本申請(qǐng)要求于2014年8月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/032,911號(hào)的優(yōu)先權(quán)，此處通過(guò)援引將其內(nèi)容整體并入本文。

2.關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開(kāi)發(fā)的聲明

本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)防部授予的DARPA-11-65-Open-BAA-FP-169下由政府支持進(jìn)行的。政府對(duì)本發(fā)明享有一定的權(quán)利。

3.序列表

本申請(qǐng)包含已以ASCII格式電子提交的序列表，此處通過(guò)援引將其整體并入本文。該2015年7月31日創(chuàng)建的ASCII副本名為KNS-001_SL.txt，大小為2,057字節(jié)。

4.

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是在大多數(shù)(如果不是全部)多細(xì)胞生物體中發(fā)現(xiàn)的部分未分化或完全未分化的細(xì)胞。干細(xì)胞能夠通過(guò)有絲細(xì)胞分裂而自我更新并分化成許多種特化的細(xì)胞類型，包括但不限于腦、骨、軟骨、腺體、肌肉、肝臟、皮膚、血管、神經(jīng)和血細(xì)胞。因?yàn)楦杉?xì)胞具有發(fā)育成特定細(xì)胞類型的潛能，并且可以或多或少地?zé)o限增殖或者經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間段的更新，它們?cè)谥委煈?yīng)用的情況下具有特殊的潛能。干細(xì)胞，無(wú)論它們是多能的(pluripotent)還是專能的(multipotent)，都可用于器官修復(fù)和替換、對(duì)包括退行性疾病在內(nèi)各種疾病的細(xì)胞治療、基因治療和新藥物的毒性或期望活性的測(cè)試。

然而，可用于實(shí)驗(yàn)和治療應(yīng)用的干細(xì)胞以及更加分化的細(xì)胞的可用來(lái)源是有限的，通常品質(zhì)較差，不適合用于治療，且是有爭(zhēng)議的。例如，用于人類治療的胚胎干細(xì)胞(ESC)的應(yīng)用被倫理問(wèn)題及來(lái)自胚胎來(lái)源的細(xì)胞可能被患者的免疫系統(tǒng)排斥的風(fēng)險(xiǎn)所阻礙。ESC應(yīng)用的第三個(gè)問(wèn)題是，ESC能夠形成被稱為畸胎瘤的腫瘤。畸胎瘤包括幾種不同的細(xì)胞類型，且常常包括毛發(fā)、牙齒和皮膚。這類腫瘤在技術(shù)上是良性的，但可呈現(xiàn)非常顯著的問(wèn)題。ESC的替代品是誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞或IPSC)。iPS細(xì)胞的產(chǎn)生是通過(guò)將遺傳材料引入到分化的“成體”細(xì)胞的細(xì)胞核中而促使支配胚胎表型的4種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，即c-Myc、Klf4、Sox2和Oct4。Takakashi K.和Yamanaka S.,Cell(2006)126(4):663-76；Takahashi等,Cell(2007)131(5):861-872。常常使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體引入這些基因。用于誘導(dǎo)細(xì)胞變?yōu)閕PS細(xì)胞的載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。這些事件導(dǎo)致細(xì)胞的行為類似于胚胎干細(xì)胞。iPS細(xì)胞也具有以上所確定的潛在問(wèn)題，最值得注意的是免疫排斥，但由于遺傳操縱，其另外還具有分化成各種類型的惡性腫瘤的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)。轉(zhuǎn)基因大部分在iPS細(xì)胞中沉默，但這種轉(zhuǎn)基因的后期再活化是可能的。一個(gè)嚴(yán)重的顧慮的是編碼c-Myc的轉(zhuǎn)基因可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Yamanaka S,Cell(2009)137(1):13-17。

因此，需要避免ESC和iPS細(xì)胞的問(wèn)題的干細(xì)胞。

5.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開(kāi)提供神經(jīng)源性成體多能干細(xì)胞(在本文中被稱為NEDAPS細(xì)胞)，其獲得方法，從其分化的細(xì)胞，以及NEDAPS細(xì)胞和其分化后代的用途。NEDAPS細(xì)胞表達(dá)Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，這是作為胚胎干細(xì)胞和多能干細(xì)胞的標(biāo)志物的四種轉(zhuǎn)錄因子。本文描述的NEDAPS細(xì)胞可以來(lái)源于外周神經(jīng)，并且，不受任何特定操作理論的約束，其看上去是對(duì)轉(zhuǎn)變成NEDAPS細(xì)胞的靜默細(xì)胞群進(jìn)行特定刺激的結(jié)果。這些細(xì)胞能夠分化成如本文所述的多種細(xì)胞類型，其不是胚胎來(lái)源的，不要求將新的遺傳材料操縱或引入NEDAPS細(xì)胞核。這種細(xì)胞可從暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件的受試者或從離體暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件的神經(jīng)安全地獲取。該NEDAPS細(xì)胞可以在體外或離體進(jìn)行培養(yǎng)，在分化或不分化的情況下繁殖，以用于醫(yī)療、獸醫(yī)或工業(yè)應(yīng)用。例如，NEDAPS細(xì)胞可以從受試者中獲取，體外培養(yǎng)和繁殖，然后重新植入需要干細(xì)胞治療的受試者，而沒(méi)有免疫排斥這些自身來(lái)源細(xì)胞的預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)。NEDAPS細(xì)胞可用于組織修復(fù)，或者它們可以在培養(yǎng)物中完全或部分地分化。當(dāng)在完全分化后進(jìn)行植入時(shí)，NEDAPS細(xì)胞的后代可原位發(fā)育成所選擇的組織或器官(例如，肝臟組織)。NEDAPS細(xì)胞或其分化后代的自體移植避開(kāi)了從胚胎獲取ESC的相關(guān)問(wèn)題，并避開(kāi)了與移植供體組織相關(guān)的免疫排斥反應(yīng)。NEDAPS細(xì)胞及其后代的應(yīng)用也有望消除或大大減少移植療法或干細(xì)胞療法中形成畸胎瘤和惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

6.附圖說(shuō)明

圖1A-1N：圖1A顯示了手術(shù)切除的并用蘇木精和伊紅染色的正常小鼠坐骨神經(jīng)(對(duì)照)。圖1B顯示了在暴露于經(jīng)皮注射的BMP2 24小時(shí)后手術(shù)切除的用蘇木精和伊紅染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖。圖1C顯示了在暴露于注射的BMP2 48小時(shí)后用H&E染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的旺盛增殖。圖1D顯示了在暴露于BMP2 24小時(shí)后針對(duì)Oct4染色的小鼠坐骨神經(jīng)。圖1E顯示了在暴露于BMP2 24小時(shí)后針對(duì)nanog染色的小鼠坐骨神經(jīng)。圖1F顯示了在暴露于BMP2 24小時(shí)后針對(duì)Sox2染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)Sox2。圖1G顯示了在暴露于BMP2 24小時(shí)后針對(duì)Klf4染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)Klf4。圖1H顯示了在暴露于BMP2 24小時(shí)后針對(duì)白介素1(一種炎癥標(biāo)志物)而染色的小鼠坐骨神經(jīng)。圖1I顯示了在暴露于BMP2 72小時(shí)后針對(duì)Oct4染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)Oct4。圖1J顯示了在暴露于BMP2 48小時(shí)后針對(duì)Sox2染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)Sox2。圖1K顯示了在暴露于BMP2 72小時(shí)后針對(duì)Sox2染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)Sox2。圖1L顯示了在暴露于BMP2 72小時(shí)后針對(duì)Oct4染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)Oct4。圖1M顯示了在暴露于BMP2 72小時(shí)后針對(duì)c-Myc染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)c-Myc。圖1N顯示了在暴露于BMP2 24小時(shí)后針對(duì)c-Myc染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意細(xì)胞的增殖，其大部分表達(dá)c-Myc。

