本發(fā)明涉及癌癥。更特別地，本發(fā)明涉及確定癌癥的侵襲性、癌癥預(yù)后和/或預(yù)測對抗癌治療的響應(yīng)的方法。

背景技術(shù)：

激素受體(ER和PR)和HER2是在臨床實踐中用于輔助進行乳腺癌的組織病理學(xué)分型和進行控制決策的標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物。激素受體(HR)-和HER2-陽性腫瘤分別從他莫昔芬和抗-HER2治療中獲益。另一方面，目前還沒有用于控制三陰性乳腺癌(TNBC，其缺乏HR/HER2的表達)的靶向藥物治療。TNBC與HR-陽性腫瘤相比對化療更為敏感，原因是其通常具更高增殖性，而且與非TNBC相比，化療后的病理學(xué)完全響應(yīng)(pCR)更可能在TNBC中出現(xiàn)^1,2。矛盾地，與非TNBC相比，TNBC與更差的生存率相關(guān)聯(lián)，因為帶有殘留疾病的TNBC患者更常發(fā)生復(fù)發(fā)^1,2。僅有31％的TNBC患者在化療后發(fā)生pCR³，因而強調(diào)了靶向治療的需要。

轉(zhuǎn)錄組分型已被用于將乳腺癌的異質(zhì)性分成五個內(nèi)在的‘PAM50’亞型：與臨床結(jié)果相關(guān)的Luminal A、Luminal B、基底樣、HER-2和正常樣亞型^4-8。已經(jīng)開發(fā)了多種基因印記來預(yù)測結(jié)果或者對治療的響應(yīng)，包括：MammaPrint⁹、OncotypeDx^10,11、Theros^12-15。這些商業(yè)化印記依賴于基于臨床表型如腫瘤響應(yīng)或生存時間選擇基因的模型。盡管其具有臨床效用，但這些模型不能確定感興趣的表型的核心生物學(xué)機制。近期，基于生物功能驅(qū)動的基因共表達印記的方法，“吸引子元基因(attractor metagene)”，已被用于預(yù)測某些癌癥的生存率。然而，這樣的方法處于早期階段，并且需要進行大量工作以開發(fā)關(guān)于總體癌癥以及特定癌癥的這種吸引子元基因分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及來自一個或多個功能性元基因的多個差異表達基因表達水平的比較，所述功能性元基因包括碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因；其中這些元基因中的多個基因的表達水平的比較被用于幫助確定某些癌癥的侵襲性。該比較還可以，或替代地，幫助為患者提供癌癥預(yù)后。本發(fā)明還涉及通過確定與前述12個功能性元基因中的一個或多個相關(guān)的一個或多個基因的表達水平來預(yù)測癌癥對抗癌治療的響應(yīng)。

本發(fā)明進一步涉及差異表達蛋白的特定印記的表達水平的比較，以促進或幫助確定特定癌癥的侵襲性、癌癥患者的預(yù)后和/或預(yù)測對抗癌治療的響應(yīng)。在確定癌癥侵襲性、預(yù)后和/或治療中，這些比較中的一個或兩者也可與前述來自一個或多個前述功能性元基因的多個基因的表達水平的比較相結(jié)合。

在第一方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物中的癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在第二方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較有利的癌癥預(yù)后。

在上述方面的一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因和/或所述一個或多個低表達基因選自前述元基因中的一個。在一個替代性實施方式中，所述一個或多個過表達基因和/或一個或多個低表達基因選自前述元基因中的多個。

適合地，對于上述方面的方法，所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因包括表21中列出的一個或多個基因。

在第三方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物中的癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自代謝元基因、信號傳導(dǎo)元基因、發(fā)育和生長元基因、染色體分離/復(fù)制元基因、免疫應(yīng)答元基因和蛋白質(zhì)合成/修飾元基因，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在第四方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自代謝元基因、信號傳導(dǎo)元基因、發(fā)育和生長元基因、染色體分離/復(fù)制元基因、免疫應(yīng)答元基因和蛋白質(zhì)合成/修飾元基因，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較有利的癌癥預(yù)后。

在第三和第四方面的一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因和/或所述一個或多個低表達基因選自前述元基因中的一個。在一個替代性實施方式中，所述一個或多個過表達基因和/或所述一個或多個低表達基因選自前述元基因中的多個。

適合地，所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因包括表22中列出的一個或多個基因。

在第三和第四方面的方法的特定實施方式中，所述一個或多個過表達基因和/或所述一個或多個低表達基因來自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個。

在第五方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物中的癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的一個或多個過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的一個或多個低表達基因的表達水平，其中：與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述一個或多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述一個或多個低表達基因的較高相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述一個或多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述一個或多個低表達基因的較低相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在第六方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的一個或多個過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的一個或多個低表達基因的表達水平，其中：與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述一個或多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述一個或多個低表達基因的較高相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述一個或多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述一個或多個低表達基因的較低相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較有利的癌癥預(yù)后。

在某些實施方式中，與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述基因?qū)儆贑IN元基因。非限制性實例包括選自ATP6V1C1、RAP2A、CALM1、COG8、HELLS、KDM5A、PGK1、PLCH1、CEP55、RFC4、TAF2、SF3B3、GPI、PIR、MCM10、MELK、FOXM1、KIF2C、NUP155、TPX2、TTK、CENPA、CENPN、EXO1、MAPRE1、ACOT7、NAE1、SHMT2、TCP1、TXNRD1、ADM、CHAF1A和SYNCRIP的基因。優(yōu)選地，所述基因選自：MELK、MCM10、CENPA、EXO1、TTK和KIF2C。

在某些實施方式中，與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述基因?qū)儆贓R元基因。非限制性實例包括選自：BTG2、PIK3IP1、SEC14L2、FLNB、ACSF2、APOM、BIN3、GLTSCR2、ZMYND10、ABAT、BCAT2、SCUBE2、RUNX1、LRRC48、MYBPC1、BCL2、CHPT1、ITM2A、LRIG1、MAPT、PRKCB、RERE、ABHD14A、FLT3、TNN、STC2、BATF、CD1E、CFB、EVL、FBXW4、ABCB1、ACAA1、CHAD、PDCD4、RPL10、RPS28、RPS4X、RPS6、SORBS1、RPL22和RPS4XP3的基因。優(yōu)選地，所述基因選自：MAPT和MYB。

在某些實施方式中，第五和第六方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個其他過表達基因的表達水平，和/或選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個其他低表達基因的表達水平，其中：所述其他過表達基因與所述其他低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性和/或較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述其他過表達基因與所述其他低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性和/或較有利的癌癥預(yù)后。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

適合地，與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因的表達水平的比較與所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和/或所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較相結(jié)合，以得到第一綜合評分。

在第七方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中的癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個過表達基因的表達水平，和/或選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個低表達基因的表達水平，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在第八方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個過表達基因的表達水平，和/或選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個低表達基因的表達水平，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比較有利的癌癥預(yù)后。

在第七和第八方面的一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSX3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在第七和第八方面的一個實施方式中，所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

在特定的實施方式中，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和/或選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中：所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性和/或較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性和/或較有利的癌癥預(yù)后。

適合地，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和/或一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較由此得到綜合評分。在一個特定的實施方式中，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和/或所述一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較與下述相結(jié)合：

(i)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因的表達水平的比較，以得到第二綜合評分；或

(ii)所述第一綜合評分，以得到第三綜合評分；或

(iii)所述選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的過表達基因的表達水平和/或所述選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的低表達基因的表達水平的比較，以得到第四綜合評分；或

(iv)所述過表達基因的表達水平和/或所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個，以得到第五綜合評分；或

(v)所述過表達基因的表達水平和/或所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因中的一個或多個，以得到第六綜合評分。

其中第二、第三、第四、第五和/或第六綜合評分指示或關(guān)聯(lián)哺乳動物中癌癥的侵襲性和/或預(yù)后。

在特定的實施方式中，第二、第三、第四、第五和/或第六綜合評分至少部分地通過加法、減法、乘法、除法和/或求冪得到。

在優(yōu)選的實施方式中，第一、第二和/或第三綜合評分至少部分地通過求冪得到，其中使所述其他過表達基因表達水平和其他低表達基因表達水平的比較自乘為以下比較次冪(is raised to a power of)：

(i)染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因的表達水平的比較；和/或

(ii)過表達蛋白表達水平和/或低表達蛋白表達水平的比較。

在第九方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中的癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和/或選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中：所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在第十方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和/或選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中：所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比較有利的癌癥預(yù)后。

在第十一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因，其中所述過表達基因與所述低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

適合地，對于本方面，所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因包括表21中列出的一個或多個基因。

在第十二方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自代謝元基因、信號傳導(dǎo)元基因、發(fā)育和生長元基因、染色體分離/復(fù)制元基因、免疫應(yīng)答元基因和蛋白質(zhì)合成/修飾元基因，其中所述過表達基因與所述低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在第十一和第十二方面的一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因和/或所述一個或多個低表達基因選自前述元基因中的一個。在一個替代性實施方式中，所述一個或多個過表達基因和/或所述一個或多個低表達基因選自前述元基因中的多個。

適合地，所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因包括表22中列出的一個或多個基因。

在特定的實施方式中，所述一個或多個過表達基因和所述一個或多個低表達基因來自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個。

根據(jù)第十一和第十二方面的方法，比較一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平的步驟包括比較所述一個或多個過表達基因的平均表達水平和/或所述一個或多個低表達基因的平均表達水平。這可以包括計算所述一個或多個過表達基因的平均表達水平與所述一個或多個低表達基因的平均表達水平的比率。適合地，所述比率提供侵襲性評分，其指示或關(guān)聯(lián)癌癥侵襲性和較不利的預(yù)后?；蛘?，比較一個或多個過表達基因的表達水平和/或一個或多個低表達基因的表達水平的步驟包括比較所述一個或多個過表達基因的表達水平的總和和/或所述一個或多個低表達基因的表達水平的總和。這可以包括計算所述一個或多個過表達的基因表達水平的總和和/或所述一個或多個低表達的基因表達水平的總和的比率。

在第十三方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：確定所述哺乳動物的一個或多個非有絲分裂癌癥細胞中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的一個或多個基因的表達水平，其中較高的表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高的響應(yīng)。

適合地，所述與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的一個或多個基因選自TTK、CEP55、FOXM1和SKIP2和/或在表4中列出的任何CIN基因。

在第十四方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的一個或多個過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的一個或多個低表達基因的表達水平，其中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述一個或多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述一個或多個低表達基因改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在某些實施方式中，與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述基因?qū)儆贑IN元基因。非限制性實例包括選自ATP6V1C1、RAP2A、CALM1、COG8、HELLS、KDM5A、PGK1、PLCH1、CEP55、RFC4、TAF2、SF3B3、GPI、PIR、MCM10、MELK、FOXM1、KIF2C、NUP155、TPX2、TTK、CENPA、CENPN、EXO1、MAPRE1、ACOT7、NAE1、SHMT2、TCP1、TXNRD1、ADM、CHAF1A和SYNCRIP的基因。優(yōu)選地，所述基因選自：MELK、MCM10、CENPA、EXO1、TTK和KIF2C。

在某些實施方式中，與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述基因?qū)儆贓R元基因。非限制性實例包括選自BTG2、PIK3IP1、SEC14L2、FLNB、ACSF2、APOM、BIN3、GLTSCR2、ZMYND10、ABAT、BCAT2、SCUBE2、RUNX1、LRRC48、MYBPC1、BCL2、CHPT1、ITM2A、LRIG1、MAPT、PRKCB、RERE、ABHD14A、FLT3、TNN、STC2、BATF、CD1E、CFB、EVL、FBXW4、ABCB1、ACAA1、CHAD、PDCD4、RPL10、RPS28、RPS4X、RPS6、SORBS1、RPL22和RPS4XP3的基因。優(yōu)選地，所述基因選自：MAPT和MYB。

適合地，該方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個其他過表達基因的表達水平，和/或選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個其他低表達基因的表達水平，其中：所述一個或多個其他過表達基因與所述一個或多個其他低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

在某些實施方式中，所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和/或所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較與與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述一個或多個過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述一個或多個低表達基因的表達水平的比較相結(jié)合以得到第一綜合評分，其指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療的響應(yīng)。舉例而言，所述第一綜合評分可以至少部分地通過加法、減法、乘法、除法和/或求冪得到。優(yōu)選地，所述綜合評分通過求冪得到，其中使所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較自乘為與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述一個或多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述一個或多個低表達基因的表達水平的比較次冪。

在第十五方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個過表達基因的表達水平，和/或選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個低表達基因的表達水平，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

適合地，第十一、第十二、第十三、第十四和第十五方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和/或選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

適合地，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和/或一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較由此得到綜合評分。在一個特定的實施方式中，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和/或所述一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較與下述相結(jié)合：

(i)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因的表達水平的比較，以得到第二綜合評分；或

(ii)所述第一綜合評分，以得到第三綜合評分；或

(iii)所述選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的過表達基因的表達水平和/或所述選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的低表達基因的表達水平的比較，以得到第四綜合評分；或

(iv)所述過表達基因的表達水平與所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個，以得到第五綜合評分；或

(v)所述過表達基因的表達水平與所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因中的一個或多個，以得到第六綜合評分。

其中第二、第三、第四、第五和/或第六綜合評分指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對抗癌治療的響應(yīng)。

在特定的實施方式中，第一、第二、第三、第四、第五和/或第六綜合評分至少部分通過加法、減法、乘法、除法和/或求冪得到。

在優(yōu)選的實施方式中，第一、第二和/或第三綜合評分至少部分地通過求冪得到，其中使所述其他過表達基因的表達水平和/或其他低表達基因的表達水平的比較自乘為以下比較次冪：

(i)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因的表達水平和/或與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因的表達水平的比較；和/或

(ii)過表達蛋白的表達水平和/或低表達蛋白的表達水平的比較。

在第十六方面，本發(fā)明提供預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和/或選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

適合地，第十一、第十二、第十三、第十四、第十五和第十六方面的抗癌治療選自內(nèi)分泌治療、化療、免疫治療和分子靶向治療。在某些實施方式中，所述抗癌治療包括間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑、BCR-ABL抑制劑、熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑、維甲酸、B細胞淋巴瘤2(Bcl2)抑制劑、糖原異生抑制劑、p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑、促分裂原活化蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)抑制劑、雷帕霉素哺乳動物靶標(biāo)(mTOR)抑制劑、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K)抑制劑、胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)抑制劑、磷脂酶C-γ(PLCγ)抑制劑、c-Jun N-端激酶(JNK)抑制劑、p21活化激酶-1(PAK1)抑制劑、脾酪氨酸激酶(SYK)抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、X連鎖凋亡抑制劑(XIAP)抑制劑、polo樣激酶1(PLK1)抑制劑、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)抑制劑及其組合。

適合地，第十一、第十二、第十三、第十四、第十五和第十六方面的方法進一步包括如下步驟：對哺乳動物施用治療有效量的抗癌治療。優(yōu)選地，所述抗癌治療在改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高的響應(yīng)時施用。

在第十七方面，本發(fā)明提供預(yù)測哺乳動物中癌癥對免疫治療劑的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自ADORA2B、CD36、CETN3、KCNG1、LAMA3、MAP2K5、NAE1、PGK1、STAU1、CFDP1、SF3B3和TXN的一個或多個過表達基因的表達水平和/或選自APOBEC3A、BCL2、BTN2A2、CAMSAP1、CAMK4、CARHSP1、FBXW4、GSK3B、HCFC1R1、MYB、PSEN2和ZNF593的一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述免疫治療藥劑相對提高或降低的響應(yīng)。

適合地，所述免疫治療劑是免疫檢查點抑制劑。優(yōu)選地，所述免疫檢查點抑制劑是或包括抗PD1抗體或抗PDL1抗體。

在第十八方面提供的是預(yù)測哺乳動物中癌癥對表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自NAE1、GSK3B、TAF2、MAPRE1、BRD4、STAU1、TAF2、PDCD4、KCNG1、ZNRD1-AS1、EIF4B、HELLS、RPL22、ABAT、BTN2A2、CD1B、ITM2A、BCL2、CXCR4和ARNT2的一個或多個過表達基因的表達水平和/或選自CD1C、CD1E、CD1B、KDM5A、BATF、EVL、PRKCB、HCFC1R1、CARHSP1、CHAD、KIR2DL4、ABHD5、ABHD14A、ACAA1、SRPK3、CFB、ARNT2、NDUFC1、BCL2、EVL、ULBP2、BIN3、SF3B3、CETN3、SYNCRIP、TAF2、CENPN、ATP6V1C1、CD55和ADORA2B的一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對EGFR抑制劑相對提高或降低的響應(yīng)。

在第十九方面提供的是預(yù)測哺乳動物中癌癥對多激酶抑制劑的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自SCUBE、CHPT1、CDC1、BTG2、ADORA2B和BCL2的一個或多個過表達基因的表達水平，和/或選自NOP2、CALR、MAPRE1、KCNG1、PGK1、SRPK3、RERE、ADM、LAMA3、KIR2DL4、ULBP2、LAMA4、CA9和BCAP31的一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述多激酶抑制劑相對提高或降低的響應(yīng)。

適合地，對于第十七、第十八和第十九方面的方法，所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述免疫治療劑、EGFR抑制劑或多激酶抑制劑相對提高的響應(yīng)；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述免疫治療藥劑、EGFR抑制劑或多激酶抑制劑相對降低的響應(yīng)。

在一些實施方式中，第十七、第十八和第十九方面的方法進一步包括如下步驟：分別向所述哺乳動物施用治療有效量的所述免疫治療劑、EGFR抑制劑或多激酶抑制劑。優(yōu)選地，所述免疫治療劑、EGFR抑制劑或多激酶抑制劑在改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平分別指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述免疫治療劑、EGFR抑制劑或多激酶抑制劑相對提高的響應(yīng)時施用。

適合地，對于前述方面的方法，比較一個或多個過表達基因或蛋白的表達水平與一個或多個低表達基因或蛋白的表達水平的步驟包括比較所述一個或多個過表達基因或蛋白的平均表達水平和/或所述一個或多個低表達基因或蛋白的平均表達水平。這可以包括計算所述一個或多個過表達基因或蛋白的平均表達水平與所述一個或多個低表達基因或蛋白的平均表達水平的比率。適合地，所述比率提供侵襲性評分，其指示或關(guān)聯(lián)癌癥侵襲性和較不利的預(yù)后?；蛘撸容^一個或多個過表達基因的表達水平與一個或多個低表達基因或蛋白的表達水平的步驟包括比較所述一個或多個過表達基因或蛋白的表達水平的總和與所述一個或多個低表達基因或蛋白的表達水平的總和。這可以包括計算所述一個或多個過表達基因或蛋白的表達水平的總和與所述一個或多個低表達基因或蛋白的表達水平的總和的比率。

在前述方法的某些實施方式中，隨后對所述哺乳動物的癌癥進行治療。

在第二十方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定用于癌癥治療的藥劑的方法，其包括如下步驟：

(i)使GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COG8、CFDP1和/或KCNG1的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與測試藥劑接觸；和

(ii)確定所述測試藥劑是否至少部分地降低、消除、壓制或抑制所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達和/或活性。

適合地，所述藥劑具有或表現(xiàn)出很少的脫靶和/或非特異性作用，或者沒有或不表現(xiàn)出顯著的脫靶和/或非特異性作用。

優(yōu)選地，所述藥劑是抗體或有機小分子。

在第二十一方面，本發(fā)明提供通過第十八方面的方法鑒定的用于癌癥治療的藥劑。

在第二十二方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物中的癌癥的方法，其包括如下步驟：向所述哺乳動物施用治療有效量的通過第十八方面的方法鑒定的藥劑。

優(yōu)選地，對于第二十、第二十一和第二十二方面的發(fā)明，所述癌癥具有選自GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COG8、CFDP1、KCNG1或其任意組合的過表達基因。

適合地，前述方面的方法進一步包括如下步驟：確定、評估或測定本文描述的過表達基因、低表達基因、過表達蛋白和/或低表達蛋白中一個或多個的表達水平。

適合地，在前述方面和實施方式中提及的哺乳動物是人。

在前述方面的本發(fā)明的某些實施方式中，所述癌癥包括乳腺癌、肺癌(包括肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)、生殖系統(tǒng)癌(包括卵巢癌、宮頸癌、子宮癌和前列腺癌)、腦和神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、頭頸癌、胃腸癌(包括結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌和胃癌)、肝癌(包括肝細胞癌)、腎癌(包括腎透明細胞癌和腎乳頭狀細胞癌)、皮膚癌(例如黑色素瘤和皮膚癌)、血細胞癌(包括淋巴樣癌和髓單核細胞癌)、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌(例如胰腺癌和垂體癌)、肌肉骨骼癌(包括骨和軟組織癌)，但不限于此。舉例而言，乳腺癌，包括侵襲性乳腺癌和如三陰性乳腺癌、2級乳腺癌、3級乳腺癌、淋巴結(jié)陽性(LN⁺)乳腺癌、HER2陽性(HER2⁺)乳腺癌和ER陽性(ER⁺)乳腺癌的癌癥亞型，但不限于此。

除非上下文另有要求，否則術(shù)語“包括”、“包含”、“含有”或類似術(shù)語旨在表示非排他性的包含，使得所記載的要素或特征的列表并不僅包括陳述或列舉的要素，而是可以包括其他未列舉或未陳述的要素或特征。

不定冠詞“一(a和an)”在這里用于指代或涵蓋單數(shù)或復(fù)數(shù)要素或特征，并且不應(yīng)被視為意指或限定“一個”或“單個”要素或特征。

附圖說明

圖1：乳腺癌亞型與侵襲性基因列表的相關(guān)性。根據(jù)侵襲性基因列表中206個基因(表4)的表達，使METABRIC數(shù)據(jù)集可視化。每種腫瘤的侵襲性評分計算為CIN元基因(CIN基因表達的平均值)與ER元基因(ER基因表達的平均值)的比率。(A)根據(jù)GENIUS組織學(xué)分類的侵襲性基因列表的表達。箱形圖顯示組織學(xué)亞型的侵襲性評分。(B)根據(jù)所有患者、非TNBC患者和ER+2級腫瘤患者的侵襲性評分(上排：按四分位數(shù)；下排：按中位數(shù))，分析了METABRIC數(shù)據(jù)集中患者的總體生存。顯示了比較上四分位數(shù)與下四分位數(shù)(上排)的以及越中位數(shù)的二分法(dichotomy)(高與低)的風(fēng)險比(HR)、置信區(qū)間(CI)和p值(對數(shù)秩檢驗，Prism)。每組中的患者數(shù)量(n)在括號中顯示。

圖2：侵襲性基因列表的網(wǎng)絡(luò)分析。(A)Ingenuity途徑分析使用對侵襲性基因列表中的206個基因的直接相互作用進行(紅色為過表達和綠色為低表達)。確定了一個高直接相互作用的網(wǎng)絡(luò)。(B)調(diào)查了A的網(wǎng)絡(luò)中的基因與侵襲性評分和總體生存的相關(guān)性(表5)，并且具有最高相關(guān)性的8個基因(MAPT、MYB、MELK、MCM10、CENPA、EXO1、TTK和KIF2C)仍然連接在直接相互作用網(wǎng)絡(luò)中。(C)根據(jù)在所有患者、非TNBC患者和ER+2級腫瘤患者中，C中8個基因的評分(上排：按四分位數(shù)；下排：按中位數(shù))，分析了METABRIC數(shù)據(jù)集中患者的總體生存。

圖3：METABRIC數(shù)據(jù)集中按8-基因評分分層的患者生存率。根據(jù)所有患者(A)或僅ER陽性患者(B)的所選擇設(shè)置中的8-基因評分，分析了METABRIC數(shù)據(jù)集中患者的總體生存。(A)在高與低8-基因評分(按中位數(shù)分開)中比較了TP53突變。通過中位數(shù)二分法將增殖標(biāo)志物Ki67的表達分開，并且然后根據(jù)它們的8-基因評分(按四分位數(shù)分開)對這些組中每一個的患者進行分層。疾病分期(I期-III期)通過中位8-基因評分分層。(B)ER⁺3級、ER+淋巴結(jié)陰性(LN-)和ER+LN+腫瘤通過四分位數(shù)分層。

圖4：與乳腺癌患者生存率相關(guān)的8-基因評分。4個已公布的數(shù)據(jù)集被用于驗證8-基因評分作為生存率的預(yù)測子。對每個數(shù)據(jù)集中的腫瘤計算8-基因評分，并且根據(jù)中位8-基因評分對患者生存進行分層；(A)GSE2990¹⁵、(B)GSE3494⁶⁵、(C)GSE2034⁶⁶和(D)GSE25066⁵³。在Kaplan-Meier生存曲線中顯示高與低8-基因評分比較的風(fēng)險比(HR)和置信區(qū)間(CI)和p值(對數(shù)秩檢驗，Prism)。患者數(shù)量(n)在括號中顯示。每個小圖中的表格顯示使用包括所有可用常規(guī)預(yù)測子的Cox-比例風(fēng)險模型的多變量生存分析。

圖5：侵襲性基因列表中的治療靶點。(A)用對照siRNA(Scrambled，Sc CTRL)或靶向指定基因的siRNA處理TNBC細胞系，MDA-MB-231、SUM159PT和Hs578T，并比較這些細胞在第6天的生存。所示數(shù)據(jù)是來自三個細胞系的平均值，其中每個細胞系處理三次重復(fù)。使用Prism進行單因素方差分析，*p<0.05、**p<0.01和***<0.001。單個細胞系的數(shù)據(jù)顯示在表5中。(B)使用一組乳腺癌細胞系制備用于TTK的免疫印跡的裂解產(chǎn)物。微管蛋白用作上樣對照。(C)在不存在或存在遞增劑量的TTK抑制劑(TTKi)AZ3146情況下的乳腺癌細胞系處理的劑量響應(yīng)曲線。使用處理后第6天進行的MTS/MTA試驗測定細胞的生存。百分生存率(n＝3每劑量)計算為來自處理細胞的信號與來自對照細胞的信號的百分比。(D)從C中每個細胞系的劑量響應(yīng)曲線，通過Prism測定影響50％細胞生存所需的TTK濃度(IC50)。

圖6：與乳腺癌生存相關(guān)的TTK蛋白表達。按照TTK的IHC染色(評分0-3)將大的乳腺癌患者群組(n＝409)中患者的總體生存分層。對所有患者以(A)四種TTK染色(類別0-3)和(B)兩個類別(0-2與3)顯示Kaplan-Meier生存曲線。對數(shù)秩檢驗和p值被用于生存曲線。(C)高TTK染色(類別3)在組織學(xué)亞組和有絲分裂指數(shù)中的分布。顯示的數(shù)據(jù)是在10個高倍視野(hpf)中作為有絲分裂細胞數(shù)測量的有絲分裂指數(shù)(中位數(shù)+范圍)。在右側(cè)顯示具有高TTK染色的腫瘤數(shù)與該群組中的腫瘤總數(shù)。高TTK表達分布遍及亞型且與有絲分裂指數(shù)不相關(guān)。

圖7：TTK與侵襲性亞型相關(guān)并且是治療靶點。(A)顯示3級腫瘤、淋巴結(jié)陽性患者(LN⁺)和具有3級腫瘤的LN⁺患者的Kaplan-Meier生存曲線。對數(shù)秩檢驗和p值被用于這些生存曲線。對于TNBC和HER2的患者，使用Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗(p值由星號標(biāo)記)(其對較早時間點的死亡給予更多的權(quán)重)，生存是統(tǒng)計學(xué)顯著的。具有高Ki67腫瘤和高TTK染色的患者的更差生存是一種趨勢，但沒有達到顯著。使用Prism進行生存曲線和統(tǒng)計學(xué)分析。(B)TNBC和非TNBC細胞系用指定濃度的單獨多西他賽(doc)、單獨TTK抑制劑(TTK)或者組合，處理6天。使用如方法中所描述的MTS/MTA試驗測定細胞生存。使用Prism中雙因素方差分析比較組合與單一藥劑以及與非TNBC細胞系，***p<0.001。(C)MDA-MB-231細胞用單獨的多西他賽或TTKi或者組合處理，并在96小時時收集以通過流式細胞術(shù)進行凋亡分析。早期凋亡細胞定義為膜聯(lián)蛋白V+/7-AAD-。

圖8：在Oncomine^TM中，TNBC中失調(diào)的基因、5年時的轉(zhuǎn)移事件和死亡的全局基因表達薈萃分析。(A)8個數(shù)據(jù)集中的TNBC與非TNBC比較，(B)7個數(shù)據(jù)集中在5年時具有轉(zhuǎn)移事件的腫瘤與在5年時無轉(zhuǎn)移事件的腫瘤比較，和(C)7個數(shù)據(jù)集中導(dǎo)致在5年時死亡的腫瘤與在5年時未導(dǎo)致死亡的腫瘤比較。圖例中說明了比較中使用的數(shù)據(jù)集，并且還包括對熱圖著色(heat map coloring)的圖解。熱圖圖解表示根據(jù)基因排名(其基于p值)的頂部或底部x％基因位置。

圖9：206侵襲性基因列表的衍生。(A和B)是Oncomine^TM中TNBC和/或5年時轉(zhuǎn)移和死亡分析之間共有的頂部過表達基因和底部低表達基因的維恩圖。(C和D)來自A和B的維恩圖與來自METABRIC數(shù)據(jù)集的與相鄰正常乳腺組織相比在TNBC中失調(diào)的基因交叉。小圖C和D中以粗體標(biāo)記的基因是構(gòu)成未過濾的侵襲性基因列表的206個基因。

