本發(fā)明涉及用于在核酸擴增反應(yīng)中定量核酸的方法。

發(fā)明背景

定量PCR的一個需要是準(zhǔn)確確定給定樣品中起始模板的拷貝數(shù)，這通常通過測量未知物的擴增的循環(huán)閾值(CT；即，為了增加超過預(yù)確定的閾值的測量的熒光的循環(huán)數(shù))和將此返回與已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比來實現(xiàn)。較低的CT表示更大的起始模板量。通常將CT為確定擴增反應(yīng)從基線轉(zhuǎn)換為指數(shù)擴增階段的點。

然而，就診斷儀器來說使用標(biāo)準(zhǔn)曲線是困難的，其中通常不方便運行該曲線。此外，標(biāo)準(zhǔn)曲線在反應(yīng)和反應(yīng)之間可能不同，取決于反應(yīng)條件，樣品中某些離子的存在等，因此考慮最好的實踐是使用對于每個反應(yīng)產(chǎn)生的獨立的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對于診斷測定，并且更特別是在通常依賴于單個反應(yīng)的護理裝置的情況下，這顯然是不切實際的。

已知使用測定擴增內(nèi)部的充分表征的擴增，測量與已知度量的偏差；這也基于來自實時數(shù)據(jù)的CT測量。然而，這不總是方便的，因為內(nèi)部對照可能與反應(yīng)成分競爭，降低檢測極限和犧牲靈敏度。

對與診斷儀器相兼容的改善的定量方法存在需求。我們描述了一種方法，其提供定量度量，作為相同擴增反應(yīng)的部分，其還允許使用解鏈曲線分析來降低反應(yīng)的復(fù)雜性，從單個擴增提供定量和基因分型信息。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明，提供在核酸擴增反應(yīng)中定量核酸的方法，所述方法包括：

提供模板核酸和第一和第二擴增引物，其中所述第一引物以有限的量存在；

在合適的條件下進行不對稱核酸擴增反應(yīng)，從而在反應(yīng)的初始階段產(chǎn)生雙鏈核酸產(chǎn)物，并且一旦限制性引物(limiting primer)耗盡，在反應(yīng)的后續(xù)階段產(chǎn)生單鏈核酸產(chǎn)物；

提供對所述單鏈核酸產(chǎn)物特異的探針，并讓所述探針與單鏈產(chǎn)物雜交；

一旦反應(yīng)進入后續(xù)階段，通過解鏈曲線分析的方式檢測產(chǎn)生的雙鏈核酸產(chǎn)物和單鏈核酸產(chǎn)物的相對量；

確定雙鏈產(chǎn)物峰高度與單鏈產(chǎn)物峰高度的比例是否小于1；并且

如果所述比例小于1，則基于雙鏈產(chǎn)物峰高度與單鏈產(chǎn)物峰高度的比例定量起始模板的量。

優(yōu)選地，所述核酸是DNA或cDNA。

不對稱PCR具有兩個不同的階段。在第一指數(shù)期，產(chǎn)物經(jīng)連續(xù)循環(huán)以指數(shù)倍增。隨著限制性引物耗盡，擴增過渡為產(chǎn)生單鏈擴增子的階段。

擴增結(jié)束時的解鏈曲線分析允許檢測單鏈產(chǎn)物和雙鏈核酸的量，從而允許產(chǎn)生兩個檢測峰。一個峰反映作為在指數(shù)期間形成的雙鏈的雙鏈體的部分并入的限制性引物，并且由于結(jié)合作為線性期的部分形成的單鏈DNA的探針確定一個峰。線性期后確定的單鏈峰的高度與起始模板的量成比例。由于上述的混雜的因素，這單獨不提供足夠的數(shù)據(jù)以定量起始模板。然而，因為雙鏈產(chǎn)物的量有限(由限制性引物與過量引物的比例限定)，雙鏈產(chǎn)物的最大量在從指數(shù)期到線性期的過渡處達到閾值，并且不增加超過它。過渡期后，對于要結(jié)合的探針存在增加量的單鏈模板，并且存在因此增加的第二峰(其高度與起始模板量成比例)。雙鏈峰因此用作限定的校準(zhǔn)物或參比物，由此測量單鏈產(chǎn)物的高度。

