本申請(qǐng)要求2014年4月1日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?4/242,574的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。

發(fā)明背景

產(chǎn)生疼痛的刺激通過初級(jí)感覺神經(jīng)元的神經(jīng)末端被檢測(cè)到，其細(xì)胞體在感覺神經(jīng)節(jié)例如背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中發(fā)現(xiàn)。信號(hào)，以動(dòng)作電位的形式，沿初級(jí)感覺神經(jīng)纖維被傳送到脊髓的背角，并從那里被傳遞到更高級(jí)的大腦中心，在大腦中心它被解釋為疼痛。初級(jí)感覺神經(jīng)元能被廣泛的熱、機(jī)械和化學(xué)刺激所激活。損傷或炎癥釋放一系列的炎癥介質(zhì)，其增加了感覺神經(jīng)元對(duì)有害的熱或機(jī)械刺激的敏感性。

白細(xì)胞介素IL-20(IL-20)是IL-10家族成員之一，IL-10家族成員包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、和IL-26。Blumberg等人，2001，細(xì)胞，104：9-19；Pestka等人，2004，免疫學(xué)年度評(píng)論22：929-979。IL-20在單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并通過激活異源二聚體受體復(fù)合物的IL-20R1/IL20R2或IL-22R1/IL20R2而作用于多種細(xì)胞類型。Dumoutier等人，2001，免疫學(xué)雜志167：3545-3549。已發(fā)現(xiàn)IL-20參與各種炎性疾病，如牛皮癬(Blumberg等人，2001；Sa等人，2007，J Immunol 178：2229-2240和Wei等人，2005，Clin Immunol 117：65-72)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Hsu等人，2006，Arthritis Rheum 54：2722-2733)、動(dòng)脈粥樣硬化(Caligiuri等人，2006，Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:1929-1930和Chen等人，2006，Arterioscler Thromb Vasc Biol 26：2090-2095)、缺血性中風(fēng)(Chen等人，2009，J Immunol 182：5003-5012)和腎衰竭(Li等人，2008，Genes Immun 9：395-404)。還可參見Wei等人，2006，J Biomed Sci 13：601-612。

發(fā)明概述

本

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
是基于意外的發(fā)現(xiàn)，即IL-20可能參與炎性疼痛的敏化，并且抑制IL-20信號(hào)通路的抗體可成功地在具有誘導(dǎo)的炎癥疼痛的小鼠中抑制機(jī)械性痛覺超敏。

因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于緩解對(duì)象疼痛例如炎性疼痛的方法，它包括給予有需要的對(duì)象緩解疼痛有效劑量的IL-20拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑是抑制IL-20介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗體，如結(jié)合于IL-20蛋白(如，人IL-20)的抗體或結(jié)合于IL-20受體(如，人IL-20受體)的抗體。用于本文描述方法中的任何抗體，可以是全長(zhǎng)抗體或其抗原結(jié)合片段?；蛘?，抗體可以是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體。

在一些實(shí)施方案中，在本文所述任何方法中使用的抗體可以是單克隆抗體mAb7E，或其抗原結(jié)合片段，或它們的功能性變體。在一實(shí)施例中，mAb7E的功能性變體含有與mAb7E相同的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在另一實(shí)施例中，功能性變體是mAb7E的人源化抗體。該人源化抗體可包括重鏈可變區(qū)(V_H)，其包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和輕鏈可變區(qū)(V_L)，其包括SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在其他實(shí)施方案中，用于本文所述任何方法中的IL-20拮抗劑，可以是結(jié)合于人IL-20受體，例如結(jié)合于IL-20R1亞基、IL-20R2亞基、IL-20R1/R2復(fù)合物、IL-22R1亞基、或IL-22R1/IL-20R2復(fù)合物的抗體。在一些實(shí)施方式中，抗體結(jié)合于人IL-20受體的亞基R1。這種抗體可以是全長(zhǎng)抗體或其抗原結(jié)合片段。它也可以是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、或單鏈抗體。在一實(shí)施例中，結(jié)合于人IL-20受體亞基R1的抗體，是含有與單克隆抗體mAb51D或mAb7GW、或mAb51D或mAb7GW的功能性變體相同的V_H和V_L的抗體。功能性變體可以含有與mAb51D或mAb7GW相同的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)?；蛘?，功能性變體可以是mAb51D或mAb7GW的人源化抗體。

本文描述的方法(如使用抑制IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗體的方法)中待治療的對(duì)象可以是患者(如，人類患者)，該患者患有疼痛、炎癥性疼痛，這些疼痛可以與急性炎癥(例如響應(yīng)于組織損傷或免疫應(yīng)答激活的直接炎癥)或慢性炎癥(例如，長(zhǎng)時(shí)間炎癥所引起的疼痛)相關(guān)。炎性疼痛包括但不限于：與急性或慢性炎癥相關(guān)的神經(jīng)病疼痛(例如，神經(jīng)疾病引起的疼痛)，急性或慢性炎癥引起的缺血性疼痛，關(guān)節(jié)炎疼痛，急性或慢性炎癥誘發(fā)的肌肉疼痛，急性、慢性炎癥、或化療引起的神經(jīng)痛。在一些實(shí)例中，對(duì)象是人類癌癥患者，該患者被聯(lián)合施用可引起外周神經(jīng)病變的化療劑(例如，本文描述的那些化療劑)。

本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括：(a)用于緩解對(duì)象疼痛(例如炎性疼痛)的藥物組合物，該藥物組合物含有本文描述的一種或多種IL-20拮抗劑(例如，抑制IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗體，如結(jié)合于人IL-20或人IL-20受體(R1、R2或它們的復(fù)合物)的抗體)；和(b)剛才描述的藥物組合物在制備用于緩解疼痛例如炎性疼痛和由例如化療劑引起的周圍神經(jīng)病變的藥物中的應(yīng)用。

在以下說明書中闡述本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)?；谝韵赂綀D、數(shù)個(gè)實(shí)施方式的詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征或優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。