圖10：206侵襲性基因列表與元基因吸引子之間的共有基因。維恩圖顯示了206侵襲性基因列表與染色體不穩(wěn)定性(CIN)、淋巴細胞特異性和ER吸引子(Cheng等2013a，Cheng等2013b)之間的共同基因(加粗)。下表列出了共有的基因。顯示了在本研究中構(gòu)成8-基因印記的6種過表達基因(用紅色標(biāo)記)和2種低表達基因(用綠色標(biāo)記)。僅存在于206基因印記中的剩余140個基因的基因集富集分析揭示了這些基因在細胞周期中起作用。

圖11：乳腺癌亞型和侵襲性基因列表的相關(guān)性。根據(jù)侵襲性基因列表中206個基因的表達，使METABRIC數(shù)據(jù)集可視化。每種腫瘤的侵襲性評分計算為過表達基因的標(biāo)準(zhǔn)化z評分表達值之和除以低表達基因的標(biāo)準(zhǔn)化z評分表達值之和。(A和B)根據(jù)PAM50內(nèi)在亞型和綜合聚類分類，使侵襲性基因列表的表達可視化。箱形圖顯示了這些亞型的侵襲性評分。箱形圖中的陰影線標(biāo)記了侵襲性評分的中位值。使用Prism的單因素方差分析，***p<0.001。Kaplan-Meier曲線是按照具有3級腫瘤的ER+患者中侵襲性評分的四分位數(shù)(左圖)或中位數(shù)(中圖)分層的METABRIC數(shù)據(jù)集中患者的總體生存。顯示高侵襲性評分(高于中位數(shù))的五種PAM50內(nèi)在亞型的腫瘤在總體生存方面沒有顯示統(tǒng)計學(xué)差異(右圖)。使用對數(shù)秩檢驗報告風(fēng)險比(HR)和95％置信區(qū)間(CI)和p值。

圖12：根據(jù)侵襲性評分，METABRIC數(shù)據(jù)集中PAM50乳腺癌亞型的生存率。從206基因列表(A)和減少的8基因列表(B)通過中位侵襲性評分二分法，分析基于PAM50亞型注釋的METABRIC數(shù)據(jù)集中患者的生存率。使用Prism中的對數(shù)秩檢驗報告p值，且p值顯示具有不同PAM50亞型但具有高侵襲性評分的所有腫瘤在患者生存率方面未顯示差異(左圖)，而PAM50亞型僅在低侵襲性評分情況中顯示明顯不同的生存率。

圖13：與患者生存率相關(guān)的TTK染色。按照TTK的IHC染色(評分0-3)將大的乳腺癌患者群組(n＝409)中患者的總體生存率分層。顯示隨訪10和20年的所有患者(具有四種TTK染色類別0-3和兩個類別(0-2與3))的Kaplan-Meier生存曲線。對數(shù)秩檢驗和p值被用于所有患者的生存曲線。當(dāng)按照TTK表達分層時，具有1級，2級或激素陽性腫瘤的患者的生存沒有統(tǒng)計學(xué)差異。使用Prism作出生存曲線和進行統(tǒng)計學(xué)分析。

圖14：本研究中用于分配“預(yù)后亞組”的標(biāo)準(zhǔn)。

圖15：小圖1：按照十(10)個CIN基因和兩(2)個ER基因作為印記分開的肺癌患者的總體生存曲線；根據(jù)印記的中位數(shù)，患者是低或高的；小圖2：按照十(10)個CIN基因和兩(2)個ER基因作為印記分開的肺腺癌的生存曲線；根據(jù)印記的中位數(shù)，患者是低或高的；小圖3：按照十(10)個CIN基因和兩(2)個ER基因作為印記分開的肺腺癌(10年)的生存曲線；根據(jù)印記的中位數(shù)，患者是低或高的；小圖4：按照六(6)個CIN基因和兩(2)個ER基因作為印記分開的肺腺癌的生存曲線；根據(jù)印記的中位數(shù)，患者是低或高的；和小圖5：按照六(6)個CIN基因和兩(2)個ER基因作為印記分開的肺腺癌(10年)的生存曲線；根據(jù)印記的中位數(shù)，患者是低或高的。

圖16：(A)來自癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)的乳腺癌群組的RNA-Seq數(shù)據(jù)。(B)按照與Oncotype Dx復(fù)發(fā)評分相比的侵襲性評分分層的TCGA中乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存率。(C)具有高侵襲性評分的乳腺腫瘤的拷貝數(shù)變異(CNV)與具有低侵襲性評分的乳腺腫瘤的拷貝數(shù)變異(CNV)的比較。

圖17：(A)來自癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)的所有癌癥的RNA-Seq數(shù)據(jù)。(B)按照與Oncotype Dx復(fù)發(fā)評分相比的侵襲性評分分層的TCGA中所有患者的無復(fù)發(fā)生存率。

圖18：按照8-基因侵襲性評分分層的TCGA數(shù)據(jù)患者中不同癌癥類型的癌癥患者的無復(fù)發(fā)生存率或總體生存率。

圖19：實施例2的概要。使用乳腺癌數(shù)據(jù)集在Oncomine^TM中進行Meta分析而與亞型或所用基因表達陣列平臺無關(guān)。在5年內(nèi)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移或死亡事件的乳腺腫瘤的全局基因表達譜與未在5年內(nèi)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移或死亡事件的乳腺腫瘤的全局基因表達譜相比較，并且選擇這些比較中的頂部過表達基因(OE)和低表達基因(UE)。然后使用在線工具KM-Plotter^TM調(diào)查導(dǎo)致轉(zhuǎn)移和死亡事件(取決于各個數(shù)據(jù)集的注釋)的原發(fā)性腫瘤中的共同失調(diào)基因(n>4000名患者，與Oncomine^TM中的數(shù)據(jù)集有一些重疊)。只選擇與基底樣乳腺癌(BLBC)或ER陰性(ER^-)乳腺癌的無復(fù)發(fā)生存率(RFS)、無遠端轉(zhuǎn)移生存率(DMFS)或總體生存率(OS)相關(guān)的基因。然后，通過在不同結(jié)果(RFS、DMFS和OS)中選擇最顯著和持久的，將來自該訓(xùn)練的96個基因篩選到28個基因。然后在包括癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集、研究在線癌癥知識庫(ROCK)數(shù)據(jù)集和用于ER-、TNBC和BLBC亞型預(yù)后的同類TNBC數(shù)據(jù)集的大乳腺癌群組基因表達研究中驗證該28-基因印記。最后，在治療前進行基因表達譜分析的研究中調(diào)查TN印記與新輔助化療后的病理學(xué)完全響應(yīng)(pCR)的關(guān)聯(lián)。

圖20：28-基因TN印記與BLBC和ER-乳腺癌的RFS、DMFS和OS相關(guān)。21個過表達基因和7個低表達基因被用作在線工具KM-Plotter中的印記。該印記(21個過表達基因的平均表達和7個低表達基因的反向表達)將RFS、DMFS和OS分層；低：低于印記表達的中位數(shù)；和高：高于印記表達的中位數(shù)。按照KM-Plotter生成單變量生存分析的風(fēng)險比(HR)和對數(shù)秩p值(p)。n＝患者數(shù)量。

圖21：在TNCBC、BLBC和ER-乳腺癌亞型中，按照TN評分作出的預(yù)后優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)臨床病理學(xué)指標(biāo)(clinicothapalogical indicator)。對TN印記分析兩個數(shù)據(jù)集，(A)TNBC數(shù)據(jù)集和(B和C)ROCK數(shù)據(jù)集，且TN評分計算為21個過表達基因的平均表達與7個低表達基因的平均表達的比率。對每種腫瘤計算該評分，并且使用整個數(shù)據(jù)集的TN評分中位數(shù)將腫瘤按TN評分分類為高(高于中位數(shù))或低(低于中位數(shù))。(A)通過群組中TN評分中位數(shù)二分法分層的TNBC群組中TNBC患者的RFR。生存曲線下方的表格顯示了TN評分和數(shù)據(jù)集中記錄的其他可用臨床指標(biāo)的單變量生存分析和多變量生存分析。在多變量分析中，TN評分優(yōu)于所有臨床指標(biāo)。(B)通過數(shù)據(jù)集中的TN評分中位數(shù)二分法分層的ROCK數(shù)據(jù)集中BLBC的RFS和DMFS。生存曲線下方的表格顯示了TN評分相對于數(shù)據(jù)集中記錄的其他可用臨床指標(biāo)的多變量生存分析。在BLDC病例的多變量分析中，TN評分優(yōu)于所有臨床指標(biāo)。(C)ER-陰性乳腺癌的RFS和DMFS按照TN評分分層(數(shù)據(jù)未顯示)，并且該表顯示了ER^-乳腺癌病例中TN評分優(yōu)于臨床指標(biāo)的多變量生存分析。

圖22：TN評分將TCGA數(shù)據(jù)集中ER-乳腺癌患者的總體生存分層。來自TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)(n＝1106)使用Illumina HiSeq RNA-seq陣列的基因表達數(shù)據(jù)被用于計算所有腫瘤的TN評分。通過TN評分中位數(shù)二分法，將腫瘤分類為高TN評分或低TN評分。將具有高TN評分的ER-乳腺癌病例的總體生存(OS)與具有低TN評分的ER-乳腺癌病例的總體生存相比較。生存曲線下方的表格顯示在單變量生存分析中，TN評分比其他臨床指標(biāo)更顯著，并且它是多變量生存分析中唯一顯著的預(yù)后指標(biāo)。

圖23：ER^-HER2^-乳腺癌中TN評分與化療后pCR相關(guān)。針對TN印記，分析了新輔助化療前對腫瘤進行譜分析并且記錄病理學(xué)完全響應(yīng)(pCR)相對于無pCR或殘留疾病(RD)的基因表達數(shù)據(jù)集，并計算每種腫瘤的TN評分。通過每個數(shù)據(jù)集中TN評分中位數(shù)二分法，將腫瘤分類為高TN評分或低TN評分。在圖中所示的數(shù)據(jù)中僅使用ER-HER2-病例。(A)顯示在低TN評分和高TN評分亞組中達到(紅條)或未達到(黑條)pCR的病例百分比的圖表。Fisher精確檢驗被用于分析2x2列聯(lián)表，并且當(dāng)觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著性時報告來自該檢驗的p值。虛線標(biāo)記出TNBC在文獻中報道的31％pCR率。用登錄號和所用的化療方案標(biāo)記每個數(shù)據(jù)集，即：GSE18728、GSE50948、GSE20271、GSE20194、GSE22226、GSE42822和GSE23988?；熆s寫：F：5-FU、A：阿霉素、C：環(huán)磷酰胺，T：紫杉烷、X：希羅達，M：甲氨蝶呤、E：表柔比星。(B)來自ISPY-1試驗的數(shù)據(jù)集GSE22226被用于比較新輔助化療后ER^-患者生存預(yù)測中的TN評分和pCR，因為該數(shù)據(jù)集也記錄了RFS。pCR與先前報告的RFS(第一幅小圖)強相關(guān)，TN評分(以下三幅小圖)不僅預(yù)測這些患者的生存，而且也可以將達到或未達到pCR的患者的生存分層，表明TN評分是新輔助化療后的pCR的獨立預(yù)后因素。

圖24：根據(jù)TN評分的癌細胞系藥物敏感性。調(diào)查了Garnett等的已發(fā)表的大型研究，其中如方法中所述計算該研究中每個細胞系的TN評分。根據(jù)TN評分中位數(shù)將細胞系分類為高TN評分或低TN評分，以比較低TN評分細胞系(白盒)和高TN評分細胞系(紅盒)的敏感性。使用Prism制圖，其在盒中顯示敏感性(顯示為-log10[IC50])(用直線標(biāo)記中位數(shù))和須(根據(jù)繪制須和離群值的Tukey方法，標(biāo)記第一和第三四分位數(shù)并將離群值標(biāo)記為點)。使用未配對雙尾t檢驗進行統(tǒng)計分析。

圖25：iBCR評分將ROCK數(shù)據(jù)集中所有乳腺癌患者的生存分層而與ER狀態(tài)無關(guān)。計算ROCK數(shù)據(jù)集(n＝1570，Affymetrix)中每種腫瘤的TN評分和Agro評分，然后iBCR評分計算為TN評分的Agro評分次冪。所有患者的RFS和ER-或ER+患者的RFS僅通過每個評分的評分中位數(shù)二分法在高評分和低評分之間進行比較。iBCR評分在低評分腫瘤和高評分腫瘤之間在所有患者以及具有較好分離的ER-和ER+子集中是預(yù)測性的(增加的風(fēng)險比[HR]和95％置信區(qū)間限值和降低的對數(shù)秩p值)。使用Prism作圖和進行使用對數(shù)秩檢驗的單變量生存分析。

圖26：iBCR評分將TCGA數(shù)據(jù)集中所有乳腺癌患者的生存分層而與ER狀態(tài)無關(guān)。計算TCGA數(shù)據(jù)集(n＝1106，Illumina RNA-Seq)中每種腫瘤的TN評分、Agro評分和iBCR評分。所有患者的RFS和ER-或ER+患者的RFS僅在高評分和低評分之間進行比較。如在圖7的ROCK數(shù)據(jù)集的結(jié)果中，iBCR評分在低評分腫瘤和高評分腫瘤之間在所有患者以及具有較好分離的ER-和ER+子集中是預(yù)測性的。

圖27：ISPY-1試驗中iBCR評分與RFS和化療后pCR相關(guān)。來自ISPY-1試驗的數(shù)據(jù)集GSE22226被用于比較ER^-HER2^-和ER⁺乳腺癌亞型中預(yù)后的Agro評分、TN評分和綜合iBCR評分和與化療(A：阿霉素、C：環(huán)磷酰胺和T：紫杉烷)后pCR的相關(guān)性。通過整個數(shù)據(jù)集中各個評分的中位數(shù)二分法，將腫瘤分類為高評分或低評分。高iBCR評分的ER^-HER2^-腫瘤不太可能達到pCR，并且這些患者的生存差。高iBCR的ER⁺患者更可能達到pCR，但由于少數(shù)ER⁺患者達到了pCR(10/62[16％])，高iBCR的ER+患者的生存仍然是差的。注意到Agro評分將除兩種ER-HER2-腫瘤以外的所有腫瘤確定為高評分，因此不應(yīng)解讀來自該組的數(shù)據(jù)。還注意到，Agro評分在ER⁺中高度預(yù)后生存和與pCR的相關(guān)性，而TN評分在這些患者中并不是。將這兩種評分整合到iBCR評分中已經(jīng)克服了這些亞型特異性評分各自的局限。

圖28：iBCR評分與乳腺癌中化療后pCR相關(guān)。如圖5所述，使用具有化療后pCR注釋的基因表達數(shù)據(jù)集計算Agro評分和TN評分及綜合iBCR評分。通過各個數(shù)據(jù)集中每個評分的中位數(shù)二分法，將腫瘤分類為高評分或低評分。(A)ER^-HER2^-病例，圖表顯示在低評分亞組和高評分亞組中達到(紅條)或未達到(黑條)pCR的病例的百分比。(B)與A中一樣分析ER⁺病例。使用Fisher精確檢驗分析2x2列聯(lián)表，并且當(dāng)觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著性時報告來自該檢驗的p值。每個數(shù)據(jù)集用登錄號和所用的化療方案標(biāo)記，即：GSE18728、GSE50948、GSE20271、GSE20194、GSE22226、GSE42822和GSE23988?；熆s寫：F：5-FU、A：阿霉素、C：環(huán)磷酰胺、T：紫杉烷、X：希羅達、M：甲氨蝶呤、E：表柔比星。

圖29：iBCR評分將他莫昔芬治療的ER+患者的生存分層。在他莫昔芬治療之前進行基因表達譜分析的兩個數(shù)據(jù)集中計算Agro評分和TN評分和iBCR評分：A和B：具有327名患者的GSE6532，137位未經(jīng)治療和190位經(jīng)他莫昔芬治療；C：具有用他莫昔芬治療5年的298名患者的GSE17705。(A)具有高iBCR評分的ER+N0患者與低iBCR評分的相應(yīng)患者相比具有差的RFS。(B)所有ER+患者以及N0和N1子集的RFS按照Agro評分和iBCR評分分層。(C)所有ER+以及N0和N1子集的DMFS生存按照Agro評分和iBCR評分分層。風(fēng)險比和對數(shù)秩p值對于iBCR評分比Agro評分更顯著，雖然Agro評分是顯著預(yù)后的。

圖30：根據(jù)iBCR評分的癌細胞系的藥物敏感性。調(diào)查了Garnett等的已發(fā)表大型研究，其中從Agro評分和TN評分計算每種細胞系的iBCR評分。根據(jù)iBCR評分中位數(shù)將細胞系分類為高iBCR評分或低iBCR評分，以比較低iBCR評分細胞系(白盒)和高TN評分細胞系(紅盒)的敏感性。還包括根據(jù)低Agro評分和高Agro評分的結(jié)果。使用Prism制圖并使用未配對雙尾t檢驗進行統(tǒng)計分析。(n.s.不顯著)。

圖31：Oncomine^TM中5年時有轉(zhuǎn)移事件或死亡的原發(fā)性乳腺腫瘤中失調(diào)基因的全局基因表達薈萃分析。(A)在7個數(shù)據(jù)集中在5年時內(nèi)有轉(zhuǎn)移事件的腫瘤與在5年時無轉(zhuǎn)移事件的腫瘤相比較，和(B)在7個數(shù)據(jù)集中在5年時導(dǎo)致死亡的腫瘤與在5年時未導(dǎo)致死亡的腫瘤相比較。圖例中說明了比較中使用的數(shù)據(jù)集，并且還包括對熱圖著色的圖解。熱圖圖解表示根據(jù)基因排名(其基于p值)的基因頂部或底部x％位置。

圖32：TN印記優(yōu)于所有已公布的用于TNBC/BLBC的印記。與已公布的TNBC印記相比，在在線數(shù)據(jù)庫KM-Plotter(Affymetrix平臺)中根據(jù)TN印記調(diào)查了基底樣乳腺癌患者(BLBC)的無復(fù)發(fā)生存。風(fēng)險比(HR)和對數(shù)秩p值由KM-Plotter生成。(A)TN評分相對于(B)來自Karn等(PLoS One，2011)；(C)來自Rody等(Breast Cancer Res，2011)的IL8，(D)VEGF，和(E)B細胞元基因；(F)來自Yau等(Breast Cancer Res，2010)；(G)來自Yu等(Clin Cancer Res，2013)；(H)來自Lee等(PLoS One，2013)和(I)來自Hallet等(Sci Rep，2012)的印記。

圖33：TN評分將Agilent TCGA數(shù)據(jù)中的ER^-乳腺癌患者的生存分層。分析使用Agilent微陣列(n＝597)的原始TCGA數(shù)據(jù)集的TN評分，其中根據(jù)三分位數(shù)將患者分配為低TN評分、中TN評分或高TN評分。然后根據(jù)這些三分位數(shù)比較僅ER-患者的RFS。根據(jù)對數(shù)秩生存檢驗，分層是顯著的(P<0.0001)。高TN評分組相比于低TN評分組的風(fēng)險比(95％置信區(qū)間)為3.484(1.035至11.23)，對數(shù)秩p值為0.0179。

圖34：ER-和BLBC中通過TN評分作出的預(yù)后不受系統(tǒng)性治療的影響。在線KM-Plotter工具被用于調(diào)查未系統(tǒng)性治療的患者(未治療)或經(jīng)系統(tǒng)性治療的患者(治療)中ER-乳腺癌(上兩行)和BLBC(下兩行)的RFS、DMFS和OS的分層。HR、95％置信區(qū)間和對數(shù)秩p值由KM-Plotter提供，還提供處于風(fēng)險中的患者數(shù)量。

圖35：根據(jù)癌細胞系百科(CCLE)研究中的TN評分，癌細胞系對抗癌藥物的敏感性。分析該研究中癌細胞系的基因表達數(shù)據(jù)以計算每個細胞系的TN評分，并通過中位數(shù)二分法將其分配為低TN評分或高TN評分。CCLE研究中使用的24種藥物各自的IC₅₀在高TN評分細胞系和低TN評分細胞系之間進行比較，并且所顯示的數(shù)據(jù)是基于使用Prism進行的未配對雙尾t檢驗具有統(tǒng)計學(xué)差異的數(shù)據(jù)。

圖36：通過加法或減法整合TN評分和Agro評分。ROCK數(shù)據(jù)集被用于研究TN評分和Agro評分的整合，目的是開發(fā)獨立于乳腺癌亞型的測試。(A)ROCK數(shù)據(jù)集中(每個點代表一位患者，總計n＝1570)ER+(黑點)和ER-(紅點)的原始Agro評分和原始TN評分。兩個評分是分散的，并且可以保留相關(guān)乳腺癌亞型中來自各個評分的信息的整合方法是必要的。這類方法在本圖和圖38中進行測試。(B)加法方法。第一列顯示ER+腫瘤中具有低(白盒)和高(紅盒)Agro評分亞組的TN評分(上圖)。在下圖中，ER-腫瘤中具有低(白盒)和高(紅盒)TN評分亞組的Agro評分。該數(shù)據(jù)顯示，對于具有低和高Agro評分的ER+腫瘤，TN評分是相似的；且對于具有低和高TN評分的ER-腫瘤，Agro評分是相似的。缺乏統(tǒng)計學(xué)差異(獨立性)表明整合是可能的。第二列顯示了對于ER+(上圖)和ER-(下圖)患者，在將每名患者的TN評分和Agro評分相加時，TN評分與Agro評分之間的線性相關(guān)性。在第三列中，將TN評分和Agro評分對所產(chǎn)生的總和評分繪圖，顯示對于ER+(上圖)和ER-(下圖)患者二者，來自各個評分的信息都保留在最終總和評分中。最后一列顯示來自在第二和第三列中分別顯示的ER+和ER-患者的數(shù)據(jù)的重疊。(C)與在B中一樣進行相同的分析，但是通過TN評分和Agro評分相減來測試整合?？偤驮u分與各個單一評分(TN評分和Agro評分)之間關(guān)系的線性表明來自各個評分的信息在最終評分中表現(xiàn)。對于與如圖37所示生存的相關(guān)性，測試這兩種方法(加法或減法)的性能。

圖37：對于ROCK數(shù)據(jù)集中ER-和ER+RFS的預(yù)后，TN評分和Agro評分的不同整合方法的比較。對于ER-或ER+乳腺癌中ROCK數(shù)據(jù)集中產(chǎn)生的綜合評分的關(guān)聯(lián)，測試通過加法或減法(來自圖36)或者乘法或除法(圖38)的整合方法。如圖所示，只有加法或乘法方法在ER-乳腺癌中是預(yù)測性的，并且在ER+乳腺癌中乘法比加法更顯著。這兩種方法是合理的，因為減法或除法方法將降低評分之一的值。由于當(dāng)乘法和除法方法顯示指數(shù)或冪曲線時觀察到的相關(guān)性，測試了兩種另外的方法，使一個評分自乘為第二評分次冪。如最后一列(紅盒中加陰影和標(biāo)記的)所示，使TN評分自乘為Agro評分次冪應(yīng)該在ER-和ER+乳腺癌亞型二者中具有更好預(yù)測性。事實上，該綜合評分的預(yù)測性在其各自的亞型中比各個評分更好。因此，該方法被用于計算綜合的乳腺癌復(fù)發(fā)(iBCR)評分。

圖38：通過除法或乘法的TN評分和Agro評分整合。使用ROCK數(shù)據(jù)集研究TN和Agro的整合，因為這些評分在相對于彼此繪制時是分散的(圖36中的小圖A)。(A)第一列中的箱形圖與圖36中的那些相同。小圖A中加陰影的盒描述了TN評分和Agro評分通過除法(頂行)或乘法(底行)的整合。在ER+(黑點)和ER-(紅點)二者中，在將TN評分和Argo評分彼此相除或相乘后對于TN評分與Agro評分之間的關(guān)系，除法產(chǎn)生了冪曲線且乘法產(chǎn)生了指數(shù)曲線。最后一列中的重疊顯示保留了ER+和ER-患者之間對于評分的差異。在圖37中測試了這兩種方法的生存相關(guān)性，并且乘法方法是適合的。(B)由于在A中的除法和乘法方法中觀察到了冪和指數(shù)曲線，通過使一個評分自乘為第二評分次冪而測試整合是合理的。如頂行中所示，疊加點或單獨點中通過使TN評分自乘為Agro評分次冪進行的整合在ER-(紅點)和ER+(黑點)患者二者中產(chǎn)生了線性關(guān)系。當(dāng)如圖37所示測試生存相關(guān)性時，這種整合方法優(yōu)于所有其他方法。

圖39：iBCR評分在TNBC患者中是預(yù)測性的。除了iBCR評分在乳腺癌混合亞型的ROCK數(shù)據(jù)集(Affymetrix)和TCGA數(shù)據(jù)集(Illumina數(shù)據(jù)集)中的驗證之外，還在同類TNBC數(shù)據(jù)集中調(diào)查了iBCR評分。如右小圖所示，與TN評分相比，iBCR是同樣預(yù)測性的(具有輕微改善)。這進一步驗證了綜合評分發(fā)展成為乳腺癌的預(yù)后測試而與ER狀態(tài)無關(guān)，與先前受限的印記不同。

圖40：根據(jù)Agro評分相對于Oncotype Dx，他莫昔芬治療的ER+患者的生存。(A)按照Agro評分分層(按三分位數(shù)的高與中與低)的已公布研究(Loi等，Clin Oncol，2007)中他莫昔芬治療的淋巴結(jié)陰性(頂部)和淋巴結(jié)陽性(底部)ER+患者的RFS和DMFS。(B)按照Agro評分的三分位數(shù)將來自已公布研究(Symmans等，J Clin Oncol，2010)的他莫昔芬治療5年的淋巴結(jié)陰性或陽性ER+患者的DMFS分層。(C)按照Oncotype Dx復(fù)發(fā)評分的風(fēng)險組，將已公布研究(Loi等，Clin Oncol，2007)中他莫昔芬治療的淋巴結(jié)陰性(頂部)和淋巴結(jié)陽性(底部)ER+患者的RFS和DMFS分層。(D)按照Oncotype Dx復(fù)發(fā)評分的風(fēng)險組，將來自已公布研究(Symmans等，J Clin Oncol，2010)的他莫昔芬治療5年的淋巴結(jié)陰性或陽性ER+患者的DMFS分層。

圖41：KM-Plotter工具中Agro評分和MammaPrint的比較。在所有乳腺癌患者、ER+、ER+淋巴結(jié)陰性(LN-)或ER+淋巴結(jié)陽性(LN+)患者中，根據(jù)Agro評分(高與低)或根據(jù)MammaPrint(高與低)的無遠端轉(zhuǎn)移生存率。KM-Plotter在線工具(n＝4142名患者)。在所有患者亞組中，Agro評分優(yōu)于MammaPrint印記，特別是對于ER+淋巴結(jié)陽性患者。

圖42：根據(jù)癌細胞系百科(CCLE)研究中的iBCR評分，癌細胞系對抗癌藥物的敏感性。分析該研究中癌細胞系的基因表達數(shù)據(jù)以計算每個細胞系的TN評分，并通過中位數(shù)二分法將其分配為低iBCR評分或高iBCR評分。將CCLE研究中使用的24種藥物各自的IC₅₀在高iBCR評分和低iBCR評分細胞系之間進行比較，并且所顯示的數(shù)據(jù)是基于使用Prism的未配對雙尾t檢驗具有統(tǒng)計學(xué)差異的數(shù)據(jù)。由于對TN評分也進行了這種分析(圖35)，Agro評分的分析結(jié)果也顯示在頂行中。

圖43：與低Agro評分腫瘤相比，高Agro評分腫瘤中的高拷貝數(shù)變異(CNV)?；诨虮磉_數(shù)據(jù)(Illumina HiSeq RNA-seq)，將TCGA數(shù)據(jù)集中的乳腺癌腫瘤分類為高或低的Agro評分。(A)使用UCSC基因組瀏覽器使TCGA拷貝數(shù)變異(分段和刪除種系CNV后)可視化，以比較從基因表達數(shù)據(jù)分類為高Agro評分的患者(上圖)和分類為低Agro評分的患者(下圖)的患者。(B)顯示臨床指標(biāo)如ER、PR和HER2狀態(tài)等等的分布。(C)高Agro評分患者與低Agro評分患者的CNV譜的差異顯示了在高Agro評分患者中整個染色體臂的增加(紅色)和損失(綠色)，表明非整倍性。

圖44：高Agro評分和高iBCR評分細胞系對極光激酶抑制劑更敏感?；谌橄侔┘毎档腁gro評分、TN評分和iBCR評分，分析了用極光激酶抑制劑處理這些細胞系的兩項研究。如圖所示，高Agro評分和特別是高iBCR評分的細胞系對極光激酶抑制劑更敏感(ENMD-2076：高iBCR評分細胞系比低iBCR評分細胞系的IC50為1.4μM比5.9μM，p＝0.0125，t檢驗；AMG900：高iBCR評分高細胞系比低iBCR評分細胞系的IC50為0.3nM比0.7nM，p＝0.0308，t檢驗)。