圖2A-2F：圖2A顯示了來(lái)自未處理的(對(duì)照)小鼠的組織樣本中的針對(duì)Oct4染色的正常小鼠坐骨神經(jīng)。在未經(jīng)刺激的神經(jīng)中Oct4不表達(dá)。圖2B顯示了直接暴露于肌內(nèi)(IM)注射的BMP2 24小時(shí)后針對(duì)Oct4染色的小鼠坐骨神經(jīng)。注意旺盛的細(xì)胞增殖和顯著異常的神經(jīng)。增殖中的細(xì)胞的細(xì)胞核對(duì)此干細(xì)胞標(biāo)志物是密集染色的。圖2C顯示來(lái)自未處理的(對(duì)照)小鼠的組織樣本中的針對(duì)c-Myc染色的正常小鼠坐骨神經(jīng)。在未經(jīng)刺激的神經(jīng)中c-Myc僅有最低限度的表達(dá)。圖2D顯示了在注射BMP2 24小時(shí)后針對(duì)c-Myc染色的小鼠坐骨神經(jīng)和周圍組織的組織切片。注意旺盛的細(xì)胞增殖，及在增殖細(xì)胞中針對(duì)c-Myc的致密核過(guò)氧化物酶染色。FIG 2E顯示來(lái)自未經(jīng)處理的(對(duì)照)小鼠的針對(duì)Klf4染色的正常小鼠坐骨神經(jīng)。未經(jīng)刺激的神經(jīng)顯示出沒(méi)有Klf4的表達(dá)。圖2F顯示了在IM注射BMP2 48小時(shí)后獲取的小鼠腱肌中的針對(duì)Klf4染色的坐骨神經(jīng)斜切片。注意旺盛的細(xì)胞增殖和通過(guò)組織平面的遷移，以及針對(duì)Klf4的陽(yáng)性過(guò)氧化物酶染色。圖2G顯示了在暴露于IM注射的BMP2 72小時(shí)后、在針對(duì)Sox2進(jìn)行免疫染色后的小鼠坐骨神經(jīng)的殘留物。注意神經(jīng)完整性和致密核過(guò)氧化物酶染色的損失。

圖3顯示了使用機(jī)械壓縮產(chǎn)生的、針對(duì)非特異性核染色劑DAPI(左側(cè)圖)、Sox2(左起第二圖)和c-Myc(左起第三圖)而染色的經(jīng)培養(yǎng)的NEDAPS細(xì)胞。右側(cè)圖是DAPI、Sox2和c-Myc圖像的疊加。

圖4顯示了使用機(jī)械壓縮產(chǎn)生的、針對(duì)非特異性核染色劑DAPI(左側(cè)圖)、Sox2(左起第二圖)和Oct4(左起第三圖)而染色的NEDAPS細(xì)胞。右側(cè)圖是DAPI、Sox2和Oct4圖像的疊加。

圖5顯示了使用機(jī)械壓縮產(chǎn)生的、針對(duì)非特異性核染色劑DAPI(左側(cè)圖)、Klf4(左起第二圖)和c-Myc(左起第三圖)而染色的NEDAPS細(xì)胞。右側(cè)圖是DAPI、Klf4和c-Myc圖像的疊加。

圖6顯示了使用機(jī)械壓縮產(chǎn)生的、針對(duì)非特異性核染色劑DAPI(左側(cè)圖)、Klf4(左起第二圖)和Oct4(左起第三圖)而染色的NEDAPS細(xì)胞。右側(cè)圖是DAPI、Klf4和Oct4圖像的疊加。

圖7顯示了使用機(jī)械壓縮產(chǎn)生的、針對(duì)非特異性核染色劑DAPI(左側(cè)圖)、Sox2(左起第二圖)和Klf4(左起第三圖)而染色的NEDAPS細(xì)胞。右側(cè)圖是DAPI、Sox2和Klf4圖像的疊加。

圖8顯示了使用機(jī)械壓縮產(chǎn)生的、針對(duì)DAPI(左側(cè)圖)、Oct4(左起第二圖)和c-Myc(左起第三圖)而染色的NEDAPS細(xì)胞。右側(cè)圖是DAPI、Oct4和c-Myc圖像的疊加。

圖9顯示了表明Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4在NEDAPS細(xì)胞中表達(dá)的PCR凝膠。M顯示分子量標(biāo)志物；Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的PCR產(chǎn)物分別顯示在圖A-D中。每個(gè)圖中的泳道1-2顯示了使用簡(jiǎn)單的機(jī)械壓縮進(jìn)行了刺激并在48小時(shí)獲取的神經(jīng)的兩份重復(fù)制備物的PCR產(chǎn)物，每個(gè)圖中的泳道3-4顯示了暴露于直接體內(nèi)施用的rhBMP2并在48小時(shí)獲取的神經(jīng)的兩份重復(fù)制備物的PCR產(chǎn)物。

圖10是顯示了在限制性干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的NEDAPS細(xì)胞的典型形態(tài)的平面顯微照片。注意扁平化的細(xì)胞形狀和對(duì)基底的貼附。這種形態(tài)與通常是圓形并且以最低限度貼附到基底上的胚胎干細(xì)胞明顯不同。

圖11所示的PCR凝膠表明：在已在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以分別誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的NEDAPS細(xì)胞中，成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的標(biāo)志物得到表達(dá)。M顯示了分子量標(biāo)志物；圖A中的泳道1-4分別顯示骨橋蛋白、I型膠原蛋白、骨鈣素和陰性對(duì)照的PCR產(chǎn)物。圖B中的泳道1-3分別顯示Flt-1、Flk-1和陰性對(duì)照的PCR產(chǎn)物。

圖12顯示了已在成骨性培養(yǎng)基中培養(yǎng)以誘導(dǎo)其分化為成骨細(xì)胞的NEDAPS細(xì)胞的融合培養(yǎng)物，已針對(duì)堿性磷酸酶活性(成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物)進(jìn)行了染色。注意染料的積累指示這種酶活性的存在，其是成骨細(xì)胞的特征。

圖13顯示了在成骨性培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NEDAPS細(xì)胞。左上圖顯示了在針對(duì)成骨細(xì)胞標(biāo)志物I型膠原進(jìn)行熒光免疫染色后的細(xì)胞。右上圖顯示了用Nomarski光學(xué)儀器成像的與左上圖相同的視野。左下圖顯示了免疫染色和Nomarski圖像的復(fù)合。右下圖是空白。

圖14是已被誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞表型的NEDAPS細(xì)胞的平面顯微照片。細(xì)胞體的圓形外觀和長(zhǎng)而窄的突起是培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞在融合之前的典型特征，其后，圓形細(xì)胞體的陣列顯示出“鵝卵石”外觀。

圖15顯示了已經(jīng)在內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NEDAPS細(xì)胞的四幅不同的顯微照片。注意這些分化的細(xì)胞的形態(tài)與其所源自的NEDAPS細(xì)胞非常不同，顯示出更圓的形狀，與基底的貼附較不親密，且細(xì)胞核較大。

圖16顯示了已經(jīng)在外胚層分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NEDAPS細(xì)胞的四幅不同的顯微照片。注意這些細(xì)胞在形態(tài)上與其所源自的NEDAPS細(xì)胞非常不同，顯示出與發(fā)育中的神經(jīng)組織一致的長(zhǎng)細(xì)胞形狀。

圖17顯示了通過(guò)對(duì)切除的神經(jīng)進(jìn)行離體刺激而產(chǎn)生的NEDAPS細(xì)胞。上圖從左至右顯示了針對(duì)Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc免疫染色的細(xì)胞。下圖顯示了上圖所示的熒光信號(hào)在相同細(xì)胞的明場(chǎng)圖像上的疊加。