附圖說明

首先描述附圖。

圖1表示抗IL-20抗體(mAb7E)對(duì)由完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的炎癥性疼痛的抑制效果的圖。CFA誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏，通過鞘內(nèi)(IT)或爪(PL)注射抗IL-20抗體(10微克)而被顯著抑制，而對(duì)照IgG(10微克)無抑制。*P<0.05,相對(duì)于IgG對(duì)照；#P<0.05,相對(duì)于IT組。數(shù)據(jù)表示5-6只小鼠的平均值±SEM。

圖2表示抗IL-20抗體mAb7E通過鞘內(nèi)注射在不同劑量下的鎮(zhèn)痛效果圖。*P<0.05，相對(duì)于基線對(duì)照(CFA3d)；#P<0.05，相對(duì)于12μg組。數(shù)據(jù)表示5-6只小鼠的平均值±SEM。

圖3為實(shí)施例2中詳述的研究的實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。紫杉醇組：紫杉醇引起的神經(jīng)病變是由隔日注射、共給予四次紫杉醇(4.5mg/kg)引起的?？笽L-20抗體/紫杉醇組：在每次注射紫杉醇前6h，給予抗IL-20抗體(“IL-20抗體”；為5mg/kg)。IL-20抗體組：在每次注射生理鹽水前6h，給予抗IL-20抗體(5mg/kg)。生理鹽水的注射體積與紫杉醇注射體積相等。對(duì)照組：四次生理鹽水分別隔日注射。每一神經(jīng)試驗(yàn)的基線測(cè)量，在給予紫杉醇或載體之前進(jìn)行，并且在治療之后，在1個(gè)月內(nèi)，每個(gè)星期對(duì)4個(gè)額外的測(cè)試進(jìn)行記錄。

圖4表示抗IL-20抗體對(duì)化療引起的機(jī)械性痛覺超敏的神經(jīng)保護(hù)作用的圖。Y軸表示歸一化的縮爪的時(shí)間(除以每組的基線水平)。每個(gè)點(diǎn)表示來自6只小鼠的平均值±SE。

圖5表示化療誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏測(cè)試中，在處理后第4周評(píng)估的縮爪時(shí)間。每個(gè)數(shù)據(jù)表示來自6只小鼠的平均值±SE。*,p<0.05；**,P<0.01，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)。

圖6表示抗IL-20抗體對(duì)化療誘導(dǎo)的熱異常性疼痛的神經(jīng)保護(hù)作用的圖。Y軸表示歸一化的熱反應(yīng)潛伏期(除以每組的基線水平)。每個(gè)點(diǎn)表示6只小鼠的平均值±SE。*，P<0.05；**P<0.01，通過非配對(duì)t檢驗(yàn)。

圖7表示化療誘導(dǎo)的熱異常性疼痛測(cè)試中，在處理后第4周評(píng)估的熱反應(yīng)潛伏期。每個(gè)數(shù)據(jù)表示6只小鼠的平均值±SE。*,p<0.05；**,P<0.01通過非配對(duì)t檢驗(yàn)。

序列簡(jiǎn)要說明

SEQ ID NO:1是編碼單克隆抗體mAb7E重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2是單克隆抗體mAb7E的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是編碼單克隆抗體mAb7E輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4是單克隆抗體mAb7E的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是編碼衍生自mAb7E的人源化抗體HL1和HL2(前體形式，其包括信號(hào)肽)的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6是衍生自mAb7E的人源化抗體HL1和HL2(前體形式，其包括信號(hào)肽)的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是編碼衍生自mAb7E的人源化抗體HL1和HL2(成熟形式，缺乏信號(hào)肽)的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8是衍生自mAb7E的人源化抗體HL1和HL2(成熟形式，缺乏信號(hào)肽)的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是編碼人源化抗體HL2(前體形式，其包括信號(hào)肽)的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10是人源化抗體HL2(前體形式，其包括信號(hào)肽)的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是編碼人源化抗體HL2(成熟形式，缺乏信號(hào)肽)的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12是人源化抗體HL2(成熟形式，缺乏信號(hào)肽)的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是人源化抗體HL1(成熟形式，缺乏信號(hào)肽)的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14是單克隆抗體mAb7GW的重鏈的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是編碼單克隆抗體mAb7GW的重鏈的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16是單克隆抗體mAb7GW的輕鏈的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17是編碼單克隆抗體mAb7GW的輕鏈的核苷酸序列。

SEQ ID NO:18是單克隆抗體mAb51D的重鏈的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19是編碼單克隆抗體mAb51D的重鏈的核苷酸序列。

SEQ ID NO:20是單克隆抗體mAb51D的輕鏈的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21是編碼單克隆抗體mAb51D的輕鏈的核苷酸序列。

發(fā)明詳述

炎癥引發(fā)一連串的生化反應(yīng)，其中包括引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛感。此外，長(zhǎng)期的(慢性的)炎癥可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)中的自適應(yīng)變化，這會(huì)導(dǎo)致痛覺被增強(qiáng)或提高。例如，發(fā)炎組織(例如，關(guān)節(jié)炎膝蓋)可能會(huì)過于脆弱，甚至輕輕一碰可能會(huì)引起疼痛，這種現(xiàn)象稱為機(jī)械性痛覺超敏。

本公開內(nèi)容報(bào)道了意想不到的發(fā)現(xiàn)：(i)IL-20可能參與敏化和/或引起炎性疼痛；(ii)能夠干擾IL-20信號(hào)通路的抗體(例如，mAb7E)成功地在炎性疼痛的動(dòng)物模型上抑制了機(jī)械性痛覺超敏。因此，本公開內(nèi)容涉及使用有效量的IL-20拮抗劑治療對(duì)象的炎性疼痛(例如，減輕炎性疼痛或延遲炎性疼痛的發(fā)病)的方法，所述IL-20拮抗劑可以是能干擾IL-20信號(hào)通路的抗體。

通用技術(shù)

