2002)。釀酒酵母GAL2、HXT1、HXT2、HXT4、HXT5和HXT7催化木糖的攝取，因為它們具有寬的底物特異性(Hamacher等，2002；Saloheimo等，2007；Sedlak&Ho2004)。然而，這些釀酒酵母對木糖的親和力遠低于對葡萄糖的親和力，并且通過轉(zhuǎn)運蛋白攝取木糖被葡萄糖強烈抑制(Saloheimo等，2007)。需要一些改變以獲得能夠生長并消耗木糖和/或阿拉伯糖的菌株。這些不同的修飾是本發(fā)明的一部分。異源木糖轉(zhuǎn)運蛋白的過表達為了改善木糖和阿拉伯糖的攝取，必須修飾重組乙偶姻生產(chǎn)菌株以表達編碼木糖或阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白的異源基因。例如，分別來自間型假絲酵母(Candidaintermedia)、樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的基因GXF1、SUT1和AT5g59250被過表達以改善酵母對木糖的利用(Runquist等，2010)。參與木糖和阿拉伯糖代謝的途徑的過表達酵母菌株能夠攝取木糖，盡管該糖不是天然底物。盡管木糖同化的基因存在于釀酒酵母中，但它們不能以足夠?qū)崿F(xiàn)顯著的糖同化的水平表達。因此，遺傳修飾對于改善戊糖的同化是必要的。能夠?qū)⒛咎腔虬⒗寝D(zhuǎn)化為木糖醇的所有酶以及將木糖醇轉(zhuǎn)化成木酮糖且將木酮糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸的酶都需要增強?；蛘?，來自木糖和阿拉伯糖途徑的同源基因必須過表達或來自細菌的異源基因必須過表達。在本發(fā)明的一個實施方式中，木糖攝取及其通過菌株的同化通過過表達以下基因而被改善，例如：1)分別編碼樹干畢赤酵母和釀酒酵母的醛縮酶還原酶的基因XYL1或GRE3，與編碼來自樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶的XYL2的過表達相關(guān)聯(lián)，與分別編碼來自釀酒酵母和樹干畢赤酵母的木酮糖激酶的基因XKS1或XYL3的過表達相結(jié)合，2)編碼來自細菌或瘤胃壺菌屬(Piromyces)菌的木糖異構(gòu)酶的基因xylA與分別編碼來自釀酒酵母和樹干畢赤酵母的木酮糖激酶的基因XKS1或XYL3的過表達相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，阿拉伯糖攝取及其通過菌株的同化被改善，通過過表達例如：1)分別編碼樹干畢赤酵母和釀酒酵母的醛縮酶還原酶的同源基因XYL1或GRE3，與編碼L-阿拉伯糖醇4-氫化酶的lad1和編碼來自里氏木霉(Trichodermareesei)的L-木酮糖還原酶的Ixr1相關(guān)聯(lián)，與編碼來自樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶的XYL2的過表達以及分別編碼來自釀酒酵母和樹干畢赤酵母的木酮糖激酶的基因XKS1或XYL3的過表達相結(jié)合，2)編碼細菌阿拉伯糖異構(gòu)酶和核酮糖激酶的異源基因araA和araB。優(yōu)化戊糖磷酸途徑這可以通過過表達至少一種屬于非氧化戊糖磷酸途徑的基因來實現(xiàn)：來自酵母菌株的TALI、TKL1、RKL1和RPE1。通過參與C5-糖代謝的酶優(yōu)化所必需的NAPDH輔因子的可用性。這通過在酵母菌株中表達大腸桿菌的轉(zhuǎn)氫酶來實現(xiàn)。來自大腸桿菌的基因udhA和/或pntAB將在生產(chǎn)菌株中過表達。預(yù)防朝向甘油合成的葡萄糖消耗：這可以通過破壞編碼甘油-3-磷酸脫氫酶EC1.1.1.8(GPDH)的GPD1基因來完成。根據(jù)本實施方式，本發(fā)明特別是在乙偶姻的產(chǎn)量方面是令人感興趣的，盡管GPD1基因的破壞導(dǎo)致去除有利于NAD的消耗NADH的酶的活性。為了平衡由此產(chǎn)生的氧化還原不平衡，GPD1破壞的菌株可能需要額外的NOXE表達。根據(jù)具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組菌株為：其不包含具有減少葡萄糖阻遏作用的任何遺傳修飾，如在WO2011/041426或Kim等(BioresourceTechnology，第146卷，2013:274)中所述。根據(jù)具體實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組菌株為：其不包含允許表達任何木糖同化途徑的任何遺傳修飾，如在Kim等(JournalofBiotechnology,2014)所述。培養(yǎng)條件本發(fā)明還涉及如上所定義的重組酵母用于生產(chǎn)乙偶姻和/或其衍生物、特別是甲基乙烯基酮(MVK)的用途。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)乙偶姻的方法，包括以下步驟：-提供如前所述的重組微生物，在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組微生物，和-回收乙偶姻。通常，本發(fā)明的微生物在約20℃至約37℃的溫度下、優(yōu)選在27℃至34℃的溫度下，在合適的培養(yǎng)基中生長。當根據(jù)本發(fā)明的重組酵母屬于釀酒酵母種時，溫度可以有利地在27℃至34℃的范圍內(nèi)，在合適的培養(yǎng)基中。用于酵母的合適的生長培養(yǎng)基是常見的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，例如包括酵母氮源、硫酸銨和作為碳源/能源的葡萄糖的肉湯或YPD培養(yǎng)基，其為用于大多數(shù)生長的最佳比例的蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的混合物。也可以使用其他定義的或合成的生長培養(yǎng)基，微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道用于特定微生物生長的適當培養(yǎng)基。術(shù)語“適當培養(yǎng)基”如上文所定義。用于根據(jù)本發(fā)明的重組酵母的已知培養(yǎng)基的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在以下出版物D.Burke等，MethodsinyeastGenetics-AcoldspringharborlaboratorycourseManual(2000)中給出。用于發(fā)酵的合適的pH范圍可以在pH3.0至pH7.5之間，其中優(yōu)選pH4.5至pH6.5作為初始條件。發(fā)酵可以在需氧條件或微需氧條件下進行。發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)物的量可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法測定，例如高效液相色譜(HPLC)或氣相色譜(GC)。本發(fā)明工藝可以采用分批發(fā)酵方法。經(jīng)典的分批發(fā)酵是封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵開始時設(shè)定，并且在發(fā)酵期間不經(jīng)歷人為改變。