dsDNA峰也可以用作用于第二峰的接受或拒絕閾值，原因在于其高度僅可以達到最大閾值，并且其還可以用作已知的定量標(biāo)志物以測量成比例的ssDNA峰高度。即，如果確定的dsDNA與ssDNA的比例小于1，則這是擴增已經(jīng)達到閾值的指示；該比例可以用作CT的替代物。如果dsDNA與ssDNA的比例大于1，則擴增未達到過渡閾值，并且結(jié)果不能可信地用于定量起始模板。因此，如果所述比例大于1，則該方法可以進一步包括放棄反應(yīng)。備選地，該方法可以進一步包括繼續(xù)反應(yīng)直到所述比例小于1。

可以將單鏈產(chǎn)物的量相對雙鏈產(chǎn)物的量校準(zhǔn)化；即，雙鏈產(chǎn)物的量可以預(yù)確定(例如，通過使用預(yù)確定量的限制性引物)，并且該已知測量值用于基于雙鏈與單鏈產(chǎn)物的比例確定單鏈產(chǎn)物的量。

雙鏈和單鏈產(chǎn)物的量通過解鏈曲線分析來檢測。在優(yōu)選的實施方案中，使用可檢測標(biāo)簽；例如，為了檢測雙鏈產(chǎn)物，可以使用優(yōu)先結(jié)合雙鏈核酸的熒光染料。優(yōu)選的這樣的染料是Green或相關(guān)染料。

在其他實施方案中，限制性引物本身可以用可檢測標(biāo)簽標(biāo)記；這允許引物結(jié)合到要檢測和區(qū)分的雙鏈產(chǎn)物中。合適的染料可以是熒光標(biāo)簽，如6-FAM。

單鏈產(chǎn)物通過對產(chǎn)物內(nèi)的靶序列特異的探針的方式檢測。最初探針可以存在于擴增反應(yīng)內(nèi)，或可以在擴增之后加入?？梢詸z測探針的存在，并且因此通過探針從產(chǎn)物的結(jié)合或解離的解鏈曲線分析確定單鏈產(chǎn)物的量?？梢詷?biāo)記探針，例如用熒光標(biāo)簽標(biāo)記，或可以使用對雙鏈DNA特異的染料檢測雜交。在優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)簽或染料提供與用于檢測雙鏈產(chǎn)物的標(biāo)簽或染料不同的信號。

所述方法可以進一步包括預(yù)確定限制性引物的量，以提供預(yù)確定的雙鏈DNA的量的步驟。這可以基于要進行的反應(yīng)選擇，并且可以選擇以提供所需程度的對反應(yīng)的敏感性。例如，在低于限定的拷貝數(shù)，僅產(chǎn)生dsDNA，因此可以選擇限制性引物的量以給出1∶15至1∶5的dsDNA與ssDNA比例；這保證產(chǎn)物的比例在限定的范圍內(nèi)，由此改善方法的靈敏度并且將峰高度調(diào)至特定閾值。