除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，這些技術(shù)都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。在文獻(xiàn)中充分解釋了這些技術(shù)，如分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版(Sambrook等，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(M.J.Gait編輯,1984)；分子生物學(xué)方法，胡馬納(Humana)出版社；細(xì)胞生物學(xué)：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(J.E.Cellis編輯,1998)學(xué)術(shù)出版社；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(R.I.Freshney編輯,1987)；細(xì)胞和組織培養(yǎng)介紹(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)納姆(Plenum)出版社；細(xì)胞和組織培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)規(guī)程(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell編輯,1993-8)約翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；酶學(xué)方法(學(xué)術(shù)出版社有限公司)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體(J.M.Miller和M.P.Calos編輯,1987)；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南(F.M.Ausubel等人編輯,1987)；PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Mullis等人編輯,1994)；免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(J.E.Coligan等人編輯,1991)；分子生物學(xué)簡(jiǎn)明手冊(cè)(威利父子Wiley and Sons,1999)；免疫學(xué)(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；抗體(P.Finch,1997)；抗體：實(shí)用方法(D.Catty編輯,IRL出版社,1988-1989)；單克隆抗體：實(shí)用方法(P.Shepherd和C.Dean編輯,牛津大學(xué)出版社,2000)；使用抗體：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(E.Harlow和D.Lane(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,1999)；抗體(M.Zanetti和J.D.Capra編輯,哈伍德學(xué)術(shù)出版社(Harwood Academic Publishers),1995)。

IL-20拮抗劑以及包含該拮抗劑的藥物組合物

IL-20是屬于IL-10細(xì)胞因子家族的促炎細(xì)胞因子。本文描述的IL-20是指白細(xì)胞介素20和其保留至少部分IL-20活性的變體。如本文所用，IL-20包括所有哺乳動(dòng)物物種的天然序列IL-20，包括人、犬、貓、馬或牛。在一實(shí)施例中，IL-20是人IL-20(GenBank登錄號(hào)NP_061194.2)。

IL-20通過結(jié)合于IL-20受體激活I(lǐng)L-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，IL-20受體是包含亞基IL-20R1和IL-20R2(也稱為RA和RB)的二聚體復(fù)合物。該IL-20受體由三種功能不同的細(xì)胞因子即IL-19、IL-20和IL-24共享，這表明該受體根據(jù)其結(jié)合于特定的細(xì)胞因子而介導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。IL-20也能結(jié)合于包含IL-20R2和IL-22R1的二聚體復(fù)合物。本文描述的IL-20受體是指能結(jié)合于IL-20且被其激活的一種或多種多肽。本文描述的IL-20受體包括所有哺乳動(dòng)物物種的IL-20R1、IL-20R2和IL-22R1，其中包括但不限于：人、犬、貓、馬、靈長(zhǎng)類動(dòng)物或牛。人IL-20受體的例子包括：hIL-20R1(GenBank登錄號(hào)NM_014432.2)、hIL-20R2(GenBank登錄號(hào)NM_144717.2)和hIL-22R1(NM_181309.1)。人IL-20受體的序列已有描述，例如，在美國(guó)專利號(hào)6,610,286、7,122,632、7,393,684和7,537,761；以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0263850A1、2006/0263851A1、2008/0247945A1和2009/0074661A1中。

本文描述的方法中使用的IL-20拮抗劑，是阻斷、抑制或降低(包括顯著地)IL-20生物活性的分子，其中包括由IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如受體結(jié)合和/或激發(fā)對(duì)IL-20的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng))介導(dǎo)的下游通路。參見US2011/0064731，其通過引用全部并入本文。術(shù)語“拮抗劑”不意味任何特定機(jī)制的生物作用，并認(rèn)為其明確包括和涵蓋直接或間接地與IL-20的所有可能的藥理學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的相互作用。為本公開內(nèi)容的目的，將明確地理解，術(shù)語“拮抗劑”涵蓋所有先前確定的術(shù)語、標(biāo)題和功能狀態(tài)以及特征，其中IL-20本身(例如，人IL-20)、IL-20生物活性(包括但不限于其介導(dǎo)任何方面的炎性疼痛的能力)或生物活性的后果，在任何有意義的程度被實(shí)質(zhì)上廢除(nullified)、降低或中和，例如至少20％、50％、70％、85％、90％、100％、150％、200％、300％或500％，或10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或10⁴倍。

示例性IL-20拮抗劑包括但不限于：中和IL-20活性的抗體(例如，抗IL-20抗體諸如mAb7E)，或結(jié)合于IL-20受體并抑制IL-20介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路的抗體(例如結(jié)合至IL-20受體亞基R1的抗體如mAb51D和mAb7GW)、針對(duì)IL-20的反義核酸(包括針對(duì)編碼IL-20的核酸的反義核酸)、針對(duì)IL-20核酸的小干擾RNA(siRNA)、針對(duì)IL-20核酸的微小RNA(microRNA)、IL-20抑制性化合物、抗IL-20R抗體(如，特異結(jié)合IL-20R1、IL-20R2或由此形成的二聚體復(fù)合物的抗體)、針對(duì)IL-20受體亞基的反義核酸分子、針對(duì)編碼IL-20受體亞基的核酸的siRNA或微小RNA、或IL-20R抑制性化合物。在一些實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑結(jié)合于IL-20或IL-20受體并抑制IL-20-IL-20R復(fù)合物形成，從而抑制IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在其他實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑抑制或減少IL-20合成和/或產(chǎn)生(釋放)。這種拮抗劑包括反義分子、siRNA和微小RNA。

能夠干擾IL-20信號(hào)傳導(dǎo)通路的抗體

抗體(可以復(fù)數(shù)形式互換使用)是免疫球蛋白分子，其能夠通過位于免疫球蛋白分子可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等的靶標(biāo)。如本文所用，術(shù)語“抗體”不僅涵蓋完整的(即全長(zhǎng))多克隆或單克隆抗體，而且包含其抗原結(jié)合片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙抗體(diabodies)、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(如，雙特異性抗體)和包含所需要特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他修飾構(gòu)型的免疫球蛋白分子，包括抗體的糖基化變體、抗體的氨基酸序列變體和共價(jià)修飾的抗體。抗體包括任何類型的抗體，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亞類)，且抗體不必是任何特定類型。取決于其重鏈恒定區(qū)的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可歸為不同類型。有五大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類型免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)，分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。