因此，在發(fā)酵開始時，用期望的一種或多種生物體接種培養(yǎng)基，并且允許在不向系統(tǒng)添加任何物質(zhì)的情況下發(fā)生發(fā)酵。然而，通常，“分批”發(fā)酵是關(guān)于添加碳源的分批，并且通常在控制例如溫度、pH和氧濃度的因素方面進行嘗試。在分批系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝物和生物質(zhì)組成持續(xù)變化直到停止發(fā)酵的時間。在分批培養(yǎng)中，細胞通過靜態(tài)滯后期進入高生長對數(shù)期，最后到達生長速率減弱或停止的穩(wěn)定期。如果不進行處理，穩(wěn)定期中的細胞將最終死亡。對數(shù)期的細胞通常負責(zé)終產(chǎn)物或中間體的大量生產(chǎn)。補料分批系統(tǒng)也可以用于本發(fā)明中。補料分批系統(tǒng)類似于典型的分批系統(tǒng)，除了碳源底物隨著發(fā)酵進行以增量添加。當分解代謝物阻遏(例如葡萄糖阻遏)易于抑制細胞的代謝并且期望在培養(yǎng)基中具有有限量的底物時，補料分批系統(tǒng)是有用的。補料分批系統(tǒng)中實際底物濃度的測量是困難的，因此基于可測量因素(如pH、溶解氧和廢氣(如CO2)的分壓)的變化來估計。發(fā)酵是本領(lǐng)域中常見的和熟知的，可以在Sunderland等(1992)中找到例子，其通過引用并入本文。盡管本發(fā)明以分批模式進行，但預(yù)期該方法也適用于連續(xù)發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中將定義的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)添加到生物反應(yīng)器中，并同時除去等量的條件培養(yǎng)基以向前進行。連續(xù)發(fā)酵通常將培養(yǎng)物維持在恒定的高密度，在該高密度時細胞主要處于對數(shù)期生長。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)影響細胞生長或終產(chǎn)物濃度的一個因素或任何數(shù)量的因素。例如，一種方法將限制性營養(yǎng)物(如碳源或氮)的水平維持在固定速率，并允許所有其它參數(shù)變化。在其他系統(tǒng)中，許多影響生長的因素可以連續(xù)改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)致力于保持穩(wěn)態(tài)生長條件，因此由于被排出的培養(yǎng)基引起的細胞損失必須與發(fā)酵中的細胞生長速率平衡。調(diào)節(jié)用于連續(xù)發(fā)酵工藝的營養(yǎng)物和生長因子的方法以及用于使產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中是熟知的。預(yù)期本發(fā)明可以使用分批、補料分批或連續(xù)工藝來實施，并且任何已知的發(fā)酵模式將是合適的。另外，預(yù)期細胞可以作為全細胞催化劑固定在底物上并經(jīng)受用于生產(chǎn)的發(fā)酵條件。為了仍然改善乙偶姻生產(chǎn)，一個具體的實施方式可以包括在合適的培養(yǎng)基(例如上述培養(yǎng)基)中培養(yǎng)重組酵母細胞，其中所述培養(yǎng)基包含最佳量的碳源、特別是葡萄糖。優(yōu)選地，在整個培養(yǎng)期間的僅一部分時間中，細胞在這樣的最佳培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些實施方式中，在培養(yǎng)開始后10小時或更久，在所述最佳培養(yǎng)基中孵育酵母細胞，其包括在培養(yǎng)開始后11、12、13、14、15或16小時或更久。優(yōu)選地，在培養(yǎng)開始后5小時至15小時的時間段中、包括6小時至10小時、例如8小時的時間段中，細胞在這樣的最佳培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在優(yōu)選的實施方式中，包含在所述最佳培養(yǎng)基中的碳源由葡萄糖組成。在優(yōu)選的實施方式中，所述最佳培養(yǎng)基包含12％w/w(重量/重量)或更多的葡萄糖、包括15％w/w或更多的葡萄糖。在優(yōu)選的實施方式中，所述最佳培養(yǎng)基包含至多40％w/w的葡萄糖、其包括至多35％w/w的葡萄糖。因此，在上述優(yōu)選實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)乙偶姻的方法可以在步驟(a)和(c)之間進一步包括中間步驟(b)，其包括在所述最佳培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞。乙偶姻的純化根據(jù)本發(fā)明的具體方面，乙偶姻的發(fā)酵生產(chǎn)包括從培養(yǎng)基中分離乙偶姻的步驟。從培養(yǎng)基中回收乙偶姻是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)任務(wù)。它可以通過本領(lǐng)域熟知的許多技術(shù)來實現(xiàn)，包括但不限于蒸餾、氣提、全蒸發(fā)或液體萃取。本領(lǐng)域的專家知道如何根據(jù)待分離的材料的特性來調(diào)整每種技術(shù)的參數(shù)。本發(fā)明中作為微生物模型的酵母已被保留，因為合成的乙偶姻完全輸出到細胞外，從而簡化了純化過程。合成的乙偶姻可以通過蒸餾收集。蒸餾可以涉及不同于培養(yǎng)基的任選組分，以便通過形成共沸物(特別是與水)來促進乙偶姻的分離。該任選組分是有機溶劑，例如環(huán)己烷、戊烷、丁醇、苯、甲苯、三氯乙烯、辛烷、二乙醚或其混合物。使用選自氦氣、氬氣、二氧化碳、氫氣、氮氣或其混合物的汽提氣體實現(xiàn)汽提。用有機溶劑，例如戊烷、己烷、庚烷、十二烷作為疏水相進行液體萃取。從本說明書中描述的重組酵母細胞產(chǎn)生的乙偶姻出發(fā)，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法獲得包括甲基乙烯基酮的乙偶姻衍生物。在整個說明書(包括權(quán)利要求書)中，除非另有說明，否則表述“包括一”應(yīng)當理解為與“包括至少一”同義。此外，根據(jù)所考慮的上下文并且除非相反的指示，否則表述“式(I)至(III)”是指式(I)、(II)和(III)，而且指式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf’)、(IIf”)、(IIg)、(IIh’)和/或(IIh”)的DNA構(gòu)建體。除非另有說明，否則術(shù)語“在...與...之間”和“范圍從...至...”應(yīng)理解為包括極限值。隨后的實施例和附圖以說明的方式給出，而不是對本發(fā)明的內(nèi)在限制。實施例a)用于制備根據(jù)本發(fā)明的重組釀酒酵母菌株的方案所有下文實施的重組釀酒酵母菌株都是使用標準酵母分子遺傳學(xué)方法(MethodsinyeastGenetics-AcoldspringharbourlaboratorycoursecourseManual(2000)，D.Burke，D.Dawson，T.StearnsCSHLPress)從標準菌株W303(Thomas和Rothstein(1989)，Cell.56，619-630)構(gòu)建的。在這些菌株中，丙酮酸脫羧酶的活性通過破壞至少一種pdc基因(pdc1、pdc5、pdc6)或通過用弱啟動子置換其同源轉(zhuǎn)錄啟動子而降低。