圖18示出了本公開(kāi)的NEDAPS細(xì)胞可以分化的示例性途徑。該圖示是簡(jiǎn)略的并且沒(méi)有顯示出沿每種分化途徑的所有可能的細(xì)胞類型或中間細(xì)胞類型。例如，造血干細(xì)胞可以分化為髓系祖細(xì)胞和淋巴系祖細(xì)胞，其分別產(chǎn)生髓細(xì)胞系(包括圖18中顯示的紅細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)和淋巴細(xì)胞系(包括淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)。

7.具體實(shí)施方式

7.1.哺乳動(dòng)物周圍神經(jīng)源性干細(xì)胞(NEDAPS細(xì)胞)

本公開(kāi)提供了神經(jīng)源性成體多能干細(xì)胞(NEDAPS細(xì)胞)及其群。如在“NEDAPS”的語(yǔ)境中所使用，術(shù)語(yǔ)“成體”是指非胚胎來(lái)源。因此，NEDAPS細(xì)胞可以來(lái)自青少年或成年受試者，受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物(例如貓、狗、兔、綿羊、豬、牛、山羊或馬)，或靈長(zhǎng)動(dòng)物(例如猴或人類)。

本公開(kāi)的NEDAPS細(xì)胞表達(dá)Oct4(也稱為Oct3/4和POU5F1)、Sox2、c-Myc和Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子。這四種轉(zhuǎn)錄因子的基因序列在哺乳動(dòng)物物種之間是高度保守的(Fritz等，Journal of Biological Chemistry(2004)第279卷(47):48950-48958；Frankenberg等，Developmental Biology(2010)第337卷:162-170；Rodda等，Journal of Biological Chemistry(2005)第280卷(26):24731-24737；Flynn等，Molecular and Cellular Biology(1998)第18卷(10):5961-5969；Stewart等，Virology(1986)154(1):121-34；Eladari等，Biochem and Biophysical Res.Communications(1986)第104卷(1):313-9)。此外，通過(guò)誘導(dǎo)這些相同、同一的四種因子的表達(dá)，已將來(lái)自小鼠、人、大鼠和獼猴的體細(xì)胞成功地重編程為能夠分化成三種胚層(外胚層、內(nèi)胚層和中胚層)的iPS細(xì)胞。Takakashi和Yamanaka，Cell(2006)126(4)：663-76；Takahashi等，Cell(2007)131(5)：861-872；Liu等，Cell Stem Cell(2008)3：587-590；Liao等，Cell Stem Cell(2009)4(1)：11-15。本公開(kāi)的NEDAPS細(xì)胞還可以表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog和SSEA1。優(yōu)選地，這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)不是重組性的(例如，并不通過(guò)引入編碼一種或多種這些轉(zhuǎn)錄因子的一種或多種表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn))。

當(dāng)在合適的分化條件下培養(yǎng)時(shí)，本公開(kāi)的NEDAPS細(xì)胞能夠分化為中胚層細(xì)胞(例如，間充質(zhì)細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞)、內(nèi)胚層細(xì)胞和外胚層細(xì)胞(例如，神經(jīng)干細(xì)胞)。NEDAPS細(xì)胞可以分化成的細(xì)胞類型的實(shí)例顯示在圖18中。各種細(xì)胞類型的分化條件是本領(lǐng)域已知的，且分化培養(yǎng)基是商購(gòu)可得的。示例性分化條件描述于第7.2.3節(jié)。

在某些實(shí)施方式中，NEDAPS細(xì)胞在體內(nèi)和體外均是能動(dòng)的(例如，由體內(nèi)細(xì)胞遷移和新分裂的細(xì)胞的體外遷移所證明)，其容易貼附到玻璃或塑料基底上，且/或僅偶爾形成集落。

本公開(kāi)的NEDAPS細(xì)胞或者其部分或完全分化的后代可以是重組的或基因工程改造的，從而例如并入來(lái)自其他物種的異源基因、來(lái)自相同物種的同源基因(例如，用來(lái)替換在NEDAPS細(xì)胞所源自的受試者中突變的基因)以表達(dá)相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)具有改善或改變的功能的經(jīng)改造的蛋白質(zhì)，或者并入標(biāo)志物(例如，可檢測(cè)標(biāo)志物或核酸標(biāo)簽)以允許鑒定NEDAPS細(xì)胞或其后代，由此例如在植入后追蹤其演變。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以將核酸引入NEDAPS細(xì)胞(例如通過(guò)以下描述的方法：Wang和Gao，Discov Med.(2014)第18卷(97)：67-77，此處通過(guò)援引將其內(nèi)容并入本文)，并且可以將該核酸并入或不并入NEDAPS細(xì)胞的基因組DNA中。例如，可以通過(guò)重組病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒)、注射裸DNA或轉(zhuǎn)染(例如，通過(guò)使用磷酸鈣、脂質(zhì)體或電穿孔的方法)將核酸引入NEDAPS細(xì)胞中。

在另一方面中，本公開(kāi)提供了NEDAPS細(xì)胞、NEDAPS細(xì)胞群和從其分化出的細(xì)胞和細(xì)胞群，例如，中胚層細(xì)胞(例如間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)、內(nèi)胚層細(xì)胞或外胚層細(xì)胞(例如神經(jīng)干細(xì)胞)。在本公開(kāi)的各個(gè)方面中，群的特征在于以下特征的一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)：

(a)其是分離的；和/或

(b)其至少50％同質(zhì)；和/或

(c)其包含至少10個(gè)細(xì)胞。

在以上特征(b)的具體實(shí)施方式中，該群為至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或大于99％同質(zhì)，例如，對(duì)于至少80％同質(zhì)的NEDAPS細(xì)胞群，群中至少80％的細(xì)胞是NEDAPS細(xì)胞。在以上特征(c)的具體實(shí)施方式中，該群包含至少50個(gè)細(xì)胞、至少100個(gè)細(xì)胞、至少200個(gè)細(xì)胞、至少500個(gè)細(xì)胞、至少1,000個(gè)細(xì)胞或至少10,000個(gè)細(xì)胞。本公開(kāi)還涉及特征(b)和(c)的前述實(shí)施方式的任意和全部排列組合，例如，群是至少75％同質(zhì)的且包含至少200個(gè)細(xì)胞，或群是至少60％同質(zhì)的且包含至少100個(gè)細(xì)胞，或群是至少90％同質(zhì)的且包含至少50個(gè)細(xì)胞。

7.2.NEDAPS細(xì)胞和從NEDAPS細(xì)胞分化出的細(xì)胞的生產(chǎn)方法

7.2.1.NEDAPS細(xì)胞增殖條件

本公開(kāi)提供了體內(nèi)和離體產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞及其群的方法。NEDAPS細(xì)胞和NEDAPS細(xì)胞群可通過(guò)離體培養(yǎng)暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件的周圍神經(jīng)或通過(guò)在受試者體內(nèi)培養(yǎng)來(lái)自暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件的周圍神經(jīng)的細(xì)胞而產(chǎn)生。在離體產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞的情況下，術(shù)語(yǔ)“周圍神經(jīng)(peripheral nerve)”包括本文所述的已被破壞的周圍神經(jīng)。適合產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞的神經(jīng)包括在對(duì)具有重要功能的神經(jīng)受損的患者進(jìn)行神經(jīng)移植的手術(shù)中常規(guī)獲取的周圍神經(jīng)。有許多這樣容易獲得的、且具有最小限度(如果有的話)的功能損失的神經(jīng)。周圍神經(jīng)可以是例如是腓腸神經(jīng)、腓腸神經(jīng)的分支、手指或腳趾的固有指(趾)神經(jīng)、閉孔神經(jīng)的薄束分支、前臂內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)的節(jié)段、前臂外側(cè)皮神經(jīng)、近端第三網(wǎng)絡(luò)空間神經(jīng)束、骨內(nèi)后神經(jīng)或其他周圍神經(jīng)。