圖45：對于總體生存和無復(fù)發(fā)生存，iBCR在胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)中是預(yù)測性的。使用UCSC基因組瀏覽器對iBCR基因印記分析胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)，并且從瀏覽器下載該印記的數(shù)據(jù)、生存數(shù)據(jù)和癌癥類型?；趇BCR印記表達，與癌癥類型無關(guān)地將腫瘤分類成四分位數(shù)組，并且這些四分位數(shù)中比較總體生存和無復(fù)發(fā)生存。如頂行所示，在該胰腺癌數(shù)據(jù)集中按照iBCR印記將總體生存和無復(fù)發(fā)生存分層。在頂行最右側(cè)小圖中，顯示了iBCR印記四分位數(shù)組中各種癌癥類型的腫瘤分布。例如宮頸癌在大多數(shù)病例下顯示高iBCR印記，而與之相反，甲狀腺癌在所有病例下顯示低iBCR印記。較低的小圖顯示根據(jù)來自胰腺癌數(shù)據(jù)集的iBCR評分的總體生存分層，其中分層在對數(shù)秩單變量生存分析中是統(tǒng)計學(xué)顯著的。除了在文獻中顯示的乳腺癌數(shù)據(jù)，iBCR印記在腎上腺皮質(zhì)癌、子宮內(nèi)膜癌、腎透明細胞癌、膀胱癌、低等級膠質(zhì)瘤和黑色素瘤中也是預(yù)測性的。iBCR還在肺腺癌中是預(yù)測性的，如圖46所示。

圖46：iBCR印記在肺腺癌(LUAD)中是預(yù)測性的。在兩個大數(shù)據(jù)集中測試了肺癌中iBCR印記的預(yù)測性。(A和B)KM-Plotter(Affymetrix數(shù)據(jù))被用于調(diào)查肺腺癌(A)和鱗狀細胞癌(B)的總體生存。iBCR印記在肺腺癌(LUAD)中顯示出強的預(yù)后價值。(C)在KM-Plotter中對肺癌中的iBCR印記與可用的臨床指標(biāo)(組織學(xué)類型(肺腺癌相對于小細胞肺癌)和疾病階段)相比較進行多變量生存分析。iBCR印記優(yōu)于這些標(biāo)準(zhǔn)臨床指標(biāo)。(D和E)按照iBCR印記表達的四分位數(shù)或三分位數(shù)將LUAD的TCGA數(shù)據(jù)(Illumina HiSeq RNA-seq數(shù)據(jù))分層，以分別測試iBCR印記與總體生存(D)和無復(fù)發(fā)生存(E)的關(guān)聯(lián)。與具有低iBCR印記表達的患者相比，具有高iBCR印記的LUAD患者具有最差的生存，并遭受早期復(fù)發(fā)和死亡。應(yīng)當(dāng)注意，還調(diào)查了鱗狀細胞肺癌的TCGA數(shù)據(jù)，而iBCR印記與生存的關(guān)聯(lián)沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，這與從KM-Plotter數(shù)據(jù)看到的非常弱的關(guān)聯(lián)相一致。

圖47：根據(jù)iBCR評分，用24種藥物處理的乳腺癌細胞系的敏感性。在不存在或存在遞增劑量的24種小分子抗癌藥物的情況下培養(yǎng)乳腺癌細胞系(10個細胞系)。重新分析該已發(fā)布的研究以比較高iBCR評分細胞系(5個細胞系：BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468和BT-20)與低iBCR評分細胞系(5個細胞系：Hs.578T、BT-474、MCF-7、T-47D和ZR-75-1)之間的敏感性。使用51種乳腺癌細胞系的已發(fā)布基因表達數(shù)據(jù)集(Neve等，Cancer Cell，2006)，從Agro評分和TN評分計算iBCR評分。高iBCR評分細胞系(紅條)比低iBCR評分細胞系(白條)對靶向9種不同激酶的13種藥物(灰色陰影)更敏感。在Prism中使用雙尾非配對t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)比較。

圖48：與iBCR mRNA基因印記相關(guān)的蛋白質(zhì)和磷蛋白。基于43個基因的mRNA表達的iBCR評分被用于將TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集中的患者分層為低、中或高iBCR評分。然后在根據(jù)iBCR mRNA印記的三組患者之間比較來自TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集(n＝747名患者)的反相蛋白質(zhì)陣列(RPPA)。(A)根據(jù)iBCR mRNA印記的ER+患者的總體生存。(B)低、中和高iBCR評分組ER+患者中顯著上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)和磷蛋白。(C)根據(jù)iBCR mRNA印記的ER-的總體生存。(D)低、中和高iBCR評分組ER-患者中顯著上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)和磷蛋白。

圖49：通過綜合的mRNA和蛋白質(zhì)iBCR印記預(yù)后乳腺癌患者生存。調(diào)查了三個iBCR mRNA評分組中失調(diào)的蛋白質(zhì)和磷蛋白與生存的關(guān)聯(lián)。八個下調(diào)蛋白和九個上調(diào)蛋白作為蛋白印記(iBCR蛋白印記)是高度預(yù)測性的。(A)在所有乳腺癌患者，ER+和ER-病例中，基于iBCR蛋白印記(上行)和綜合的iBCR mRNA與蛋白印記(下行)的總體生存分層。(B)使用Cox比例風(fēng)險模型的單變量和多變量生存分析，顯示綜合的iBCR mRNA/蛋白印記優(yōu)于所有臨床病理學(xué)指標(biāo)。

圖50：與iBCR mRNA基因印記相關(guān)的蛋白質(zhì)和磷蛋白。(A)基于TCCR數(shù)據(jù)集中(n＝472名患者)的iBCR mRNA基因印記的肺腺癌總體生存分層。(B)在iBCR mRNA基因印記的四分位數(shù)中腫瘤之間蛋白質(zhì)磷蛋白水平的比較。(C)基于從小組(n＝212名患者)推斷的六種蛋白質(zhì)的肺腺癌患者總體生存分層。(D)綜合的iBCRmRNA/蛋白印記將肺腺癌患者(n＝212名患者)的總體生存分層。(E)用于生存分析的多變量Cox比例風(fēng)險模型顯示在肺腺癌中綜合的iBCR mRNA/蛋白評分優(yōu)于所有臨床病理學(xué)指標(biāo)。

圖51：在腎臟腎透明細胞癌(KIRC)(左側(cè)垂直小圖)、皮膚的皮膚黑色素瘤(SKCM)(中間垂直小圖)和子宮體子宮內(nèi)膜癌(UCEC)(右側(cè)垂直小圖)中，iBCR測試是預(yù)測性的。(A)基于iBCR mRNA基因印記的總體生存分層。(B)基于iBCR蛋白印記的總體生存分層。(C)基于綜合的BCR mRNA/蛋白印記的總體生存分層。

圖52：在卵巢腺癌(OVAC)(左側(cè)垂直小圖)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)(中間垂直小圖)和結(jié)腸/直腸腺癌(COREAD)(右側(cè)垂直小圖)中，iBCR測試是預(yù)測性的。(A)基于iBCR mRNA基因印記的總體生存分層。(B)基于iBCR蛋白印記的總體生存分層。(C)基于綜合的BCR mRNA/蛋白印記的總體生存分層。

圖53：在低等級膠質(zhì)瘤(LGG)(左側(cè)垂直小圖)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)(中間垂直小圖)和肺鱗狀細胞癌(LUSC)(右側(cè)垂直小圖)中，iBCR測試是預(yù)測性的。(A)基于iBCR mRNA基因印記的總體生存分層。(B)基于iBCR蛋白印記的總體生存分層。(C)基于綜合的BCR mRNA/蛋白印記的總體生存分層。

圖54：在(A)腎臟腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、(B)宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌(CESC)、(C)肝臟肝細胞癌(LIHC)、(D)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中，iBCR試驗是預(yù)測性的。對于這些癌癥類型，TCGA數(shù)據(jù)集不包括RPPA陣列；僅使用iBCR mRNA基因表達測試。

圖55：iBCR mRNA/蛋白印記的蛋白-蛋白相互作用。使用STRING數(shù)據(jù)庫分析iBCR測試的成分。對于蛋白-蛋白相互作用(129種相互作用)，iBCR測試(65個成分)明顯集中(P＝5.6E-14)。相互作用的可信度通過增加連接藍線的厚度來表示。值得注意的是，右上方不顯示相互作用的成分包含幾個未被良好表征的新基因。對于與癌癥標(biāo)志相關(guān)的幾種生物學(xué)功能(參見表20)，iBCR測試是集中的。

圖56：作為免疫治療伴隨診斷的iBCR測試。(A)來自iBCR測試的12個基因，特別是來自TN成分的，與用pidilizumab+利妥昔單抗免疫療法治療的濾泡性淋巴瘤患者的無進展生存顯著相關(guān)。顯示了治療前腫瘤中12個基因的表達譜(紅色表示過表達，和綠色表示低表達)。白盒和黑盒分別表示有或沒有無進展生存。(B)基于iBCR印記，評分計算為過表達基因的表達與低表達基因的表達的比率。比較基于評分中位數(shù)二分法的患者生存。小圖中顯示了低評分腫瘤與高評分腫瘤之間生存比較的風(fēng)險比(HR)和對數(shù)秩p值。(C)8名患者在治療前和治療后進行譜分析，并且使這些患者中來自iBCR測試的12個基因的表達譜可視化。觀察到了表達的逆轉(zhuǎn)趨勢，且這對于保持沒有疾病進展的第9號患者最為明顯。(D)與治療前相比，一個基因在治療后的所有患者中具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。該基因?qū)Φ?號患者在治療后與治療前顯示出顯著的差異。(E)從表23中標(biāo)記為“濾泡性淋巴瘤”的基因印記計算的相同患者組的生存曲線。所有約定如上文(B)那樣。顯示了基于評分中位數(shù)二分法的患者的無復(fù)發(fā)生存。

圖57：來自基因表達數(shù)據(jù)集的薈萃分析的基因的網(wǎng)絡(luò)分析。

圖58：功能性元基因與乳腺癌患者生存相關(guān)。

圖59：作為EGFR抑制和多激酶抑制的伴隨診斷的iBCR測試。(A)來自iBCR測試的17個基因(參見表23)與用EGFR抑制劑西妥昔單抗治療的結(jié)腸直腸癌患者的生存顯著相關(guān)。(B)來自iBCR測試的16個基因(參見表23)與用EGFR抑制劑西妥昔單抗結(jié)合順鉑治療的三陰性乳腺癌患者的總體生存顯著相關(guān)。(C)來自iBCR測試的19個基因(參見表23)與用EGFR抑制劑埃羅替尼治療的肺癌患者的無進展生存顯著相關(guān)。(D)來自iBCR測試的20個基因(參見表23)與用多激酶抑制劑索拉非尼治療的肺癌患者的無進展生存顯著相關(guān)。

具體實施方式

本發(fā)明至少部分地基于如下發(fā)現(xiàn)：基于已發(fā)布基因表達譜的薈萃分析，存在與腫瘤侵襲性和差的臨床結(jié)果相關(guān)的基因。更具體地，發(fā)現(xiàn)這些基因(參見表21)的過表達和/或低表達與乳腺癌中差的生存相關(guān)。使用Ingenuity Pathway Analysis軟件的網(wǎng)絡(luò)分析識別了在這些具有如表21中概述的不同生物學(xué)功能的生存相關(guān)基因內(nèi)的大量網(wǎng)絡(luò)或元基因。然后從各個網(wǎng)絡(luò)或元基因選擇與患者生存始終相關(guān)的較小的基因子集。這些基因及其相應(yīng)功能的列表顯示在表22中。這些基因被分為六個功能元基因或網(wǎng)絡(luò)。

本發(fā)明還至少部分地基于如下發(fā)現(xiàn)：在三陰性乳腺癌(TNBC)中，存在在示例侵襲性臨床行為的特定亞群中共同失調(diào)的基因。更具體地，這在與非TNBC和正常乳腺相比的TNBC中，在與其各自的相對物相比的遠端轉(zhuǎn)移和/或死亡相關(guān)的腫瘤中是明顯的。最初，發(fā)現(xiàn)206個復(fù)發(fā)性失調(diào)基因的列表對于染色體不穩(wěn)定性(CIN)和雌激素受體信號傳導(dǎo)(ER)元基因特別集中。已經(jīng)示出了基于CIN元基因表達水平相對于ER元基因表達水平的比率的侵襲性評分以鑒定侵襲性腫瘤而不管分子亞型和臨床病理學(xué)指標(biāo)。此外，涉及著絲粒結(jié)合或染色體分離的蛋白質(zhì)的耗盡可以是治療性的，并且顯著降低TNBC細胞系的體外生存，特別是對于TTK。使用小分子抑制劑的TTK抑制影響TNBC細胞系的生存。同時，TTK mRNA和蛋白水平與侵襲性腫瘤表型相關(guān)。TTK蛋白的有絲分裂非依賴性表達在TNBC和其他侵襲性乳腺癌亞組中是預(yù)測性的，表明CIN/非整倍性的保護推動了侵襲性和治療抗性。TTK抑制與化療的組合在體外過表達TTK的細胞的處理中有效，因此提供了對受保護CIN表型的治療性治療。

另外，本發(fā)明至少部分在基于發(fā)現(xiàn)改變的基因表達的第二印記，包括21個過表達基因和7個低表達基因，其在患有ER^-乳腺癌、TNBC和基底樣乳腺癌(BLBC)的患者中是高度預(yù)測性的。實際上，這一28基因印記與前述侵襲性評分或基因印記的結(jié)合產(chǎn)生了綜合評分，其在與ER狀態(tài)無關(guān)的乳腺癌中是預(yù)測性的。此外，綜合評分廣泛地在癌癥中(與癌癥類型無關(guān))，以及在除乳腺癌之外的特定癌癥類型如肺腺癌中是預(yù)測性的。此外，28基因印記和綜合評分均顯示預(yù)測乳腺癌患者中對化療的響應(yīng)，以及鑒定將受益于內(nèi)分泌治療的ER⁺淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者。本文所述印記的改變的表達還預(yù)測在癌細胞系中和在臨床上對一系列抗癌治療劑的敏感性，且特別是分子靶向抑制劑。

本發(fā)明的發(fā)明人還鑒定了蛋白印記，其在一系列癌癥(包括乳腺癌和肺腺癌)中是高度預(yù)測性的。此外，該蛋白印記可以與前述28基因印記和侵襲性基因印記結(jié)合，以提供癌癥中穩(wěn)健的預(yù)后指標(biāo)，其顯示出優(yōu)于已知的臨床病理學(xué)指標(biāo)。

在一個方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物中癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中多個過表達基因的表達水平和多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因，其中：所述多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在另一方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中多個過表達基因的表達水平和多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因，其中：所述多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較有利的癌癥預(yù)后。

在上述方面的一個實施方式中，所述多個過表達基因和/或所述多個低表達基因選自所述元基因中的一個。在一個替代性實施方式中，所述多個過表達基因和/或所述多個低表達基因選自所述元基因中的多個。

適合地，對于上述方面的方法，所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因包括表21中列出的一個或多個基因。

在另一方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物中癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中多個過表達基因的表達水平和多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自代謝元基因、信號傳導(dǎo)元基因、發(fā)育和生長元基因、染色體分離/復(fù)制元基因、免疫應(yīng)答元基因和蛋白質(zhì)合成/修飾元基因，其中：所述多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在又一方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中多個過表達基因的表達水平和多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自代謝元基因、信號傳導(dǎo)元基因、發(fā)育和生長元基因、染色體分離/復(fù)制元基因、免疫應(yīng)答元基因和蛋白質(zhì)合成/修飾元基因，其中：所述多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或多個過表達基因與所述多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較有利的癌癥預(yù)后。

適合地，所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因包括表21中列出的一個或多個基因。

在前述兩方面的方法的特定實施方式中，多個過表達基因和多個低表達基因來自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個。根據(jù)前述方面的方法，比較多個過表達基因的表達水平與多個低表達基因的表達水平的步驟包括比較所述多個過表達基因的平均表達水平與所述多個低表達基因的平均表達水平。這可以包括計算多個過表達基因的平均表達水平與多個低表達基因的平均表達水平的比率。適合地，所述比率提供侵襲性評分，其指示或關(guān)聯(lián)癌癥侵襲性和較不利的預(yù)后?；蛘?，比較多個過表達基因的表達水平與多個低表達基因的表達水平的步驟包括比較所述多個過表達基因的表達水平的總和與所述多個低表達基因的表達水平的總和。這可以包括計算多個過表達基因的表達水平的總和與多個低表達基因的表達水平的總和的比率。

為了本發(fā)明的目的，“分離的”是指已經(jīng)被從其天然狀態(tài)移除或以其它方式經(jīng)歷人工操作的材料。分離的材料可以實質(zhì)上或基本上不含通常在其天然狀態(tài)下伴隨其的組分，或者可以被操作以便與通常在其天然狀態(tài)下伴隨其的組分一起處于人工狀態(tài)。分離的材料可以處于天然形式，化學(xué)合成形式或重組形式。

如本文所用“基因”是核酸，其是基因組的結(jié)構(gòu)性遺傳單位，所述基因組可以包括一個或多個編碼氨基酸的核苷酸序列和一個或多個非編碼核苷酸序列，包括啟動子和其他5’非翻譯序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化序列和其他3’非翻譯序列，但不限于此。在大多數(shù)細胞生物中，基因是包含雙鏈DNA的核酸。

基因的非限制性實例在本文中闡述，特別是在表4、21和22中，其包括引用基因的核苷酸序列或其編碼蛋白的登錄號，正如在本領(lǐng)域中充分理解的。

本文使用的術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈的DNA和RNA。DNA包括基因組DNA和cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化RNA。核酸也可以是DNA-RNA雜交體。核酸包含通常包括包含A、G、C、T或U堿基的核苷酸的核苷酸序列。然而，核苷酸序列可以包括其他堿基，例如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿苷，但不限于此。

還包括的是“變體”核酸，其包括包含天然存在(例如等位基因)變體和直系同源物(例如來自不同物種)的核苷酸序列的核酸。優(yōu)選地，核酸變體與本文公開的核苷酸序列共有至少70％或75％，優(yōu)選至少80％或85％或更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。

還包括的是核酸片段?！捌巍笔呛怂岬墓?jié)段、域、部分或區(qū)域，其分別構(gòu)成小于100％的該核苷酸序列。非限制性實例是擴增產(chǎn)物或引物或探針。在特定的實施方式中，核酸片段可以包含，例如所述核酸的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475和500個連續(xù)核苷酸。

如本文所用，“多核苷酸”是具有八十(80)個或更多個連續(xù)核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”具有少于八十(80)個連續(xù)核苷酸?！疤结槨笨梢允菃捂溁螂p鏈的寡核苷酸或多核苷酸，其出于例如在RNA印跡或DNA印跡中檢測互補序列的目的而被適合地標(biāo)記?！耙铩蓖ǔＪ菃捂湽押塑账?，優(yōu)選具有15-50個連續(xù)核苷酸，其能夠與互補的核酸“模板”退火并且通過DNA聚合酶如Taq聚合酶、RNA依賴性DNA聚合酶或Sequenase^TM的作用以模板依賴性的方式延伸，。“模板”核酸是經(jīng)歷核酸擴增的核酸。

將認識到，本文提到的“過表達的”基因或蛋白質(zhì)是與相應(yīng)的正常或以其它方式非癌性的細胞或組織或參比/對照水平或樣本相比，在癌細胞或組織中以更高水平表達的基因或蛋白質(zhì)。

將認識到，本文提到的“低表達的”基因或蛋白質(zhì)是與相應(yīng)的正常或以其它方式非癌性的細胞或組織或參比/對照水平或樣本相比，在癌細胞或組織中以較低水平表達的基因或蛋白質(zhì)。

在某些實施方式中，本文提到的“過表達的”和“低表達的”基因可以形成元基因，或是元基因的組分。

如本文所用，“元基因”是多個不同基因的編組、群組或網(wǎng)絡(luò)，所述多個不同基因顯示關(guān)聯(lián)或指示特定功能或表型的共同的、共有的或聚集的表達譜、表達水平或其他表達特征。非限制性實例包括碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因。表21提供了作為上述12個元基因的組分的基因的非限制性實例。進一步的非限制性實例包括代謝元基因、信號傳導(dǎo)元基因、發(fā)育和生長元基因、染色體分離/復(fù)制元基因、免疫應(yīng)答元基因和/或蛋白質(zhì)合成/修飾元基因。表22提供了作為上述6個元基因的組分的基因的非限制性實例。

在特定的實施方式中，所述多個過表達基因和/或所述多個低表達基因選自所述元基因中的一個。在這個方面，多個過表達基因和/或多個低表達基因選自相同的元基因。舉例而言，所述多個過表達基因或所述多個低表達基因可僅來自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個。在進一步的實例中，所述多個過表達基因和所述多個低表達基因二者可僅來自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個。

或者，所述多個過表達基因和/或所述多個低表達基因選自本文所述元基因中的多個。

“侵襲性”和“侵襲的”是指癌癥由于特征或因素中的一種或多種或者組合而具有相對差的預(yù)后的性質(zhì)或傾向，所述特征或因素包括：對可用于癌癥治療的療法至少部分抵抗；侵襲力；轉(zhuǎn)移潛力；治療后復(fù)發(fā)；和患者生存的低概率，但不限于此。

癌癥可以包括任何侵襲性或潛在侵襲性癌癥、腫瘤或其他惡性腫瘤，例如在http://www.cancer.gov/cancertopics/alphalist的NCI Cancer Index中列出的，包括所有主要癌癥形式，例如肉瘤、上皮癌、淋巴瘤、白血病和胚細胞瘤，但不限于此。這些可包括乳腺癌、肺癌(包括肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)、生殖系統(tǒng)癌(包括卵巢癌、宮頸癌、子宮癌和前列腺癌)、腦和神經(jīng)系統(tǒng)癌、頭頸癌、胃腸癌(包括結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌和胃癌)、肝癌、腎癌、皮膚癌(skin cancer)(例如黑色素瘤和皮膚癌(skin carcinoma))、血細胞癌(包括淋巴癌和髓單核細胞癌)、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌(例如胰腺癌和垂體癌)、肌肉骨骼癌(包括骨和軟組織癌)，但不限于此。

在某些實施方式中，癌癥包括乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、低等級膠質(zhì)瘤、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺腺癌、急性髓性白血病、胰腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、黑色素瘤和肺鱗狀細胞癌。

乳腺癌包括所有侵襲性乳腺癌和癌癥亞型，如三陰性乳腺癌、2級乳腺癌、3級乳腺癌、淋巴結(jié)陽性(LN⁺)乳腺癌、HER2陽性(HER2⁺)乳腺癌和ER陽性(ER⁺)乳腺癌，但不限于此。

如本文所用，“三陰性乳腺癌”(TNBC)是通常具有侵襲性的乳腺癌亞型，其缺乏或具有顯著降低的雌激素受體(ER)蛋白、孕酮受體(PR)蛋白和HER2蛋白的表達。TNBC和其它侵襲性乳腺癌通常對可用于乳腺癌治療的最有效療法中的一些不敏感，包括HER2定向療法(如曲妥珠單抗)和內(nèi)分泌療法(如他莫昔芬和芳香酶抑制劑)。

如本文所用，基因表達水平可以是表達的基因或基因產(chǎn)物(包括核酸如RNA、mRNA和cDNA和蛋白)的絕對或相對量。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，本發(fā)明不需要被限制到比較本文提供的過表達基因和/或蛋白的表達水平與低表達基因和/或蛋白的表達水平。因此，在特定實施方式中，過表達和/或低表達的基因和/或蛋白的表達水平是與對照表達水平相比較，例如哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中“管家”基因的基因和/或蛋白表達的水平。

在進一步的實施方式中，過表達和/或低表達的基因和/或蛋白的表達水平是與表達閾值水平相比較，例如非侵襲性癌組織中基因和/或蛋白表達的水平。表達閾值水平通常是特定基因或基因組(包括其基因產(chǎn)物)的定量表達水平。通常，樣品中超過或低于表達閾值水平的基因或基因組的表達水平預(yù)測特定的疾病狀態(tài)或結(jié)果。表達閾值水平的性質(zhì)和數(shù)值(如果有的話)將基于選擇用以測定用于測定的一個或多個基因或蛋白的表達的方法而變化，例如，哺乳動物中的預(yù)后、侵襲性和/或?qū)拱┲委煹捻憫?yīng)。鑒于本公開，使用本領(lǐng)域已知的測量基因或蛋白質(zhì)表達的任何方法，例如本文所述的那些，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠測定哺乳動物樣品中基因/蛋白表達閾值水平，其可用于確定例如預(yù)后、侵襲性和/或?qū)拱┲委煹捻憫?yīng)。在一個實施方式中，閾值水平是參比群體中過表達和/或低表達的基因和/或蛋白的平均值和/或中位數(shù)表達水平(中位數(shù)或絕對值)，所述參比群體例如具有相同的癌癥類型、亞組、階段和/或等級作為測定表達水平的所述哺乳動物。另外，表達閾值水平的概念不應(yīng)限于單個值或結(jié)果。在這個方面，表達閾值水平可以涵蓋多個閾值表達水平，其可以表示，例如，例如無進展生存的高、中或低概率。

“蛋白質(zhì)”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸、D-或L-氨基酸，如本領(lǐng)域熟知的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”在其范圍內(nèi)還包括蛋白質(zhì)的磷酸化形式(即磷蛋白)。

還提供的是蛋白質(zhì)“變體”，例如天然存在的(例如等位基因變體)和直系同源物。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)變體與本文公開的氨基酸序列共有至少70％或75％，優(yōu)選至少80％或85％或更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。

還提供的是蛋白片段，包括包含整個氨基酸序列的小于100％的肽片段。在特定的實施方式中，蛋白片段可以包含，例如至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375和400個所述蛋白的連續(xù)氨基酸。

“肽”是具有不超過五十(50)個氨基酸的蛋白質(zhì)。

“多肽”是具有多于五十(50)個氨基酸的蛋白質(zhì)。

將認識到，除了比較一種或多種基因或蛋白質(zhì)的表達水平之外，本發(fā)明的方法還可以包括如下步驟：測定、評價、評估、化驗或測量本文所述過表達基因、低表達基因、過表達蛋白和/或低表達蛋白的一個或多個的表達水平。術(shù)語“測定”、“測量”、“評估”、“評價”和“化驗”在本文中可交換使用，并且可以包括本領(lǐng)域已知的任何形式的測量，例如下文所述的那些。

可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)測定、評價、評估、化驗或測量核酸，如RNA、mRNA和cDNA。這些可以是包括核酸序列擴增、核酸雜交、核苷酸測序、質(zhì)譜以及任意這些的組合的技術(shù)。

核酸擴增技術(shù)通常包括在適當(dāng)條件下使一個或多個引物與“模板”核苷酸序列退火并使用聚合酶合成與靶互補的核苷酸序列，從而“擴增”靶核苷酸序列的重復(fù)循環(huán)。核酸擴增技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；鏈置換擴增(SDA)；滾環(huán)復(fù)制(RCR)；基于核酸序列的擴增(NASBA)；Q-β復(fù)制酶擴增；解旋酶依賴性擴增(HAD)；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)；切口酶擴增反應(yīng)(NEAR)和重組酶聚合酶擴增(RPA)，但不限于此。如本文一般使用的，“擴增產(chǎn)物”是指通過核酸擴增技術(shù)產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。

PCR包括：定量和半定量PCR、實時PCR、等位基因特異性PCR、甲基化特異性PCR、不對稱PCR、巢式PCR、多重PCR、降落式PCR和其它對于“基本”PCR擴增的變化和改變。

可以使用從細胞或組織來源提取、分離或以其它方式獲得的DNA或RNA進行核酸擴增技術(shù)。在其他實施方式中，可以對經(jīng)適當(dāng)處理的細胞或組織樣品直接進行核酸擴增。

核酸雜交通常包括在適當(dāng)條件下將核苷酸序列(通常以探針的形式)與靶核苷酸序列雜交，由此繼而檢測雜交的探針-靶核苷酸序列。非限制性實例包括RNA印跡、狹縫印跡、原位雜交和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測，但不限于此。可以使用從細胞或組織來源提取、分離、擴增或以其它方式獲得的DNA或RNA或著直接在經(jīng)適當(dāng)處理的細胞或組織樣品上進行核酸雜交。

還將認識到，可以利用核酸擴增與核酸雜交的組合。

測定、評價、評估、化驗或測量蛋白水平可以通過本領(lǐng)域已知的能夠檢測細胞或組織表達蛋白(無論是在細胞表面上或是在細胞內(nèi)表達)，或從細胞或組織來源分離、提取或以其他方式獲得的蛋白的任何技術(shù)進行。這些技術(shù)包括使用結(jié)合蛋白質(zhì)的一種或多種抗體的基于抗體的檢測、電泳、等電聚焦、蛋白質(zhì)測序、色譜技術(shù)和質(zhì)譜及其組合，但不限于此。基于抗體的檢測可包括使用結(jié)合蛋白的熒光標(biāo)記抗體的流式細胞術(shù)、ELISA、免疫印跡、免疫沉淀、原位雜交、免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)，但不限于此。合適的技術(shù)可以適用于高通量和/或快速分析，例如使用蛋白陣列，如TissueMicroArray^TM(TMA)、MSD MultiArrays^TM和多孔ELISA，但不限于此。