在本發(fā)明的某些實施方案中，對單鏈產(chǎn)物特異的探針可以是可以用于區(qū)分靶序列的等位基因的探針；例如，存在于起始模板中的特定基因的等位基因。例如，探針可以是如國際專利公開WO2012/093262中所述的那樣，其內(nèi)容通過參考結(jié)合于本文。該公開描述了利用與具有不同解鏈溫度的突變體和野生型等位基因雜交的探針，使用探針作為阻斷探針以優(yōu)先擴增基因座的突變體等位基因。相似的探針可以用于本方法，以區(qū)別靶基因的等位基因。以此方式，本方法可以不僅定量起始模板，而且用于對模板基因分型。在該實施方案中，探針以比其與第二等位基因雜交所用的解鏈溫度低的解鏈溫度(Tm)與第一等位基因雜交；引物在寡核苷酸探針結(jié)合位點側(cè)面的第一和第二位點處與樣品中的核酸雜交；其中引物：樣品的Tm高于探針：第一等位基因的Tm；并且所述方法包括以下步驟：將反應(yīng)混合物維持在探針：第一等位基因Tm和探針：第二等位基因Tm之間的溫度，從而探針優(yōu)先與第二等位基因雜交；對反應(yīng)混合物進行熱循環(huán)擴增，該擴增包括解鏈階段、退火階段和延伸階段，其中延伸和退火階段的溫度在探針：第一等位基因Tm和探針：第二等位基因Tm之間，從而探針在這些階段與第二等位基因雜交；由此擴增第一等位基因；并且探針與樣品的雜交在為或低于探針：第一等位基因Tm的溫度，和在為或低于探針：第二等位基因Tm的較高溫度檢測。

在本發(fā)明的進一步實施方案中，探針可以是接頭探針，如國際申請WO2013/041853中所述的，其內(nèi)容通過參考結(jié)合于本文。該申請描述了使用具有由接頭核酸序列分開的錨區(qū)域和報告區(qū)域的探針，所述錨區(qū)域和報告區(qū)域具有不相關(guān)的解鏈溫度。該探針也可以用于進行靶點的基因分型，其中報告區(qū)域設(shè)計為當(dāng)與野生型和突變體等位基因序列雜交時，具有第一和第二解鏈溫度。

附圖簡述

現(xiàn)在將僅通過實施例和參考附圖來描述本發(fā)明的這些和其他方面，其中：

圖1顯示不對稱PCR的指數(shù)和線性擴增階段中DNA的量的示意圖；

圖2顯示來自樣品反應(yīng)的單鏈和雙鏈DNA的相對峰高度；

圖3顯示對樣品中的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)進行的樣品測定的結(jié)果；和

圖4至7顯示對丙型肝炎病毒(HCV)進行的樣品測定的結(jié)果。

附圖詳述

首先參考圖1，這顯示不對稱PCR擴增反應(yīng)中DNA量的示意圖。該反應(yīng)包括模板，以及第一和第二引物，第一引物以有限的量存在。在最初指數(shù)階段，兩種引物都以足夠量存在以允許在連續(xù)循環(huán)中倍增產(chǎn)物，并產(chǎn)生雙鏈DNA。一旦限制性引物耗盡，反應(yīng)過渡到線性階段，其中產(chǎn)生單鏈擴增子，其以線性增加而不是指數(shù)增加。

如果將限制性引物使用熒光團標(biāo)記，或如果使用雙鏈特異性染料如Green，則雙鏈產(chǎn)物的量可以容易地使用解鏈曲線分析進行定量。加入用于單鏈產(chǎn)物的分開的探針-例如，使用第二熒光團標(biāo)記-也可以用于定量單鏈產(chǎn)物。探針可以存在于反應(yīng)混合物中，或可以在擴增后加入。此外，以不同特異性與不同靶序列雜交的探針的使用可以用于進一步分析單鏈產(chǎn)物。例如，單鏈產(chǎn)物可以通過解鏈曲線分析測定以區(qū)分不同基因型。

雙鏈產(chǎn)物的量由限制性引物的量限制，從而雙鏈產(chǎn)物的最大量是已知的。這允許雙鏈產(chǎn)物用于校準(zhǔn)確定量的單鏈產(chǎn)物，或作為參考值以在解鏈曲線分析期間由測量的峰高度確定單鏈產(chǎn)物的量。

引物標(biāo)記的產(chǎn)物也可以用于產(chǎn)生CT值，其用作對反應(yīng)的核對；此外，線性期之后單鏈產(chǎn)物的熒光與起始模板的量成比例。