NEDAPS細(xì)胞增殖條件可以包括使周圍神經(jīng)暴露于細(xì)胞因子，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族細(xì)胞因子的成員。用于產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞的優(yōu)選BMP蛋白是BMP2，例如重組人BMP2(rhBMP2)。rhBMP2由Medtronic作為銷售，并且被FDA批準(zhǔn)用于刺激骨形成。研究表明BMP2誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥，并且認(rèn)為此神經(jīng)炎癥可能是BMP2誘導(dǎo)的骨形成過(guò)程的基礎(chǔ)。Heggeness，The Spine Journal，(2011)11:506。暴露于BMP2后，在小鼠、大鼠和人類中觀察到了類似的神經(jīng)炎性反應(yīng)。參見(jiàn)例如Carragee等，The Spine Journal，(2011)11:471-491；Dmitriev等，The Spine Journal，(2011)11:500-505；Salisbury等，Journal of Cellular Biochemistry(2011)112:2748-2758。NEDAPS細(xì)胞可以通過(guò)將BMP2溶液(例如，含BMP2的鹽水溶液)直接施用至手術(shù)暴露的周圍神經(jīng)或者通過(guò)肌內(nèi)(IM)注射至周圍神經(jīng)附近的位置而在受試者體內(nèi)產(chǎn)生。

通?？梢砸?0ng～1mg的量將BMP2直接施用至暴露的神經(jīng)或者注射至周圍神經(jīng)附近的位置。在某些實(shí)施方式中，BMP2的量為10ng、25ng、40ng、50ng、60ng、75ng、100ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400ng、500ng、750ng或1mg，或選自前述值中的任意一對(duì)所限定的范圍，例如，10ng～250ng、40ng～75ng、50ng～300ng、60ng～150ng等等。直接施用至暴露的神經(jīng)或者注射至周圍神經(jīng)附近位置的BMP2的量可以在體積為1μl～10ml的溶液中提供。在某些實(shí)施方式中，該體積為0.1ml～2ml，例如，0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml，或選自前述值中的任意一對(duì)所限定的范圍，例如，0.1ml～1ml、0.25ml～1ml或0.5ml～1.5ml等等。根據(jù)靶標(biāo)周圍神經(jīng)的大小，BMP2的施用量或BMP2溶液的使用體積可以是變化的。

作為另一種選擇，可以通過(guò)使受試者暴露于諸如骨折、鈍挫傷、熱損傷或電擊等導(dǎo)致BMP2局部產(chǎn)生的條件而在體內(nèi)產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，NEDAPS細(xì)胞獲自遭受骨折、鈍挫傷、熱損傷或電擊的受試者。

NEDAPS細(xì)胞增殖條件還可以包括使周圍神經(jīng)暴露于除BMP2以外或與BMP2一起使用的神經(jīng)炎性劑，例如腫瘤壞死因子α、白介素-1β、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、組胺、白介素6或它們的組合。

在其他實(shí)施方式中，NEDAPS細(xì)胞增殖條件包括向周圍神經(jīng)施加創(chuàng)傷(體內(nèi)或離體)。創(chuàng)傷可以是例如，機(jī)械創(chuàng)傷，例如，壓縮周圍神經(jīng)(例如1～2秒)、切割或切斷周圍神經(jīng)、或者切碎周圍神經(jīng)、電刺激(例如，過(guò)度刺激)、超聲沖擊波或者熱攻擊。這樣，在本公開(kāi)的一個(gè)方面，NEDAPS細(xì)胞的產(chǎn)生可通過(guò)對(duì)周圍神經(jīng)組織進(jìn)行物理傷害來(lái)刺激。

通過(guò)在包含BMP2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)和/或通過(guò)對(duì)神經(jīng)施加機(jī)械創(chuàng)傷(例如，壓縮和/或切碎)以使周圍神經(jīng)暴露于BMP2，也可以離體實(shí)現(xiàn)NEDAPS細(xì)胞增殖。在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中的BMP2濃度為5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、750ng/ml或1mg/ml，或選自前述值中的任意一對(duì)所限定的范圍，例如，5ng/ml～50ng/ml、10ng/ml～250ng/ml、40ng/ml～75ng/ml、50ng/ml～300ng/ml、60ng/ml～150ng/ml等等。

也可以使用本文描述的NEDAPS細(xì)胞增殖條件的組合來(lái)產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞。例如，NEDAPS細(xì)胞可以通過(guò)使周圍神經(jīng)暴露于BMP2、壓縮和切碎中的兩種或三種的組合而產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，NEDAPS細(xì)胞增殖條件包括將暴露或未暴露于BMP2的周圍神經(jīng)切碎。

通過(guò)鑒定和使用適合的周圍神經(jīng)，可以以最小的發(fā)病率使用人類受試者和家養(yǎng)動(dòng)物來(lái)實(shí)施本公開(kāi)的產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞的方法。用于人類和獸醫(yī)應(yīng)用的適合的神經(jīng)的實(shí)例是腓腸神經(jīng)或其一個(gè)分支、手或腳中指(趾)的指(趾)固有神經(jīng)、來(lái)自由于例如損傷或疾病而截肢的斷肢的神經(jīng)。在四肢的部分需要被截肢或廢棄或者神經(jīng)損傷無(wú)法被修復(fù)的主要?jiǎng)?chuàng)傷的情況下，可以獲取這種神經(jīng)，并用來(lái)產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞，它進(jìn)而可以用于此受試者的再生程序和過(guò)程(即，在自體移植過(guò)程中)，或用于高度匹配的受試者(即，在高度匹配但同種異基因的移植過(guò)程中)。此技術(shù)在人類和獸醫(yī)應(yīng)用中對(duì)產(chǎn)生用于組織工程和其他再生療法的個(gè)體遺傳“完美匹配”的細(xì)胞而言將是特別理想的。

7.2.2.神經(jīng)獲取和NEDAPS細(xì)胞培養(yǎng)

在體內(nèi)暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件的受試者的周圍神經(jīng)可以在暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件后立即通過(guò)例如手術(shù)切除而從受試者中獲取，或者在一段時(shí)間后獲取。在某些實(shí)施方式中，在暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件后的至多4天、更優(yōu)選至多3天獲取周圍神經(jīng)。例如，可以例如約在暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件后的約8小時(shí)(或1/3天)、約12小時(shí)(或半天)、約24小時(shí)(或一天)、約48小時(shí)(或兩天)、或約72小時(shí)(或三天)獲取周圍神經(jīng)，或者在暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件后的選自由前述值中的任意一對(duì)所限定的范圍的時(shí)間段后獲取周圍神經(jīng)，例如8小時(shí)～72小時(shí)(或1/3天～三天)、8小時(shí)～12小時(shí)(或1/3天～半天)、12小時(shí)～24小時(shí)(或半天～一天)、24小時(shí)～48小時(shí)(或一天～兩天)、或者48小時(shí)～72小時(shí)(或兩天～三天)等等后。在獲取后，可選地，可以破壞神經(jīng)以便使NEDAPS細(xì)胞從神經(jīng)中釋出。

在暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件后，已暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件的周圍神經(jīng)可以離體培養(yǎng)一段時(shí)間，并且可以可選地在培養(yǎng)之前或之后將其破壞。在某些實(shí)施方式中，在暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件后，將已暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件的周圍神經(jīng)離體培養(yǎng)至多4天、更優(yōu)選至多3天，例如，約8小時(shí)(或1/3天)、約12小時(shí)(或半天)、約24小時(shí)(或一天)、約48小時(shí)(或兩天)或約72小時(shí)(或三天)，或者培養(yǎng)選自由前述值中的任意一對(duì)所限定的范圍的時(shí)間段，例如，8小時(shí)～72小時(shí)(或1/3天～三天)、8小時(shí)～12小時(shí)(或1/3天～半天)、12小時(shí)～24小時(shí)(或半天～一天)、24小時(shí)～48小時(shí)(或一天～兩天)或者48小時(shí)～72小時(shí)(或兩天～三天)等等。

機(jī)械和/或酶方法可用于破壞周圍神經(jīng)。例如，神經(jīng)可被切碎、拉壞和/或用一種或多種蛋白酶進(jìn)行處理，例如胰蛋白酶、膠原蛋白酶(例如溶組織梭菌膠原蛋白酶)或基質(zhì)金屬蛋白酶.