在某些實施方式中，可通過測量調(diào)節(jié)基因表達的非編碼RNA(例如miRNA)間接評估基因表達水平。微RNA(miRNA或miR)是結(jié)合靶mRNA轉(zhuǎn)錄物的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)中的互補序列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)物，通常導(dǎo)致基因沉默。miRNA是短DNA分子，平均只有22個核苷酸長。人類基因組可以編碼超過1000個miRNA，其可以靶向約60％的哺乳動物基因并且在許多人類細胞類型中是豐富的。每個miRNA可以改變數(shù)百個單獨mRNA的表達。特別地，miRNA可以在負調(diào)節(jié)(例如轉(zhuǎn)錄物降解和掩蔽、翻譯抑制)和/或正調(diào)節(jié)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯激活)中具有多重作用。此外，多種類型的癌癥中已經(jīng)牽涉到異常的miRNA表達。

在這方面，可以對多個過表達基因和多個低表達基因計算平均表達水平，或者表達水平總和，從而產(chǎn)生或計算比率。

因此，在本發(fā)明的某些實施方式中，確定癌癥患者的癌癥侵襲性和/或預(yù)后還包括測定多個過表達基因的表達水平(例如表達水平的平均值或總和)與多個低表達基因的表達水平(例如，表達水平的平均值或總和)的比率。

在另一方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物中癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的多個低表達基因的表達水平，其中：與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在又一方面，本發(fā)明涉及一種確定哺乳動物的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的多個低表達基因的表達水平，其中：與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較有利的癌癥預(yù)后。

染色體不穩(wěn)定性(CIN)元基因中基因的非限制性實例包括：ATP6V1C1、RAP2A、CALM1、COG8、HELLS、KDM5A、PGK1、PLCH1、CEP55、RFC4、TAF2、SF3B3、GPI、PIR、MCM10、MELK、FOXM1、KIF2C、NUP155、TPX2、TTK、CENPA、CENPN、EXO1、MAPRE1、ACOT7、NAE1、SHMT2、TCP1、TXNRD1、ADM、CHAF1A和SYNCRIP基因，但不限于此；并且雌激素受體信號傳導(dǎo)(ER)元基因可包括：BTG2、PIK3IP1、SEC14L2、FLNB、ACSF2、APOM、BIN3、GLTSCR2、ZMYND10、ABAT、BCAT2、SCUBE2、RUNX1、LRRC48、MYBPC1、BCL2、CHPT1、ITM2A、LRIG1、MAPT、PRKCB、RERE、ABHD14A、FLT3、TNN、STC2、BATF、CD1E、CFB、EVL、FBXW4、ABCB1、ACAA1、CHAD、PDCD4、RPL10、RPS28、RPS4X、RPS6、SORBS1、RPL22和RPS4XP3基因，但不限于此。表4提供了作為CIN元基因的組分或作為ER元基因的組分的基因的進一步實例。

可以針對CIN元基因和ER元基因計算平均表達水平，從而產(chǎn)生或計算比率。

或者，可以針對CIN元基因和ER元基因計算表達水平的總和，從而產(chǎn)生或計算比率。

在某些實施方式中，CIN元基因相對于ER元基因的表達水平的平均值或總和的更高或增加的比率相關(guān)、關(guān)聯(lián)或指示更高或增加的癌癥侵襲性。

因此，本發(fā)明的一些實施方式提供了“侵襲性評分”，其是CIN元基因表達水平(例如CIN基因表達的平均值或總和)與ER元基因表達水平(例如ER基因表達的平均值或總和)的比率。

因此，本發(fā)明的上述方面的實施方式包括測定、評估或測量與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的多個過表達基因的表達水平，以及測定、評估或測量與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的多個低表達基因的表達水平。在這方面，參照表4，其提供了206個基因的列表，其包括與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的基因和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因。

優(yōu)選地，染色體不穩(wěn)定性基因?qū)儆贑IN元基因，其包括基因例如：ATP6V1C1、RAP2A、CALM1、COG8、HELLS、KDM5A、PGK1、PLCH1、CEP55、RFC4、TAF2、SF3B3、GPI、PIR、MCM10、MELK、FOXM1、KIF2C、NUP155、TPX2、TTK、CENPA、CENPN、EXO1、MAPRE1、ACOT7、NAE1、SHMT2、TCP1、TXNRD1、ADM、CHAF1A和SYNCRIP，但不限于此。在一個優(yōu)選的實施方式中，染色體不穩(wěn)定性基因選自：MELK、MCM10、CENPA、EXO1、TTK和KIF2C。優(yōu)選地，雌激素受體信號傳導(dǎo)基因?qū)儆贓R元基因，其包括基因例如：BTG2、PIK3IP1、SEC14L2、FLNB、ACSF2、APOM、BIN3、GLTSCR2、ZMYND10、ABAT、BCAT2、SCUBE2、RUNX1、LRRC48、MYBPC1、BCL2、CHPT1、ITM2A、LRIG1、MAPT、PRKCB、RERE、ABHD14A、FLT3、TNN、STC2、BATF、CD1E、CFB、EVL、FBXW4、ABCB1、ACAA1、CHAD、PDCD4、RPL10、RPS28、RPS4X、RPS6、SORBS1、RPL22和RPS4XP3，但不限于此。在一個優(yōu)選的實施方式中，雌激素受體信號傳導(dǎo)基因選自：MAPT和MYB。

在某些實施方式中，前述兩方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個其他過表達基因的表達水平，和選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個其他低表達基因的表達水平，其中：所述一個或多個其他過表達基因與所述一個或多個其他低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性和/或較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個其他過表達基因與所述一個或多個其他低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性和/或較有利的癌癥預(yù)后。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

在這方面，可以對一個或多個其他過表達基因和一個或多個其他低表達基因計算平均表達水平，或者計算表達水平的總和，從而產(chǎn)生或計算比率。

因此，在本發(fā)明的某些實施方式中，確定癌癥患者的癌癥侵襲性和/或預(yù)后還包括：確定一個或多個其他過表達基因的表達水平(例如表達水平的平均值或總和)與一個或多個其他低表達基因的表達水平(例如，表達水平的平均值或總和)的比率。

一個或多個其它過表達基因和一個或多個其它低表達基因的表達的檢測和/或測量可以通過本文所述的這些方法中的任一種或其組合進行(例如測量mRNA水平或其擴增的cDNA拷貝和/或通過測量其蛋白質(zhì)產(chǎn)物)，但不限于此。

適合地，與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較與所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較相結(jié)合，以得到第一綜合評分。在特定的實施方式中，這可以包括至少部分通過加法、減法、乘法、除法和/或求冪以得到第一綜合評分。

舉例而言，與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較可加上、減去、乘以、除以所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較，和/或自乘所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較次冪，以得到第一綜合評分?；蛘撸鲆粋€或多個其他過表達基因的表達水平和所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較可加上、減去、乘以、除以與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較，和/或自乘與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較次冪，以得到第一綜合評分。

在一個特別優(yōu)選的實施方式中，第一綜合評分通過求冪得到，其中使所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較自乘為與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較次冪。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本文所述的其他過表達和低表達的基因可以不必然地分別與染色體不穩(wěn)定性和雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)。

在進一步的方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1，其中所述一個或多個低表達基因選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

在又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中一個或多個過表達基因的表達水平和一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1，其中所述一個或多個低表達基因選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比較有利的癌癥預(yù)后。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

在特定的實施方式中，前述方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中：所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性和/或較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性和/或較有利的癌癥預(yù)后。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，本文所述的一個或多個過表達蛋白和/或一個或多個低表達蛋白的表達水平可包括所述蛋白的一個或多個磷酸化形式(即磷蛋白)。在一個實施方式中，EIF4EBP1是或包含選自pEIF4EBP1^S65、pEIF4EBP1^T37、pEIF4EBP1^T46和pEIF4EBP1^T70的一個或多個磷蛋白。在一個實施方式中，EGFR是或包含選自pEGFR^Y1068和pEGFR^Y1173的一個或多個磷蛋白。在一個實施方式中，HER3是或包含pHER3^Y1289。在一個實施方式中，AKT1是或包含選自pAKT1^S473和pAKT1^X308的一個或多個磷蛋白。在一個實施方式中，NFKB1是或包含pNFKB1^S536。在一個實施方式中，HER2是或包含pHER2^Y1248。在一個實施方式中，ESR1是或包含pESR1^S118。在一個實施方式中，PEA15是或包含pPEA15^S116。在一個實施方式中，RPS6是或包含選自pRPS6^S235、pRPS6^S236、pRPS6^S240和pRPS6^S244的一個或多個磷蛋白。

可以對過表達基因、低表達基因、過表達蛋白和/或低表達蛋白計算表達水平的平均值或總和，從而產(chǎn)生或計算比率。

因此，在本發(fā)明的某些實施方式中，確定癌癥患者的癌癥侵襲性和/或預(yù)后包括測定：(i)一個或多個過表達基因的表達水平(例如表達水平的平均值或總和)與一個或多個低表達基因的表達水平(例如，表達水平的平均值或總和)的比率；和/或(ii)一個或多個過表達蛋白的表達水平(例如表達水平的平均值或總和)與一個或多個過表達蛋白的表達水平(例如表達水平的平均值或總和)的比率。

過表達蛋白和低表達蛋白的表達的檢測和/或測量可以通過上文描述的那些方法中的任一種或其組合進行，但不限于此。

適合地，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較是為了由此得到綜合評分。在一個特定的實施方式中，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和所述一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較與下述相結(jié)合：

(i)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因的表達水平的比較，以得到第二綜合評分；或

(ii)所述第一綜合評分，以得到第三綜合評分；或

(iii)所述選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的過表達基因的表達水平和所述選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的低表達基因的表達水平的比較，以得到第四綜合評分；或

(iv)所述過表達基因的表達水平和所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個，以得到第五綜合評分；或

(v)所述過表達基因的表達水平和所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因中的一個或多個，以得到第六綜合評分。

在特定的實施方式中，第二、第三、第四、第五和/或第六綜合評分至少部分地通過加法、減法、乘法、除法和/或求冪得到。舉例而言，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和所述一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較可加上、從其減去、乘以、除以(i)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較或(ii)第一綜合評分，和/或自乘為(i)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較或(ii)第一綜合評分次冪?；蛘?，與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較或者第一綜合評分可加上、減去、乘以、除以所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和所述一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較，和/或自乘為所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和所述一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較次冪。

在進一步的方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中癌癥侵襲性的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中：所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性；和/或所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性。

在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物中癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和/或選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中：所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比較有利的癌癥預(yù)后。

在前述兩方面的特定實施方式中，一個或多個過表達蛋白和/或一個或多個低表達蛋白是或包括上文所述的磷蛋白。

可對所述一個或多個過表達蛋白和所述一個或多個低表達蛋白計算表達水平的平均值或總合，從而產(chǎn)生或計算上文所述的比率。

這種關(guān)于患者癌癥的侵襲性和/或預(yù)后的信息可以證明對于醫(yī)生和/或臨床醫(yī)務(wù)人員在確定最有效的治療過程中有用。確定癌癥復(fù)發(fā)的可能性或轉(zhuǎn)移的可能性可以幫助醫(yī)生和/或臨床醫(yī)務(wù)人員確定是否應(yīng)該采取更保守或更激進的治療方法。因此，預(yù)后可以提供對預(yù)測受益于給定治療方案的患者的選擇和分類。

因此，另一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中多個過表達基因的表達水平和多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因，其中所述過表達基因與所述低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，當(dāng)基因或蛋白的表達水平在與對照或參比樣品或表達水平(例如閾值水平)相比更高/增加或更低/降低時，相對表達水平可以被認為是“改變的”或“調(diào)節(jié)的”。在一個實施方式中，如果相對表達水平大于參比群體的相對表達水平的平均值和/或中位數(shù)，則其可被分類為高，并且如果相對表達水平小于參比群體的相對表達水平的平均值和/或中位數(shù)，則其可被分類為低。在這方面，參比群體可以是一組受試者，所述受試者具有的相同癌癥類型、亞組、階段和/或等級，作為測定相對表達水平的所述哺乳動物。

適合地，對于本方面，所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因包括表21中列出的一個或多個基因。

在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中多個過表達基因的表達水平和多個低表達基因的表達水平，其中所述過表達基因和所述低表達基因來自一個或多個元基因，所述元基因選自代謝元基因、信號傳導(dǎo)元基因、發(fā)育和生長元基因、染色體分離/復(fù)制元基因、免疫應(yīng)答元基因和蛋白質(zhì)合成/修飾元基因，其中所述過表達基因與所述低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在上述兩方面的一個實施方式中，所述多個過表達基因和/或所述多個低表達基因選自前述元基因中的一個。在一個替代性實施方式中，所述多個過表達基因和/或所述多個低表達基因選自前述元基因中的多個。

適合地，所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因包括表22中列出的一個或多個基因。

在特定的實施方式中，所述多個過表達基因和所述多個低表達基因來自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個。

在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：測定哺乳動物的一個或多個癌癥細胞中與染色體不穩(wěn)定性(CIN)相關(guān)的一個或多個基因的表達水平，其中：較高的表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對抗癌治療的相對提高的響應(yīng)。

如將更詳細描述的，一些CIN基因的過表達可以預(yù)測癌癥對抗癌治療的響應(yīng)，特別是而非排他地，當(dāng)由非有絲分裂癌細胞過表達時。在本文中，“非有絲分裂的”是指癌細胞不處于細胞周期的有絲分裂期或“M期”。優(yōu)選地，非有絲分裂癌細胞處于分裂間期。一般地，表4所述任何過表達CIN基因可預(yù)測癌癥對抗癌治療的響應(yīng)。在特定的實施方式中，CIN基因選自：TTK，CEP55，F(xiàn)OXM1和SKIP2。在特定的優(yōu)選實施方式中，CIN基因選自：TTK，CEP55，F(xiàn)OXM1和SKIP2，且所述癌癥為乳腺癌。在這方面，本發(fā)明人已經(jīng)顯示，提取的CIN基因mRNA或編碼蛋白的“大量”測量并未提供CIN基因的過表達是否可預(yù)測癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的有用指示。更具體地，通過個體癌細胞特別是非有絲分裂或分裂間期癌細胞檢測CIN基因表達提供了癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的更有力指示。

如前所述，CIN基因表達的檢測和/或測量可以通過測量CIN基因的RNA(例如mRNA或其擴增的cDNA拷貝)或通過測量CIN基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物而進行。在特別優(yōu)選的實施方案中，CIN基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物通過免疫組織化學(xué)檢測或測量。通常，雖然并非排他地，優(yōu)選的免疫組織化學(xué)方法包括將抗體結(jié)合到由細胞或組織表達的CIN基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，然后檢測結(jié)合抗體。僅舉例而言，抗體可以是未標(biāo)記的、用酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶)直接標(biāo)記的，或者用生物素或地高辛直接標(biāo)記的。在抗體未標(biāo)記的實施方式中，二級抗體(如上所述被標(biāo)記的)可用于檢測結(jié)合抗體。生物素化抗體可以使用與酶如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶復(fù)合的抗生物素蛋白檢測。合適的酶底物包括二氨基聯(lián)苯胺(diaminobanzidine)(DAB)、堅固紅、3-乙基苯并噻唑啉磺酸(ABTS)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)、硝基四氮唑藍(NBT)，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TNB)和4-氯-1-萘酚(4-CN)，但不限于此。

在進一步的方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的多個低表達基因的表達水平，其中：與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因相比于與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在某些實施方式中，與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述基因?qū)儆贑IN元基因。非限制性實例包括選自：ATP6V1C1、RAP2A、CALM1、COG8、HELLS、KDM5A、PGK1、PLCH1、CEP55、RFC4、TAF2、SF3B3、GPI、PIR、MCM10、MELK、FOXM1、KIF2C、NUP155、TPX2、TTK、CENPA、CENPN、EXO1、MAPRE1、ACOT7、NAE1、SHMT2、TCP1、TXNRD1、ADM、CHAF1A和SYNCRIP的基因。在一個優(yōu)選的實施方式中，染色體不穩(wěn)定性基因選自：MELK、MCM10、CENPA、EXO1、TTK和KIF2C。

在某些實施方式中，與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述基因?qū)儆贓R元基因。非限制性實例包括選自：BTG2、PIK3IP1、SEC14L2、FLNB、ACSF2、APOM、BIN3、GLTSCR2、ZMYND10、ABAT、BCAT2、SCUBE2、RUNX1、LRRC48、MYBPC1、BCL2、CHPT1、ITM2A、LRIG1、MAPT、PRKCB、RERE、ABHD14A、FLT3、TNN、STC2、BATF、CD1E、CFB、EVL、FBXW4、ABCB1、ACAA1、CHAD、PDCD4、RPL10、RPS28、RPS4X、RPS6、SORBS1、RPL22和RPS4XP3的基因。在一個優(yōu)選的實施方式中，雌激素受體信號傳導(dǎo)基因選自：MAPT和MYB。

適合地，該方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個其他過表達基因的表達水平，和選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個其他低表達基因的表達水平，其中：所述一個或多個其他過表達基因與所述一個或多個其他低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個其他低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

在某些實施方式中，所述一個或多個其他過表達基因的表達水平和所述一個或多個其他低表達基因的表達水平的比較與與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述多個過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述多個低表達基因的表達水平的比較相結(jié)合以得到如本文所述的第一綜合評分，其指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療的響應(yīng)。

在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的一個或多個過表達基因的表達水平，和選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的一個或多個低表達基因的表達水平，其中：所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自ABHD5、ADORA2B、BCAP31、CA9、CAMSAP1、CARHSP1、CD55、CETN3、EIF3K、EXOSC7、GNB2L1、GRHPR、GSK3B、HCFC1R1、KCNG1、MAP2K5、NDUFC1、PML、STAU1、TXN和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、ERC2、IGH、ME1、MTMR7、SMPDL3B和ZNRD1-AS1。

在特定的實施方式中，前述五個方面的方法進一步包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中：所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥較高的侵襲性和/或較不利的癌癥預(yù)后；和/或所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)與具有較高表達水平的哺乳動物相比所述癌癥較低的侵襲性和/或較有利的癌癥預(yù)后。

在特定的實施方式中，一個或多個過表達蛋白和/或一個或多個低表達蛋白是或包括上文所述的磷蛋白。

可以對過表達基因、低表達基因、過表達蛋白和/或低表達蛋白計算表達水平的平均值或總和，從而產(chǎn)生或計算上文所述的比率。

過表達蛋白和低表達蛋白的表達的檢測和/或測量可以通過上文所述的那些方法中的任一種或其組合進行，但不限于此。

適合地，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較是為了由此得到綜合評分。在一個特定的實施方式中，所述一個或多個過表達蛋白的表達水平和所述一個或多個低表達蛋白的表達水平的比較與下述相結(jié)合：

(i)與染色體不穩(wěn)定性相關(guān)的所述過表達基因的表達水平和與雌激素受體信號傳導(dǎo)相關(guān)的所述低表達基因的表達水平的比較，以得到第二綜合評分；或

(ii)所述第一綜合評分，以得到第三綜合評分；或

(iii)所述選自CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1的過表達基因的表達水平和所述選自BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3的低表達基因的表達水平的比較，以得到第四綜合評分；或

(iv)所述過表達基因的表達水平和所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述碳水化合物/脂代謝元基因、所述細胞信號傳導(dǎo)元基因、所述細胞發(fā)育元基因、所述細胞生長元基因、所述染色體分離元基因、所述DNA復(fù)制/重組元基因、所述免疫系統(tǒng)元基因、所述代謝疾病元基因、所述核酸代謝元基因、所述翻譯后修飾元基因、所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和/或所述多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個，以得到第五綜合評分；或

(v)所述過表達基因的表達水平和所述低表達基因的表達水平的比較，其中所述基因來自所述代謝元基因、所述信號傳導(dǎo)元基因、所述發(fā)育和生長元基因、所述染色體分離/復(fù)制元基因、所述免疫應(yīng)答元基因和/或所述蛋白質(zhì)合成/修飾元基因中的一個或多個，以得到第六綜合評分，

其中第二、第三、第四、第五和/或第六綜合評分指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對抗癌治療的響應(yīng)。

在特定的實施方式中，第二、第三、第四、第五和/或第六綜合評分至少部分地通過加法、減法、乘法、除法和/或求冪得到，如上文所述。

在進一步的相關(guān)方面，本發(fā)明提供預(yù)測哺乳動物中癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1的一個或多個過表達蛋白的表達水平，和/或選自VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6的一個或多個低表達蛋白的表達水平，其中所述一個或多個過表達蛋白與所述一個或多個低表達蛋白相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高或降低的響應(yīng)。

在特定的實施方式中，一個或多個過表達蛋白和/或一個或多個低表達蛋白是或包括上文所述的磷蛋白。

從上述內(nèi)容可以認識到，本發(fā)明提供了確定癌癥侵襲性、促進為患者提供癌癥預(yù)后和/或預(yù)測癌癥對抗癌治療的響應(yīng)的方法。特別地，本發(fā)明的概括性實施方案包括在確定癌癥侵襲性、提供癌癥預(yù)后和/或預(yù)測癌癥對抗癌治療的響應(yīng)之后治療患者的步驟。因此，這些實施方案涉及使用有關(guān)癌癥侵襲性、癌癥預(yù)后和/或癌癥對抗癌治療的預(yù)測響應(yīng)的獲得信息，以由此構(gòu)建和實施針對患者的抗癌治療方案。在一個優(yōu)選的實施方式中，這對于特定患者是個人化的，使得治療方案對該特定患者是優(yōu)化的。

癌癥治療可包括藥物療法，化療，抗體、核酸和其他生物分子療法，放療，手術(shù)，營養(yǎng)療法，放松或冥想療法和其它天然或整體療法，但不限于此。在特定的實施方式中，癌癥治療可以靶向非整倍體或非整倍體腫瘤和/或染色體不穩(wěn)定性。

通常，藥物、生物分子(例如抗體、抑制性核酸如siRNA)或化療藥劑在本文中稱為“抗癌治療劑”。在與乳腺癌相關(guān)的一些實施方式中，抗癌療法可包括HER2定向療法(如曲妥珠單抗)和內(nèi)分泌療法(例如他莫昔芬和芳香酶抑制劑)。在其他或替代性實施方式中，療法可包括施用CIN基因或CIN基因產(chǎn)物的抑制劑，例如表4中所列的那些中的一種或多種。將認識到，使用特異性抑制劑AZ3146抑制CIN基因產(chǎn)物TTK對TNBC細胞系有效。此外，siRNA介導(dǎo)的CIN基因TTK、TPX2、NDC80和PBK的敲減對TNBC細胞系有效。

在某些實施方式中，癌癥治療可針對表4、10、21和/或22所列的基因或基因產(chǎn)物以外的基因或基因產(chǎn)物。舉例而言，癌癥治療可靶向基因或基因產(chǎn)物，如PLK1^71，72或其他^73-76，以由此靶向非整倍體腫瘤或腫瘤細胞。

適合地，考慮到(i)與30基因印記(即：BRD8、BTN2A2、KIR2DL4、ME1、PSEN2、CALR、CAMK4、ITM2C、NOP2、NSUN5、SF3B1、ZNRD1-AS1、ARNT2、ERC2、SLC11A1、BRD4、APOBEC3A、CD1A、CD1B、CD1C、CXCR4、HLA-B、IGH、KIR2DL3、SMPDL3B、MYB、RLN1、MTMR7、SORBS1和SRPK3)中的一個或多個低表達基因比較的29基因印記(即：CAMSAP1、CETN3、GRHPR、ZNF593、CA9、CFDP1、VPS28、ADORA2B、GSK3B、LAMA4、MAP2K5、HCFC1R1、KCNG1、BCAP31、ULBP2、CARHSP1、PML、CD36、CD55、GEMIN4、TXN、ABHD5、EIF3K、EIF4B、EXOSC7、GNB2L1、LAMA3、NDUFC1和STAU1)中的一個或多個過表達基因的相對表達；(ii)與一個或多個低表達蛋白(即：VEGFR2、HER3、ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6)比較的一個或多個過表達蛋白(即：DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、Ku80、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2、AKT1、NFKB1、HER2、ASNS和COL6A1)的相對表達；和/或(iii)第一、第二、第三和/或第四綜合評分時，抗腫瘤治療藥劑選自：化療、內(nèi)分泌療法、免疫療法和分子靶向療法。在某些實施方式中，抗癌治療包括ALK抑制劑(例如：TAE684)，極光激酶抑制劑(例如：Alisertib、AMG-900、BI-847325，GSK-1070916A、伊洛美曲塞、MK-8745、danusertib)，BCR-ABL抑制劑(例如：尼洛替尼、達沙替尼、帕納替尼)，HSP90抑制劑(例如：坦沙霉素(17-AAG)、PF0429113，AUY922，Luminespib，ganetespib，Debio-0932)，EGFR抑制劑(例如：Afatinib、Erlotinib、Lapatinib、西妥昔單抗)，PARP抑制劑(例如：ABT-888、AZD-2281)，維甲酸(例如：全反式維甲酸或ATRA)，Bcl2抑制劑(例如：ABT-263)，糖異生抑制劑(例如：二甲雙胍)，p38MAPK抑制劑(例如：BIRB0796、LY2228820)，MEK1/2抑制劑(例如：曲美替尼、cobimetinib、比馬替尼、selumetinib、pimasertib、refametinib、TAK-733)，mTOR抑制劑(例如：BEZ235，JW-7-25-1)，PI3K抑制劑(例如：Idelalisib、buparlisib/apelisib、copanlisib、GSK-2636771、pictilisib、AMG-319、AZD-8186)，IGF1R抑制劑(例如：BMS-754807、dalotuzumab、ganitumab、linsitinib)，PLCγ抑制劑(例如：U73122)，JNK抑制劑(例如：SP600125)，PAK1抑制劑(例如：IPA3)，SYK抑制劑(例如：BAY613606)，HDAC抑制劑(例如：Vorinostat)，F(xiàn)GFR抑制劑(例如：多柔比星)，XIAP抑制劑(例如：Embelin)，PLK1抑制劑(例如：Volasertib、P-937)，ERK5抑制劑(例如：XMD8-92)，MPS1/TTK抑制劑(例如：BAY-1161909)及其任意組合。

舉例而言，具有與一個或多個低表達基因(例如7基因印記中的那些)相比的一個或多個過表達基因(例如21基因印記中的那些)的相對高表達水平的患者，具有與一個或多個低表達蛋白相比的一種或多種過表達蛋白的相對高表達水平的患者，和/或具有本文所述的高綜合評分的患者，在用化療治療時更可能有利地響應(yīng)，例如病理學(xué)完全響應(yīng)。在這方面，化療的非限制性實例包括：嘧啶類似物(例如：5-氟尿嘧啶、卡培他濱)，紫杉烷(例如：紫杉醇)，蒽環(huán)類藥物(例如：多柔比星、表柔比星)，抗葉酸藥物(例如：二氫葉酸還原酶抑制劑甲氨蝶呤)，烷化劑(例如：環(huán)磷酰胺)或其任何組合。將認識到，化療可作為佐劑、新輔助劑和/或作為標(biāo)準(zhǔn)治療單獨或與其它抗癌治療藥劑組合施用。

另外，在某些實施方式中，具有與一個或多個低表達的基因(例如30基因印記中的基因)相比一個或多個過表達基因(例如29基因印記中的那些)相對高表達水平的患者，具有與一種或多種低表達蛋白相比的一種或多種過表達蛋白的相對高表達水平的患者，和/或具有本文所述的高綜合評分的患者，可以更可能有利地響應(yīng)于(即，對于其更敏感)HSP90、EGFR，IGF1R、mTOR、PI3K、p38MAPK、PLCγ、JNK、PAK1、ERK5、XIAP、PLK1和/或MEK1/2的抑制，并且不太可能有利地響應(yīng)于(即，更不敏感于)使用ALK抑制劑、BCR-ABL抑制劑、PARP抑制劑、維甲酸、Bcl2抑制劑、糖異生抑制劑、p38MAPK抑制劑、FGFR抑制劑、SYK抑制劑、HDAC抑制劑和/或IGF1R抑制劑的抗癌治療。

還將認識到，本文所述的基因和蛋白印記可用于鑒定那些預(yù)后較差的患者，例如具有更大的和/或更高等級的腫瘤的患者，其可獲益于除該特定患者群體的典型或標(biāo)準(zhǔn)抗癌治療方案之外的一個或多個抗癌治療劑。舉例而言，涉及高綜合評分和因而相對差的預(yù)后的牽涉或不牽涉淋巴結(jié)的ER⁺乳腺癌患者更可能有利地響應(yīng)或獲益于化療和/或內(nèi)分泌療法。這可包括這些患者改善的生存和/或減少的腫瘤復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移可能性。

在某些實施方式中，對于具有與7基因印記的低表達基因相比21基因印記的過表達基因的相對高表達水平和/或具有高綜合評分的患者，癌癥治療可針對表13、15、16和17中列出的那些基因或基因產(chǎn)物。

另外，對于具有與低表達蛋白相比過表達蛋白的相對高表達水平和/或具有高綜合評分的患者，癌癥治療可針對表19中列出的那些蛋白中的一種或多種。

將認識到，本文所述的用于預(yù)測癌癥對抗癌治療(例如免疫治療藥劑)的響應(yīng)的那些方法可進一步包括如下步驟：對哺乳動物施用治療有效量的抗癌治療。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述抗癌治療在改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述抗癌治療相對提高的響應(yīng)時施用。