在最有效的菌株中，只有pdc1和pdc6被刪除。在所考慮的重組釀酒酵母菌株中表達多種外源性酶。根據(jù)其可獲得的米氏方程酶促參數(shù)選擇它們(參見下表1)。高kcat表示高效率，多種Km用于覆蓋底物的不同濃度。選擇多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)酶是因為該生物是天然的2,3-丁二醇(直接來源于乙偶姻的產(chǎn)物)的生產(chǎn)者。因此，它具有有效催化乙偶姻合成的酶。所實施的外源酶乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脫羧酶和形成水的NADH氧化酶有關(guān)的基因命名顯示在下文的表1中。這些基因由酶的首字母縮寫、隨后是來源生物體的首字母縮寫指定，如下：表1此外，為了更好地理解以下基因型：-ade2、his3、leu2、trp1和ura3是營養(yǎng)缺陷型標記基因。-小寫字母表示所考慮的基因無活性，大寫字母反映活性基因。-“::”：在基因名稱之后，意味著該基因被隨后的基因干擾(如果插入多于一個基因，則它們在括號[]中標記)。基因的干擾伴隨編碼序列的完全缺失，但保留啟動子。因此，跟有“::”的基因是無活性的且以小寫字母表示。如果沒有指定，則被插入的基因的轉(zhuǎn)錄由被破壞的基因的啟動子控制。-“基因.K1”意為該基因來自乳酸克魯維酵母。-允許給定基因的組成型過表達的轉(zhuǎn)錄啟動子見于文獻(velculescu等(1997)Cell88,243-251)中。本文使用的啟動子由“p”及隨后它們的同源基因名稱命名。它們各自的序列號也在下文中提及。-轉(zhuǎn)錄終止子也置于每個基因之后。為了避免不想要的調(diào)控啟動子和終止子框架，一個插入的基因不是來自相同的原始基因。本文使用的終止子用“t”及隨后它們的同源基因名稱命名。它們各自的序列號也在下文中提及。使用酵母能夠有效重組具有序列同源性的游離DNA末端的能力，將上述基因的群整合在重組酵母中。根據(jù)本領(lǐng)域人員可得的公開方法獲得重組酵母。值得注意的是，可以遵循Shao等(NucleicAcidsResearch,2009,第37卷,第2期:e16)和Shao等(MethodsinEnzymology,2012ElsevierInc.,第517卷:203)描述的方法，最終只有微小變異。更具體地，待克隆的編碼序列是人工合成的。對于異源序列(非酵母)，修飾核酸序列以便使用酵母密碼子選擇獲得同義編碼序列。使用限制酶和經(jīng)典克隆技術(shù)，將每個合成序列克隆在轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之間。每個啟動子序列的前面是與上游基因的終止子序列同源的50至200個核苷酸序列。類似地，每個基因(包含啟動子-編碼序列-終止子的基因)的終止子之后是與緊接著的基因同源的序列。因此，待整合的每個單元具有與上游單元和下游單元兩者均重疊的50至200個核苷酸。對于第一單元，啟動子前面是與其將整合的基因座的酵母染色體核苷酸同源的50-200個核苷酸。類似地，對于最后一個單元，終止子之后是與其將整合的基因座的酵母染色體核苷酸同源的50-200個核苷酸。然后從質(zhì)粒構(gòu)建體PCR擴增每個單元，產(chǎn)生具有重疊序列的線性DNA的X單位。該基因之一是營養(yǎng)缺陷型標記，以便選擇重組結(jié)果。所有線性片段一次在酵母中轉(zhuǎn)化，并且選擇出與所用標記相關(guān)的營養(yǎng)缺陷型的重組酵母。然后通過PCR和測序驗證序列的完整性。b)關(guān)于ALS酶和ALD酶不單獨評估ALS酶和ALD酶，而是通過乙偶姻的產(chǎn)量成對(ALS+ALD)評估。根據(jù)其動力學(xué)參數(shù)選擇三種外源ALD和ALS：ALS.Nt、ALS.Pp、ALS.Bs和ALD.Bb、ALD.L1、ALD.Ea(參見上文)。將ALS和ALD的九種可能組合中的八種聯(lián)合插入在啟動子后面的ura3-酵母菌株的染色體上，隨后是一個終止子。這兩個基因的插入破壞了pdc1基因。同時插入URA3標記基因以選擇轉(zhuǎn)化體。ALS/ALD的組合插入菌株YA747中，即具有以下基因型的W303衍生物：YA747:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::HIS5.Sp,pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3構(gòu)建了以下菌株：YA768:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3注意：在這種情況下基因“ALS.Bs”處于pdc1的天然啟動子、即啟動子pPDC1的控制下。YA769:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3YA770:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3YA771:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1,pTDH3-ALD.Bb-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3YA772:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1,pTDH3-ALD.Ll-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3YA773:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1,pTDH3-ALD.Ll-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3YA810:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTPI1,pTDH3-ALD.Bb-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3YA811:MAT-a,ade2,bdh1::TRP1.Kl,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1,pTDH3-ALD.Bb-tMET25,URA3.Kl],pdc6::LEU2.Kl,trp1,ura3所有這些菌株在8％葡萄糖YPA(酵母提取物1％、細菌蛋白胨2％、腺嘌呤0.1mM、葡萄糖8％)中生長24小時。收獲它們，根據(jù)標準方法測定乙偶姻和乙醇含量，該標準方法的具體說明源自Gonzalesetal等(2010)，AppliedandenvironmentalMicrobiology76670-679。對于一些菌株，測定若干克隆，“-”后的最后一個數(shù)是克隆數(shù)。注意，當內(nèi)源性bdh酶被破壞時，不產(chǎn)生2,3-BDO。按照標準方法及Gonzales等(2010)，AppliedandenvironmentalMicrobiology76670-679監(jiān)測乙醇和乙偶姻的生產(chǎn)。結(jié)果下文的表2顯示了上述測試菌株的乙偶姻產(chǎn)量。