用于本文描述方法的抗體可以是鼠科、大鼠、人或任何其他來源(包括嵌合或人源化抗體)。在一些實(shí)施例中，抗體包括修飾的恒定區(qū)，如免疫惰性的恒定區(qū)，例如不觸發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解，或不刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)?？梢允褂妹绹?guó)專利號(hào)5,500,362公開的方法評(píng)價(jià)ADCC活性。在其他實(shí)施方式中，如Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624、PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB99/01441和/或UK專利申請(qǐng)?zhí)?809951.8中所描述，對(duì)恒定區(qū)進(jìn)行修飾。

任何本文描述的抗體可以是單克隆或多克隆的?！皢慰寺】贵w”是指同源抗體群，“多克隆抗體”是指異源抗體群。這兩個(gè)術(shù)語不限制抗體的來源或者制備抗體的方式。

在一實(shí)施例中，用于本文描述方法中的抗體是人源化抗體。人源化抗體是指非人(例如鼠科)抗體形式，其為特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈、或其抗原結(jié)合片段，包含來自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的具有所需特異性、親和力和能力的CDR的殘基取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)非人殘基取代。此外，人源化抗體可以包括既不存在于受體抗體也不存在于引入的CDR或框架序列的殘基，但是包括這些殘基以進(jìn)一步完善和優(yōu)化抗體性能。通常，人源化抗體將包含基本上全部的至少一個(gè)和通常兩個(gè)可變區(qū)，其中全部或基本全部CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，全部或基本全部FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。最佳地，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)，典型地是至少部分的人免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)?？贵w可以具有如WO99/58572中描述的修飾的Fc區(qū)。其他形式的人源化抗體具有一或多個(gè)CDR(一，二，三，四，五，六個(gè))，其相對(duì)于原始抗體被改變，其也稱為“衍生自”原始抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR的一個(gè)或多個(gè)CDR。人源化抗體也可以涉及親和力成熟。

在另一實(shí)施例中，本文描述的抗體是嵌合抗體，其可以包括衍生自人抗體的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。嵌合抗體是指具有衍生自第一物種的可變區(qū)或部分可變區(qū)和衍生自第二物種的恒定區(qū)的抗體。通常，在這些嵌合抗體中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)均模擬衍生自一種哺乳動(dòng)物(如，非人哺乳動(dòng)物，如小鼠、兔和大鼠)的抗體的可變區(qū)，而不變部分與衍生自另一哺乳動(dòng)物諸如人的抗體序列同源。在一些實(shí)施方式中，可以在可變區(qū)和/或恒定區(qū)進(jìn)行氨基酸修飾。

在一些實(shí)施例中，本文描述的抗體特異性結(jié)合靶抗原，如人IL-20或人IL-20受體的兩亞基之一(如，IL-20R1)?！疤禺愋越Y(jié)合”到靶標(biāo)或表位的抗體是本領(lǐng)域公知的術(shù)語，檢測(cè)該特異性結(jié)合的方法也是本領(lǐng)域公知的。如果與其他靶標(biāo)相比，分子與特定靶抗原反應(yīng)或結(jié)合得更頻繁，更迅速，具有更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間和/或具有更大的親和力，則該分子被認(rèn)為顯示出“特異性結(jié)合”。如果與其結(jié)合于其他物質(zhì)相比，抗體以更大的親和力(affinity)、親合力(avidity)，更容易和/或以更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間結(jié)合于靶抗原，則抗體是特異性結(jié)合于靶抗原。例如，特異性(或優(yōu)先)結(jié)合于IL-20表位的抗體，是與其結(jié)合于其他IL-20表位或非IL-20表位相比，以更大的親和力、親合力，更容易和/或以更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間結(jié)合該IL-20表位的抗體。通過閱讀該定義，應(yīng)理解，例如，特異性結(jié)合第一靶抗原的抗體可以或可以不特異性或優(yōu)先結(jié)合第二靶抗原。因此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不一定需要(雖然其可包括)專一結(jié)合。通常，但不必須，提及結(jié)合就意味著優(yōu)先結(jié)合。

能干擾IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗體可以是結(jié)合IL-20(如人IL-20)并抑制IL-20生物活性和/或IL-20介導(dǎo)的下游通路的抗體。或者，該抗體可以是結(jié)合IL-20受體(IL-20R)的抗體，如結(jié)合于IL-20受體亞基之一或兩者，并抑制IL-20觸發(fā)的受體介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

抗IL-20抗體

抗IL-20抗體是能結(jié)合于IL-20并抑制IL-20生物活性和/或IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的下游通路的抗體。在一些實(shí)施例中，用于本文描述方法中的抗IL-20抗體，抑制IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％、或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍?？笽L-20抗體的實(shí)例包括但不限于：美國(guó)專利號(hào)7,435,800、7,115,714、7,119,175、7,151,166和7,393,684以及PCT公開號(hào)WO2007/081465、WO99/27103、WO2004/085475和WO2005052000中公開的那些。

抗IL-20抗體與IL-20(如人IL-20)的結(jié)合親和力可以小于約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM中任一到任何約2pM。結(jié)合親和力可以用K_D或解離常數(shù)表示，增加的結(jié)合親和力對(duì)應(yīng)減少的K_D。檢測(cè)抗體與IL-20結(jié)合親和力的一種方法是通過測(cè)定該抗體的單功能Fab片段的結(jié)合親和力。為獲得單功能Fab片段，抗體(例如IgG)可用木瓜蛋白酶切割或重組表達(dá)?？贵w的抗IL-20Fab片段的親和力，可以通過表面等離子共振(BIAcore3000TM表面等離子體共振(SPR)系統(tǒng)，BIAcore，INC，PiscawayNJ)確定。獲得動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)(通常在25℃檢測(cè))，并通過k_off/k_on計(jì)算平衡解離常數(shù)(K_D)值。