治療癌癥的方法可以是預(yù)防性(prophylactic)、防止性(preventative)或治療性的，并且適合于哺乳動物中的癌癥治療，特別是人類。如本文所用，“治療”是指治療性的干預(yù)、行動過程或方案，其在癌癥和/或其癥狀已經(jīng)至少開始發(fā)展后至少改善癌癥的癥狀。如本文所用，“預(yù)防”是指治療性的干預(yù)、行動過程或方案，其在癌癥和/或癌癥癥狀發(fā)作之前開始，從而預(yù)防、抑制或延緩癌癥或癥狀的發(fā)展或進展。

術(shù)語“治療有效量”描述足以在用特定藥劑治療的受試者中達到所需效果的該藥劑的量。例如，這可以是包含結(jié)合本文所述的一個或多個過表達和/或低表達基因或其基因產(chǎn)物的一個或多個藥劑的組合物減少、減輕和/或預(yù)防癌癥或癌癥相關(guān)疾病、紊亂或病情所必須的量。在一些實施方式中，“治療有效量”足以減少或消除癌癥癥狀。在其它實施方式中，“治療有效量”是足以實現(xiàn)期望的生物效應(yīng)的量，例如有效減少或預(yù)防癌癥生長和/或轉(zhuǎn)移的量。

理想地，藥劑的治療有效量是足以在受試者中誘導(dǎo)所需結(jié)果而不引起實質(zhì)性細胞毒性作用的量?？捎糜跍p少、減輕和/或預(yù)防癌癥的藥劑的有效量將取決于待治療的受試者，任何相關(guān)疾病、紊亂和/或病情的類型和嚴(yán)重程度(例如，任何相關(guān)轉(zhuǎn)移的數(shù)量和位置)，以及治療組合物的給藥方式。

適合地，抗癌治療藥劑作為包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物施用于哺乳動物。

“藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”是指可以安全地用于全身給藥的固體或液體的填料、稀釋劑或包封物質(zhì)。根據(jù)特定給藥途徑，可使用本領(lǐng)域公知的多種載體。這些載體可選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、膠質(zhì)、滑石、硫酸鈣、脂質(zhì)體和其它基于脂質(zhì)的載體、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、乳化劑、等滲鹽水和鹽如無機酸鹽(包括鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽)、有機酸(例如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽)和無熱原水。

描述藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的有用文獻是Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，其通過引用并入本文。

可采用任何安全的給藥途徑為患者提供本發(fā)明的組合物。例如，可以采用口服、直腸、腸胃外、舌下、口腔、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)皮等。肌內(nèi)和皮下注射適合于例如施用免疫治療組合物、蛋白質(zhì)疫苗和核酸疫苗。

劑型包括片劑、分散劑、混懸劑、注射劑、溶液劑、糖漿劑、錠劑、膠囊劑、栓劑、氣溶膠、透皮貼劑等。這些劑型還可包括注射或植入專門為此目的設(shè)計的控釋裝置或被改進而以這種方式另外作用的其它形式的植入物。可通過用例如疏水聚合物(包括丙烯酸樹脂、蠟、高級脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素)涂布治療劑而實現(xiàn)治療劑控釋。此外，可通過使用其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球?qū)崿F(xiàn)控釋。

本發(fā)明中適合于口服或腸胃外給藥的組合物可作為離散單元如膠囊、小藥囊或片劑存在，其各自含有預(yù)定量的本發(fā)明的一個或多個治療藥劑；可作為粉劑或顆粒劑或者作為在水性液體、非水性液體、水包油乳液或油包水液體乳液中的溶液劑或混懸劑存在。這樣的組合物可以通過任何藥學(xué)方法制備，但是所有方法都包括如下步驟：使如上所述的一個或多個藥劑與構(gòu)成一個或多個必要成分的載體結(jié)合。通常，通過將本發(fā)明的藥劑與液體載體或細分固體載體或兩者均勻且緊密地混合而制備混合物，然后如果需要，將產(chǎn)物成形為所需外觀。

上述組合物可以以與劑型相容的方式且以藥學(xué)上有效的量施用。在本發(fā)明背景下，施用于患者的劑量應(yīng)足以在患者中實現(xiàn)適當(dāng)時間段的有益響應(yīng)。待施用的藥劑的量可取決于待治療的受試者，包括年齡、性別、體重及其一般健康狀況、將取決于從業(yè)者的判斷的因素。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是乳腺癌，并且一個或多個過表達蛋白選自DVL3、VEGFR2、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR、HER3、SMAD1、NFKB1和HER2，并且一個或多個和低表達蛋白選自ASNS、MAPK9、YWHAE、RAD50、PGR、COL6A1、PEA15和RPS6。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是肺癌，例如肺腺癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、TXN、KCNG1、BCAP31、GSK3B、FOXM1、ZNF593、EXO1、KIF2C、TTK、MELK、CENPA、TPX2、CA9、GRHPR、HCFC1R1、CEP55、MCM10、CENPN和CARHSP1，并且所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、MTMR7、ZNRD1-AS1、MAPT和BTG2；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自DVL3、PAI-1、Ku80、GATA3、ITGA2和AKT1，并且所述一個或多個低表達蛋白選自ESR1。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是腎癌，例如腎透明細胞癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自EIF3K、ADORA2B、KCNG1、BCAP31、EXOSC7、FOXM1、CD55、ZNF593、KIF2C、TTK、MELK、CENPA、TPX2、CEP55、PML、CENPN和CARHSP1，并且所述一個或多個低表達基因選自BCL2和MAPT；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自DVL3、PAI-1和EIF4EBP1，并且所述一個或多個低表達蛋白選自HER3、MAPK9、ESR1和RAD50。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是黑素瘤，例如皮膚的皮膚黑色素瘤，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自EIF3K、ADORA2B、GSK3B、EXOSC7、FOXM1、EXO1、KIF2C、CENPA、TPX2、CAMSAP1、MCM10和ABHD5，并且所述一個或多個低表達基因選自BCAP31、BTN2A2、SMPDL3B、MTMR7、ME1和BTG2；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自PAI-1、EIF4EBP1、EGFR、HER3和Ku80，并且所述一個或多個低表達蛋白選自ASNS、MAPK9和ESR1。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是子宮內(nèi)膜癌，例如子宮體子宮內(nèi)膜樣癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、EIF3K、KCNG1、BCAP31、GSK3B、EXOSC7、FOXM1、ZNF593、EXO1、KIF2C、MAP2K5、TTK、MELK、GRHPR和PML，并且所述一個或多個低表達基因是MYB；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自DVL3、INPP4B、EIF4EBP1和ASNS，并且所述一個或多個低表達蛋白選自MAPK9、ESR1和YWHAE。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是卵巢腺癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、EIF3K、TXN、ADORA2B、KCNG1、GSK3B、STAU1、MAP2K5和HCFC1R1，并且所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2和ZNRD1-AS1；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自PAI-1和VEGFR2，并且所述一個或多個低表達蛋白選自ASNS、MAPK9、ESR1、YWHAE和PGR。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是頭頸癌，例如頭頸鱗狀細胞癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、TXN、ADORA2B、KCNG1、CD55、ZNF593、NDUFC1和HCFC1R1，并且所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2和MTMR7；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自PAI-1、INPP4B、EGFR、HER3、SMAD1、GATA3、ITGA2和COL6A1，并且所述一個或多個低表達蛋白選自VEGFR2和ASNS。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是結(jié)腸直腸癌，例如結(jié)腸直腸腺癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自EIF3K、TXN、CD55、NDUFC1、HCFC1R1和PML，并且所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、SMPDL3B和MET；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自DVL3、PAI-1、INPP4B、EIF4EBP1、EGFR和HER3，并且所述一個或多個低表達蛋白選自ASNS、MAPK9、YWHAE、RAD50和PEA15。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是膠質(zhì)瘤，例如低等級膠質(zhì)瘤，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自TXN、BCAP31、STAU1、PML、CARHSP1和BTN2A2；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、Ku80、SMAD1和NFKB1，并且所述一個或多個低表達蛋白選自ESR1、YWHAE和PGR。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是膀胱癌，例如尿路上皮癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自ADORA2B、KCNG1、STAU1、MAP2K5和CAMSAP1，并且所述一個或多個低表達基因選自GNB2L1、EIF3K、TXN、BCAP31、EXOSC7、CD55、NDUFC1、GRHPR、CETN3、BTN2A2、SMPDL3B和ERC2；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自DVL3、VEGFR2、Ku80、SMAD1和AKT1，并且所述一個或多個低表達蛋白是ASNS。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是肺癌，例如肺鱗狀細胞癌，其中：

(i)所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、ZNF593和SMPDL3B，并且所述一個或多個低表達基因選自GSK3B、MAP2K5、NDUFC1、CAMSAP1、ABHD5和ME1；和/或

(ii)所述一個或多個過表達蛋白選自DVL3、PAI-1、VEGFR2、INPP4B、EGFR和GATA3，并且所述一個或多個低表達蛋白是ASNS。

在上述方法的特定實施方式中，所述癌癥是腎上腺皮質(zhì)癌，其中：

所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、EIF3K、TXN、ADORA2B、KCNG1、BCAP31、FOXM1、ZNF593、EXO1、KIF2C、MAP2K5、TTK、MELK、CENPA、TPX2、GRHPR、CEP55、MCM10和CENPN，并且所述一個或多個低表達基因選自MTMR7、BCL2、MAPT、MYB和STC2。

在上述方法的特定實施方式中，所述癌癥是腎臟腎乳頭狀細胞癌，其中：

所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、ADORA2B、KCNG1、GSK3B、FOXM1、CD55、EXO1、KIF2C、STAU1、TTK、MELK、CENPA、TPX2、CA9、CEP55和MCM10，并且所述一個或多個低表達基因選自SMPDL3B和BCL2。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是胰腺導(dǎo)管腺癌，其中：

所述一個或多個過表達基因選自EIF3K、ADORA2B、GSK3B、EXOSC7、FOXM1、CD55、EXO1、STAU1、CAMSAP1和CETN3，并且所述一個或多個低表達基因選自BTN2A2、SMPDL3B、MTMR7、ME1、BCL2和ERC2。

在上述方法的特定實施方式中，所述癌癥是肝臟肝細胞癌，其中：

所述一個或多個過表達基因選自GNB2L1、TXN、EXOSC7和CA9，并且所述一個或多個低表達基因是MTMR7。

在上述方法的特定實施方式中，癌癥是宮頸鱗狀細胞癌和/或?qū)m頸內(nèi)腺癌，其中：

所述一個或多個過表達基因選自STAU1、CA9和ME1，并且所述一個或多個低表達基因選自EIF3K、TXN、BCAP31、EXOSC7和ZNRD1-AS1。

此外，在某些實施方式中，具有與一個或多個低表達基因(例如30基因印記中的那些)相比一個或多個過表達基因(例如29基因印記中的那些)的高相對表達水平的患者，具有與一個或多個低表達蛋白相比一種或多種過表達蛋白的高相對表達水平的患者，和/或具有本文所述的高綜合評分的患者，可以更可能有利地響應(yīng)免疫療法。

因此，一個方面提供預(yù)測哺乳動物中癌癥對免疫治療藥劑的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自ADORA2B、CD36、CETN3、KCNG1、LAMA3、MAP2K5、NAE1、PGK1、STAU1、CFDP1、SF3B3和TXN的一個或多個過表達基因的表達水平，和選自APOBEC3A、BCL2、BTN2A2、CAMSAP1、CAMK4、CARHSP1、FBXW4、GSK3B、HCFC1R1、MYB、PSEN2和ZNF593的一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述免疫治療藥劑相對提高或降低的響應(yīng)。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自ADORA2B、CETN3、KCNG1、MAP2K5、STAU1和TXN，和/或一個或多個低表達基因的表達水平選自BTN2A2、CAMSAP1、CARHSP1、GSK3B、HCFC1R1和ZNF593。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自ADORA2B、CD36、KCNG1、LAMA3、MAP2K5、NAE1、PGK1、STAU1、CFDP1和SF3B3，和/或一個或多個低表達基因的表達水平選自APOBEC3A、BCL2、BTN2A2、CAMK4、FBXW4、PSEN2和MYB。

對于本方面的特定實施方案將理解，來自碳水化合物/脂代謝元基因、細胞信號傳導(dǎo)元基因、細胞發(fā)育元基因、細胞生長元基因、染色體分離元基因、DNA復(fù)制/重組元基因、免疫系統(tǒng)元基因、代謝疾病元基因、核酸代謝元基因、翻譯后修飾元基因、蛋白質(zhì)合成/修飾元基因和多重網(wǎng)絡(luò)元基因中的一個或多個的一個或多個其他過表達基因和/或一個或多個其他低表達基因，例如表21中列出的那些，可被包括在比較一個或多個過表達基因的表達水平和一個或多個低表達基因的表達水平的步驟中。

在它們涉及癌癥的情況下，免疫療法或免疫治療藥劑使用或改變受試者的免疫機制，從而促進或便利癌癥的治療。在這方面，用于治療癌癥的免疫療法或免疫治療藥劑包括基于細胞的療法、抗體療法(例如抗PD1或抗PDL1抗體)和細胞因子療法。這些療法都利用了癌細胞通常在其表面上具有稱為癌抗原的細微不同分子的現(xiàn)象，所述癌抗原可以被癌癥受試者的免疫系統(tǒng)檢測到。因此，免疫療法被用于通過使用這些癌抗原作為靶而刺激癌癥患者的免疫系統(tǒng)攻擊癌癥細胞。

免疫療法或免疫治療藥劑的非限制性實例包括：阿達木單抗(adalimumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利珠單抗(belimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、BMS-936559、brentuximab、塞妥珠單抗(certolizumab)、西妥昔單抗(cituximab)、達利珠單抗(daclizumab)、依庫麗單抗(eculizumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、英夫利昔(infliximab)、易普利單抗(ipilimumab)、lambrolkizumab、美泊利單抗(mepolizumab)、MPDL3280A、莫羅單抗(muromonab)、那他珠單抗(natalizumab)、nivolumab、奧法木單抗(ofatumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、pexelizumab、pidilizumab、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(tocilizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、烏司他珠單抗(ustekinumab)、阿巴他塞(abatacept)、阿替曲塞(alefacept)和地尼白介素(denileukin diftitox)。在特別優(yōu)選的實施方式中，免疫治療藥劑是免疫檢查點抑制劑，例如抗PD1抗體(例如，pidilizumab、nivolumab、lambrolkizumab、派姆單抗)、抗PDL1抗體(例如，BMS-936559、MPDL3280A)和/或抗CTLA4抗體(例如，易普利單抗)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的，免疫檢查點是指免疫系統(tǒng)的多種抑制途徑，其對于在受試者中維持自身耐受性和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的持續(xù)時間和/或幅度是至關(guān)重要的。癌癥可使用特定的免疫檢查點途徑作為免疫抵抗的主要機制，特別是對抗對于腫瘤抗原具有特異性的T細胞。因此，免疫檢查點抑制劑包括阻斷或抑制免疫系統(tǒng)的抑制途徑的任何藥劑。此類抑制劑可包括小分子抑制劑或可包括結(jié)合并阻斷或抑制免疫檢查點受體的抗體或其抗原結(jié)合片段，或結(jié)合并阻斷或抑制免疫檢查點受體配體的抗體。舉例而言，可為阻斷或抑制而被靶向的免疫檢查點受體或受體配體包括但不限于：CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049。說明性免疫檢查點抑制劑包括：tremelimumab(CTLA-4阻斷抗體)、抗OX40、PD-L1單克隆抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻斷劑)、nivolumab(抗PD1抗體)、pidilizamab(CT-011；抗-PD1抗體)、BY55單克隆抗體、AMP224(抗PDL1抗體)、BMS-936559(抗PDL1抗體)、MPLDL3280A(抗PDL1抗體)、MSB0010718C(抗PDL1抗體)和Yervoy/易普利單抗(抗CTLA-4檢查點抑制劑)，但不限于此。

在一個實施方式中，預(yù)測癌癥對免疫治療藥劑的響應(yīng)的方法可進一步包括如下步驟：對哺乳動物施用治療有效量的免疫治療藥劑。

在相關(guān)方面，提供預(yù)測哺乳動物中癌癥對EGFR抑制劑的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自NAE1、GSK3B、TAF2、MAPRE1、BRD4、STAU1、TAF2、PDCD4、KCNG1、ZNRD1-AS1、EIF4B、HELLS、RPL22、ABAT、BTN2A2、CD1B、ITM2A、BCL2、CXCR4和ARNT2的一個或多個過表達基因的表達水平和選自CD1C、CD1E、CD1B、KDM5A、BATF、EVL、PRKCB、HCFC1R1、CARHSP1、CHAD、KIR2DL4、ABHD5、ABHD14A、ACAA1、SRPK3、CFB、ARNT2、NDUFC1、BCL2、EVL、ULBP2、BIN3、SF3B3、CETN3、SYNCRIP、TAF2、CENPN、ATP6V1C1、CD55和ADORA2B的一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對EGFR抑制劑相對提高或降低的響應(yīng)。

將認識到，EGFR抑制劑可以是本領(lǐng)域任何已知的，包括單克隆抗體及其小分子抑制劑，如上文所述的那些。在特定的實施方式中，EGFR抑制劑是或包含埃羅替尼和/或西妥昔單抗。

在某些實施方式中，癌癥是或包括肺癌、結(jié)腸直腸癌或乳腺癌。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自NAE1、GSK3B和TAF2，和/或一個或多個低表達基因選自CD1C、CD1E、CDIB、KDM5A、BATF、EVL、PRKCB、HCFC1R1、CARHSP1、CHAD、KIR2DL4、ABHD5、ABHD14A、ACAA1、SRPK3和CFB。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自MAPRE1、BRD4、STAU1、TAF2、GSK3B、PDCD4、KCNG1、ZNRD1-AS1、EIF4B和HELLS，和/或一個或多個低表達基因的表達水平選自ARNT2、NDUFC1、BCL2、ABHD14A、EVL、ULBP2和BIN3。

在一個實施方式中，所述一個或多個過表達基因選自RPL22、ABAT、BTN2A2、CD1B、ITM2A、BCL2、CXCR4和ARNT2，和/或一個或多個低表達基因的表達水平選自SF3B3、CETN3、SYNCR1P、TAF2、CENPN、ATP6V1C1、CD55和ADORA2B。

在相關(guān)方面，提供預(yù)測哺乳動物中癌癥對多激酶抑制劑的響應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟：比較所述哺乳動物的一個或多個癌癥細胞、組織或器官中選自SCUBE、CHPT1、CDC1、BTG2、ADORA2B和BCL2的一個或多個過表達基因的表達水平，和選自NOP2、CALR、MAPRE1、KCNG1、PGK1、SRPK3、RERE、ADM、LAMA3、KIR2DL4、ULBP2、LAMA4、CA9和BCAP31的一個或多個低表達基因的表達水平，其中所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比改變或調(diào)節(jié)的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)所述癌癥對所述多激酶抑制劑相對提高或降低的響應(yīng)。

多激酶抑制劑通常通過抑制多種細胞內(nèi)和/或細胞表面激酶起作用，其中一些可涉及癌癥的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移進展，因此減少腫瘤生長和復(fù)制。將認識到，多激酶抑制劑可以是本領(lǐng)域任何已知的，包括小分子抑制劑，如上文所述的那些。多激酶抑制劑的非限制性實例包括：索拉非尼(sorafenib)、曲美替尼(trametinib)、達拉菲尼(dabrafenib)、維莫菲尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、阿昔替尼(axitinib)、普納替尼(ponatinib)、魯索利替尼(ruxolitinib)、凡德他尼(vandetanib)、卡波替尼(cabozantinib)、阿法替尼(afatinib)、依魯替尼(ibrutinib)和瑞戈非尼(regorafenib)。在一個特定的實施方式中，多激酶抑制劑是或包含索拉非尼。

在一個實施方式中，所述癌癥是或包括肺癌。

適合地，關(guān)于預(yù)測癌癥對免疫治療藥劑、EGFR抑制劑或多激酶抑制劑的響應(yīng)，所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較高的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)癌癥對藥劑或抑制劑相對提高的響應(yīng)；和/或所述一個或多個過表達基因與所述一個或多個低表達基因相比較低的相對表達水平指示或關(guān)聯(lián)癌癥對藥劑或抑制劑相對降低的響應(yīng)。

在進一步的方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定用于癌癥治療的藥劑的方法，其包括如下步驟：

(i)使GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COG8、CFDP1和/或KCNG1的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與測試藥劑接觸；和

(ii)確定所述測試藥劑是否至少部分減少、消除、壓制或抑制所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達和/或活性。

適合地，癌癥具有上文所述的類型，但不限于此。優(yōu)選地，癌癥具有選自GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COGS、CFDP1和KCNG1及其任意組合的過表達基因，

適合地，藥劑具有或表現(xiàn)出很少的脫靶和/或非特異性作用，或者具有或表現(xiàn)出不顯著的脫靶和/或非特異性作用。

優(yōu)選地，所述藥劑是抗體或有機小分子。

在涉及抗體抑制劑的實施方式中，抗體可以是多克隆或單克隆的、天然的或重組的?？捎糜诳贵w生產(chǎn)、純化和使用的公知方案可見于例如Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons NY，1991-1994)的第2章和Harlow,E.&Lane,D.Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，其均通過引用并入本文。

通常，本發(fā)明的抗體與GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COG8、CFDP1和KCNG1中的一種或多種的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離蛋白、片段、變體或衍生物結(jié)合或綴合。例如，抗體可以是多克隆抗體。這樣的抗體可例如通過將蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離蛋白、片段、變體或衍生物注射到生產(chǎn)物種中制備，所述生產(chǎn)物種可以包括小鼠或兔，以獲得多克隆抗血清。生產(chǎn)多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？墒褂玫氖纠苑桨冈诶鏑oligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，同上，和Harlow&Lane，1988，同上中描述。

單克隆抗體可使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)，例如和Milstein，1975，Nature 256,495(通過引用并入本文)的文章中描述的，或者通過其最近的改進，例如Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，同上中描述的，通過使來源于生產(chǎn)物種的脾或其它抗體產(chǎn)生細胞永生化，所述生產(chǎn)物種已被接種一個或多個分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物和/或其片段、變體和/或衍生物。

通常，候選抑制劑抗體的抑制活性可通過體外和/或體內(nèi)試驗評估，所述試驗在抗體的存在下檢測或測量GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COG8、CFDP1和KCNG1中的一個或多個的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達水平和/或活性。

在涉及有機小分子抑制劑的實施方式中，這可涉及篩選擁有數(shù)十萬到數(shù)百萬的候選抑制劑(例如，包括合成的、有機小分子或天然產(chǎn)物的化學(xué)化合物)的大型化合物文庫，所述候選抑制劑可以就在數(shù)百處分子靶點中的任一處的生物活性進行篩選或測試，以找到潛在的新藥或先導(dǎo)化合物。篩選方法可包括但不限于基于計算機(“計算機模擬(in silico)”)的篩選和基于體外試驗的高通量篩選。

通常，來自該初布篩選過程的活性化合物或“命中物”然后通過一系列其它體外和/或體內(nèi)測試依次測試，以進一步表征活性化合物。在每個階段選擇逐漸更少數(shù)量的“成功”化合物以進行后續(xù)測試，最終導(dǎo)致選擇一個或多個藥物候選物開始在人類臨床試驗中測試。

在臨床階段，篩選測試藥劑可以包括在受試者暴露于測試化合物之前和之后從測試受試者獲得樣品。然后可測量和分析過表達基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在樣品中的水平，以確定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平和/或活性在暴露于測試藥劑后是否改變。舉例而言，樣品中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平可以通過質(zhì)譜、蛋白質(zhì)印跡、ELISA和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它合適的方法測定。此外，蛋白質(zhì)產(chǎn)物的活性，例如它們的酶活性，可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法測定。這可包括，例如酶測定法，如分光光度法、熒光測定法、量熱法、化學(xué)發(fā)光法、光散射法、微尺度熱泳法、放射性測定法和色譜測定法。

將認識到，可以常規(guī)檢查已經(jīng)用測試藥劑治療的受試者可能由治療產(chǎn)生的任何生理效應(yīng)。具體地，將評價測試藥劑降低受試者中的癌癥可能性或復(fù)發(fā)的能力?；蛘?，如果將測試藥劑施用于先前已診斷患有癌癥的受試者，則將篩選它們減緩或停止癌癥進展以及誘導(dǎo)疾病緩解的能力。

在特定實施方式中，本發(fā)明可提供“伴隨診斷”，由此檢測為具有升高的表達的一個或多個基因是被抗癌治療靶向的相同基因。

在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了通過上述方法鑒定的用于癌癥治療的藥劑。

適合地，癌癥具有上文所述的類型，但不限于此。優(yōu)選地，癌癥具有選自GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COG8、CFDP1、KCNG1及其任意組合的過表達基因。

在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動物中的癌癥的方法，其包括如下步驟：對哺乳動物施用治療有效量的上述藥劑。

在這方面，然后可以將鑒定為能夠減少、消除、壓制或抑制GRHPR，NDUFCl，CAMSAP1，CETN3，EIF3K，STAU1，EXOSC7，COG8，CFDP1和/或KCNG1的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達水平和/或活性的測試藥劑施用于患有進展中癌癥或處于進展中癌癥風(fēng)險的患者。例如，抑制或降低一個或多個前述基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的活性和/或表達的測試藥劑的施用可治療癌癥和/或降低癌癥風(fēng)險，如果生物標(biāo)記物的增加的活性至少部分地是癌癥進展和/或發(fā)作的原因。

適合地，癌癥具有上文所述的類型，但不限于此。優(yōu)選地，具有選自GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7、COG8、CFDP1、KCNG1或其組合的過表達基因。

本文提及的所有計算機程序、算法、專利和科學(xué)文獻都通過引用并入本文。

對于本發(fā)明，本文提供的基因或蛋白(例如表4、5、10、15、16、17和18中所示的那些)的數(shù)據(jù)庫登錄號或獨特標(biāo)識符，以及基因和/或蛋白序列或與其相關(guān)的序列，通過引用并入本文。

參考以下非限制性實施例，使得可以完全理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方式并付諸實踐。

實施例

實施例1

材料和方法

TNBC中全局基因表達的薈萃分析

在Oncomine^TM數(shù)據(jù)庫¹⁹(Compendia Bioscience,MI)中，使用乳腺癌初級過濾器(130個數(shù)據(jù)集)、樣本過濾器以使用臨床標(biāo)本和數(shù)據(jù)集過濾器來使用有超過151名患者的mRNA數(shù)據(jù)集(22個數(shù)據(jù)集)，我們進行了全局基因表達薈萃分析。包括所有年齡、性別、疾病階段或治療的患者。應(yīng)用三個另外的過濾器以進行三個獨立的差別分析：(1)三陰性(TNBC病例與非TNBC病例，8個數(shù)據(jù)集^49-56)；(2)5年時的轉(zhuǎn)移事件分析(轉(zhuǎn)移事件與無轉(zhuǎn)移事件，7個數(shù)據(jù)集^53,54,57-61)和(3)5年時的生存(死亡的患者與生存的患者，7個數(shù)據(jù)集^{49,54,56,58,61-63})?；跀?shù)據(jù)集中過表達模式或低表達模式中中位數(shù)基因排名的中位數(shù)p值選擇失調(diào)基因(圖8)。這三個失調(diào)基因列表的聯(lián)合形成了侵襲性乳腺癌中的失調(diào)基因的基因列表(圖9)。使用METABRIC數(shù)據(jù)集²¹作為進一步分析的驗證集。從Oncomine^TM提取METABRIC數(shù)據(jù)集的標(biāo)準(zhǔn)化z分數(shù)表達數(shù)據(jù)并將其導(dǎo)入具有內(nèi)置RBioconductor包的BRB-ArrayTools⁶⁴(V4.2，Biometric Research Branch，NCI，Maryland，USA)。使用Prism v6.0(GraphPad Software，CA，USA)建立METABRIC數(shù)據(jù)集的生存曲線，并且使用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗對生存曲線進行統(tǒng)計比較。

Ingenuity途徑分析和八基因列表的導(dǎo)出

使用Ingenuity(IngenuityCA)進行途徑分析。對于中的途徑分析，我們僅使用直接關(guān)系。在途徑分析后，我們著手于鑒定概括侵襲性206基因列表的最小基因列表。我們?nèi)缦率褂肕ETABRIC數(shù)據(jù)集在BRB-ArrayTools軟件中進行統(tǒng)計過濾，以得到最小基因列表：(1)使用Pearson's相關(guān)系數(shù)(單變量p值閾值為0.001)，通過數(shù)量性狀分析確定CIN元基因和ER元基因中各個基因與該元基因自身的相關(guān)性；(2)使用單變量Cox比例風(fēng)險模型(單變量檢驗p值<0.001)，確定各個基因與總體生存的關(guān)聯(lián)；和(3)針對各個基因計算高侵襲性評分腫瘤和低侵襲性評分腫瘤之間基因表達的倍數(shù)變化。我們選擇具有與元基因的Pearson相關(guān)系數(shù)>0.7、生存相關(guān)最強且高侵襲性評分腫瘤和低侵襲性評分腫瘤之間失調(diào)超過2倍的基因。使用METABRIC數(shù)據(jù)集和四個可公開獲得的數(shù)據(jù)集驗證8基因評分。如先前所述⁶⁷分析了四個數(shù)據(jù)集(GSE25066⁵³、GSE3494⁶⁵、GSE2990¹⁵、GSE2034⁶⁶)。