在某些實(shí)施方式中，在壓縮、獲取和通過(guò)切碎和/或用一種或多種蛋白酶進(jìn)行處理而破壞周圍神經(jīng)后，在含BMP2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)自周圍神經(jīng)的細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在壓縮、獲取和通過(guò)切碎和用一種或多種蛋白酶進(jìn)行處理而破壞周圍神經(jīng)后，在含BMP2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)自周圍神經(jīng)的細(xì)胞。

所獲取的周圍神經(jīng)、來(lái)自被破壞的周圍神經(jīng)的細(xì)胞、和分離的NEDAPS細(xì)胞可在非分化性培養(yǎng)基中培養(yǎng)以使NEDAPS細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)。實(shí)施例3描述了用于培養(yǎng)處于未分化狀態(tài)的NEDAPS細(xì)胞的適合的培養(yǎng)基。其他適合的非分化性培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的，很多是商購(gòu)可得的，例如，Knockout^TM DMEM(Gibco，目錄號(hào)10829-018)和mTeSR^TM 1培養(yǎng)基(Stemcell Technologies，目錄號(hào)05857)?？梢栽诓粡纳窠?jīng)中存在的其他細(xì)胞類型中分離出NEDAPS細(xì)胞的情況下從周圍神經(jīng)培養(yǎng)NEDAPS細(xì)胞。作為另一種選擇，可以將單個(gè)或多個(gè)NEDAPS細(xì)胞與一種或多種其他細(xì)胞類型分離，例如，通過(guò)顯微操作、流式細(xì)胞術(shù)或本領(lǐng)域已知的用于分選或分離細(xì)胞的其他方法，并進(jìn)行培養(yǎng)以產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞的群或擴(kuò)增群。

在神經(jīng)暴露于NEDAPS細(xì)胞增殖條件后，NEDAPS細(xì)胞群可在未分化形式標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中保持，或分化為潛能較低的細(xì)胞類型，例如如第7.2.3節(jié)所描述。分化可以在暴露于增殖條件后立即進(jìn)行，或者在將NEDAPS細(xì)胞保持在未分化形式后進(jìn)行。

7.2.3.干細(xì)胞分化

通過(guò)暴露于分化條件，NEDAPS細(xì)胞群可分化為潛能較低的細(xì)胞類型，例如，在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為特定細(xì)胞類型的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)該群。本公開(kāi)的NEDAPS細(xì)胞可分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層系的細(xì)胞。NEDAPS細(xì)胞可分化成的細(xì)胞類型的具體實(shí)例如圖18所示。各種細(xì)胞類型的分化條件是本領(lǐng)域已知的，且分化培養(yǎng)基是商購(gòu)可得的，例如用于分化ESC或iPS細(xì)胞的培養(yǎng)基。示例性方法和培養(yǎng)基在實(shí)施例4～6中描述。例如，StemXVivo^TM Ectoderm試劑盒(R&D Systems，目錄號(hào)#SC031)、StemXVivo^TM Mesoderm試劑盒(R&D Systems，目錄號(hào)#SC030)和StemXVivo^TM Endoderm試劑盒(R&D Systems，目錄號(hào)#SC019)可分別用于使NEDAPS細(xì)胞分化為外胚層細(xì)胞、中胚層細(xì)胞和內(nèi)胚層細(xì)胞，實(shí)施例4中描述的培養(yǎng)基可用于使NEDAPS細(xì)胞群分化為成骨細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞(即，兩種間充質(zhì)細(xì)胞類型)，實(shí)施例5中描述的培養(yǎng)基可用于使NEDAPS細(xì)胞群分化為內(nèi)胚層細(xì)胞，實(shí)施例6中描述的培養(yǎng)基可用于使NEDAPS細(xì)胞群分化為神經(jīng)干細(xì)胞(即，外胚層細(xì)胞類型)。

7.3.用途

本文描述的方法可用于產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞群和由其分化出的細(xì)胞類型的群，例如，產(chǎn)生具有以下特征的群：(a)是分離的和/或(b)是至少50％同質(zhì)的和/或(c)包含至少10個(gè)細(xì)胞，及第7節(jié)所描述的其任何實(shí)施方式。所述群對(duì)于自體應(yīng)用具有特殊優(yōu)點(diǎn)，即，對(duì)于NEDAPS細(xì)胞所源自的(人類或其他動(dòng)物)受試者中的移植具有特殊優(yōu)點(diǎn)。

可以對(duì)NEDAPS細(xì)胞和其分化后代進(jìn)行離體操縱以產(chǎn)生用于治療受試者的細(xì)胞。這些細(xì)胞可用于獲益于細(xì)胞或器官再生的任何狀況。具體應(yīng)用包括器官培養(yǎng)、傷口愈合(例如治療糖尿病下肢傷口)、夏科關(guān)節(jié)病、壓力性潰瘍、或骨折、神經(jīng)再生、恢復(fù)免疫功能、造血、組織工程、基因治療(例如，Wang和Gao，Discov Med.(2014)第18卷(98)：151-161中所描述的，此處通過(guò)援引將其內(nèi)容并入本文)，以及可以使用在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)和誘導(dǎo)分化的干細(xì)胞的任何其他醫(yī)療場(chǎng)合。

在一個(gè)實(shí)施方式中，未分化的NEDAPS細(xì)胞或由NEDAPS細(xì)胞分化成的成骨細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)，然后將其放入期望骨形成的部位，例如骨折部位、節(jié)段性骨缺損部位(例如，在腫瘤切除后)或需要骨向內(nèi)生長(zhǎng)成植入物的部位(例如，人工關(guān)節(jié)部件)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，未分化的NEDAPS細(xì)胞或已經(jīng)由NEDAPS細(xì)胞分化成的內(nèi)皮細(xì)胞可在培養(yǎng)物中繁殖，然后通過(guò)手術(shù)或注射方式放置到需要血管形成的解剖學(xué)區(qū)域，例如血液供應(yīng)降低的肢。在另一個(gè)實(shí)施方式中，由NEDAPS細(xì)胞分化成的成纖維細(xì)胞可在培養(yǎng)物中繁殖，然后將其放置到需要軟組織愈合的解剖學(xué)區(qū)域，例如，用于治療諸如糖尿病足潰瘍等緩慢愈合的傷口。在另一個(gè)實(shí)施方式中，由NEDAPS細(xì)胞分化成的造血細(xì)胞可被注射到患有貧血的受試者的循環(huán)系統(tǒng)或骨髓中。然后所注射的造血細(xì)胞可以為受試者產(chǎn)生血細(xì)胞。

本公開(kāi)的NEDAPS細(xì)胞還可用于評(píng)價(jià)藥物化合物和其他化學(xué)品的毒性，例如通過(guò)在美國(guó)專利No.8,703,483所描述的方法中使用NEDAPS細(xì)胞，此處通過(guò)援引將其內(nèi)容并入本文。