在一些實(shí)施方式中，抗體結(jié)合人IL-20，不顯著結(jié)合衍生自另一哺乳動(dòng)物物種的IL-20。在一些實(shí)施方式中，抗體結(jié)合人IL-20以及衍生自另一哺乳動(dòng)物物種的一或多個(gè)IL-20。在還有的其他實(shí)施方式中，抗體結(jié)合IL-20，不顯著與其他細(xì)胞因子(如相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、IL-17A、IL-19、IL-22、IL-24和IL-26)交叉反應(yīng)?？贵w結(jié)合的表位可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。

在一些實(shí)施方式中，本文描述的抗IL-20抗體是抗IL-20抗體7E，其是指單克隆抗體mAb7E和它的功能性變體。MAb7E由保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(10801大學(xué)大道，馬納薩斯，VA.20110-2209，USA)且保藏編號(hào)為PTA-8687的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。在本申請(qǐng)被授予美國(guó)專利后，該雜交瘤細(xì)胞系將不可撤銷地且沒有限制/條件地對(duì)公眾公開，且對(duì)于專利可實(shí)施期將從保藏之日起在ATCC保存至少30年，或在最近日期之后保存為期5年。

如下制備mAb7E重鏈可變區(qū)(V_H)和輕鏈可變區(qū)(V_L)的氨基酸序列和編碼核苷酸序列。

mAb7E重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

mAb7E輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

mAb7E的功能性變體(等價(jià)物)具有與mAb7E基本相同的表位結(jié)合特異性，表現(xiàn)出相對(duì)于mAb7E至少20％(如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的中和IL-20介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性。在一些實(shí)施方式中，mAb7E的功能性變體包含與mAb7E相同的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的區(qū)域/殘基，如在CDR中決定特異性的相同的殘基或整個(gè)CDR?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，從mAb7GW或mAb51D的重鏈/輕鏈序列的氨基酸序列(如上所示)來鑒定負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的區(qū)域/殘基。參見，如，www.bioinf.org.uk/abs；Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)和Chothia等人，J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。

此外，抗體中CDR區(qū)的確定也是本領(lǐng)域已知的。參見，如，www.bioinf.org.uk/abs；Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)和Chothia等人，J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。至少有兩種技術(shù)用于確定CDR：(1)基于跨物種序列變異的方法(即Kabat等人，免疫學(xué)感興趣的蛋白序列“Sequences of proteins of Immunological Interest”(第5版,1991,美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院,馬里蘭州貝塞斯達(dá)))；和(2)基于抗原抗體復(fù)合物的結(jié)晶研究方法(Chothia等人(1989)Nature 342:877；Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。如本文所用，CDR可以指通過任一方法或通過兩種方法的組合來定義的CDR。

在一些實(shí)施例中，mAb7E的功能性變體包括VH鏈和VL鏈，VH鏈包括V_HCDR1、V_HCDR2和V_HCDR3，其與相應(yīng)的mAb7E的V_HCDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同；VL鏈包括V_LCDR1、V_LCDR2和V_LCDR3，其與相應(yīng)的mAb7E的V_HCDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。

或者，mAb7E的功能性變體包括VH鏈和VL鏈，所述VH鏈與mAb7E的VH鏈(成熟或前體)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同，所述VL鏈與mAb7E的VL鏈(成熟或前體)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。

使用由Karlin和Altschul改進(jìn)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77,1993)的Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68,1990)的算法，檢測(cè)兩個(gè)氨基酸序列的“百分比相同度”。該算法并入Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。可以采用XBLAST程序開展BLAST蛋白研究，設(shè)定分?jǐn)?shù)＝50，字長(zhǎng)＝3，從而獲得與感興趣的蛋白分子同源的氨基酸序列。當(dāng)兩序列間存在間隙時(shí)，可以采用Altschul等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17):3389-3402,1997中描述的Gapped BLAST。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。

在其他實(shí)施例中，mAb7E的功能性變體包括V_H鏈和/或V_L鏈，與mAb7E的V_HCDR相比，V_H鏈在V_HCDR區(qū)(V_HCDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)個(gè)氨基酸殘基變異；與mAb7E的V_HCDR相比，V_L鏈在V_LCDR區(qū)(V_LCDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)個(gè)氨基酸殘基變異。

mAb7E的功能性變體也在美國(guó)專利號(hào)7,611,705和US2011/0064731中被披露，兩者通過引用并入本文。

在一實(shí)施例中，mAb7E的功能性變體是衍生自mAb7E的人源化抗體。以下提供的示例性人源化mAb7E抗體HL1和HL2，也參見美國(guó)專利號(hào)8,597,647。

人源化抗IL-20抗體HL1和HL2的V_H鏈的氨基酸序列及編碼核苷酸序列

下劃線的區(qū)域表示信號(hào)肽，粗體/斜體區(qū)域是CDR。SEQ ID NOs:8和7分別表示成熟VH氨基酸序列(缺乏信號(hào)肽)和它的編碼核苷酸序列。

人源化抗IL-20抗體HL2的V_L鏈(VL2)的氨基酸序列和編碼核苷酸序列

下劃線的區(qū)域表示信號(hào)肽，粗體/斜體區(qū)域是CDR。SEQ ID NOs:12和11分別表示成熟V_L氨基酸序列(缺乏信號(hào)肽)和它的編碼核苷酸序列。

人源化抗體HL1包括與HL2相同的V_H鏈和與HL2的V_L相同的V_L鏈(SEQ ID NO：13；成熟形式)，不同點(diǎn)在于：HL2的成熟V_L的位置2的I殘基被F取代。

本文還公開了上述人源化抗體HL1和HL2的功能性變體。這些功能性變體可以包括V_H鏈和V_L鏈，V_H鏈包括與HL1和HL2的V_H的氨基酸序列(前體或成熟形式；分別為SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8)有至少85％(如，90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列，V_L鏈具有與HL2的V_L的氨基酸序列(前體或成熟形式；分別為SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12)有至少85％(如，90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。這些變體能夠結(jié)合于IL-20分子，特別是人IL-20分子。在一些實(shí)施例中，相對(duì)于上述示例性人源化抗體，變體具有類似的抗原-結(jié)合親和力(如，K_d<4x10^-9)。