細胞培養(yǎng)和藥物處理

從ATCC^TM(VA，USA)獲得乳腺癌細胞系并且按照ATCC^TM說明書進行培養(yǎng)。所有細胞系都定期測試支原體并使用STR分析進行鑒定。對于siRNA篩選，使用RNAiMAX(Life Technologies，CA，USA)，10nM各自的siRNA，用siRNA溶液(Shanghai Gene Pharma，中國)轉(zhuǎn)染細胞(MDA-MB-231、SUM159PT和Hs578T)。對于藥物處理，多西他賽和TTK抑制劑AZ3146購自Selleck Chemicals LLC(TX，USA)并在DMSO中稀釋。在siRNA敲減或藥物處理后6天，按照制造商說明書(Promega Corporation，WI，USA)使用CellTiterAssay測定細胞與對照相比的生存。對于免疫印跡，使用標(biāo)準(zhǔn)方案，并用針對TTK的抗體(抗MPS1小鼠單克隆抗體[Nl]ab11108(Abcam，Cambridge)和γ-微球蛋白探測膜，然后用加強版化學(xué)發(fā)光試劑(Milipore，MA，USA)顯影。使用BD FACSCanto II^TM流式細胞儀(BDBiosciences，CA，USA)，按照制造商說明書使用Annexin V-Alexa₄₈₈和7-AAD(Life Technologies)進行流式細胞術(shù)以定量凋亡。

乳腺癌組織微陣列，免疫組織化學(xué)和生存分析

Brisbane Breast Bank從表示同意的患者收集了新鮮乳腺腫瘤樣本；該研究由當(dāng)?shù)氐膫惱砦瘑T會批準(zhǔn)。從來自1987年至1994年在Royal Brisbane and Women's Hospital進行切除術(shù)的患者的福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的乳腺腫瘤樣品的雙份核心構(gòu)建組織微陣列(TMA)。對于生物標(biāo)志物分析，用針對ER、PR、Ki67、HER2、CK5/6、CK14、EGFR和TTK的抗體(表8)對全腫瘤切片或TMA(取決于標(biāo)記物)進行染色，并由經(jīng)培訓(xùn)的病理學(xué)家評分。按照制造商說明書，使用Universal ABC試劑盒(Vector laboratories，CA)檢測信號。將染色的切片以高分辨率掃描(ScanScope Aperio，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)，然后將圖像分割成單獨的核心，以使用Spectrum軟件(Aperio)進行分析。從Queensland Cancer Registry和原始診斷病理學(xué)報告收集生存和其他臨床數(shù)據(jù)，此外，我們還對每個病例用H&E染色的代表性腫瘤切片進行內(nèi)部組織病理學(xué)審查(SRL)。對于HER2擴增分析，使用HER2CISH分析TMA。本研究中分配預(yù)后亞組的標(biāo)準(zhǔn)概述于圖14中。

其他統(tǒng)計分析

使用Prism v6.0準(zhǔn)備統(tǒng)計分析。所用檢驗的類型在圖例中說明。使用Windows版MedCalc，12.7版(MedCalc Software，Ostend，Belgium)進行單變量和多變量Cox比例風(fēng)險回歸分析。

結(jié)果

TNBC中基因表達譜的薈萃分析

使用Oncomine^TM數(shù)據(jù)庫¹⁹(4.5版)，我們對已發(fā)布的基因表達數(shù)據(jù)(與平臺無關(guān))進行了薈萃分析。我們比較了8個數(shù)據(jù)集中492個TNBC病例的表達譜與1382個非TNBC病例的表達譜，并在TNBC病例中發(fā)現(xiàn)了1600個過表達基因和1580個低表達基因(來自Student’s t檢驗的8個數(shù)據(jù)集中的截止中位p值<1x10^-5，圖8)。我們還比較了在5年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的512名患者的表達譜與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的732名患者的原發(fā)性乳腺癌表達譜(總共7個數(shù)據(jù)集)，以鑒定轉(zhuǎn)移病例中的500個過表達基因和480個低表達基因(來自Student’s t檢驗的7個數(shù)據(jù)集中的截止中位p值<0.05，圖8)。最后，我們比較了7個數(shù)據(jù)集中5年內(nèi)死亡的232名患者與生存的879名患者的原發(fā)性乳腺腫瘤表達譜，在差的生存者中發(fā)現(xiàn)了500個過表達基因和500個低表達基因(來自Student’s t檢驗的7個數(shù)據(jù)集中的截止中位p值<0.05，圖8)。這些分析的聯(lián)合——在TNBC和在5年內(nèi)轉(zhuǎn)移或?qū)е滤劳龅哪[瘤中的失調(diào)基因——產(chǎn)生了305個過表達基因和341個低表達基因的基因列表(圖9A和B)。來自我們的分析的失調(diào)基因沒有考慮與正常乳腺組織相比的失調(diào)。為了鑒定癌癥相關(guān)基因，我們使用METABRIC(乳腺癌國際聯(lián)盟的分子分類)數(shù)據(jù)集²¹作為驗證數(shù)據(jù)集。在薈萃分析中鑒定的305個過表達基因和341個低表達基因中，117個過表達基因和89個低表達的基因(206個基因)在TNBC(250個病例)中相對于144個相鄰正常組織失調(diào)(1.5倍數(shù)變化截止值；圖9C和D)。

侵襲性基因列表的臨床病理特征

我們將來自上述分析的206個基因(我們稱為“侵襲性基因列表”，表4)與最近描述的元基因吸引子^16,17進行比較，發(fā)現(xiàn)45個過表達基因在CIN元基因中，而19個低表達基因在ER元基因中(圖10)。侵襲性基因列表的表達在METABRIC數(shù)據(jù)集中可視化，通過GENUIS分類²²根據(jù)組織學(xué)亞型分層。如圖1A所示，與相鄰正常乳腺組織相比，ER^-/HER2^-(TNBC)顯示最高的CIN基因上調(diào)(熱圖中的紅色)和ER信號傳導(dǎo)基因下調(diào)(熱圖中的綠色)。其他亞型的腫瘤顯示出這些基因的一系列失調(diào)。為了量化這些趨勢，我們將“侵襲性評分”計算為CIN元基因(CIN基因表達的平均值)與ER元基因(ER基因表達的平均值)的比率。ER^-/HER2^-(TNBC)的侵襲性評分最高，然后是HER2⁺，然后是ER⁺腫瘤(圖1中的框圖)。我們還分析了由PAM50分類⁸預(yù)先定義的五種內(nèi)在乳腺癌亞型的侵襲性評分，和在通過基因表達和拷貝數(shù)數(shù)據(jù)亞型²¹的組合聚類定義的十種綜合聚類(intClust)亞型的侵襲性評分(圖11)。侵襲性評分在對于TNBC富集并具有差的預(yù)后的基底樣和intClust 10亞型中最高。

有趣的是，多種亞型的腫瘤得分高于侵襲性評分中位數(shù)(圖1和圖11中框圖的直線)。為此，我們檢查了METABRIC數(shù)據(jù)集中患者的總體生存，該數(shù)據(jù)集由四分位數(shù)分層，并且還由侵襲性評分中位數(shù)二分。侵襲性評分高的腫瘤比侵略性評分低的那些具有更差的生存。侵襲性評分高的非TNBC腫瘤患者的生存具有類似于TNBC患者的差的生存(圖1B)。在ER⁺腫瘤中，我們發(fā)現(xiàn)高侵襲性評分預(yù)測了2級(圖1B)腫瘤和3級(圖11)腫瘤二者中差的生存率。侵襲性評分高的腫瘤顯示出差的生存，不管是什么PAM50內(nèi)在乳腺癌亞型(圖11)。PAM50分類法僅在低侵襲性評分腫瘤中是預(yù)測性的(圖12)。

與患者生存相關(guān)的侵襲性基因列表中的直接相互作用的一個網(wǎng)絡(luò)

使用Ingenuity途徑分析我們對侵襲性基因列表進行網(wǎng)絡(luò)分析，并發(fā)現(xiàn)了具有在206個失調(diào)基因中的97個之間的直接相互作用的網(wǎng)絡(luò)(圖2A)。為了找到代表侵襲性基因和這個網(wǎng)絡(luò)的最少基因，分析了該網(wǎng)絡(luò)中的97個基因與METABRIC數(shù)據(jù)集中的CIN元基因或ER元基因以及總體生存的相關(guān)性(表5)。我們根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇基因：(1)與元基因的最高相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)>0.7)；(2)與總體生存的關(guān)聯(lián)(Cox比例風(fēng)險模型，p<0.001)，和(3)在高和低侵襲性評分腫瘤之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差最小的超過2倍的表達失調(diào)。這些分析鑒定了來自ER元基因的兩個基因(MAPT和MYB)和來自CIN元基因的六個基因(MELK、MCM10、CENPA、EXO1、TTK和KIF2C)。這8個基因在直接連接的網(wǎng)絡(luò)中保持(圖2B)。通過微陣列(PAM)分析的預(yù)測(數(shù)據(jù)未顯示)，從這八個基因的腫瘤分類(高于中位數(shù)與低于中位數(shù))，再次代表CIN元基因與ER元基因的比率，以95％靈敏度和97％特異性預(yù)測了從206個基因的分類。重要的是，來自這8個基因的高評分在所有患者、非TNBC患者和ER⁺2級患者中鑒定出差的生存(圖2C)。

接下來，我們探索了8基因評分在METABRIC數(shù)據(jù)集中的多種分子和組織學(xué)環(huán)境中的預(yù)后。按照8-基因評分將具有野生型TP53的腫瘤患者的生存分層(圖3A)。具有突變的TP53的患者(其大部分有高評分)顯示出比具有野生型TP53的患者更差的生存，表明TP53突變是獨立的預(yù)后因素。按照8-基因評分將具有低或高增殖標(biāo)志物Ki67表達的腫瘤患者分層，表明8-基因評分與增殖無關(guān)(圖3A)。我們還發(fā)現(xiàn)8-基因評分將來自所有疾病階段的患者的生存進行分層(I期-III期，圖3A)。我們集中于ER⁺，并且發(fā)現(xiàn)，如在ER⁺2級腫瘤的情況下(圖2C)；8-基因評分將ER⁺3級腫瘤患者的生存分層(圖3B)。重要的是，8-基因評分鑒定了分別具有與ER^-LN^-和ER^-LN⁺患者類似的差的生存的ER⁺LN^-和ER⁺LN⁺患者(圖3B)。高8-基因評分鑒定了所有PAM50亞型腫瘤患者的差的生存，并且通過PAM50分類作出的預(yù)后僅在低8-基因評分腫瘤中明顯(圖12)。

多變量生存分析中的8-基因侵襲性評分

為了排除使用206個基因或8個基因計算的侵襲性評分是多余的可能性；與常規(guī)臨床變量和現(xiàn)有基因印記進行比較，我們在METABRIC數(shù)據(jù)集(使用Illumina平臺)中進行多變量Cox比例風(fēng)險模型分析。如表1所述，侵襲性評分與常規(guī)變量相比與患者生存顯著相關(guān)，并且優(yōu)于MammaPrint⁹、OncotypeDx^10,11、增殖/細胞周期^16,20和CIN²⁰印記。而且，我們的侵襲性評分優(yōu)于最近從CIN印記開發(fā)的CIN4分類法²³。

使用在線工具Kaplan-Meier(KM)-繪圖器²⁴(表6和表7)，其具有超過2000名患者的基因表達和生存數(shù)據(jù)(但不是METABRIC數(shù)據(jù)集的一部分)，我們驗證了單變量生存關(guān)聯(lián)中的六個CIN基因和兩個ER基因。我們發(fā)現(xiàn)六個過表達基因(MELK、MCM10、CENPA、EXO1、TTK和KIF2C)的總體表達與所有患者、ER⁺患者，淋巴結(jié)陰性(LN^-)或陽性(LN⁺)患者中的無復(fù)發(fā)生存(RFS)和無遠端轉(zhuǎn)移生存(DMFS)顯著相關(guān)(表6)。在這些患者組中，兩個低表達基因(MAPT和MYB)也與RFS和DMFS顯著相關(guān)(表7)。

更重要的是，我們在四個數(shù)據(jù)集(來自Gene Expression Omnibus[GEO]的Affymetrix平臺；GSE2990、GSE3494、GSE2034和GSE25066)中進行了8-基因評分的多變量生存分析。再次地，在所測試的每個數(shù)據(jù)集中，該評分與多變量Cox比例風(fēng)險模型中的生存顯著相關(guān)(圖4)?？偟膩碚f，我們發(fā)現(xiàn)，在使用不同平臺的多個數(shù)據(jù)集中，8-基因評分與其他臨床病理學(xué)指標(biāo)無關(guān)地鑒定了具有差的生存的患者，并優(yōu)于現(xiàn)有印記。

侵襲性基因列表中的治療靶點

CIN元基因中的過表達基因參與或調(diào)節(jié)有絲分裂、紡錘體裝配和檢查點、著絲粒附著、染色體分離和有絲分裂退出。因此，不出意外的是，一些過表達基因是分子抑制劑如CDK1^25,26和AURKA/AURKB²⁷的靶點，并且已經(jīng)在臨床前和臨床上進行試驗²⁸。為此，我們在三個TNBC細胞系(MDA-MB-231、SUM159PT和Hs578T)中對CIN元基因的25個基因進行了siRNA耗竭。我們發(fā)現(xiàn)四個基因(TTK、TPX2、NDC80和PBK)的敲減一致地影響了這些細胞的生存(圖5A和表5)。TTK的敲減顯示了最差的生存，并且因為它在8-基因評分中，我們選擇TTK進行進一步研究。我們發(fā)現(xiàn)與接近正常的MCF10A細胞系和luminal/HER2細胞系相比，TTK蛋白在TNBC細胞系中更高(圖5B)。接下來，我們使用針對一組乳腺癌細胞系的特異性TTK抑制劑(TTKi)，AZ3146，發(fā)現(xiàn)TNBC細胞系對TTKi更敏感(圖5C)。

侵襲性腫瘤中的TTK表達和聯(lián)合治療的潛力

為了進一步研究TTK作為治療靶點的潛力，我們研究了乳腺癌患者中mRNA水平和蛋白水平的TTK表達。在2000名患者的METABRIC數(shù)據(jù)集中，我們分析了中位數(shù)二分的TTK mRNA表達與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性(表2)。高TTK mRNA表達與更低年齡的腫瘤診斷、更大的腫瘤大小、更高的腫瘤等級、更高的Ki67表達、TP53突變、ER/PR陰性腫瘤表型、HER2陽性和TNBC相關(guān)。基于PAM50亞型化，高TTK mRNA與luminal B、HER2富集和基底樣腫瘤相關(guān)。

我們還通過IHC分析了乳腺癌患者(406名患者)群組中的TTK表達。在細胞周期的所有階段都檢測到TTK及其活性，然而，其在有絲分裂期間上調(diào)²⁹。因此，為了排除有絲分裂期間升高的TTK水平的偏倚，我們觀察了非有絲分裂細胞中的TTK染色以定義高TTK水平(評分為3)。與TTK mRNA相似，高TTK蛋白水平(表3)與高腫瘤等級、高Ki67表達和TNBC狀態(tài)(特別是基底TNBC)相關(guān)。此外，和TTK mRNA與PAM50內(nèi)在亞型的關(guān)聯(lián)相一致，在HER2陽性和增殖性ER⁺/HER2^-腫瘤(與luminal B最相關(guān))中觀察到高TTK蛋白，但在非增殖性ER⁺/HER2^-腫瘤(與luminal A最相關(guān))中觀察到低TTK蛋白。除了這些與侵襲性表型的關(guān)聯(lián)之外，我們還發(fā)現(xiàn)高TTK蛋白與侵襲性組織學(xué)特征(包括導(dǎo)管組織學(xué)、不斷推進的腫瘤邊界、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、核多形性、淋巴細胞浸潤和更高的有絲分裂分數(shù))顯著相關(guān)(表3)?？偟膩碚f，與來自206個或8個基因的高侵襲性評分類似，TTK mRNA和蛋白的高水平跨越乳腺癌亞型標(biāo)記侵襲性行為。

我們檢查了TTK蛋白水平與患者生存的關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)在5年(圖6A和B)和10年和20年(圖13)時，具有高TTK染色(類別3)的乳腺腫瘤具有比其他染色組更差的生存。重要的是，高TTK染色(類別3)不限于特定的組織學(xué)亞組或具有高有絲分裂指數(shù)的腫瘤(圖6C)。接下來，我們聚焦于侵襲性亞組(3級、淋巴結(jié)陽性、TNBC、HER2或高Ki67)的預(yù)后，并發(fā)現(xiàn)高TTK蛋白水平鑒定了異常侵襲性腫瘤，其導(dǎo)致少于2年的差的生存(圖7A)。最后，為了利用我們的以下發(fā)現(xiàn)：TTK作為侵襲性評分的一部分與侵襲性乳腺腫瘤相關(guān)并且TTK抑制在過表達這種蛋白的TNBC細胞系中有效(圖5)，我們研究了將TTK抑制與化療結(jié)合的治療潛力。我們發(fā)現(xiàn)，在過表達TTK的TNBC細胞系的治療中，與不過表達TTK的細胞系相比，TTKi與非常低水平(亞致死劑量)的多西他賽協(xié)同(圖7B)，并且該組合誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡(圖7C)。

肺腺癌中的CIN元基因和ER元基因

還有理由相信，元基因印記可以適用于其他癌癥，如肺癌。圖15提供了按照十(10)個CIN基因(包括上述六(6)個基因以及CENPN、CEP55、FOXM1和TPX2)劃分，以及按照兩(2)個ER基因MAPT和MYB作為印記劃分的肺癌患者的總生存曲線；患者根據(jù)印記中位數(shù)分為低或高。當(dāng)在肺癌患者的多變量Cox回歸分析中針對AJCC T(大小)和N(淋巴結(jié))階段(腫瘤大小(T階段)和淋巴結(jié)狀態(tài)(N階段))作出調(diào)整時，該印記優(yōu)于腫瘤等級和疾病階段并且保持顯著(表9)。特別是，該印記在肺腺癌中是預(yù)測性的。即使當(dāng)包括6個CIN基因和2個ER基因的最小基因組時，肺腺癌的預(yù)后也是顯著的。

在圖16A中，我們顯示了TCGA數(shù)據(jù)集中乳腺癌患者的全局基因表達(通過RNA seq)。從這些數(shù)據(jù)中，研究8-基因評分(侵襲性評分)和Oncotype Dx(復(fù)發(fā)評分)與生存的關(guān)聯(lián)。8-基因評分比Oncotype Dx更好地將乳腺癌生存分層(圖16B)。進一步地，8-基因評分(侵襲性評分)鑒定了具有高基因組拷貝數(shù)變異的腫瘤，所述高基因組拷貝數(shù)變異參與整個染色體臂的缺失和復(fù)制，反映出非整倍體(圖16C)。

我們還發(fā)現(xiàn)8-基因評分(侵襲性評分)比Oncotype Dx更好地在TCGA數(shù)據(jù)中將總體上所有癌癥的生存分層(圖17)，并且8-基因評分(侵襲性評分)在每種測試的癌癥中都是預(yù)測性的(圖18)。類似地，如在乳腺癌中(圖16C)，8-基因評分(侵襲性評分)鑒定了具有高基因組拷貝數(shù)變異的所有癌癥類型的腫瘤，所述高基因組拷貝數(shù)變異涉及整個染色體臂的缺失和重復(fù)(反映出非整倍性)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些癌癥類型包括乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、成膠質(zhì)細胞瘤、低等級膠質(zhì)瘤、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺腺癌、急性髓性白血病、胰腺癌和肺鱗狀細胞癌。

討論

Oncomine^TM數(shù)據(jù)庫中基因表達的這種薈萃分析鑒定了206個基因的列表以兩種核心生物學(xué)功能/元基因富集：染色體不穩(wěn)定性(CIN)和ER信號傳導(dǎo)。我們計算了侵襲性評分——CIN元基因與ER元基因的比率，其與乳腺癌的總體生存相關(guān)。8個基因(6個CIN基因和2個ER信號傳導(dǎo)基因)的核心是代表性的，并概括了與206個基因的結(jié)果的相關(guān)性。來自6個CIN基因與2個ER信號傳導(dǎo)基因的評分，即8-基因評分，與嚴(yán)重乳腺癌數(shù)據(jù)集中的生存相關(guān)。在多變量生存分析中，我們的侵襲性評分優(yōu)于常規(guī)變量和已公布的印記。特別是在ER⁺腫瘤中，一些病例的生存與侵襲性HER2⁺和TNBC亞型一樣差。我們的數(shù)據(jù)表明癌癥相關(guān)的生物學(xué)功能(即CIN和ER信號傳導(dǎo))的相互作用是比單個基因或單一功能更好的表型預(yù)測子。這個見解與最近的研究一致，所述研究顯示生物學(xué)驅(qū)動的預(yù)測子的相互作用提供了更好的預(yù)后^16,17,30。最近，所有ER^-腫瘤都被描述為具有高水平的CIN元基因，然而，ER⁺腫瘤是否可以被描述為低CIN腫瘤是不清楚的¹⁶。在我們的研究中，我們明確了ER⁺疾病包含相當(dāng)大部分的具有高CIN基因水平的腫瘤，并且CIN基因與ER基因之間的相關(guān)性是這些患者的生存的有力預(yù)測子。

染色體分離的保真度通過在嚴(yán)格控制的過程中微管從染色體的有絲分裂紡錘體到著絲粒的適當(dāng)附著而確保，并且CIN是指整個染色體的錯誤分離，因此產(chǎn)生非整倍性³¹。使用非整倍性作為CIN的替代標(biāo)記物，Carter等開發(fā)了一種基因印記，并發(fā)現(xiàn)該“CIN印記”預(yù)測多種癌癥中的臨床結(jié)果²⁰。最近，一個最小基因組(其捕獲CIN印記，CIN4(AURKA、FOXM1、TOP2A和TPX2))被描述為來自FFPE組織的腫瘤非整倍性的第一臨床可用qPCR衍生測量。由于2級腫瘤在臨床結(jié)果方面具有異質(zhì)特征，CIN4分級的意義在于將2級腫瘤分層為良好預(yù)后組和不良預(yù)后組²³。我們的侵襲性評分在所有腫瘤等級和疾病階段(I-III期，以及淋巴結(jié)陰性和淋巴結(jié)陽性)中都是預(yù)測性的，并且在METABRIC數(shù)據(jù)集多變量生存分析中優(yōu)于CIN印記和CIN4分類。引人注目的是，但與此前的研究^32,33一致，使用CIN元基因和我們來自基因表達水平的侵襲性評分的預(yù)后被限制在ER⁺疾病，而非TNBC或HER2亞型。根據(jù)我們的結(jié)果和此前已公布的¹⁶，這可以被解釋為ER^-腫瘤具有高CIN元基因水平。然而，我們TTK蛋白水平的結(jié)果清楚地證實，TNBC腫瘤、HER2腫瘤、高等級腫瘤、淋巴結(jié)陽性腫瘤和增殖性腫瘤包含具有高TTK水平的亞組(不包括有絲分裂細胞)，并且有著比具有低TTK表達或有絲分裂細胞中的TTK表達的那些更差的生存。我們提出存在兩種類型的高CIN基因表達，其通過mRNA表達研究可能不被清楚地區(qū)分。一種形式的升高的CIN基因涉及高水平的有絲分裂和增殖，而我們通過IHC測量的不包括有絲分裂細胞的第二種形式是由另一侵襲性表型驅(qū)動；非整倍性的保護和基因組不穩(wěn)定性。最近對CIN4分類器的研究為我們的主張?zhí)峁┝酥С?。在本研究中，使用流式細胞術(shù)通過DNA含量測量非整倍性，作者發(fā)現(xiàn)具有高CIN4評分的大部分腫瘤具有正常的DNA倍數(shù)，并且大部分非整倍體案例具有低CIN4評分²³。

染色體錯誤分離和非整倍性增強了基因重組和缺陷性DNA損傷修復(fù)³⁴以驅(qū)動瘤發(fā)生所需的“突變體表型”³⁵。由失調(diào)有絲分裂紡錘體裝配檢查點(SAC)和非整倍性引起的基因組不穩(wěn)定性已被稱為“非致癌基因成癮(non-oncogene addiction)”^36,37。有吸引力的是表明由于癌癥干細胞、非整倍性和治療抗性之間的聯(lián)系，CIN和非整倍性被TNBC中含量高的乳腺癌干細胞利用³⁸。這得到了研究的支持，其指出了在腫瘤起始、進展和癌癥干細胞中涉及SAC和染色體分離的多種基因，例如：卵巢癌中的AURKA⁴¹、成膠質(zhì)細胞瘤中的MELK/FOXM1^42,43、乳腺癌中的MELK⁴⁴和MAD2⁴⁵和多種癌癥中的SKP2⁴⁶。CIN基因保護非整倍性的作用可以為如下矛盾提供深入了解：TNBC由于更高的增殖水平而對化療顯示更好的響應(yīng)，但這些腫瘤卻具有更差的結(jié)果。我們提出TNBC中的抗性可以歸因于非整倍體細胞適應(yīng)和驅(qū)動復(fù)發(fā)的能力。至少在體內(nèi)，化療已顯示誘導(dǎo)增殖靜止的非整倍體細胞為治療抗性的機制³⁹。我們設(shè)想TNBC中CIN元基因特別是參與染色體分離的基因的高水平保護了這種狀態(tài)。事實上，一項研究發(fā)現(xiàn)高TTK水平保護了乳腺癌細胞中的非整倍性，其沉默則降低了乳腺癌細胞系在體內(nèi)的致瘤性⁴⁷。我們來自患者群組的結(jié)果證明了高TTK蛋白表達(除有絲分裂)確實是侵襲性腫瘤預(yù)測性的，并且支持了非整倍性的保護和基因組不穩(wěn)定是推動差的結(jié)果的侵襲性表型的觀點。

我們與TTK分子抑制劑結(jié)果(與使用siRNA耗竭的已發(fā)布研究一致^47,48)支持了在具有高CIN表型的腫瘤中靶向染色體分離作為治療策略的想法。我們還建議，盡管如先前描述TTK在TNBC中是高的^47,48，顯示侵襲性特征的相當(dāng)大比例的非TNBC腫瘤也顯示CIN基因的升高水平，并且將從這樣的靶向療法中獲益。據(jù)我們所知，亞致死劑量的紫杉烷與TTK抑制劑的組合迄今尚未在乳腺癌中(但已在其它癌癥中)進行研究^33,50-53。我們的研究結(jié)果表明TTK抑制確實使具有高TTK的乳腺癌細胞對多西他賽敏感。

特別參照圖16-18，以及8-基因評分(侵襲性評分)，其對于治療后癌癥患者的生存是預(yù)測性的，侵襲性評分還鑒定了具有涉及整個染色體臂的高拷貝數(shù)變異的腫瘤，反映出非整倍體狀態(tài)。因此，侵襲性評分還可以充當(dāng)通過靶向表4中所列的基因(包括用于產(chǎn)生侵襲性評分的8個基因(例如TTK^67-70))，或通過靶向非整倍體狀態(tài)的其他藥物(例如PLK1^71,72或其他^73-76)而靶向非整倍性的藥物的伴隨診斷。

總之，我們的研究強調(diào)了基于生物學(xué)表型的乳腺癌分類有助于理解致癌表型和治療潛力的驅(qū)動因素。重要的是，我們的研究證明CIN基因(在這里以TTK為例)的IHC評估為CIN對腫瘤侵襲性和預(yù)后的貢獻提供了更好的表征和理解。

貫穿本說明書，目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，而不將本發(fā)明限制于任何一種實施方式或特定的特征集合?？梢詫υ诒疚闹忻枋龊驼f明的實施方式作出各種改變和改動，而不背離本發(fā)明的主要精神和范圍。

本文提及的所有計算機程序、算法、專利和科學(xué)文獻都通過引用整體全文并入本文。

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表1：METABRIC數(shù)據(jù)集中侵襲性評分的單變量生存分析和多變量生存分析

HR：風(fēng)險比。CI：置信區(qū)間。ns：不顯著。OncoTypeDx評分為低(L，＜18)，中(I，18-31)，高(H＞31)。全部變量都包含在多變量Cox比例風(fēng)險模型分析中，并且通過逐步模型，只有顯著的協(xié)變量包括在上表中顯示的最終分析中。

表2：METABRIC數(shù)據(jù)集中TTK mRNA水平與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

X2：使用Prism進行的卡方檢驗。ns：不顯著。

表3：TTK蛋白表達與臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)

根據(jù)以下分類由兩個獨立評估者對TMA打分：0，陰性；1，弱的病灶染色(對該分析合并陰性病例)；2，中到強的病灶染色(總體上＜50％腫瘤細胞)；3＝中到強的彌漫性染色(＞50％腫瘤細胞)。關(guān)于染色細胞％，我們忽略有絲分裂細胞以評估非有絲分裂依賴性TTK表達。#卡方檢驗(Prism，ns：不顯著)

表4：侵襲性基因列表(206個基因)