然而，因為雙鏈產(chǎn)物受限制性引物的量限制，這也可以用于核對反應(yīng)的量和作為內(nèi)部對照。如圖2中所示，反應(yīng)將產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物直至最大量。在隨后的擴增循環(huán)中該量將不增加，而單鏈產(chǎn)物不這樣受限，并且因此繼續(xù)增加。因此擴增可以進行，直到其到線性期，并且可以確定產(chǎn)生的核酸的相對量(例如，通過在熒光解鏈曲線分析中確定峰高度)。dsDNA峰可以用作對于ssDNA峰的接受或放棄閾值-如果峰的比例小于1(即，存在比dsDNA多的ssDNA)，則反應(yīng)已經(jīng)經(jīng)過過渡階段并且ssDNA的量可以認(rèn)為與起始模板成比例。

相反，如果峰的比例大于1(存在比ssDNA多的dsDNA)，則反應(yīng)還沒有經(jīng)過過渡階段，并且不能認(rèn)為ssDNA的量與起始模板直接成比例。在該情況下，因為已經(jīng)失敗，放棄測定。備選地，可以繼續(xù)反應(yīng)，直到峰比例小于1。

以此方式，H1(dsDNA峰的高度)與H2(ssDNA峰的高度)的比例的測量都給予內(nèi)部控制以保證反應(yīng)完成，并且如果dsDNA的峰量已知，可以用作已知量標(biāo)簽。這可以給出起始模板量的絕對值以及相對定量。同樣，H1(dsDNA)的絕對值可以用于確定反應(yīng)是否完成。

該方法的實例在圖3中顯示。使用結(jié)核分枝桿菌作為模型系統(tǒng)，將一個引物標(biāo)記，用FAM-T替代兩個T，并且另一個引物未標(biāo)記。使用對擴增的序列特異的探針來檢測擴增。

反應(yīng)條件以及探針和引物如英國專利申請GB1317355.4中所用的。簡言之，合成兩種接頭探針，覆蓋跨MTB rpoB基因的密碼子507-520和520-533的90bp區(qū)域。使用氰基乙基亞磷酰胺方法制備寡核苷酸。在每個探針中探針的兩個報告結(jié)構(gòu)域由接頭連接。每個探針的3’端包括阻斷基團。注意，兩個接頭探針覆蓋基因組序列的毗鄰區(qū)。探針序列是：

rpoB(507＞520)連接的-探針

(5′＞3′)

(SEQ ID NO 1)

rpoB(520＞533)連接的-探針

(5′＞3′)

(SEQ ID NO 2)

1＝熒光素dT

2＝磷酸區(qū)塊

3＝三甲氧基芪

*＝肌苷殘基(5個/探針)

用于來自樣品的靶rpoB序列的PCR擴增的引物顯示如下：

FWD引物v1

(5’＞3’)

GCAGACGTTGATCAACATCC(SEQ ID NO 3)

FWD引物v2

(5’＞3’)

CGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTT(SEQ ID NO 4)。

使用這些探針，可能檢測由于探針序列和靶序列之間的錯配引起的解鏈溫度的改變導(dǎo)致的靶序列中突變的存在。單堿基錯配可以以高靈敏度檢測。參見，例如，國際專利申請WO2013/041853，其描述了使用相似的探針(盡管僅是單個探針，不是相鄰探針對)來檢測rpoB基因中的SNP突變。

標(biāo)記的探針在對稱和不對稱PCR中都給出好的擴增檢測(即，在標(biāo)記的引物不是有限的情況下，和其有限的情況下)。兩個峰(ss和ds的)檢測允許建立過渡閾值；降低有限的標(biāo)記的引物的量能夠用于降低該閾值(參見圖3.1中的解鏈曲線，表明分別是＞10^5個模板拷貝數(shù)和＜10^5個模板拷貝數(shù)的過渡閾值)。

計算峰高度的比例(dsDNA與ssDNA的比例，參見圖3.2)給出超過至少5個對數(shù)(logs)的起始拷貝數(shù)至100拷貝的目標(biāo)模型系統(tǒng)的好的近似值。如可以看到的，起始拷貝數(shù)的對數(shù)以線性方式與峰高度比例相關(guān)。因此，擴增反應(yīng)后確定峰高度比例允許確定起始拷貝數(shù)。圖上兩條分開的線表示來自使用150um和250um探針的線性圖的數(shù)據(jù)。