抗IL-20R抗體

抗IL-20R抗體是能結(jié)合IL-20R(如，結(jié)合于它的兩亞基的任一或兩者，或結(jié)合于二聚體復(fù)合物)的抗體，并特異性抑制IL-20R生物活性和/或IL-20介導(dǎo)的其下游通路。在一些實(shí)施例中，用于本文描述方法中的抗IL-20抗體，抑制IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。在一些實(shí)施例中，抗IL-20R抗體特異性結(jié)合IL-20R1，如人IL-20R1。該抗體可以對(duì)IL-20R2或IL-20R1/IL-20R2復(fù)合物具有低親和力，或不結(jié)合IL-20R2或IL-20R1/IL-20R2復(fù)合物。在其他實(shí)施例中，抗IL-20R抗體特異性結(jié)合IL-20R2，如人IL-20R2。該抗體可以對(duì)IL-20R1或IL-20R1/IL-20R2復(fù)合物具有低親和力，或不結(jié)合IL-20R1或IL-20R1/IL-20R2復(fù)合物。在還有的其他實(shí)施例中，本文描述的抗IL-20R抗體特異性結(jié)合IL-20R1/IL-20R2復(fù)合物。

抗IL-20R抗體與IL-20R或其亞基(如人IL-20R或人IL-20R1)的結(jié)合親和力，可以小于約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM任一個(gè)值到約2pM。結(jié)合親和力可以用K_D或解離常數(shù)表示，增加的結(jié)合親和力對(duì)應(yīng)減少的K_D。檢測(cè)抗體到IL-20R結(jié)合親和力的一種方法是通過測(cè)定該抗體的單功能Fab片段的結(jié)合親和力。為獲得單功能Fab片段，抗體(例如IgG)可用木瓜蛋白酶切割或重組表達(dá)?？贵w的抗IL-20R Fab片段的親和力可以通過表面等離子共振(BIAcore3000TM表面等離子體共振(SPR)系統(tǒng)，BIAcore，INC，PiscawayNJ)確定。獲得動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率(kon)和解離速率(k_off)(通常在25℃檢測(cè))；并通過k_off/k_on計(jì)算平衡解離常數(shù)(K_D)值。

在一些實(shí)施方式中，抗體結(jié)合人IL-20R或其亞基(如，人IL-20R1)，不特異性結(jié)合衍生自另一哺乳動(dòng)物物種的IL-20R。在一些實(shí)施方式中，抗體結(jié)合人IL-20R以及來自另一哺乳動(dòng)物物種的一個(gè)或多個(gè)IL-20R。在還有的其他實(shí)施方式中，抗體結(jié)合IL-20R，不顯著與其他細(xì)胞因子受體交叉反應(yīng)?？贵w結(jié)合的表位可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。

在一些實(shí)施方式中，用于本文描述方法中的抗體是具有與單克隆抗體mAb7GW或mAb51D相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)(V_H和V_L)的抗體、單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段、或mAb7GW或mAb51D的功能等價(jià)物。US2011/0256093，其通過引用全部并入本文。以下示出的是mAb7GW和mAb51D的重鏈和輕鏈的氨基酸序列，連同它們的編碼核苷酸序列。

mAb7GW重鏈：

氨基酸序列(SEQ ID NO：14)

(斜體區(qū)域是指重鏈恒定區(qū))

核苷酸序列(SEQ ID NO：15)

(斜體區(qū)域編碼重鏈恒定區(qū))

mAb7GW輕鏈

氨基酸序列(SEQ ID NO：16)

(斜體區(qū)域是指輕鏈恒定區(qū))

核苷酸序列(SEQ ID NO：17)

(斜體區(qū)域編碼輕鏈恒定區(qū))

mAb51D重鏈

氨基酸序列(SEQ ID NO：18)

(斜體區(qū)域是指重鏈恒定區(qū))

核苷酸序列(SEQ ID NO：19)

(斜體區(qū)域編碼重鏈恒定區(qū))

mAb51D輕鏈

氨基酸序列(SEQ ID NO：20)

(斜體區(qū)域是指輕鏈恒定區(qū))

核苷酸序列(SEQ ID NO：21)

(斜體區(qū)域編碼輕鏈恒定區(qū))

mAb7GW或mAb51D的功能性變體具有與mAb7GW或mAb51D相同的表位結(jié)合特異性，表現(xiàn)出相對(duì)于mAb7GW或mAb51D至少20％(如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的中和IL-20R1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性。在一些實(shí)施方式中，mAb7GW或mAb51D的功能性變體包含與mAb7GW或mAb51D相同的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的區(qū)域/殘基，如CDR中決定特異性的相同的殘基或整個(gè)CDR。可以通過本領(lǐng)域已知方法，由mAb7GW或mAb51D的重鏈/輕鏈序列的氨基酸序列(如上所示)來鑒定負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的區(qū)域/殘基。參見，如，www.bioinf.org.uk/abs；Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)和Chothia等人，J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。

在一些實(shí)施例中，mAb7GW或mAb51D的功能等價(jià)物(變體)包括V_H鏈和V_L鏈，V_H-鏈包括V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3，其與相應(yīng)的mAb7GW或mAb51D的V_H CDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同；V_L鏈包括V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3，其與相應(yīng)的mAb7GW或mAb51D的V_H CDR至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。

或者，mAb7GW或mAb51D的功能等價(jià)物包括V_H鏈和V_L鏈，所述V_H鏈與mAb7GW或mAb51D的V_H鏈(成熟或前體)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同，所述V_L鏈與mAb7GW或mAb51D的V_L鏈(成熟或前體)至少75％(如80％、85％、90％、95％或98％)相同。

在其他實(shí)施例中，mAb7GW或mAb51D的功能等價(jià)物包括V_H鏈和/或V_L鏈，與mAb7GW或mAb51D的V_H CDR相比，所述V_H鏈在V_H CDR區(qū)(V_H CDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)個(gè)氨基酸殘基變異；與mAb7GW或mAb51D的V_H CDR相比，V_L鏈在V_L CDR區(qū)(V_LCDR1、CDR2和/或CDR3)包括至多5(如1、2、3、4或5)個(gè)氨基酸殘基變異。