表5：來自Ingenuity途徑分析的失調(diào)基因以及與侵襲性評分的相關(guān)性

表6：8基因評分中的6個過表達基因與5和10年時的RFS和DMFS的關(guān)聯(lián)

p值來自KM-plotter的對數(shù)秩檢驗

表7：8-基因評分中2個過表達基因與5和10年時的RFS和DMFS的關(guān)聯(lián)

p值來自KM-plotter的對數(shù)秩檢驗

表8：用于本研究中乳腺癌TMA分析的抗體和免疫組織化學(xué)條件的細節(jié)

＊在壓力鍋中125℃下0.01M檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中抗原修復(fù)5分鐘，或在壓力鍋中105℃下0.001M Tris/EDTA中(pH 8.8)抗原修復(fù)15分鐘。

表9：多變量分析

實施例2

材料和方法

TNBC中全局基因表達的薈萃分析

在Oncomine^TM數(shù)據(jù)庫[37](Compendia Bioscience,Ann Arbor,MI)中，使用乳腺癌初級過濾器(130個數(shù)據(jù)集)、樣本過濾器以使用臨床標(biāo)本和數(shù)據(jù)集過濾器以使用具有超過151名患者的mRNA數(shù)據(jù)集(22個數(shù)據(jù)集)，我們進行了全局基因表達的薈萃分析。使用兩個另外的過濾器以進行兩個獨立的差別分析。第一個差別分析是5年時轉(zhuǎn)移事件分析(轉(zhuǎn)移事件與無轉(zhuǎn)移事件，7個數(shù)據(jù)集[51，56-61])，第二個差別分析是5年時生存(死亡的患者與生存的患者，7個數(shù)據(jù)集[39，57，59，61-64])。針對兩個差別分析中的每一個，基于數(shù)據(jù)集中過表達模式或低表達模式的中位數(shù)基因排名的中位p值選擇失調(diào)基因。

導(dǎo)出28-印記(TN印記)

在線工具KM-Plotter[38]，其核對來自Affymterix平臺的超過4000個乳腺癌患者的基因表達數(shù)據(jù)，被用于開發(fā)28-基因印記。從Oncomine^TM薈萃分析中發(fā)現(xiàn)的在5年內(nèi)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移或死亡事件的原發(fā)性腫瘤中失調(diào)的基因，166個基因在兩個生存事件中是共有的。然后在KM-Plotter中逐個研究這些基因，將單變量生存分析限制于ER^-亞型或BLBC亞型。簡單地選擇在ER^-或BLBC亞型中與無復(fù)發(fā)生存(RFS)、無遠端轉(zhuǎn)移生存(DMFS)或總體生存(OS)顯著相關(guān)的基因。然后對在這種過濾中顯著的96個基因根據(jù)它們的顯著性水平以及在不同的生存結(jié)果(RFS、DMFS和OS)和在ER^-和BLBC亞型中的顯著性普遍(prevalence of significance)而進行分選?；谠摲诌x，獲得具有不同水平的生存關(guān)聯(lián)的6組基因列表(表14)。然后將這些組中的每一組用作元基因，并在KM-Plotter中研究ER^-和BLBC亞型中每組中基因的平均表達與生存的關(guān)聯(lián)?；谶@些分析，選擇四個組，并排除兩個。此外，對于兩個組，發(fā)現(xiàn)前4個基因和前3個基因比該組的剩余基因具有更高預(yù)測性，并且選擇這些基因?？傊x擇這兩個組中的7個基因(它們的下調(diào)與差的生存相關(guān))和其他兩個組中的21個基因(它們的上調(diào)與差的生存相關(guān))，以在KM-Plotter中測試與生存的關(guān)聯(lián)。與原始列表中的任何單個基因或來自該列表的任何組相比，這28個基因作為基因印記顯示出與生存的最高關(guān)聯(lián)。這28個基因被選擇作為三陰性(TN)印記，并進行如下所述的驗證。

在乳腺癌群組中驗證TN印記

使用三個大型乳腺癌基因表達數(shù)據(jù)集進行驗證。從Gene Expression Omnibus(GEO)獲得Research Online Cancer Knowledgebase(ROCK)數(shù)據(jù)集[40](GSE47561：n＝1570名患者)和同源TNBC數(shù)據(jù)集[32](GSE31519：n＝579名TNBC患者)，且將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到具有內(nèi)置R Bioconductor包的BRB-ArrayTools[65](V4.2，Biometrics Research Branch，NCI，Maryland，USA)。從UCSC Genome Browser[66,67]獲得Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)集[39]；使用Illumina HiSeq RNA-Seq陣列(n＝1106名患者)或?qū)傆?106名患者中的597名患者使用Agilent定制陣列(Agilent G4502A-07-3)。在這些數(shù)據(jù)集的每一個中研究TN印記，其中設(shè)計評分來量化印記：TN評分＝21個基因的平均表達(其過表達與差的生存相關(guān))÷7個基因的平均表達(其低表達與差的生存相關(guān))。計算每個數(shù)據(jù)集中每個腫瘤的TN評分，并且在每個數(shù)據(jù)集中通過TN評分中位數(shù)二分法將腫瘤分配為高或低TN評分腫瘤。在一些情況下，使用各個數(shù)據(jù)集中TN評分的三分位數(shù)將腫瘤分為高、中或低TN評分腫瘤，而在其他情況下，使用TN評分的四分位數(shù)將腫瘤分為第一、第二、第三或第四四分位數(shù)的腫瘤。比較高(超過中位數(shù)、最后的三分位數(shù)、或第四四分位數(shù))與低TN評分組的患者生存。使用Prism v6.0(GraphPad Software，CA，USA)構(gòu)建生存分析，并且使用對數(shù)秩(Mantel-Cox)檢驗進行生存曲線的統(tǒng)計學(xué)比較。

TN評分和印記與新輔助化療后的病理學(xué)完全響應(yīng)(pCK)以及對內(nèi)分泌療法的響應(yīng)的關(guān)聯(lián)

從GEO獲得在單獨的新輔助化療或內(nèi)分泌療法之前進行基因表達譜分析的數(shù)據(jù)集。本研究中新輔助化療和記錄病理學(xué)完全響應(yīng)(pCR)使用的數(shù)據(jù)集包括：GSE18728[42]，GSE50948[43]，GSE20271[44]，GSE20194[45]，GSB22226[41，46]，GSE42822[47]和GSE23988[48]。對于在內(nèi)分泌療法(他莫昔芬)之前進行基因表達譜分析并記錄患者生存的數(shù)據(jù)集包括：GSE6532[25]和GSE17705[51]。這些使用Affymetrix基因表達陣列平臺的數(shù)據(jù)集被導(dǎo)入到BRB-ArrayTools中并如前所述被標(biāo)準(zhǔn)化[68]。數(shù)據(jù)集中的每個腫瘤都按照如前文部分描述的我們的印記分配為高評分或低評分。使用Prism在高評分腫瘤和低評分腫瘤之間比較化療后的pCR比率或內(nèi)分泌療法后患者的生存。

通過分類比較進行的全局基因表達譜比較

進行全局基因表達比較以比較具有高TN或iBCR評分的腫瘤與具有低TN或iBCR評分的腫瘤，以表征這些腫瘤之間的額外差異，并鑒定可以適合于藥物靶向的失調(diào)基因。這些比較在ROCK數(shù)據(jù)集中1570名患者的大型群組中進行，且使用BRB-ArrayTools進行分類比較檢驗(Class Comparasion test)。兩個類別是高評分腫瘤與低評分腫瘤，并且在ArrayTools中的這個插件中選擇的參數(shù)如下：使用的單變量檢驗的類型＝雙樣本T檢驗；類別變量＝TN評分(高或低)或者iBCR評分(高或低)；倍數(shù)變化截止值＝1.5倍；基于10000個隨機排列和每個單變量檢驗的名義顯著性水平計算顯著基因的排列p-值：0.05。這些分析的結(jié)果示于表13和15-17中。

在結(jié)合乳腺癌復(fù)發(fā)(iBCR)評分中Agro和TN印記的結(jié)合

我們前面已發(fā)布了同樣來自薈萃分析和廣泛驗證的侵襲性(Agro)印記和評分，并顯示這種印記在ER+乳腺癌中是預(yù)測性的[36]，為了測試Agro印記是否可以與TN印記(在ER^-乳腺癌是預(yù)測性的)結(jié)合以產(chǎn)生與ER狀態(tài)無關(guān)的結(jié)合測試，研究了多種結(jié)合方法。結(jié)合方法背后的假設(shè)是確定可以描述ER^-和ER⁺乳腺癌亞型二者中TN評分與Agro評分之間的關(guān)系的直接關(guān)系，其也與綜合評分直接相關(guān)。換句話說，綜合評分將保留分別來自Agro評分和TN評分各自的與它們在ER⁺和ER^-乳腺癌中的預(yù)后價值相關(guān)的信息。使用ROCK數(shù)據(jù)集測試不同結(jié)合方法以及這些方法在ER⁺和ER^-乳腺癌生存的分層方面的性能。評分的加或減產(chǎn)生了TN評分和Agro評分與所產(chǎn)生的綜合評分之間的直接關(guān)系(圖36)。然后分析這兩種方法對ROCK數(shù)據(jù)集中ER⁺和ER^-亞型的預(yù)后，并且只有加法方法保留了在ER^-乳腺癌中的預(yù)后(圖37)。類似地，測試了TN評分和Agro評分的乘法和除法，并且指數(shù)和冪曲線關(guān)系描述了兩個評分之間以及與綜合評分的相關(guān)性(圖38)。再次地，這兩種方法在ROCK數(shù)據(jù)集中測試預(yù)后，并且只有乘法方法保留了ER^-乳腺癌中的預(yù)后(圖37)。因為乘法和除法方法對評分之間的關(guān)系產(chǎn)生了指數(shù)和冪曲線，通過使一個評分自乘為另一個評分次冪的結(jié)合顯得是合理的。指數(shù)和冪曲線是冪方程的結(jié)果。實際上，通過使TN評分自乘為Agro評分次冪的結(jié)合在ER⁺和ER^-乳腺癌二者中都是高度預(yù)測性的(圖37和38)。這種綜合評分，即結(jié)合乳腺癌復(fù)發(fā)(iBCR)評分，事實上在ROCK數(shù)據(jù)集的ER⁺和ER^-患者中，分別比單一Agro評分和單一TN評分具有更高預(yù)測性。在ROCK和同源TNBC數(shù)據(jù)集(Affymetrix平臺)、TOGA數(shù)據(jù)集(Illumina RNA-Seq平臺)和ISPY-1試驗數(shù)據(jù)集(GSE22226[41，46]，安捷倫平臺)中驗證了iBCR評分，說明了iBCR評分的平臺獨立性，這是由Agro印記和TN印記的平臺獨立性所推動的，因為它們從薈萃分析發(fā)現(xiàn)而與獨立研究所使用的陣列平臺無關(guān)。

挖掘藥物篩選研究

研究了用大組抗癌藥物處理大組癌細胞系的兩個大型研究，以確定具有高Agro評分、高TN評分或高iBCR評分的細胞系與具有低Argo評分、低TN評分或低iBCR評分的細胞系相比是否對特定抗癌藥物顯示不同的敏感性。簡言之，如前所述，從GEO獲得來自Genentech(mRNA Cancer Cell Line Profiles GSE10843)、Pfizer(Pfizer Molecular Profile Data for Cell Line GSE34211)和Broad Institute/Novartis(Cancer Cell Encyclopedia[COLE]GSE3613)的基因表達譜分析的數(shù)據(jù)集并導(dǎo)入到ArrayTools。對所有細胞系計算Agro評分、TN評分和iBCR評分，并基于各個數(shù)據(jù)集中的中位數(shù)二分法，將細胞系按各個評分分配為高或低。對于在多于一個數(shù)據(jù)集中譜分析的細胞系，使用平均評分。使用這些數(shù)據(jù)，比較了具有高和低Agro、TN或iBCR評分的癌細胞系與在兩項研究中調(diào)查的具有低評分的癌細胞系對抗癌藥物的敏感性[49，50]。本文描述了與低評分細胞系相比在高評分細胞系中具有顯著不同的IC50的藥物。使用Prism的未配對雙尾t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。

其他統(tǒng)計分析

使用Windows版MedCalc，12.7版(MedCalc Software，Qstend，Belgium)進行單變量和多變量Cox比例風(fēng)險回歸分析。

結(jié)果

在Oneomine^TM中的基因表達譜薈萃分析

我們使用Oncomine^TM數(shù)據(jù)庫[37](4.5版)對已發(fā)布的基因表達數(shù)據(jù)(與平臺或乳腺癌亞型無關(guān))進行薈萃分析。我們能夠比較5年時發(fā)生轉(zhuǎn)移的512名患者與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的732名患者的原發(fā)性乳腺癌的表達譜(總共7個數(shù)據(jù)集)，以鑒定轉(zhuǎn)移病例中的500個過表達基因和500個低表達基因(數(shù)據(jù)集中截止中位p值<0.05，Student’s t檢驗，圖31)。我們還比較了5年內(nèi)死亡的232名患者與生存的879名患者的原發(fā)性乳腺腫瘤的表達譜(7個數(shù)據(jù)集)，在差的生存者中發(fā)現(xiàn)了500個過表達基因和500個低表達基因(數(shù)據(jù)集中截止中位p值<0.05，Student’s t檢驗，圖31)。由于多個數(shù)據(jù)集注釋了這些結(jié)果中的一個而非二者，我們意識到這些分析的聯(lián)合更合適，特別是死亡是轉(zhuǎn)移疾病中最可能的結(jié)果。與5年內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤和死亡相關(guān)的腫瘤中的過表達基因和低表達基因的聯(lián)合揭示了共有的101個過表達基因和65個低表達基因(圖19)。然后使用在線工具KM-plotter[38]使這166個失調(diào)基因經(jīng)歷訓(xùn)練以得到下述方法中描述的28基因印記(TN印記)，接著在乳腺癌基因表達數(shù)據(jù)集的多個大型群組中對該印記即TN印記進行驗證(圖19)。

TN印記在TNBC、BLBC和ER^-乳腺癌亞型中是預(yù)測性的

使用KM-Plotter對從Oncomine^TM薈萃分析中發(fā)現(xiàn)的與差的結(jié)果相關(guān)的原發(fā)性乳腺腫瘤中的166個失調(diào)基因進行研究。31個基因的過表達和65個基因的低表達與BLBC或ER^-乳腺癌的RFS、DMFS或OS相關(guān)(表14)?；趩巫兞可娣治鲋械娘@著性水平和這種顯著性在不同疾病結(jié)果(RES、DMFS和OS)中的普遍性，列出了21個過表達基因和7個低表達基因的列表(表1)，作為與BLBC和ER^-乳腺癌亞型二者中的生存有著最強關(guān)聯(lián)的印記(圖20)。

然后在兩個乳腺癌群組(同源TNBC數(shù)據(jù)集[32]和Research Online Cancer Knowledgebase(ROCK)數(shù)據(jù)集[40])的多變量生存分析中驗證該28-基因印記(TN印記)。我們設(shè)計了評分來量化TN印記的趨勢，即TN評分，其計算為21個過表達基因的平均表達與7個低表達基因的平均表達的比率。TN評分中位數(shù)二分法將TNBC(圖21A)、BLBC(圖21B)和ER-(圖21C)患者的生存分層，并優(yōu)于所有標(biāo)準(zhǔn)臨床病理學(xué)指標(biāo)。這些分析表明TN評分是獨立的預(yù)后因子，其鑒別生存差的TNBC、BLBC或ER^-患者，與腫瘤大小和等級、患者年齡、淋巴結(jié)狀態(tài)或治療無關(guān)。TN印記也優(yōu)于所有先前發(fā)表的在ER^-、TNBC或BLBC亞型中預(yù)測性的印記[30-35](圖32)。

雖然在Oncomine^TM中該印記的發(fā)現(xiàn)包括使用Affymterix、Alumina和Agilent平臺的數(shù)據(jù)集，但是上述訓(xùn)練和驗證僅限于Affymterix平臺。因此，我們在使用Illumina HiSeq RNA-seq平臺的Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)集[39]中驗證了TN評分。如圖22所示，通過TN評分將TCGA數(shù)據(jù)集中ER^-患者的RFS分層，并且該分層優(yōu)于通過標(biāo)準(zhǔn)臨床病理學(xué)指標(biāo)進行的分層。最初的TCGA出版物對597名患者使用Agilent定制陣列(Agilent G4502A-07-3)，我們分析了TN評分在該數(shù)據(jù)中的預(yù)后。TN評分將該Agilent TCGA數(shù)據(jù)中的ER^-患者的生存分層(圖33)?？偟膩碚f，TN印記/評分的預(yù)后價值在TNBC、BLBC和ER^-乳腺癌亞型的大型獨立乳腺癌群組中得到驗證，與所使用的基因表達陣列平臺無關(guān)。

TN評分和化療后pCR的可能性

化療是ER^-乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)療法，并且是ER^-HER2^-(TNBC)乳腺癌的唯一治療模式。雖然，病理學(xué)完全響應(yīng)(pCR)根據(jù)受體狀態(tài)而不同，但它仍然高度預(yù)測不同乳腺癌亞型中的生存[41]。鑒于TN評分與TNBC、BLBC和ER^-乳腺癌中結(jié)果的關(guān)聯(lián)，我們探究這個評分是否也與化療后的pCR相關(guān)。為此，我們分析了可公開獲得的新輔助化療試驗數(shù)據(jù)集，其記錄了pCR并進行了治療前基因表達譜分析。如圖23A所示，當(dāng)ER^-/HER2^-患者具有高TN評分時，這些患者化療后的pCR較少可能在TX(GSE18728)，AT/CMF(GSE50948)或FAC(GSE20271)化療方案之后。在一項研究(GSE20194)中，TFAC化療方案較少可能在高TN評分腫瘤中產(chǎn)生pCR，但在第二項研究(GSE20271)中沒有顯著的關(guān)聯(lián)。高TN評分的ER^-HER2^-腫瘤具有對AC/T化療(GSE22226AC/T)更低響應(yīng)的趨勢。相比之下，在分別用FEC/TX(GSE42822)和FAC/TX(GSE23988)方案治療后，在57％和60％的高TN評分ER^-HER2^-腫瘤中實現(xiàn)了pCR?？偟膩碚f，通過TN評分分層的pCR的比率在低或高TN評分腫瘤中與所報道在TNBC中一般為31％的pCR比率顯著不同[9](圖23A中的虛線)。在一個數(shù)據(jù)集(ISPY-1試驗(GSE22226))中，還記錄了無復(fù)發(fā)生存(RFS)。如圖23B所示，如先前已發(fā)布的，pCR是ER^-HER2^-乳腺癌的RFS的強預(yù)測子[41]。TN評分不僅是化療后RFS的強預(yù)測子，而且除了將未達到pCR的患者分層為良好和不良預(yù)后組以外，還可以將達到pCR的患者的生存分層為良好和不良預(yù)后組(圖23B)。該數(shù)據(jù)表明TN評分是獨立的，并且具有在ER^-HER2^-(TNBC)乳腺癌患者中新輔助化療后監(jiān)測pCR的額外價值。為了進一步說明TN評分的作用，我們分別對未系統(tǒng)性治療患者和系統(tǒng)性治療患者在KM-plotter中分析ER^-和BLBC患者的結(jié)果。如表11(圖34的生存曲線)中所總結(jié)的，TN印記在未系統(tǒng)性治療或系統(tǒng)性治療的ER-和BLBC亞型中是預(yù)測性的。

基于TN印記的治療靶點

TN印記中的過表達基因包含新的基因，僅有有限的文獻描述了它們的功能，特別是在癌癥中。這些基因包括：GRHPR、NDUFC1、CAMSAP1、CETN3、EIF3K、STAU1、EXOSC7和KCNG1。這些基因是研究其敲減對ER^-或TNBC乳腺癌細胞系生存的影響的未來研究的新的候選者。另外，我們采取兩種方法識別通過TN印記設(shè)想的可能治療策略，以使通過該印記鑒定的生存差的患者獲益。首先，我們比較了高TN評分的TNBC/BLBC腫瘤與低TN評分的TNBC/BLBC腫瘤的全局基因表達譜。其次，我們分析了已發(fā)表的臨床前研究，其用一組分子靶向藥物治療癌細胞系，以確定高TN評分的細胞系是否對特定藥物表現(xiàn)出敏感性。在第一種方法中，在ROCK數(shù)據(jù)集中進行高TN評分的BLBC或ER^-腫瘤的全局基因表達譜與低TN評分的BLBC或ER^-腫瘤的全局基因表達譜之間的類別比較。與低TN評分的BLBC腫瘤相比，高TN評分的BLBC腫瘤過表達171個探針和低表達251個探針(表15)。在類似的分析中，高TN評分的ER^-腫瘤過表達307個探針和低表達332個探針(表16)。在過表達的探針中，與低TN評分的相比較，87個探針(82個基因)在高TN評分的BLBC和ER^-乳腺癌中是共同過表達的。在這87個探針中，39個探針在BLBC和ER^-乳腺癌中是預(yù)測性的(在表15中以粗體標(biāo)記)。更重要的是，這87個探針包括編碼多種激酶、酶和離子通道的基因，其可以是用于治療結(jié)果差的高TN評分腫瘤的當(dāng)前或未來的藥物開發(fā)的靶點。

在第二種方法中，分析了已發(fā)布的研究，其考察了多組針對癌細胞系的分子藥物。Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)研究[50]調(diào)查了24種抗癌藥物在479種癌細胞系中的藥理學(xué)譜，所述癌細胞系還用基因表達陣列進行譜分析。我們計算了該研究中每個細胞系的TN評分，并根據(jù)TN評分比較了這些細胞系對抗癌藥物的敏感性。高TN評分的癌細胞系對ALK(TAE684)和BCR-ABL(尼洛替尼)的抑制較不敏感，但對HSP90(坦塞霉素[17-AAG])和EGFR(埃羅替尼或拉帕替尼)的抑制更敏感(圖35)。在類似的方法中，我們還分析了第二個大型研究(Garnett等[49])，其對超過600種癌細胞系測試了130種藥物。如圖24所示，高TN評分的細胞系對PARP(ABT-888)、維甲酸(ATRA)、Bcl2(ABT-263)、DHFR(甲氨蝶呤)、葡萄糖(二甲雙胍)和p38MAPK(BIRB0796)的抑制較不敏感。兩種IGF1R抑制劑顯示不同的結(jié)果；高TN評分的細胞系對OSI-906抑制劑更不敏感，但對BMS-536924抑制劑更敏感。如圖24所示，與來自CCLE研究的發(fā)現(xiàn)相一致，高TN評分的細胞系也對HSP90抑制(17-AAG和伊利司莫)敏感(圖35)。高TN評分的細胞系還對mTOR/PI3K(BEZ235)和MEK(RDEA-119)抑制更敏感。

TN評分和侵襲性評分的結(jié)合

我們最近發(fā)表了來自O(shè)ncomine^TM薈萃分析的侵襲性基因印記/評分(Agro評分)[36]，并驗證了該評分在ER⁺乳腺癌中在基因水平是預(yù)測性的。ER^-乳腺癌、BLBC和TNBC幾乎一致地表達高水平的Agro評分，因此該印記在這些亞型中不是預(yù)測性的。我們進一步表明這些基因中的一個，TTK/MPS1，在TNBC細胞系和一些ER^-陰性細胞系中上調(diào)，并且TTK是這些細胞系中的治療靶點。而且，我們表明通過免疫組織化學(xué)(IHC)的TTK蛋白水平在非常具侵襲性的乳腺癌亞組中是預(yù)測性的，所述乳腺癌包括高等級、增殖性腫瘤、淋巴結(jié)陽性、TNBC和HER2⁺亞型[36]。TN基因印記(在ER^-/BLBC/TNBC中是預(yù)測性的)和Agro基因印記(在ER⁺中是預(yù)測性的)的結(jié)合將生成整合的印記和評分，其在乳腺癌中是預(yù)測性的而與亞型無關(guān)。如方法部分中詳述的，在ROCK數(shù)據(jù)集中研究TN和Agro評分相加、相減、相乘或相除，以確定將保留評分各自提供的信息的直接關(guān)系。通過TN和Agro評分的相加或相減觀察到了線性關(guān)系(圖36)，但是只有通過相加的結(jié)合才在ER^-患者中是預(yù)測性的(圖37)。另一方面，TN評分和Agro評分的相乘和相除分別產(chǎn)生指數(shù)和冪曲線關(guān)系(圖38)。只有評分的乘積才在ER^-乳腺癌中是預(yù)測性的(圖37)。由于乘法和除法對TN評分和Agro評分之間的關(guān)系產(chǎn)生了指數(shù)和冪曲線，我們還測試了使一個評分自乘為第二個評分次冪。實際上，TN評分自乘為Agro評分次冪在ROCK數(shù)據(jù)集的ER-和ER+患者中是高度預(yù)測性的(圖37)。在ROCK數(shù)據(jù)集(圖25)和TCGA數(shù)據(jù)集(圖26)的所有患者、ER-和ER+患者中，這種整合TN評分和Agro評分的方法(結(jié)合乳腺癌復(fù)發(fā)(iBCR)評分)是預(yù)測性的。而且，在同類TNBC數(shù)據(jù)集[32]中，該iBCR評分與TN評分一樣是預(yù)測性的(圖39)，支持iBCR評分作為乳腺癌中的預(yù)后測試。

iBCR評分和化療后pCR的可能性

在ISPY-1試驗(GSE22226)中研究了iBCR評分與患者生存和化療后pCR可能性的關(guān)聯(lián)。通過iBCR評分比單獨的TN評分更好地將ER^-/HER2^-患者的RFS分層(圖27)。高iBCR評分的ER^-/HER2^-患者較少可能達到pCR(圖27)，這可以解釋這些患者較差的生存。在ER⁺乳腺癌中，iBCR評分與Agro評分相似地將患者的RFS分層。雖然在高iBCR評分的ER⁺腫瘤中觀察到更高可能性的pCR(圖27)，但該亞組具有差的RFS。這可以通過達到pCR的ER⁺患者的少的數(shù)量(10/62[16％]相對于ER^-HER2^-中的10/34[29％])來解釋。這些結(jié)果提供了iBCR評分作為結(jié)合Agro評分(ER⁺中預(yù)后)和TN評分(ER^-中預(yù)后)的單一測試的價值的進一步驗證和證據(jù)。圖25中來自ROCK數(shù)據(jù)集(Affymetrix平臺)的結(jié)果，圖26中來自TCGA數(shù)據(jù)集(Illumina平臺)的結(jié)果和圖27中來自ISPY-1試驗(Agilent平臺)的結(jié)果也為Agro評分和TN評分和所得iBCR評分跨三個主要基因表達陣列平臺的獨立研究的穩(wěn)健性提供了證據(jù)。

接下來，在ER-HER2-和ER⁺患者二者的其他新輔助化療數(shù)據(jù)集中研究iBCR評分與pCR的關(guān)聯(lián)。pCR較少可能在TX(GSE18728)化療方案后在高iBCR的ER^-/HER^-患者中，并且與用AT/CMF(GSE50948)治療時的低iBCR的ER-/HER2-患者沒有差別。在其他數(shù)據(jù)集中，pCR更可能在用FAC(GSE20271)、TFAC(GSE20271和GSE2Q19)、FEC/TX(GSE42822)和EAC/TX(GSE23988)新輔助化療方案治療后的高iBCR評分的ER-/HER2-患者中(圖28A)。

如表12中四個研究的總結(jié)所示，在總共183名ER^-HER2^-患者中，120名患者(65.6％)具有高iBCR評分，并且其中54名患者(29.5％)達到了pCR，而66名患者(36.1％)未達到pCR。未達到pCR(66/120，55％)和可以在pCR后對高iBCR評分患者觀察到復(fù)發(fā)(55/120，45％)的高iBCR評分患者的較大數(shù)量，可以解釋高iBCR評分的ER^-HER2^-患者的較差生存(圖25和圖26中10年時40-50％生存)?；谶@些研究以及化療是ER^-/HER2^-乳腺癌治療的主要支柱，低iBCR評分的患者可以省卻額外治療，特別是如果他們在化療后達到pCR。另一方面，高iBCR的ER-HER2-患者和特別是未達到pCR的高iBCR的ER-HER2-患者應(yīng)被提供額外治療，所述治療可基于Agro印記或TN印記中的上調(diào)基因或者基于這些腫瘤中的其他過表達基因(表15和表16)或者來自我們從藥物敏感性研究進行的臨床前分析(圖24和35)。