NEDAPS細(xì)胞和由其分化出的細(xì)胞可以是重組的，例如用于基因治療用途。

對(duì)于向受試者的植入，NEDAPS細(xì)胞和由其分化出的細(xì)胞的群可以配制在藥學(xué)上可接受的介質(zhì)或賦形劑中或者可生物相容的和/或生物可降解的支架或基質(zhì)中。

8.實(shí)施例

8.1.實(shí)施例1：使用BMP2產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞

材料和方法：麻醉十只小鼠(在經(jīng)IACUC批準(zhǔn)的方案下)并使用標(biāo)準(zhǔn)方法暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)。在7只動(dòng)物中，將50納克的BMP2直接放置到神經(jīng)上。在3只對(duì)照動(dòng)物中，不對(duì)神經(jīng)施用試劑。

動(dòng)物在12小時(shí)、24小時(shí)或48小時(shí)后被人道處死，重新暴露并獲取坐骨神經(jīng)。神經(jīng)在甲醛中固定并包埋在石蠟中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法切片。

結(jié)果：未處理的神經(jīng)看上去正常(參見(jiàn)圖1A)，除了可能發(fā)現(xiàn)一些輕微的炎癥，據(jù)認(rèn)為其是由于手術(shù)暴露引起的。

發(fā)現(xiàn)經(jīng)BMP2處理的神經(jīng)是片段化和受到破壞的(參見(jiàn)圖1)，但注意到了在神經(jīng)內(nèi)的顯著細(xì)胞增殖。注意到在切片過(guò)程中和切片之后，被處理的神經(jīng)是自發(fā)片段化的。用BMP2處理的神經(jīng)是異常且非常脆弱的。

8.2.實(shí)施例2：使用IM注射的BMP2產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞

材料和方法：麻醉二十只小鼠，經(jīng)皮注射(IM)50ng或100ng的BMP2至每個(gè)小鼠的右側(cè)腱肌。在24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)后處死小鼠。在不解剖至坐骨神經(jīng)的情況下獲取腱肌，但要小心地使所獲取的組織包含此神經(jīng)的通常解剖學(xué)位置。從4只動(dòng)物獲取對(duì)側(cè)(未處理的)腱肌作為對(duì)照組織。

因?yàn)锽MP2是通過(guò)IM注射施用的，所以難以知道在獲取組織和處理之后注射部位與任何給定的顯微區(qū)域的接近程度如何。針對(duì)干細(xì)胞標(biāo)志物的陣列和一組炎性標(biāo)志物對(duì)切片染色。

結(jié)果：即使在24小時(shí)的動(dòng)物中，注射了BMP2的來(lái)自肢的神經(jīng)也出現(xiàn)破壞和輕微片段化(參見(jiàn)圖2B和2D)。截至72小時(shí)，來(lái)自經(jīng)處理的動(dòng)物的神經(jīng)表現(xiàn)出了顯著的異常(參見(jiàn)圖2F)。72小時(shí)的樣本顯示出了嚴(yán)重異常的神經(jīng)。異常的神經(jīng)所呈現(xiàn)出的占優(yōu)勢(shì)地位的細(xì)胞普遍表達(dá)Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4全部四種ESC標(biāo)志物。

在24小時(shí)和48小時(shí)持續(xù)觀察到神經(jīng)內(nèi)的穩(wěn)健細(xì)胞增殖，而且大部分這些增殖中的細(xì)胞對(duì)全部四種ESC標(biāo)志物都呈陽(yáng)性染色(參見(jiàn)圖2B、2D、2F和2G)。

8.3.實(shí)施例3：NEDAPS細(xì)胞的產(chǎn)生、分離和培養(yǎng)

體內(nèi)NEDAPS細(xì)胞產(chǎn)生：所有動(dòng)物活動(dòng)都在衛(wèi)奇塔州立大學(xué)的動(dòng)物護(hù)理設(shè)施中進(jìn)行，并且獲得了衛(wèi)奇塔州立大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。8周～12周齡的雌性BALB/c小鼠購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)并在研究使用前使其對(duì)該設(shè)施適應(yīng)至少1周～6周。在手術(shù)當(dāng)天，為了預(yù)防性止痛，在手術(shù)前1小時(shí)，小鼠通過(guò)皮下注射接收0.05mg/kg的丁丙諾啡。通過(guò)腹腔注射90mg/kg的氯胺酮和8mg/kg的甲苯噻嗪來(lái)麻醉小鼠，并通過(guò)鼻錐補(bǔ)充1％～2％的異氟烷。每只動(dòng)物的右腿被剃光并用聚維酮碘和乙醇對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒。在大腿外側(cè)面產(chǎn)生切口，并通過(guò)鈍器解剖露出坐骨神經(jīng)。使用具有1mm寬度的鑷子沿露出的神經(jīng)長(zhǎng)度方向在四個(gè)或五個(gè)部位將神經(jīng)手動(dòng)壓縮至其原始直徑的大約25％，或?qū)⑸窠?jīng)暴露于含60ng BMP2的10μl無(wú)菌生理鹽水中( Bone Graft,Medtronic Spinal and Biologies,Memphis,TN)。每只動(dòng)物的切口被縫合閉合并護(hù)理動(dòng)物8小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)，而后通過(guò)CO₂吸入處死。在處死后立即獲取神經(jīng)用于組織學(xué)分析、細(xì)胞培養(yǎng)或使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法篩選基因表達(dá)。

還通過(guò)將BMP2經(jīng)皮注射進(jìn)小鼠大腿后側(cè)的腱肌塊來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如上進(jìn)行相同的麻醉、止痛和安樂(lè)死。在注射后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)處死動(dòng)物。尸體解剖后立即通過(guò)尖銳剖離而獲取建肌塊，并在福爾馬林中固定樣本，在石蠟中包埋并切片?？傆?jì)37只小鼠通過(guò)IM注射含60ng BMP2的5μl無(wú)菌鹽水而得到處理。

NEDAPS細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：從小鼠坐骨神經(jīng)分離出NEDAPS細(xì)胞，并根據(jù)修改的公開(kāi)方案進(jìn)行培養(yǎng)(Wu等，Biotechnology letters 2009；31:1703-1708)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將坐骨神經(jīng)段在PBS中切碎成1mm的片，以600×g離心5分鐘形成沉淀塊。然后將神經(jīng)組織在37℃在含0.2％(0.27U/ml)膠原蛋白酶(Worthington Biochemical Corp)的0.5ml無(wú)菌DMEM中溫育90分鐘，然后加入等體積的0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液5分鐘并攪拌。將300μl熱滅活胎牛血清(FBS)添加到混合物中以終止酶消化。在通過(guò)100μm尺寸的濾網(wǎng)過(guò)濾后，將所分離的細(xì)胞以600×g離心10分鐘形成沉淀。在補(bǔ)充有20％敲除血清替代品(KSR，Gibco)、100μΜMEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、1×GlutaMAX^TM-I(目錄號(hào)35050-079，Gibco)、55μΜβ-巰基乙醇(Gibco)、20ng/ml人白血病抑制因子(LIF，Gibco)、100U/ml青霉素(Invitrogen，Grand Island，NY)和100μg/ml鏈霉素(Invitrogen)的DMEM(Gibco，Life Technologies)中重懸浮細(xì)胞沉淀并且分配到6孔培養(yǎng)皿中或4孔腔室載玻片上。細(xì)胞在37℃、5％CO₂的環(huán)境中培養(yǎng)。