以此方式，使用限制性引物進行不對稱PCR，接著比較雙鏈和單鏈產(chǎn)物的量，表明提供確定起始模板量的有用方法。例如，反應(yīng)可以在測試樣品上利用已知量的限制性引物進行。一旦達到所需的dsDNA與ssDNA比例，則可以確定峰高度。dsDNA的量由限制性引物的量控制，而ssDNA的量與起始模板的量成比例。因此，dsDNA峰可以用作已知量以確定反應(yīng)中ssDNA的量。由此，可以確定起始模板的量。

盡管這些實例描述了限制性引物的濃度與起始模板拷貝數(shù)的比較，測定可以同樣地(并且更直接地)比較每個的拷貝數(shù)或每個的濃度，條件是給定的DNA序列的拷貝數(shù)可以從濃度確定，并且反之亦然。

測定的進一步說明在圖4-7中顯示。這些表明樣品中丙型肝炎病毒(HCV)的量的定量的實例。對一系列已知起始拷貝數(shù)的樣品進行不對稱PCR。

引物和探針如下：

HCV-Fwd：5’-1GCTAGCCGAGAGTGTGGGT-3’(SEQ ID NO5)

HCV-Rev：5’-TGCACGGTCTACGAGACCTCC(SEQ ID NO6)

1＝三甲氧基芪

粗體下劃線＝熒光素dT

正向引物是限制性引物。

病毒載量探針1：

1GCCT5GTGGTAC5GCCTGAT66666AGGGTGCT5GCGAG5GCCCC3(SEQ ID NO 7)

1＝TMS(三甲氧基芪)

5＝熒光素dT

6＝肌苷

3＝丙醇

探針是WO2013/041853中所述類型的接頭探針，其中兩個片段由聚肌苷分隔，并且在與靶標(biāo)雜交時具有不相關(guān)的解鏈溫度。

反應(yīng)條件和循環(huán)次數(shù)如下：

循環(huán)參數(shù)

利用不同起始量的HCV模板(HCV5馬德里質(zhì)粒)進行幾次測定。結(jié)果顯示在圖4中。這表明，與起始模板無關(guān)，引物峰(即，檢測結(jié)合有引物的dsDNA的峰)處于恒定的高度，而ssDNA峰的高度取決于起始模板的量而變化(NTC＝無模板對照)。起始模板和ssDNA峰高度之間的關(guān)系是線性的，參見圖5。這允許測定內(nèi)(intra assay)定量，其中峰比例可以用于確定起始模板的量。

調(diào)節(jié)限制性引物的濃度導(dǎo)致表示標(biāo)記的引物(相當(dāng)于dsDNA)的峰的大小的逐步增加，和由探針測定的靶序列強度的減少。參見圖6。在有很多限制性引物(本實施例中為0.25um)的情況下，dsDNA峰高度與ssDNA峰高度的比例接近1；然而，只要其仍然小于1，就仍然可以使用該測定。此外，不同起始量的靶標(biāo)之間的區(qū)別變得更窄。用于這些圖的起始模板的濃度與圖4中使用的相同；除了限制性引物的濃度之外，其他反應(yīng)條件也是一樣。不考慮限制性引物濃度，如圖7中所示的，保持起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)和峰比例之間的線性關(guān)系(x軸是對數(shù)的)。注意，在這些圖中，顯示的比例是ssDNA與dsDNA的比例，不是圖3中所示的dsDNA與ssDNA的比例。因此，對于這些結(jié)果，所需要的比例大于1；對于某些值，未達到該比例，例如0.1um限制性引物和2.5x10^4個起始模板。盡管如此，保持這一關(guān)系。重要的是，盡管在這些特定實例中的檢測極限相對差(低拷貝數(shù)給出小于1的ssDNA與dsDNA比例)，但這是特定測定設(shè)計的后果。該結(jié)果用于證明原理，預(yù)期該原理對一定范圍的備選反應(yīng)條件有效。