ER⁺中的高iBCR評分與AT/CMF(GSE50948)、TX(GSE18728)、TFAC(GSE20271和GSE20144)和FAC/TX(GSE23988)新輔助化療方案后pCR的較高可能性相關(guān)(圖38B)。雖然有這種較高的pCR可能性，但是高iBCR的ER⁺患者具有較差的生存(圖25和26)，這可以通過較少數(shù)量的ER⁺患者達到pCR來解釋(在上述5個研究的207名ER⁺患者中，具有低iBCR評分的5名[2.5％]和具有高iBCR評分的20名[9.7％]達到pCR)。因此，對于ER⁺乳腺癌，可通過iBCR評分報告關(guān)于在治療計劃中包括化療和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)分泌療法的決定。iBCR評分在ER⁺患者的治療計劃中的價值在下一部分中描述。

iBCR評分和ER⁺乳腺癌的治療

用內(nèi)分泌療法特別是他莫昔芬治療ER⁺乳腺癌患者。當(dāng)這些患者是淋巴結(jié)陽性(N1)時，還包含了輔助化療。對于淋巴結(jié)陰性(N0)的ER⁺患者，包括化療的決策是不太確定的，因為如果包括化療，預(yù)后良好的患者(小的和較低等級的腫瘤)將被過度治療；而如果不包括化療，預(yù)后較差的患者(大的和較高等級的腫瘤)將會治療不足。這種臨床決策是開發(fā)Oncotype復(fù)發(fā)評分、和最近的PAM50復(fù)發(fā)風(fēng)險評分的動機。我們此前已發(fā)布了在2000名患者的METABRIC數(shù)據(jù)集[36]中的多變量生存分析中，Agro評分優(yōu)于Oncotype Dx和MammaPrint測試。通過在所有ER⁺患者和在N0和N1亞組中直接比較Agro評分與Oncotype Dx(圖40)和MammaPrint(圖41)，這一發(fā)現(xiàn)進一步得到了支持。對于iBCR評分，如圖29A所示，該評分在未用他莫昔芬治療的ER⁺N0患者中是預(yù)測性的，表明高iBCR的ER⁺N0患者應(yīng)該用他莫昔芬治療。當(dāng)用他莫昔芬治療ER⁺N0或ER⁺N1患者時，iBCR評分仍可鑒定RFS差的患者(圖29B)和DMFS差的患者(圖29C)。因此，具有高iBCR評分的ER⁺N0或ER⁺N1患者可獲益于在他們的治療中包括輔助化療，因為這些患者可以經(jīng)歷更好的pCR(圖28B)。盡管如此，由于ER⁺中的pCR比率不高，應(yīng)當(dāng)為高iBCR評分的ER⁺患者(特別是N1)提供另外的靶向治療。用于這些患者的靶向治療的類型在下一部分中建議。

iBCR評分預(yù)測對于ER^-/HER2^-和ER⁺及乳腺癌亞型的治療

Agro印記和TN印記中的過表達基因含有可靶向的基因，其可用于針對在標(biāo)準(zhǔn)治療后生存差的高iBCR腫瘤的治療性干預(yù)。類似于上文對TN印記進行的分析，我們采用兩種方法來鑒別高iBCR評分乳腺腫瘤中另外的可能靶點。在第一種方法中，在ROCK數(shù)據(jù)集中在高iBCR評分的ER⁺或ER^-腫瘤的全局基因表達譜與低iBCR評分的ER⁺或ER^-腫瘤的全局基因表達譜之間進行分類比較。然后，通過與同樣在該數(shù)據(jù)集中進行譜分析的正常乳腺組織比較，過濾所產(chǎn)生的基因列表(1178個探針，數(shù)據(jù)未顯示。與低iBCR評分腫瘤和正常乳腺組織相比，高iBCR評分腫瘤過表達204個探針(181個基因)和低表達124個探針(116個基因)(表17)。在181個過表達基因中，高iBCR評分的ER⁺與正常乳腺和低iBCR的ER⁺相比，134個基因特異性上調(diào)，并且高iBCR評分的ER^-與正常乳腺和低iBCR的ER^-相比，95個基因特異性上調(diào)。如表13所示，高iBCR評分的ER^-腫瘤與低iBCR評分的ER^-腫瘤和正常乳腺組織相比，49個基因獨特地上調(diào)。類似的比較顯示，高iBCR評分的ER⁺腫瘤具有86個基因的獨特上調(diào)。與低iBCR評分的ER^-和ER⁺腫瘤以及正常乳腺組織相比，高iBCR評分的ER^-和ER⁺腫瘤共同表達46個基因。這些基因編碼多種激酶、酶和離子通道，其可以是用于治療結(jié)果差的高iBCR評分腫瘤的當(dāng)前或未來藥物開發(fā)的靶點。在下調(diào)的探針中，特別有趣的發(fā)現(xiàn)是micro-RNA(miRNA)hsa-mir-568(在高iBCR評分的ER^-中與正常乳腺和低iBCR評分的ER^-相比分別下調(diào)9.3和2.2倍；在高iBCR評分的ER⁺中與正常乳腺和低iBCR評分的ER⁺相比分別下調(diào)5.6和2.9倍)。這種下調(diào)的miRNA在高iBCR評分腫瘤中靶向這些腫瘤中的多種上調(diào)基因，特別是與正常乳腺組織相比上調(diào)的那些(表18)。這種miRNA可以是針對高iBCR評分乳腺癌的基于基因組的治療。

在第二種方法中，再次地與上文對TN評分的分析相類似，針對iBCR評分與癌細胞系對抗癌藥物的敏感性的關(guān)聯(lián)分析了已發(fā)布的藥物篩選研究。在CCLE研究中(圖42)，具有高iBCR評分的癌細胞系對ALK(TAE684)和BCR-ABL(尼洛替尼)的抑制更不敏感，與TN評分結(jié)果類似。此外，高iBCR細胞系對FGFR(TKI258)和IGF1R(AEW541)的抑制更不敏感。高iBCR評分的細胞系對HSP90(坦螺旋霉素(Tanespimycin)[17-AAG])的抑制更敏感(圖42)。在Garnett等的第二個大型研究[49]中，高iBCR評分的細胞系與低iBCR評分的細胞系相比對8種抗癌藥物更敏感(圖30)。這些包括HSP90(17AAG)、mTOR/PI3K(BEZ235)和IGFIR(BMS-536924)的抑制劑，正如同樣在TN評分結(jié)果中觀察到的。另外，高iBCR評分的細胞系對于PI3K(GDC0941)、mTQR(JW-7-25-1)、XIAP(信筒子醌(Embelin))和PLK1(B1-2536)的抑制更敏感，其也符合Agro評分的結(jié)果(圖30)。Agro評分也鑒別了對RSK(CMK)、MEK(PD0325901)和DNA損傷(博來霉素)的抑制的敏感性。類似于高TN評分的結(jié)果，高iBCR評分的細胞系同樣對PARP(ABT-888和AZD-2281)、維甲酸(ATRA)、Bcl2(ABT-263)、DHFR(甲氨蝶呤)和葡萄糖(二甲雙胍)的抑制更不敏感。此外，高iBCR評分的細胞系對SYK(BAY613606)、HDAC(伏立諾他(Vorinostat))和BCR-ABL(尼洛替尼)和p38MAPK(BIRB 0796)的抑制更不敏感。高Agro評分的細胞系對針對GSK3A/B(SB216763)的另外的藥物不太敏感。總的來說，TN評分(圖24和35)和Agro評分和組合的iBCR評分(圖30和42)與對多種抗癌藥物的敏感性相關(guān)，而且未來的實驗驗證會將這些評分建立為這些藥物的伴隨診斷，并且通過將這些藥物導(dǎo)向生存差的高評分的患者而使乳腺癌患者獲益。

根據(jù)iBCR評分，乳腺癌細胞系對靶向抑制劑的敏感性

乳腺癌細胞系(10個細胞系)：BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468、BT-20、Hs.578T、BT-474、MCF-7、T-47D和ZR-75-1，在不存在或存在遞增劑量的24種抗癌藥物的情況下培養(yǎng)。使用MTS/MTA試驗在處理后第6天確定與未處理細胞相比的細胞生存。使用劑量響應(yīng)曲線在Prism中分析細胞系對藥物的響應(yīng)，以計算IC50的log₁₀(IC50為殺死50％細胞所需的劑量)。敏感性表示為log₁₀[IC50]。根據(jù)iBCR評分重新分析我們此前已發(fā)布的這項藥物篩選(Al-Ejeh等，Oncotarget，2014)。分析Neve等(Cancer Cell，2006)的51個乳腺癌細胞系的基因表達數(shù)據(jù)集以計算各個細胞系的Agro評分和TN評分來計算iBCR評分。通過Neve等的數(shù)據(jù)集中所有細胞系的中位數(shù)二分法，將各個細胞系分配為低或高iBCR評分?；诘突蚋遡BCR評分分類，我們的篩選中使用的10個細胞系的敏感性在高iBCR評分的細胞系(5個細胞系)與低iBCR評分的細胞系(5個細胞系)之間進行比較。如圖47所示，高iBCR評分的細胞系對p38MAPK(LY2228820)、PLC(U73122)、JNK(SP600125)、PAK1(IPA3)、MEK(AS703026和AZD6244)、ERK5(XMD 8-92和BIXG2188)、HSP90(17-AAG、PF0429113和AUY922)、IGF1R(GSK1904529A)和EGFR(阿法替尼)的抑制明顯更為敏感。我們的篩選結(jié)果與我們從兩個此前已發(fā)布的大型細胞系研究中鑒定的高iBCR評分的癌細胞系對HSP90、IGF1R和MEK抑制劑的更高敏感性相一致。

討論

我們對Oncomine^TM數(shù)據(jù)庫中基因表達數(shù)據(jù)集的薈萃分析在此前已經(jīng)鑒定了一個印記，即侵襲性印記(Agro印記)，其在ER⁺乳腺癌中是預(yù)測性的。我們通過IHC驗證了該印記中的基因中的一個，即TTK/MPS1，并發(fā)現(xiàn)分裂間期細胞(不包括有絲分裂細胞)中的TTK陽性在高度侵襲性乳腺癌如高等級、高等級和淋巴結(jié)陽性和高度增殖性(Ki67陽性)病例中是預(yù)測性的[36]。在這項研究中，我們使用我們的薈萃分析方法確定第二個印記，即三陰性印記(TN印記)，其在ER^-、TNBC和BLBC亞型中是高度預(yù)測性的。TN印記在多變量生存分析中優(yōu)于所有標(biāo)準(zhǔn)臨床病理學(xué)指標(biāo)，并且還在ER^-乳腺癌中優(yōu)于已發(fā)布的印記。我們還能夠結(jié)合Agro印記(在ER⁺乳腺癌中是預(yù)測性的)以產(chǎn)生結(jié)合乳腺癌復(fù)發(fā)(iBCR)測試。這兩個印記和iBCR在與所使用的基因表達陣列無關(guān)的大型獨立乳腺癌群組研究中得以驗證，表明我們的印記的試驗者/技術(shù)獨立性。重要的是，Agro印記和TN印記二者以及iBCR測試與針對ER⁺的內(nèi)分泌療法和針對ER^-和ER⁺乳腺癌的新輔助化療之后的響應(yīng)和結(jié)果相關(guān)。此外，通過比較高iBCR評分腫瘤與低iBCR評分腫瘤的全局基因表達譜，我們能夠鑒定多個過表達靶點，其可用于這些并未真正從當(dāng)前治療標(biāo)準(zhǔn)獲益的預(yù)后差的患者的靶向治療。此外，針對癌細胞系的藥物篩選的大型臨床前研究的挖掘表明，印記和iBCR評分預(yù)測細胞系對特定藥物更高的敏感性。因此，印記和iBCR測試可以用作伴隨診斷，以將靶向療法導(dǎo)向會從這些治療中獲益以增加他們的低生存率的患者?？偟膩碚f，我們的研究不僅廣泛地說明了我們的印記在個體化醫(yī)學(xué)中的潛力，而且可以揭示未來的研究以理解腫瘤侵襲性的潛在機制，iBCR測試確定腫瘤侵襲性導(dǎo)致差的生存。

到目前為止，對于ER^-乳腺癌的預(yù)后和針對這些腫瘤(特別是當(dāng)缺乏HER2表達時)的有效治療的開發(fā)存在未滿足的醫(yī)學(xué)需要?；熑匀皇沁@些患者的唯一標(biāo)準(zhǔn)治療，并且新輔助環(huán)境中化療后的響應(yīng)率在ER^-HER2^-(TNBC)患者中報告為31％[9]。確定將真正獲益于化療的患者將有助于臨床醫(yī)務(wù)人員確定可能需要更長的或額外的治療方案(包括研究性臨床試驗招募)的患者。我們的印記和iBCR評分預(yù)測了在高評分患者中與低評分患者相比在化療后更高的pCR。低評分患者具有更好的生存并且可能不需要另外的治療。另一方面，盡管在高評分患者中pCR較高，但當(dāng)我們分析來自ISPY-1試驗的數(shù)據(jù)時，該患者亞組仍然具有差的生存，并且甚至在高評分患者中達到pCR后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。我們來自比較分析和挖掘臨床前藥物篩選的結(jié)果鑒別了多個靶點和對開發(fā)中藥物的敏感性。因此，對于我們的印記/iBCR測試具有高評分的ER^-患者和特別是TNBC患者可以獲益于包括由這些印記設(shè)想的治療，以增加他們的生存率。這種臨床開發(fā)將取決于未來我們的印記和iBCR測試在臨床試驗和臨床前研究中的預(yù)期驗證。

在ER⁺乳腺癌中，存在三種商業(yè)測試作出臨床決策以省去輔助化療或者包括輔助化療與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)分泌療法：Oncotype和這些已經(jīng)對用內(nèi)分泌療法治療的ER⁺淋巴結(jié)陰性(N0)乳腺癌患者進行了驗證，根據(jù)這些測試是否推薦高風(fēng)險患者接受輔助化療。在他莫昔芬治療后的ER⁺N0患者生存的直接比較中，我們的印記和iBCR測試勝過這些測試。而且，我們的測試還預(yù)測了ER⁺患者對化療的響應(yīng)，并且重要的是可以預(yù)測對靶向治療的敏感性。目前的商業(yè)測試沒有這種能力。重要的是，我們的印記和iBCR測試還在具有未滿足的需要的亞組(ER⁺淋巴結(jié)陽性(ER⁺N1)乳腺癌)中是預(yù)測性的，這些患者的生存通過我們的印記和iBCR測試分為差的和好的預(yù)后組，其同樣告知這些患者是否獲益于內(nèi)分泌療法。我們的印記和iBCR測試的臨床驗證以及藥物敏感性預(yù)測的驗證將有助于開發(fā)針對ER⁺患者的新治療方案，這些患者在當(dāng)前治療標(biāo)準(zhǔn)后處于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性擴散的高風(fēng)險中。

通過我們的印記鑒定的侵襲性ER^-腫瘤與其相對物和正常乳腺組織的比較鑒定了多種激酶、酶(特別是氧化還原)和鉀通道，其可以為開發(fā)針對ER^-乳腺癌的靶向治療提供新的方向。另一方面，對于通過我們的印記鑒定的侵襲性ER⁺腫瘤，盡管靶點不限于細胞周期和增殖，但是這些功能顯著地集中。這種高增殖譜可以解釋化療后這些腫瘤中較高的pCR，因為增殖性腫瘤會更高響應(yīng)于化療藥物。盡管如此，我們之前已經(jīng)闡明，Agro印記中的過表達基因，也因此是iBCR測試中的過表達基因，是參與著絲粒結(jié)合和染色體分離的基因，并且該印記甚至在增殖性腫瘤(高Ki67表達)中也是預(yù)測性的[36]。參與染色體分離的基因的失調(diào)將產(chǎn)生非整倍性和染色體不穩(wěn)定性(CIN)[52]。至少在體內(nèi)，已經(jīng)顯示化療誘導(dǎo)增殖靜止的非整倍體細胞作為治療抗性機制[53]。支持高Agro分涉及非整倍性的觀點，拷貝數(shù)變異(CNV)TCGA數(shù)據(jù)的分析顯示，與低Argo評分腫瘤相比，高Agro評分腫瘤具有高水平的CNV，特別是涉及整個染色體或染色體臂的那些(圖43)。因此，盡管增殖可能是高Agro/iBCR評分的ER⁺腫瘤的特征，但是這些腫瘤似乎是非整倍體。與此觀點一致，高Agro/iBCR評分的細胞系對PLK1和HSP90抑制(圖30)和極光激酶抑制劑(圖44)的敏感性支持了高Agro/iBCR評分預(yù)測對于抗非整倍體治療的敏感性。PLK1和極光激酶是非整倍性中的經(jīng)典靶點，并且已經(jīng)報告HSP90抑制選擇性地殺死非整倍體癌細胞[54]。還發(fā)現(xiàn)了高TN評分腫瘤對HSP90的敏感性，并且有趣的是，我們此前已經(jīng)通過乳腺癌的激酶組譜分析鑒定了HSP90是TNBC中的靶點。我們顯示了組合治療中HSP90抑制在體外和體內(nèi)是有效的[55]。我們提出抗非整倍體藥物(包括PLK1、極光激酶和HSP90抑制劑)應(yīng)該對高Agro/iBCR評分的ER⁺腫瘤有效，并且HSP90抑制應(yīng)當(dāng)在高TN/iBCR評分的ER^-腫瘤中有效。雖然通過我們的印記和iBCR測試設(shè)想的其他治療也應(yīng)該被研究，上述目標(biāo)代表用于初始驗證和開發(fā)的一線靶點。

總之，我們在Oneomine^TM中的薈萃分析以及廣泛的后續(xù)驗證和分析已經(jīng)開發(fā)了與ER狀態(tài)無關(guān)的、用于乳腺癌預(yù)后以及對標(biāo)準(zhǔn)治療的響應(yīng)的預(yù)測的新型印記和綜合基因組測試。該新型印記和它們的整合還具有在具有差的生存的乳腺癌患者中作為對多種類型的靶向治療的伴隨診斷測試的潛力。我們的印記和iBCR測試未來的驗證和臨床開發(fā)具有巨大的潛力和對乳腺癌的個體化和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的影響。最后，應(yīng)當(dāng)注意，iBCR測試在多種其他癌癥(圖45)的預(yù)后中具有價值，并且特別是在肺腺癌中(圖46)，因此我們的方法和新型印記可以為其它癌癥類型提供益處。

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表10：從Oncomine^TM的乳腺癌基因表達數(shù)據(jù)的薈萃分析發(fā)現(xiàn)的28-基因印記

表11：TN印記在ER-和BLBC中是預(yù)測性的，與系統(tǒng)性治療無關(guān)

如圖2中所述，28-基因印記在在線工具KM-plotter中使用，但是限制于對未系統(tǒng)治療或已系統(tǒng)治療的ER-或BLBC患者的分析。RFS、DMFS和OS的生存曲線在圖34中示出；僅有來自這些曲線的風(fēng)險比(HR)、95％置信區(qū)間(Cl 95％)和對數(shù)秩p值在表中報告。

表12：根據(jù)iBCR評分，ER-HER2-患者的pCR的可能性

比較了來自四個研究的按照低和高iBCR評分分層的ER-/HER2-患者在四種化療方案(FAC(GSE20271)、TFAC(GSE20271和GSE20194)、FEC/TX(GSE42822)和FAC/TX(GSE23988))后達到或未達到pCR。

表13：高iBCR評分腫瘤中與低iBCR腫瘤和正常乳腺組織相比的上調(diào)基因

表14：在BLBC和ER-乳腺癌中，來自KM-Plotter在線工具中Oncomine薈萃分析的基因的單變量生存分析。產(chǎn)生28-基因印記。

表15：ROCK數(shù)據(jù)集中，高TN評分BLBC腫瘤與低TN評分BLBC腫瘤的全局基因表達譜的分類比較(突出顯示的探針組指示在高TN評分BLBC和ER-乳腺腫瘤中共有的，加粗的探針組指示在BLBC和ER-乳腺癌中共有且預(yù)測性的)

表16：ROCK數(shù)據(jù)集中，高TN評分ER-腫瘤與低TN評分ER-腫瘤的全局基因表達譜的分類比較(突出顯示的探針組指示腺腫瘤中共同的)。

表17：ROCK數(shù)據(jù)集中，在與正常乳腺比較后高iBCR評分ER-和ER+腫瘤與低iBCR評分腫瘤的全局基因表達譜的分類比較。

表18：在高iBCR評分ER-/ER+腫瘤中下調(diào)的has-mir-568的上調(diào)靶標(biāo)。

加粗的基因在高iBCR評分ER-/ER+中相對于正常乳腺上調(diào)。

實施例3

本文表述的iBCR測試是從乳腺癌的基因表達譜的薈萃分析開發(fā)的。該測試基于43個基因的表達，所述43個基因作為印記在乳腺癌(與亞型無關(guān))中是預(yù)測性的。該測試也被發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中是預(yù)測性的。高iBCR評分的患者比低iBCR評分的患者具有差得多的總體生存。

在當(dāng)前的研究中，出于三個目的對于多種癌癥類型研究了Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)集。首先，為了確定高iBCR評分的乳腺癌病例與低iBCR評分的乳腺癌病例之間在蛋白質(zhì)水平上的差異。也對肺腺癌進行這種比較。其次，為了確定高和低iBCR評分腫瘤之間失調(diào)的蛋白/磷蛋白是否是預(yù)測性的。最后，iBCR miRNA印記和相關(guān)蛋白印記的預(yù)后價值在由TCGA進行譜分析的其他癌癥類型中是預(yù)測性的。

如圖48A和B所示，高iBCR評分與低iBCR評分的ER⁺乳腺癌病例之間反相蛋白質(zhì)陣列(RPPA)數(shù)據(jù)的比較鑒定了這兩個患者亞組之間的多種失調(diào)的蛋白和磷蛋白。高iBCR評分的ER^-乳腺癌病例與低iBCR評分的ER^-乳腺癌病例相比的相似分析也鑒定了這兩個患者亞組之間失調(diào)的蛋白和磷蛋白(圖48C和D)，然后測試這些顯著失調(diào)的蛋白和磷蛋白與總體生存的關(guān)系。9個蛋白/磷蛋白上調(diào)和8個蛋白/磷蛋白的下調(diào)在乳腺癌中是高度預(yù)測性的(圖49A)。重要的是，并且與所有已知的細胞病理學(xué)指標(biāo)相比，iBCR mRNA和蛋白印記的結(jié)合是乳腺癌患者(與亞型無關(guān))總體生存的最顯著指標(biāo)(圖49B)。

肺腺癌TCGA數(shù)據(jù)集中的相似分析鑒定了基于iBCR mRNA印記的蛋白/磷蛋白，其作為蛋白印記是預(yù)測性的(圖50A-C)，iBCR mRNA/蛋白印記的結(jié)合是高度預(yù)測性的，并且在肺腺癌中優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)細胞病理學(xué)指標(biāo)(圖50D和E)。

表19總結(jié)了iBCR測試中mRNA水平的43個基因和23個蛋白/磷蛋白。在乳腺癌(圖48和圖49)和肺腺癌(圖50)中預(yù)測性的組分在表19中標(biāo)記。然后，在其他癌癥類型中測試表19中的基因的mRNA和蛋白/磷蛋白水平與總體生存的關(guān)聯(lián)。表19中總結(jié)了與總體生存相關(guān)的iBCR測試組分的mRNA和蛋白水平的失調(diào)。對于每種癌癥類型，使用標(biāo)記的組分作為印記，并且腎臟腎透明細胞癌(IRC)、皮膚皮膚黑素瘤(SKCM)、子宮體子宮內(nèi)膜樣癌(UCEC)，卵巢腺癌(OVAC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、結(jié)腸/直腸腺癌(COREAD)、低等級膠質(zhì)瘤(LGG)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、腎臟腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、宮頸鱗狀細胞癌和宮頸內(nèi)腺癌(CESC)、肝臟肝細胞癌(LIHC)和胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的總體生存的分層顯示于圖51至54。

總之，在所有癌癥測試中，iBCR測試(包括mRNA和蛋白組分)是高度預(yù)測性的測試(表19)。該測試鑒定了侵襲性人類癌癥，并且對于蛋白-蛋白相互作用(圖55)以及與癌癥特點相關(guān)的生物學(xué)功能集中(表20)。

表19：來自TCGA數(shù)據(jù)集的不同癌癥中的iBCR測試成分

+表示過表達與較差生存的關(guān)聯(lián)(還繪上紅色陰影)

-表示低表達與較差生存的關(guān)聯(lián)(還繪上綠色陰影)

表20：iBCR測試中與癌癥標(biāo)志相關(guān)的生物學(xué)功能的集中

實施例4

Westin等的研究(Lancet Oncol，2014，vol 15(1))在接受pidilizumab聯(lián)合利妥昔單抗之前對18個濾泡性淋巴瘤患者進行了基因表達譜分析。研究了iBCR印記中基因的表達與這些患者中的無進展生存(PFS)的關(guān)聯(lián)。12個基因顯示與PFS的強關(guān)聯(lián)(圖56A)(所有與生存相關(guān)的基因?qū)儆趇BCR測試的TN組分)。如圖56B所示，基于iBCR印記計算的評分高度預(yù)測pidilizumab+利妥昔單抗免疫治療后的患者生存。該研究還對治療后15天患者中的8名進行譜分析。該印記中基因的表達在治療前和治療后在這些患者中比較。除了朝向總體表達譜逆轉(zhuǎn)的趨勢外，這對于生存的一個患者(圖56C-患者編號9)最為明顯，一個基因(ADORA2B)在治療后的腫瘤中與治療前的腫瘤中相比顯著不同(圖56D)。該基因可用于在基于iBCR測試選擇患者后確認響應(yīng)。

這里呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明iBCR測試可以是某些免疫療法的伴隨診斷，這并不令人驚訝，因為TN組分除了涉及氧化還原反應(yīng)和激酶的基因外，還包括多個免疫相關(guān)基因。

實施例5

在Oncomine^TM中，使用乳腺癌數(shù)據(jù)集(與亞型或所用基因表達陣列平臺無關(guān))進行薈萃分析。5年內(nèi)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移或死亡事件的乳腺腫瘤的全局基因表達譜與5年內(nèi)未導(dǎo)致轉(zhuǎn)移或死亡事件的乳腺腫瘤的全局基因表達譜相比較，并且選擇這些比較中的頂部過表達基因(OE)和低表達基因(UE)。然后使用在線工具KM-Plotter^TM調(diào)查導(dǎo)致轉(zhuǎn)移和死亡事件的原發(fā)性腫瘤中的共同失調(diào)基因(取決于每個數(shù)據(jù)集的注釋)(n>4000名患者，與Oncomine^TM中的數(shù)據(jù)集有一些重疊)。選擇與乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存相關(guān)的基因。

從該分析中鑒定的860個基因然后經(jīng)歷使用Ingenuity Pathway Analysis軟件的網(wǎng)絡(luò)分析以鑒定該基因列表中的功能網(wǎng)絡(luò)(參見表21)。圖57顯示了從薈萃分析鑒定的含有860個基因的11個功能網(wǎng)絡(luò)，其中每個網(wǎng)絡(luò)的功能被具體說明并且這些網(wǎng)絡(luò)之間的交互用連接線描繪。過表達與較差的生存相關(guān)的基因標(biāo)記為紅色，而低表達與較差的生存相關(guān)的基因標(biāo)記為綠色。在任何給定網(wǎng)絡(luò)中，較大的圓標(biāo)記具有與患者生存的最高關(guān)聯(lián)的基因。

然后，從薈萃分析中鑒定的這860個基因中過濾出與11個功能網(wǎng)絡(luò)的每一個中與患者生存具有最高關(guān)聯(lián)的基因。由此，從11個功能網(wǎng)絡(luò)選擇的133個基因(表22中所列)顯示于圖58(小圖A)中，其中顯示了每個網(wǎng)絡(luò)的功能?；谶@些網(wǎng)絡(luò)，將133個基因分類為六種功能性元基因(表22中所列)，其包括：代謝、信號傳導(dǎo)、發(fā)育和生長、染色體分離/復(fù)制、免疫應(yīng)答和蛋白質(zhì)合成/修飾元基因。圖58的小圖B中顯示了這些元基因中的每一個與KM Plotter數(shù)據(jù)集中乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存的關(guān)聯(lián)。通過計算元基因中過表達基因的表達水平(總和或平均值)與元基因中低表達基因的表達水平(總和或平均值)的比率，對這些元基因中每一個進行評分。綠線(具有更好的生存)表示元基因的較低評分(過表達基因與低表達基因的比率)，而紅線(具有較差的生存)表示高評分(過表達基因與低表達基因的比率)。

表21.與乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存相關(guān)的860個基因

過表達與較差生存相關(guān)的基因加粗，且低表達與較差生存相關(guān)的基因加上下劃線。

表22：與乳腺癌患者無復(fù)發(fā)生存相關(guān)的133個基因

過表達與過表達與較差生存相關(guān)的基因加粗，且低表達與較差生存相關(guān)的基因加上下劃線。

實施例6

上述實施例鑒定了與12個致癌功能相關(guān)的133個基因，其表達與癌癥侵襲性和臨床結(jié)果密切相關(guān)(表22)。研究了來自該列表的基因的表達與以下患者中的生存的關(guān)聯(lián)：(i)接受pidilizumab聯(lián)合利妥昔單抗之前的濾泡性淋巴瘤患者(Westin等，Lancet Oncol，2014，第15卷(1))；(ii)用西妥昔單抗治療的結(jié)腸直腸癌患者(GSE5851)；(iii)用西妥昔單抗和順鉑治療的三陰性乳腺癌患者(GSE23428)；(iv)用埃羅替尼治療的肺癌患者(GSE33072)；和(v)用索拉非尼治療的肺癌患者(GSE33072)。該分析鑒定了新的基因的集，與iBCR印記部分重疊，該基因的表達與不同治療組中的生存高度相關(guān)(表23)。基于這些基因印記計算的每個患者組的評分為高度預(yù)測這些患者組(pidilizumab+利妥昔單抗，圖56E；所有其他治療，圖59)中的生存。

表23.與接受抗腫瘤治療的患者的生存相關(guān)的iBCR基因印記

低表達與對治療的響應(yīng)相關(guān)的基因加粗，且過表達與對治療的響應(yīng)相關(guān)的基因加上下劃線。