NEDAPS細(xì)胞的表征：為了表征NEDAPS細(xì)胞，針對(duì)成對(duì)的ESC標(biāo)志物(Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc)進(jìn)行雙染。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在室溫下用4％多聚甲醛將在腔室載玻片中生長(zhǎng)的細(xì)胞固定30分鐘，用PBS洗3次，然后用3％正常驢血清和0.1％Triton X-100進(jìn)行封閉。一抗包括山羊抗Klf4(R&D)、山羊抗Sox2(Santa Cruz Biotechnology)、山羊和兔抗Oct4(Abcom)及兔抗c-Myc(Santa Cruz Biotechnology)。使用的二抗是Alexa488偶聯(lián)的驢抗山羊IgG和Alexa594偶聯(lián)的驢抗兔IgG(Life Technologies)。細(xì)胞用山羊和兔抗體一抗對(duì)(Klf-4+c-Myc、Sox2+c-Myc、Klf-4+Oct4、和Sox2+OCT4)在37℃雙染60分鐘。在用PBS沖洗后，在37℃在具有不同熒光波長(zhǎng)的1:200二抗溫育細(xì)胞30分鐘，將蓋玻片蓋到帶有DAPI Fluoromount G(SouthernBiotech)的切片上，其還復(fù)染了細(xì)胞核。在TCS SP5II激光共聚焦掃描顯微鏡(Leica Microsystems)下觀察染色的細(xì)胞，用LAS圖像分析光學(xué)軟件獲取圖像。用1024×1024像素的掃描模式格式獲取光學(xué)單切片，其像素大小為0.21μm。進(jìn)行多通道圖像的自動(dòng)化順序集合的采集以減少通道間的光譜串?dāng)_，對(duì)雙染信號(hào)的單個(gè)圖像進(jìn)行疊加以產(chǎn)生共定位圖像。

使用先前詳細(xì)描述的RT-PCR技術(shù)測(cè)定測(cè)試組之中Klf-4、c-Myc、Sox2和Oct4的基因表達(dá)譜(Yang等，J Bone Joint Surg Am.(2005)87(5)：1088-97.)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，細(xì)胞在STAT-60^TM(Tel-Test，F(xiàn)riendswood，TX)溶液中在5-ml Dounce均質(zhì)器中勻漿，通過(guò)氯仿分離和異丙醇沉淀分離出總RNA。在含5.5mM MgCl₂、500μΜ的每種三磷酸脫氧核苷酸、0.5U/μΙRNase抑制劑、2.5μΜ隨機(jī)六聚體和1.25U/μΙ逆轉(zhuǎn)錄酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)的40μl PCR緩沖液中，在Veriti 96孔熱循環(huán)儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上，以25℃10分鐘、48℃25分鐘和95℃5分鐘從0.5g總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA(cDNA)。使含有SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)、2μl cDNA和400nM測(cè)試基因引物對(duì)的RT-PCR反應(yīng)混合物在 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)中運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。動(dòng)態(tài)記錄熒光信號(hào)。使用Primer3程序(bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3)設(shè)計(jì)每個(gè)靶基因的引物對(duì)，并通過(guò)Sigma-Genosys(Woodlands，Texas)構(gòu)建。引物序列在表1中示出。

表1-用于RT-PCR擴(kuò)增的引物

結(jié)果：如圖3～9所示，培養(yǎng)的NEDAPS細(xì)胞表達(dá)Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc。觀察到這些細(xì)胞通常是非常扁平的且遍布玻璃或塑料基底(參見(jiàn)圖10)，這表明這些細(xì)胞是貼附性的。當(dāng)更換培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞不會(huì)被“沖洗掉”，也表明細(xì)胞是貼附在基底上的。將細(xì)胞傳代至新的培養(yǎng)板上要求使其暴露于胰蛋白酶以進(jìn)行脫附。

8.4.實(shí)施例4：成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的分化(中胚層細(xì)胞分化)

細(xì)胞培養(yǎng)：保持NEDAPS細(xì)胞在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)。對(duì)于成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)，在含有10m Mβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml抗壞血酸、和10nM地塞米松的DMEM/F12培養(yǎng)基中補(bǔ)充10％胎牛血清、100mg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素得到成骨培養(yǎng)基，在其中培養(yǎng)NEDAPS細(xì)胞。7天后進(jìn)行堿性磷酸酶染色和I型膠原蛋白染色，以鑒定成骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特性。將定向?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞分化的NEDAPS細(xì)胞鋪到包被纖維連接蛋白(Sigma-Aldrich，US)的培養(yǎng)瓶上，并在補(bǔ)充有EGM^TM-2-MV SingleQuots^TM的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2(Lonza Walkersville，Inc.Walkersville，MD)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有5％FBS、10ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、50ng/ml人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、50ng/ml人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、1μg/ml氫化可的松和100U/ml青霉素(Invitrogen，US)和100μg/ml鏈霉素(Invitrogen，US)。

分化的細(xì)胞的表征：如先前所述(Jiang等，J Biomed Mater Res A(2013)101：2817-2825)，使用市售的堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)對(duì)分化的成骨細(xì)胞中的堿性磷酸酶活性進(jìn)行半定量性展示。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，制備堿性染料混合物來(lái)在蒸餾水中溶解Fast Violet B膠囊和Naphthol AS_MX堿性磷酸鹽。在檸檬酸緩沖的丙酮中固定30秒后，在26℃在堿性染料混合物中溫育細(xì)胞30分鐘，然后用Mayer's蘇木精復(fù)染1分鐘。所得的在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的不溶性彌散性紅色染料沉積物指示堿性磷酸酶活性。還進(jìn)行了針對(duì)I型膠原蛋白的免疫染色。

如實(shí)施例3所述，使用RT-PCR技術(shù)測(cè)定了成骨細(xì)胞標(biāo)志物骨橋蛋白、I型膠原蛋白和骨鈣素及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Fit-1和Flk-1的基因表達(dá)譜。使用的引物在表2中示出。

表2-用于RT-PCR擴(kuò)增的引物

結(jié)果：在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)成骨標(biāo)志物骨橋蛋白、I型膠原蛋白和骨鈣素(參見(jiàn)圖11)，并且對(duì)于堿性磷酸酶和I型膠原蛋白的染色是陽(yáng)性的(參見(jiàn)圖12～13)，表明NEDAPS細(xì)胞已分化為成骨細(xì)胞。在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞典型的形態(tài)，其具有小而圓的細(xì)胞體和多個(gè)長(zhǎng)延伸突起(參見(jiàn)圖14)，并且表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flt-1和Flk-1(參見(jiàn)圖11)。

8.5.實(shí)施例5：定型內(nèi)胚層(DE)的誘導(dǎo)

細(xì)胞培養(yǎng)：使用來(lái)自Gibco(Life Technologies)的商業(yè)試劑盒將NEDAPS細(xì)胞誘導(dǎo)成DE系。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在37℃、5％CO₂下用 Essential 8^TM培養(yǎng)基在12孔板中培養(yǎng)NEDAPS細(xì)胞。在第1天，用預(yù)熱的DE誘導(dǎo)培養(yǎng)基A替換Essential 8^TM培養(yǎng)基24小時(shí)。在第2天，完全吸出DE誘導(dǎo)培養(yǎng)基A，并用預(yù)熱的DE誘導(dǎo)培養(yǎng)基B替換。在37℃溫育平板24小時(shí)。在倒置顯微鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

結(jié)果：在DE誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，生長(zhǎng)的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上與誘導(dǎo)之前的NEDAPS細(xì)胞有很大不同。與未分化的NEDAPS細(xì)胞相比，該細(xì)胞變得更圓(即，較少的鱗狀)并顯示出更大的核(參見(jiàn)圖15)，表明從NEDAPS細(xì)胞發(fā)生了明確分化和內(nèi)胚層特征的發(fā)展。