(c)抗體制備

可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法，制備本文描述的能干擾IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗體。參見，例如Harlow和Lane,(1988)抗體：實(shí)驗(yàn)手冊(cè),冷泉港實(shí)驗(yàn)室,紐約。

在一些實(shí)施方式中，可以采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備對(duì)靶抗原(如，人IL-20或IL-20R1)特異性的抗體。全長(zhǎng)靶抗原或其片段，任選地連接到載體蛋白如KLH，可以用于免疫宿主動(dòng)物以產(chǎn)生結(jié)合該抗原的抗體。免疫接種宿主動(dòng)物的通路和時(shí)間安排一般是符合刺激和生產(chǎn)抗體的既定和常規(guī)技術(shù)，如本文進(jìn)一步描述。生產(chǎn)小鼠、人源化和人抗體的一般技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在本文中描述?？紤]任何哺乳動(dòng)物對(duì)象包括人類或其中的抗體生產(chǎn)細(xì)胞可以被操縱從而作為生產(chǎn)哺乳動(dòng)物包括人的雜交瘤細(xì)胞系的基礎(chǔ)。典型地，宿主動(dòng)物腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、口服、皮下、足跖和/或皮內(nèi)接種一定量的免疫原，包括如本文描述的。

采用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497的一般體細(xì)胞雜交技術(shù)或Buck,D.W.,等人,In Vitro,18:377-381(1982)改進(jìn)的技術(shù)，可以從淋巴細(xì)胞和永生化骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤。有用的骨髓瘤細(xì)胞系，包括但不限于：X63-Ag8.653以及來自索爾克研究所細(xì)胞配送中心(圣迭戈，加利福尼亞州，美國(guó))(Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA,)的那些細(xì)胞系，可以用于雜交。通常，技術(shù)涉及使用融合劑如聚乙二醇或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的電方式，融合骨髓瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。融合后，將細(xì)胞從融合培養(yǎng)基中分離，并在選擇生長(zhǎng)培養(yǎng)基如次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以消除未雜交的親本細(xì)胞。本文描述的任何培養(yǎng)基(補(bǔ)加或未補(bǔ)加血清)，可用于培養(yǎng)分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一替代，EBV永生化B細(xì)胞可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗IL-20單克隆抗體。如果需要的話，擴(kuò)增雜交瘤并亞克隆，并且通過常規(guī)免疫檢測(cè)程序(如，放射免疫法、酶聯(lián)免疫法或熒光免疫法)檢測(cè)上清液的抗免疫原活性。

可以用作抗體來源的雜交瘤，包括產(chǎn)生能干擾IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的單克隆抗體的母體雜交瘤的所有衍生細(xì)胞、后代細(xì)胞。產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤可以使用已知程序在體外或體內(nèi)生長(zhǎng)。如果需要的話，可以通過常規(guī)免疫球蛋白純化程序，如硫酸銨沉淀，凝膠電泳，透析，色譜和超濾從培養(yǎng)基或體液中分離單克隆抗體。如果存在不需要的活性，可以去除，例如通過將制備物流過由免疫原附著于固相而制備的吸附劑，并從免疫原洗脫或釋放所需抗體。用利用雙官能或衍生劑(例如馬來酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))，N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOC1，或R1N＝C＝NR(其中R和Rl是不同的烷基)偶聯(lián)到蛋白(在待免疫物種中具有免疫原性，如鑰孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)，將靶抗原或含有靶氨基酸序列的片段來免疫宿主動(dòng)物，可以產(chǎn)生抗體(如單克隆抗體)群。

如果需要的話，感興趣的抗體(單克隆或多克隆的)(如通過雜交瘤產(chǎn)生)可以被測(cè)序，然后多核苷酸序列可以克隆到用于表達(dá)或繁殖的載體。編碼感興趣的抗體的序列可被保持在宿主細(xì)胞載體內(nèi)，然后可以擴(kuò)增宿主細(xì)胞并冷凍供將來使用。或者，多核苷酸序列可用于基因操做以“人源化”抗體或改善親和力(親和力成熟)或抗體的其他特征。例如，如果抗體用于人類臨床試驗(yàn)和治療，恒定區(qū)可以工程化以更類似于人恒定區(qū)以避免免疫應(yīng)答。可能需要遺傳操作抗體序列，以獲得與靶抗原的更強(qiáng)親和力和抑制由IL-20介導(dǎo)的信號(hào)通路的更大功效。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯而易見的是可對(duì)抗體進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)多核苷酸改變并仍然保持其對(duì)靶抗原的結(jié)合特異性。

在其他實(shí)施方式中，可以通過使用已經(jīng)被工程化以表達(dá)特定的人免疫球蛋白的市售小鼠獲得全人的抗體。為產(chǎn)生更可取(如完全人抗體)或更強(qiáng)健的免疫應(yīng)答而設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，也可用于產(chǎn)生人源化或人抗體。該類技術(shù)的實(shí)例為Amgen,Inc.(弗里蒙特,加利福尼亞州)的Xenomouse^RTM，以及Medarex,Inc.(普林斯頓,新澤西州)的HuMAb-mouse^RTM和TCmouse^TM。在另一個(gè)替代方案中，可以通過噬菌體展示技術(shù)重組生產(chǎn)抗體。參見，例如美國(guó)專利號(hào)5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150；以及Winter等人，(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455?；蛘撸删w展示技術(shù)(McCafferty等人，(1990)Nature 348:552-553)可以用于從來自未免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫，在體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。

可以通過常規(guī)方法制備完整抗體(全長(zhǎng)抗體)的抗原結(jié)合片段。例如，通過胃蛋白酶消化抗體分子可以產(chǎn)生F(ab’)2片段，通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵能產(chǎn)生Fab片段。