表2菌株乙醇(g/l)乙偶姻(g/l)ALSALDYA747-832.20.2YA772-631.40.6NtLlYA772-1029.51.2NtLlYA773-331.80.2PpLlYA810-132.30.2BsBbYA768-431.11.0BsEaYA768-731.02.1BsEaYA770-625.54.85PpEaYA770-1221.86.7PpEaYA811-419.86PpBbYA811-521.155.75PpBbYA771-520.65.5NtBbYA769-122.256.05NtEaYA769-825.654.4NtEa從這些結(jié)果單獨考慮，可以得出結(jié)論，增強乙偶姻生產(chǎn)的最佳酶是ALSPp、ALSNt、ALDEa和ALDBb，其確實表現(xiàn)為最有效的酶。c)NOXE酶對乙偶姻產(chǎn)量的有利的技術(shù)效果已經(jīng)制備了依照YA1609的重組酵母。YA1609:MAT-a,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2-pENO2-ALD.Ll-tCYC1,HIS5.Sp],pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,LEU2.Kl],trp1,ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1,URA3]x12YA1609-1、YA1609-2和YA1609-4是來自該菌株YA1609的不同克隆。注意到這些重組酵母總是具有其天然的內(nèi)源性BHH活性。然后在與上述相同的條件下測定這些菌株在16％葡萄糖YPA(酵母提取物1％、細菌蛋白胨2％、腺嘌呤0.1mM、葡萄糖8％)中的乙偶姻生產(chǎn)。按照標準方法及Gonzales等(2010)，AppliedandenvironmentalMicrobiology76670-679監(jiān)測乙醇和乙偶姻的生產(chǎn)。結(jié)果結(jié)果報告于下文表3。表3這些結(jié)果表明，NOXE的存在導(dǎo)致乙偶姻的非常顯著的積累。YA1609-4現(xiàn)在在與上述相同的培養(yǎng)基中實施。然而，該測定通過以下參數(shù)而不同：環(huán)境：0.5lYPA，16％葡萄糖在細胞培養(yǎng)開始后16小時，將細胞在包含終濃度為16％w/w葡萄糖的培養(yǎng)基中孵育8小時的時間段。攪拌：800rpm(2pales)，1.9ms-1溫度：30℃氣體：0.15L/min(0.3vvm)然后測定細胞的乙偶姻生產(chǎn)。按照標準方法及Gonzales等(2010)，AppliedandenvironmentalMicrobiology76670-679監(jiān)測乙醇和乙偶姻的生產(chǎn)。結(jié)果結(jié)果報告于下文的表4。表4這些結(jié)果表明所考慮的培養(yǎng)參數(shù)也可以影響乙偶姻生產(chǎn)。d)生產(chǎn)乙偶姻的重組酵母的其它實施例已經(jīng)制備了其它重組酵母，其在下文中描述。YA1573-4:MAT-a,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2,pENO2-ALD.Ll-tCYC1,HIS5.Sp],pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1-BDH.Sc-tENO2],trp1,ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1,URA3]x12YA1609-4:MAT-a,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2,pENO2-ALD.Ll-tCYC1,HIS5.Sp],pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,LEU2.Kl],trp1,ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1,URA3]x12YA1661-2:MAT-a,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2,pENO2-ALD.Ll-tCYC1,HIS5.Sp],pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pENO2-NOXE.Spn-tPGK1],trp1,ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1,URA3]x12。注意到這些重組酵母總是具有其天然的內(nèi)源性BHH活性。然后在與上述相同的條件下測定這些菌株在16％葡萄糖YPA(酵母提取物1％、細菌蛋白胨2％、腺嘌呤0.1mM、葡萄糖8％)中的乙偶姻生產(chǎn)。按照標準方法及Gonzales等(2010)，AppliedandenvironmentalMicrobiology76670-679監(jiān)測乙醇和乙偶姻的生產(chǎn)。結(jié)果結(jié)果報告于下文表5。表5表5的這些結(jié)果表明，與用編碼NOXE的單一核酸轉(zhuǎn)化的重組酵母相比，在重組酵母中存在多種編碼NOXE的核酸導(dǎo)致乙偶姻的積累增加。e)防止乙偶姻向2,3-BDO逃逸在以下內(nèi)源bdh1、bdh2、adh1、adh3和/或adh4基因中的至少一個基因可以是失活的。在一些菌株中，營養(yǎng)缺陷型標記物被重新引入以使它們成為原養(yǎng)型。它們均具有與YA1660相同的啟動子和終止子：YA1660-2,YA1660-3,YA1660-4和YA1711-16C:MAT-a,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2,pENO2-ALD.Ll-tCYC1,HIS5.Sp],pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pENO2-NOXE.Spn-tPGK1,LEU2.Kl],trp1,ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1,URA3]x12。YA1711-45c:Mat-α,,his3,leu2,pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2,pENO2-ALD.Ll-tCYC1,HIS5.Sp],pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pENO2-NOXE.Spn-tPGK1,LEU2.Kl],trp1,ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1,URA3]x12YA1711-13A,YA1711-16B:Mat-a,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl],trp1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12YA1711-19A和YA1711-46A:Mat-α,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl],trp1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12YA1822-1和YA1822-2:Mat-α,