8.6.實(shí)施例6：神經(jīng)干細(xì)胞的分化(外胚層細(xì)胞分化)

細(xì)胞培養(yǎng)：繁殖并誘導(dǎo)NEDAPS細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞增殖，在NSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Stemcell Technologies，目錄號(hào)05700)中含10％NeuroCult^TM NSC增殖補(bǔ)充物(體積/體積)(Stemcell Technologies，目錄號(hào)05701)的完全NeuroCult^TM NSC增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)NEDAPS細(xì)胞。在培養(yǎng)物中還包含終濃度為20ng/ml的rhEGF。當(dāng)達(dá)到30％的細(xì)胞融合時(shí)，移除培養(yǎng)基，并更換含10％NeuroCult^TM NSC分化補(bǔ)充物的完全NeuroCult^TM NSC分化培養(yǎng)基(Stemcell Technologies，目錄號(hào)05703)，將培養(yǎng)物在37℃溫育2天。在倒置顯微鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

結(jié)果：在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，細(xì)胞具有與分化前的NEDAPS細(xì)胞相比非常不同的形態(tài)。與通常為鱗狀細(xì)胞形態(tài)的原始NEDAPS細(xì)胞相比，分化的細(xì)胞是非常不同的，具有非常細(xì)長(zhǎng)的細(xì)胞體(參見(jiàn)圖16)。這些細(xì)長(zhǎng)的細(xì)胞顯示了外胚層的特征性原始神經(jīng)細(xì)胞的特征。

8.7.實(shí)施例7：一步法產(chǎn)生NEDAPS細(xì)胞

材料和方法：使用無(wú)菌技術(shù)手術(shù)暴露并取回小鼠坐骨神經(jīng)。在從身體中解剖出來(lái)之前，沿該神經(jīng)施加1秒～2秒的溫和壓縮。如實(shí)施例3所述，將神經(jīng)組織切碎成1mm的碎片，并用膠原蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行消化。離心收集細(xì)胞，并將其在實(shí)施例3中所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基中放置到12孔培養(yǎng)板或8孔腔室載玻片中。24小時(shí)后向培養(yǎng)基中添加BMP2，其終濃度為750ng/ml，并培養(yǎng)24小時(shí)，其后移除培養(yǎng)基并替換成實(shí)施例3中所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基：補(bǔ)充有20％敲除血清替代品(KSR，Gibco)、100μΜ MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、1×GlutaMAX^TM-I(目錄號(hào)35050-079，Gibco)、55μΜβ-巰基乙醇(Gibco)、20ng/ml人白血病抑制因子(LIF，Gibco)、100U/ml青霉素(Invitrogen，Grand Island，NY)和100μg/ml鏈霉素(Invitrogen)的DMEM(Gibco，Life Technologies)。在所有階段，在37℃和5％CO₂氣氛下培養(yǎng)細(xì)胞。

細(xì)胞表征：針對(duì)Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

結(jié)果：使用此方法產(chǎn)生的細(xì)胞表達(dá)Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc四種胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物(參見(jiàn)圖17)。

9.特定實(shí)施方式

本公開(kāi)由以下特定實(shí)施方式例示。

1.一種在周圍神經(jīng)中誘導(dǎo)干細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述方法包括：

提供受試者；

使所述受試者的選定的周圍神經(jīng)暴露于外源刺激選定的一段時(shí)間；

在所述選定的一段時(shí)間后，從經(jīng)刺激的周圍神經(jīng)獲取干細(xì)胞；及

在非分化性培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)所述胚胎干細(xì)胞。

2.如實(shí)施方式1所述的方法，其中，所述干細(xì)胞選自由全能(totipotent)細(xì)胞、多能細(xì)胞、專能細(xì)胞、寡能(oligopotent)細(xì)胞、單能細(xì)胞和它們的組合組成的組。

3.如實(shí)施方式1所述的方法，其中，所述外源刺激是物理?yè)p傷、機(jī)械操縱、破壞、電刺激或暴露于細(xì)胞因子中的一種或多種。

4.如實(shí)施方式3所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族的細(xì)胞因子的成員。

5.如實(shí)施方式4所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子是BMP2。

6.如實(shí)施方式5所述的方法，其進(jìn)一步包括：向所述周圍神經(jīng)原位施用BMP2以刺激所述干細(xì)胞的增殖；

手術(shù)切除所述周圍神經(jīng)，及

在非分化性培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)所述干細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)干細(xì)胞的增殖，從而產(chǎn)生干細(xì)胞群。

7.如實(shí)施方式3所述的方法，其進(jìn)一步包括：

向所述周圍神經(jīng)原位施加電刺激以刺激干細(xì)胞的增殖；

手術(shù)切除所述周圍神經(jīng)，及

在非分化性培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)所述干細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)干細(xì)胞的增殖，從而產(chǎn)生干細(xì)胞群。

8.如實(shí)施方式1所述的方法，其進(jìn)一步包括使所述干細(xì)胞體外暴露于一種或多種分化因子以使所述干細(xì)胞分化形成組織祖細(xì)胞。

9.如實(shí)施方式8所述的方法，其進(jìn)一步包括將所述組織祖細(xì)胞再植入到受試者體內(nèi)。

10.如實(shí)施方式9所述的方法，其中，受試者是實(shí)施方式1的周圍神經(jīng)的供體。

11.如實(shí)施方式1所述的方法，其進(jìn)一步包括：

從所述受試者獲取經(jīng)刺激的周圍神經(jīng)；及

在開(kāi)始培養(yǎng)之前或之后機(jī)械破壞該神經(jīng)以促進(jìn)所述周圍神經(jīng)釋出胚胎干細(xì)胞。

12.如實(shí)施方式11所述的方法，其中，所述機(jī)械破壞包括切碎或分割所述周圍神經(jīng)的鞘中的一種或多種。

13.如實(shí)施方式1所述的方法，其進(jìn)一步包括：

從所述受試者獲取經(jīng)刺激的周圍神經(jīng)；及

在開(kāi)始培養(yǎng)之前或之后對(duì)該神經(jīng)進(jìn)行酶處理以促進(jìn)所述周圍神經(jīng)釋出干細(xì)胞。

14.如實(shí)施方式13所述的方法，其中，所述酶處理包括用蛋白酶進(jìn)行處理。

15.如實(shí)施方式14所述的方法，其中，所述蛋白酶是膠原蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶中的至少一種。

16.如實(shí)施方式1所述的方法，其進(jìn)一步包括：

從所述受試者手術(shù)切除周圍神經(jīng)的至少一部分；

使手術(shù)切除的周圍神經(jīng)暴露于外源刺激選定的一段時(shí)間；

在所述選定一段時(shí)間后，從經(jīng)刺激的周圍神經(jīng)獲取胚胎干細(xì)胞；及

在非分化性培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。

雖然已示出和描述了多種具體的實(shí)施方式，但應(yīng)理解的是，在不脫離本公開(kāi)的主旨和范圍的情況下可以進(jìn)行多種變化。

10.參考文獻(xiàn)的引用

本申請(qǐng)中引用的全部出版物、專利、專利申請(qǐng)和其他文件出于所有目的通過(guò)援引以其整體并入本文，其程度等同于單獨(dú)指明將各個(gè)出版物、專利、專利申請(qǐng)和其他文件出于所有目的通過(guò)援引并入。在本文并入的一種或多種參考文獻(xiàn)與本公開(kāi)的教導(dǎo)不一致的情況下，以本說(shuō)明書的教導(dǎo)為準(zhǔn)。

序列表

<110> 堪薩斯大學(xué)

<120> 哺乳動(dòng)物周圍神經(jīng)源性干細(xì)胞、其產(chǎn)生方法及其用途

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