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl],trp1::TRP1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12YA1870-10A:Mat-a,adh3::TRP1.Kl,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl],trp1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12YA1870-11B:Mat-α,adh3::TRP1.Kl,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl],trp1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12YA1870-10B:Mat-α,adh1::TRP1.Kl,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl],trp1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12YA1870-11A:Mat-α,adh1::TRP1.Kl,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl],trp1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12YA1870-2A和YA1870-3D:Mat-a,adh1::TRP1.Kl,adh3::TRP1.Kl,bdh1::LEU2.Kl,bdh2::HIS5.Sp,his3,leu2,pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp-loxP],pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl-loxP],trp1,ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12所有上述菌株以及YA1609-4和YA1661-2以及這些菌株的二倍體組合應(yīng)當被認為是具有改善的乙偶姻產(chǎn)量的菌株。f)顯示防止乙偶姻向2,3-BDO逃逸的其它實施例菌株YA1711-19A已在3升發(fā)酵器中在2％酵母提取物、10％蔗糖中生長0至24小時，然后緩慢加入600g葡萄糖(30g/l，20小時)。將全部由其中已經(jīng)引入外源性ALS、ALD和NOXE的菌株組成的以下菌株，在500ml錐形瓶中、在30℃及2％酵母提取物和30％蔗糖中孵育并振蕩24小時和48小時：序列表SEQIDN°1(＝ADNALS.Bs)ATGTCTACCAAAGCAACAAAAGAGCAAAAGAGCCTTGTGAAGAATAGAGGTGCAGAACTTGTCGTTGATTGCTTGGTAGAACAGGGAGTCACTCACGTTTTCGGGATACCCGGCGCTAAAATCGACGCCGTGTTTGACGCTTTACAGGATAAGGGACCAGAGATCATTGTTGCTAGACATGAACAGAATGCAGCGTTCATGGCTCAAGCTGTAGGTAGACTTACTGGGAAACCCGGTGTGGTTTTGGTTACTAGTGGACCAGGTGCATCAAATCTAGCAACAGGTTTGTTAACAGCGAATACAGAGGGAGATCCTGTTGTTGCATTAGCAGGAAACGTTATCAGAGCGGATAGACTGAAAAGAACCCATCAATCATTGGATAATGCTGCATTATTTCAGCCAATTACGAAATATTCCGTCGAAGTACAGGATGTGAAGAACATACCTGAAGCTGTAACTAATGCGTTTCGTATAGCTTCTGCTGGTCAAGCTGGTGCAGCTTTTGTTTCGTTTCCGCAAGACGTTGTCAACGAGGTTACGAACACTAAGAATGTGAGAGCAGTAGCAGCCCCAAAATTAGGACCAGCTGCTGATGATGCTATATCAGCTGCTATTGCTAAGATTCAGACAGCCAAACTACCTGTTGTCTTAGTAGGTATGAAAGGTGGCAGGCCAGAAGCAATCAAGGCAGTTAGAAAACTGTTGAAGAAGGTTCAATTGCCGTTTGTGGAAACCTATCAAGCCGCAGGGACTTTGTCTAGGGATCTAGAAGATCAATACTTCGGTAGAATAGGGTTGTTCAGAAATCAACCTGGCGACTTGTTACTGGAACAAGCCGATGTCGTGCTTACAATTGGTTACGATCCGATTGAATATGACCCCAAATTTTGGAATATTAATGGTGATAGGACTATTATCCACTTAGACGAGATTATTGCCGATATTGACCATGCTTATCAACCTGATCTGGAACTGATAGGTGATATTCCAAGTACTATCAACCATATAGAGCATGATGCCGTCAAAGTGGAATTTGCCGAAAGAGAACAGAAGATCCTATCCGATCTAAAGCAGTACATGCATGAAGGCGAACAAGTTCCAGCAGATTGGAAATCCGATAGAGCACATCCATTGGAAATTGTCAAAGAATTGAGAAATGCAGTTGATGACCATGTTACAGTTACTTGTGACATAGGTAGTCACGCTATTTGGATGTCTAGGTACTTCAGATCTTATGAGCCATTAACGTTGATGATATCCAATGGCATGCAAACCCTTGGAGTCGCTTTACCATGGGCCATTGGTGCGTCGTTAGTAAAGCCAGGAGAGAAAGTCGTTTCTGTGTCAGGTGATGGTGGTTTCTTGTTCTCTGCCATGGAATTGGAAACCGCCGTTCGTTTGAAAGCCCCTATAGTACACATCGTGTGGAATGATTCGACCTATGACATGGTCGCGTTTCAACAATTGAAGAAGTACAACCGTACTTCAGCTGTTGATTTCGGCAACATTGACATTGTGAAGTACGCGGAAAGCTTTGGCGCCACAGGCCTAAGAGTCGAATCACCTGATCAATTAGCAGATGTACTTAGGCAAGGGATGAACGCTGAAGGACCTGTAATTATCGACGTACCTGTTGACTATAGCGACAACATCAATTTAGCCAGTGATAAATTACCCAAAGAGTTTGGTGAGCTAATGAAAACGAAAGCTTTGTAASEQIDN°2(＝氨基酸ALS.Bs)MSTKATKEQKSLVKNRGAELVVDCLVEQGVTHVFGIPGAKIDAVFDALQDKGPEIIVARHEQNAAFMAQAVGRLTGKPGVVLVTSGPGASNLATGLLTANTEGDPVVALAGNVIRADRLKRTHQSLDNAALFQPITKYSVEVQDVKNIPEAVTNAFRIASAGQAGAAFVSFPQDVVNEVTNTKNVRAVAAPKLGPAADDAISAAIAKIQTAKLPVVLVGMKGGRPEAIKAVRKLLKKVQLPFVETYQAAGTLSRDLEDQYFGRIGLFRNQPGDLLLEQADVVLTIGYDPIEYDPKFWNINGDRTIIHLDEIIADIDHAYQPDLELIGDIPSTINHIEHDAVKVEFAEREQKILSDLKQYMHEGEQVPADWKSDRAHPLEIVKELRNAVDDHVTVTCDIGSHAIWMSRYFRSYEPLTLMISNGMQTLGVALPWAIGASLVKPGEKVVSVSGDGGFLFSAMELETAVRLKAPIVHIVWNDSTYDMVAFQQLKKYNRTSAVDFGNIDIVKYAESFGATGLRVESPDQLADVLRQGMNAEGPVIIDVPVDYSDNINLASDKLPKEFGELMKTKALSEQIDN°3(＝ADNALS.Nt)ATGGCTGCTGCTGCAGCTGCTCCATCTCCATCTTTTTCTAAAACCTTGTCCTCCTCCTCTTCCAAATCTTCTACTTTGTTGCCAAGATCTACTTTCCCATTTCCACATCATCCACATAAGACTACTCCACCACCATTGCATTTGACTCCAACTCATATTCACTCCCAAAGAAGAAGATTCACCATCTCCAACGTTATTTCTACCACCCAAAAGGTTTCTGAAACTCAAAAGGCTGAAACCTTCGTTTCTAGATTTGCTCCAGATGAACCTAGAAAGGGTTCTGATGTTTTGGTTGAAGCTTTGGAAAGAGAAGGTGTTACCGATGTTTTTGCTTATCCAGGTGGTGCTTCTATGGAAATTCATCAAGCTTTGACCAGATCCTCCATCATTAGAAATGTTTTGCCAAGACATGAACAAGGTGGTGTTTTCGCTGCTGAAGGTTATGCTAGAGCTACTGGTTTTCCAGGTGTATGTATTGCTACTTCTGGTCCAGGTGCTACTAATTTGGTTTCTGGTTTGGCTGATGCTTTGTTGGATTCTGTTCCAATCGTTGCTATTACTGGTCAAGTTCCAAGAAGAATGATTGGTACAGATGCTTTCCAAGAAACCCCAATTGTCGAAGTTACTAGATCTATTACCAAGCACAACTACTTGGTTATGGACGTTGAAGATATCCCAAGAGTTGTTAGAGAAGCATTTTTCTTGGCTAGATCTGGTAGACCAGGTCCAGTTTTGATTGATGTTCCAAAGGATATCCAACAACAATTGGTTATCCCAGATTGGGACCAACCTATGAGATTGCCAGGTTATATGTCTAGATTGCCAAAGTTGCCAAACGAAATGTTGTTAGAACAAATCGTCAGATTGATCTCCGAATCTAAAAAGCCAGTCTTGTATGTTGGTGGTGGTTGTTCTCAATCTAGTGAAGAATTGAGAAGATTCGTCGAATTGACCGGTATTCCAGTTGCTTCTACATTGATGGGTTTGGGTGCTTTTCCAACTGGTGATGAATTGTCTTTGTCTATGTTGGGTATGCACGGTACTGTTTATGCTAATTACGCTGTTGATTCCTCCGATTTGTTGTTAGCTTTTGGTGTTAGATTCGATGATAGAGTCACTGGTAAGTTGGAAGCTTTTGCTTCTAGAGCTAAGATCGTTCATATCGACATTGATTCCGCTGAAATCGGTAAAAACAAGCAACCACATGTTTCTATTTGCGCCGATATTAAGTTGGCATTGCAAGGTTTGAACAGTATCTTGGAATCCAAAGAAGGTAAATTGAAGTTGGACTTCTCTGCTTGGAGACAAGAATTGACAGTTCAAAAGGTTAAGTACCCATTGAACTTCAAGACTTTCGGTGATGCTATTCCACCACAATACGCTATTCAAGTTTTGGATGAATTGACCAACGGTTCCGCTATTATTTCAACTGGTGTTGGTCAACATCAAATGTGGGCTGCTCAATATTACAAGTACAGAAAACCTAGACAATGGTTGACTTCTGGTGGTTTAGGTGCTATGGGTTTTGGTTTGCCAGCTGCTATTGGTGCTGCTGTTGGTAGACCTGATGAAGTTGTTGTAGATATTGATGGTGACGGTTCCTTCATTATGAACGTCCAAGAATTGGCTACCATCAAGGTTGAAAATTTGCCAGTCAAGATCATGTTATTGAACAATCAACACTTGGGTATGGTCGTCCAATGGGAAGATAGATTTTACAAAGCTAATAGAGCCCACACCTACTTGGGTAATCCATCTAATGAAGCTGAAATCTTCCCAAACATGTTGAAGTTTGCTGAAGCTTGTGGTGTTCCAGCTGCAAGAGTTACTCATAGAGATGATTTGAGAGCTGCCATCCAAAAGATGTTGGATACTCCAGGTCCATACTTGTTGGATGTTATTGTCCCACATCAAGAACATGTCTTGCCAATGATTCCATCTGGTGGTGCCTTTAAAGATGTTATTACTGAAGGTGACGGTAGATCCTCTTACTGASEQIDN°4(＝氨基酸ALS.Nt)MAAAAAAPSPSFSKTLSSSSSKSSTLLPRSTFPFPHHPHKTTPPPLHLTPTHIHSQRRRFTISNVISTTQKVSETQKAETFVSRFAPDEPRKGSDVLVEALEREGVTDVFAYPGGASMEIHQALTRSSIIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGFPGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPIVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVMDVEDIPRVVREAFFLARSGRPGPVLIDVPKDIQQQLVIPDWDQPMRLPGYMSRLPKLPNEMLLEQIVRLISESKKPVLYVGGGCSQSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGAFPTGDELSLSMLGMHGTVYANYAVDSSDLLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADIKLALQGLNSILESKEGKLKLDFSAWRQELTVQKVKYPLNFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGSAIISTGVGQHQMWAAQYYKYRKPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVGRPDEVVVDIDGDGSFIMNVQELATIKVENLPVKIMLLNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPSNEAEIFPNMLKFAEACGVPAARVTHRDDLRAAIQKMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDVITEGDGRSSYSEQIDN°5(＝ADNALS.Pp)ATGTCCGCACAAATACCTGAAGTTAGAAGTACAAATGAATTGAGAGAAAAATGGATGAAGCCTGAAGTAATCACTGGTTCCGAAATATTGTTAAGATCATTGTTATTGGAAGGTGTCGATTGTGTATTTGGTTATCCAGGTGGTGCTGTCTTGTACATCTATGATGCAATGTACGGTTTTAAAGACTTCAAGCATGTTTTAACCAGACACGAACAAGGTGCTATACATGCTGCAGATGGTTATGCCAGAGCTTCCGGTAAAGTAGGTGTTTGCATCGCAACAAGTGGTCCAGGTGCCACCAATTTGGTTACTGGTATCGCAACAGCCTTTATGGATTCTGTTCCTTTGGTTGTCATTACTGGTAACGTCATTTCTTCATTAATCGGTACAGATGCATTCCAAGAAGCCGACATAACTGGTATCACAATGCCAATAACTAAGCACTCATATTTGGTTAGAGATGTCGAAGACTTGCCTAGAATAATCCATGAAGCATTTCACATAGCAAATACAGGTAGAAAGGGTCCAGTTTTGATAGATATCCCTAAAGACATATCCGCCGCTCAAACCTTATTCGTACCACAAACCGGTCCTGTTACTATGAGAGGTTACAACCCAAAGGTTTTGCCTAACAAGATACAATTGGATAAATTGACACAAGCCATCTCCGAAGCTGAAAGACCATTCATTTTGGCAGGTGGTGGTGTAGTTTATAGTGGTGGTCATGAAGCCTTATACGAATTTGTTAGAAAGACTGAAATCCCTATCACTACAACCTTATTGGGTTTAGGTGGTTTCCCATCAGGTCATGAATTGTGGACTGGTATGCCTGGTATGCACGGTACATACACCTCCAATCAAGCAATACAACAATCTGATTTGTTGATCTGTATTGGTGCTAGATTTGATGACAGAGTTACTGGTAAATTGGATGGTTTCGCACCACAAGCCAAAATTGTACATATAGATATCGACCCTGCAGAAATAGGTAAAAATGTTGCAGCCGATATTCCAATAGTAGGTGACGTTAAGGCTGTCTTAGAATTATTGAACCAAGATGTTAAGAGAGCCGATAGAGCTGACGCATGGAGAGCACAAATCCAACATTGGAAGAACGAAAAGCCATATTCCTACAAGGATAGTGAAACAGTTTTGAAACCTCAATGGGTCGTAGAATTATTGGATGAAACTACAAAGGGTGGTGCTATTGTCACCACTGACGTAGGTCAACACCAAATGTGGGCTGCACAATACTACAAGTTTAATCAACCAAGATCATGGGTTACATCAGGTGGTTTAGGTACTATGGGTTTTGGTTTCCCATCTGCTATTGGTGCACAAATGGCCAATCCTGATAGATTGGTTATCTCTATTAACGGTGACGGTGGTATGCAAATGTGTTCACAAGAATTAGCTATTTGCGCTATTAATAACATCCCAGTAAAGATCGTTATCATTAATAACCAAGTTTTGGGTATGGTCAGACAATGGCAAGAATTGATCTATAACAACAGATACTCTCATATTGATTTGGCTGGTTCACCTGACTTTGTCAAATTGGCCGAAGCCTATGGTGTAAAGGGTTTAAGAGCAACCAATAAGGAAGAAGCCAGAAGAGCTTGGCAAGAAGCATTGGATACTCCAGGTCCTGTTGTCGTAGAATTTGTTGTCTCTAAAGAAGAAAACGTTTATCCAATGGTTACACAAGGTTCCACAATAGACCAAATGTTGATGGGTGACGAATGASEQIDN°6(＝氨基酸ALS.Pp)MSAQIPEVRSTNELREKWMKPEVITGSEILLRSLLLEGVDCVFGYPGGAVLYIYDAMYGFKDFKHVLTRHEQGAIHAADGYARASGKVGVCIATSGPGATNLVTGIATAFMDSVPLVVITGNVISSLIGTDAFQEADITGITMPITKHSYLVRDVEDLPRIIHEAFHIANTGRKGPVLIDIPKDISAAQTLFVPQTGPVTMRGYNPKVLPNKIQLDKLTQAISEAERPFILAGGGVVYSGGHEALYEFVRKTEIPITTTLLGLGGFPSGHELWTGMPGMHGTYTSNQAIQQSDLLICIGARFDDRVTGKLDGFAPQAKIVHIDIDPAEIGKNVAADIPIVGDVKAVLELLNQDVKRADRADAWRAQIQHWKNEKPYSYKDSETVLKPQWVVELLDETTKGGAIVTTDVGQHQMWAAQYYKFNQPRSWVTSGGLGTMGFGFPSAIGAQMANPDRLVISINGDGGMQMCSQELAICAINNIPVKIVIINNQVLGMVRQWQELIYNNRYSHIDLAGSPDFVKLAEAYGVKGLRATNKEEARRAWQEALDTPGPVVVEFVVSKEENVYPMVTQGSTIDQMLMGDESEQIDN°7(＝ADNALD.Bb)ATGGGTAAGAAGAACATTATTACCTCTATCACCTCCTTGGCTTTGGTTGCTGGTTTGTCTTTGACTGCTTTTGCTGCTACTACTGCTACTGTTCCAGCTCCACCAGCTAAACAAGAATCTAAACCAGCTGTTGCTGCTAATCCAGCTCCTAAGAATGTTTTGTTCCAATACTCTACCATCAACGCCTTGATGTTGGGTCAATTTGAAGGTGATTTGACCTTGAAGGACTTGAAGTTGAGAGGTGATATGGGTTTGGGTACTATCAATGATTTGGACGGTGAAATGATCCAAATGGGTACTAAGTTCTACCAAATCGATTCTACCGGTAAGTTGTCTGAATTGCCAGAATCTGTTAAGACTCCATTCGCTGTTACTACTCACTTCGAACCTAAAGAAAAGACTACCTTGACCAACGTCCAAGACTACAATCAATTGACCAAGATGTTGGAAGAAAAGTTCGAAAACAAGAACGTTTTCTACGCCGTTAAGTTGACTGGTACTTTCAAAATGGTTAAGGCTAGAACCGTTCCTAAGCAAACTAGACCATATCCACAATTGACTGAAGTCACCAAGAAGCAATCCGAATTTGAATTCAAGAACGTCAAGGGTACTTTGATCGGTTTTTACACTCCAAATTATGCTGCTGCTTTGAACGTTCCAGGTTTTCACTTGCATTTCATTACCGAAGATAAGACCTCTGGTGGTCATGTTTTGAACTTGCAATTTGATAACGCCAACTTGGAAATCTCCCCAATCCATGAATTTGATGTTCAATTGCCACACACCGATGATTTCGCTCATTCTGATTTGACTCAAGTTACTACCTCCCAAGTTCATCAAGCTGAATCTGAAAGAAAGTASEQIDN°8(＝氨基酸ALD.Bb)MGKKNIITSITSLALVAGLSLTAFAATTATVPAPPAKQESKPAVAANPAPKNVLFQYSTINALMLGQFEGDLTLKDLKLRGDMGLGTINDLDGEMIQMGTKFYQIDSTGKLSELPESVKTPFAVTTHFEPKEKTTLTNVQDYNQLTKMLEEKFENKNVFYAVKLTGTFKMVKARTVPKQTRPYPQLTEVTKKQSEFEFKNVKGTLIGFYTPNYAAALNVPGFHLHFITEDKTSGGHVLNLQFDNANLEISPIHEFDVQLPHTDDFAHSDLTQVTTSQVHQAESERKSEQIDN°9(＝ADNALD.Ea)ATGATGATGCACTCCTCCGCCTGCGACTGTGAAGCAAGTTTATGCGAAACATTGAGAGGTTTTTCCGCCAAGCACCCAGATTCCGTTATATATCAAACATCCTTGATGAGTGCTTTGTTATCTGGTGTCTACGAAGGTGACACTACAATCGCAGACTTGTTAGCTCATGGTGACTTTGGTTTGGGTACTTTTAATGAATTAGACGGTGAAATGATCGCATTTTCTTCACAAGTTTACCAATTGAGAGCTGATGGTTCAGCAAGAGCTGCAAAACCAGAACAAAAGACACCTTTTGCAGTCATGACCTGGTTCCAACCACAATACAGAAAAACTTTTGATGCCCCAGTTTCAAGACAACAAATTCACGATGTAATAGACCAACAAATCCCTTCAGATAATTTGTTTTGTGCCTTGAGAATAGACGGTAACTTCAGACATGCTCACACCAGAACTGTTCCAAGACAAACTCCACCTTATAGAGCCATGACAGATGTATTGGATGACCAACCTGTTTTTAGATTCAATCAAAGAGAAGGTGTTTTAGTCGGTTTTAGAACCCCACAACACATGCAAGGTATCAACGTAGCAGGTTATCATGAACACTTCATTACTGATGACAGACAAGGTGGTGGTCATTTGTTAGATTACCAATTGGAATCCGGTGTTTTGACATTCGGTGAAATCCACAAGTTGATGATTGATTTGCCAGCCGACAGTGCTTTCTTACAAGCCAACTTACACCCATCAAACTTAGACGCCGCAATCAGATCAGTAGAAAACTAASEQIDN°10(＝氨基酸ALD.Ea)MMMHSSACDCEASLCETLRGFSAKHPDSVIYQTSLMSALLSGVYEGDTTIADLLAHGDFGLGTFNELDGEMIAFSSQVYQLRADGSARAAKPEQKTPFAVMTWFQPQYRKTFDAPVSRQQIHDVIDQQIPSDNLFCALRIDGNFRHAHTRTVPRQTPPYRAMTDVLDDQPVFRFNQREGVLVGFRTPQHMQGINVAGYHEHFITDDRQGGGHLLDYQLESGVLTFGEIHKLMIDLPADSAFLQANLHPSNLDAAIRSVENSEQIDN°11(＝ADNALD.L1)ATGTCATCGAGAATCTTTCAACACAATACCTTCACAACTTTGAGTAGCGGATTTTACAAAGGCACAATCACGTTGAAAGAAGCCTTAGAACACGGATCAGTTGGCATAGGTACATTAGATACTGCAAATGGTGAAGTTACCATCATCAACGGTATAGCCTATCATGGAGATTCGGAAAACCATGTGAGATTGGTGGAAGAGGATGAAACGATGCCTTATGTCGCTATGGTTGAACATCAACCCATTGCAAAGTTCACTGATTCCTCTGTGTCAAATAGCGAAGATTTCCTATCCGCTTTAACCAAAAGGTTTCCAACCGTTAATACTGCCTACACAATTGTCATGACTGGTCAGTTTAAGGAAGTAACTGTCTCTTCTAAACCAGCGAACAATACTAGACCATATGACGAAATAATGGCTGATCAACCGTACTTTACAAAGGAGAACATTAGTGGTACAATGGTTGGTGTATGGGCTCCTAAACATCTTACTGATCTATTTGGGTTAGGCTTTCACCTTCACTTCGTTTCTGACGATAAGACGTTTACTGCACATGTACAGAATTTCATTACAGAGAATCTGGAAATTGAGATAGGGAAAATTACCAAGATTGACCAAGAATTTCCTGATGATGACGAGAACTTCGACCAACATTTGTTCCAATAASEQIDN°12(＝氨基酸ALD.L1)MSSRIFQHNTFTTLSSGFYKGTITLKEALEHGSVGIGTLDTANGEVTIINGIAYHGDSENHVRLVEEDETMPYVAMVEHQPIAKFTDSSVSNSEDFLSALTKRFPTVNTAYTIVMTGQFKEVTVSSKPANNTRPYDEIMADQPYFTKENISGTMVGVWAPKHLTDLFGLGFHLHFVSDDKTFTAHVQNFITENLEIEIGKITKIDQEFPDDDENFDQHLFQSEQIDN°13(＝ADNNOXE.L1)ATGGGTATTGTCGTAATAGGTACTAACCATGCCGGAATAGCTACAGCAAATACCTTAATCGACCAATATCCAGGACATGAAATTGTTATGATTGACAGAAACTCGAATATGAGTTATCTTGGCTGTGGTACAGCGATTTGGGTTGGGAGACAAATCGAGAAACCTGATGAACTTTTCTATGCAAAAGCAGAAGATTTCGAAAAGAAGGGTGTTAAAATCCTGACCGAGACTGAAGTGTCAGAAATCGACTTTACCAACAAAATGATATATGCCAAAAGCAAGACTGGGGAGAAAATCACGGAATCTTATGATAAGCTAGTATTGGCAACAGGAAGCAGACCAATCATACCCAATTTGCCTGGTAAAGATCTTAAAGGAATTCATTTCTTAAAGTTATTCCAGGAAGGTCAAGCCATTGACGAAGAATTCGCAAAGAATGACGTGAAAAGAATCGCGGTAATTGGTGCTGGTTATATTGGAACAGAGATAGCTGAAGCAGCTAAACGTAGAGGGAAAGAAGTGTTGTTGTTTGATGCTGAAAGTACCTCATTAGCGTCATACTACGACGAAGAATTTGCCAAAGGCATGGATGAAAATTTGGCACAACACGGGATTGAGTTGCACTTTGGTGAACTTGCCCAAGAGTTCAAGGCAAATGAAGAAGGTCATGTCTCCCAGATTGTTACAAACAAATCCACTTATGATGTGGATCTGGTCATCAATTGCATAGGATTTACTGCCAATTCAGCCTTAGCTGGTGAGCATCTAGAAACGTTTAAGAACGGTGCCATAAAGGTTAATAAGCATCAACAATCTAGTGATCCAGACGTGTATGCAGTTGGTGATGTTGCAACTATCTACTCTAACGCTTTGCAAGACTTTACTTACATCGCTTTAGCTAGCAATGCTGTTAGATCAGGCATTGTTGCTGGACACAATATTGGCGGTAAATCCATAGAATCTGTCGGTGTTCAGGGTAGTAACGGCATTTCTATATTCGGATACAATATGACAAGTACTGGTTTATCAGTAAAAGCTGCTAAGAAGATTGGTCTAGAAGTCTCCTTTTCTGATTTTGAAGATAAGCAAAAGGCTTGGTTTCTGCATGAGAACAATGATTCGGTCAAAATAAGGATCGTATACGAAACAAAATCCAGGAGAATA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