遺傳工程抗體，如人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體和雙特異性抗體，可以通過如常規(guī)重組技術(shù)生產(chǎn)。在一實(shí)施例中，可用常規(guī)程序(如通過采用能特異結(jié)合于編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的寡核苷酸探針)容易地分離和測(cè)序編碼對(duì)靶抗原特異性的單克隆抗體的DNA。雜交瘤細(xì)胞作為此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，DNA可放入一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染入原本不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的合成。參見如，PCT公開號(hào)WO 87/04462。然后，可以修飾DNA，例如通過采用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列取代同源鼠序列，Morrison等人，(1984)Proc.Nat.Acad.Sc i.81:6851，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列，共價(jià)接合到免疫球蛋白編碼序列。以這種方式，可以制備具有靶抗原結(jié)合特異性的基因工程抗體，如“嵌合”或“雜交”抗體。

用于生產(chǎn)“嵌合抗體”開發(fā)的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。參見如，Morrison等人.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等人.(1984)Nature 312,604和Takeda等.(1984)Nature 314:452。

用于構(gòu)建人源化抗體的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的。參見如，Queen等人，Proc.Na tl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。在一實(shí)施例中，按照本領(lǐng)域中已知的方法，對(duì)非人的親本抗體V_H和V_L的可變區(qū)進(jìn)行三維分子建模分析。接著，使用相同的分子建模分析來鑒定被預(yù)測(cè)對(duì)正確CDR結(jié)構(gòu)的形成重要的框架氨基酸殘基。平行地，使用親本V_H和V_L序列作為搜索查詢，從任何抗體基因數(shù)據(jù)庫來識(shí)別具有與那些非人的親本抗體同源的氨基酸序列的人V_H和V_L鏈。然后選擇人V_H和V_L受體基因。

所選擇的人受體基因內(nèi)的CDR區(qū)可以替換為來自非人的親本抗體或其功能性變體的CDR區(qū)。必要時(shí)，被預(yù)測(cè)在與CDR區(qū)相互作用中重要的母鏈的框架區(qū)域內(nèi)的殘基(見上文描述)，可以用于代替人受體基因內(nèi)的相應(yīng)殘基。

可以通過重組技術(shù)連接編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列和編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，來制備單鏈抗體。優(yōu)選地，在兩可變區(qū)之間加入柔性接頭。或者，可以采用用于生產(chǎn)單鏈抗體描述的技術(shù)(U.S專利號(hào)4,946,778和4,704,692)，從而生產(chǎn)噬菌體scFv文庫，可以采用常規(guī)程序從所述文庫識(shí)別出對(duì)IL-20R1或IL-20R2特異性的scFv克隆。進(jìn)一步篩選陽性克隆從而鑒定抑制IL-20受體活性的那些克隆。

本領(lǐng)域已知和本文描述方法獲得的抗體，可以采用本領(lǐng)域公知的方法來表征。例如，一種方法是識(shí)別抗原結(jié)合的表位，即“表位定位”。本領(lǐng)域有很多方法用于定位和表征蛋白上表位的位置，包括解析抗體-抗原復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)、競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定、基因片段表達(dá)測(cè)定、以及合成肽測(cè)定，這在以下文獻(xiàn)中有描述，例如，在Harlow和Lane,“使用抗體,實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,N.Y.,1999的第11章。在另一個(gè)實(shí)施例中，表位定位可以用于檢測(cè)抗體結(jié)合的序列。表位可以是線性表位，即包含在單段氨基酸中，或由不一定包含在單段(一級(jí)結(jié)構(gòu)線性序列)內(nèi)的氨基酸三維相互作用形成的構(gòu)象表位。可以分離或合成(例如，重組地)不同長(zhǎng)度(如，至少4-6個(gè)氨基酸長(zhǎng))的肽，并用于與抗體的結(jié)合測(cè)定。在另一實(shí)施例中，可以在系統(tǒng)篩選中使用衍生自靶抗原序列的重疊肽并檢測(cè)抗體結(jié)合來確定抗體結(jié)合的表位。根據(jù)基因片段表達(dá)測(cè)定，編碼靶抗原的開放閱讀框被隨機(jī)或通過特定的遺傳構(gòu)建而分段，從而確定抗原的表達(dá)片段與待測(cè)試抗體的反應(yīng)性?；蚱慰梢?，例如，通過PCR產(chǎn)生，然后在體外轉(zhuǎn)錄，并在放射性氨基酸的存在下翻譯成蛋白。然后通過免疫沉淀和凝膠電泳確定抗體與放射性標(biāo)記的抗原片段的結(jié)合。某些表位還可以通過利用噬菌體顆粒(噬菌體文庫)的表面上展示的隨機(jī)肽序列的大文庫來鑒定?；蛘撸梢栽诤?jiǎn)單的結(jié)合測(cè)定中，測(cè)試明確的重疊肽片段文庫與測(cè)試抗體的結(jié)合。在另外的實(shí)施例中，可以進(jìn)行抗原結(jié)合域誘變、結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)和丙氨酸掃描誘變，從而識(shí)別表位定位所需的、足夠的和/必須的殘基。例如，可以使用靶抗原突變體進(jìn)行結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)，靶抗原突變體中IL-20多肽的多個(gè)片段已被衍生自密切相關(guān)的但抗原性不同的蛋白(如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白家族另一成員)的序列所取代(交換)。通過評(píng)估抗體與突變IL-20的結(jié)合，可以評(píng)價(jià)特定抗原片段對(duì)于抗體結(jié)合的重要性。

或者，可以使用已知結(jié)合于相同抗原的其他抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，從而測(cè)定抗體是否如其他抗體那樣結(jié)合于相同表位。競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

其他IL-20拮抗劑

除了上述能干擾IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗體之外的IL-20拮抗劑，可以用于本文描述的方法。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑包括至少一反義核酸分子，該反義核酸分子能阻斷或減少功能性IL-20(如人IL-20)或IL-20受體亞基(如IL-20R1)的表達(dá)。IL-20和IL-20受體亞基的核苷酸序列是已知的且容易從公開的數(shù)據(jù)庫獲得。參見上文公開內(nèi)容。制備特異性結(jié)合靶mRNA而不與其他多核苷酸交叉反應(yīng)的反義寡核苷酸分子是常規(guī)的。示例性的靶位包括但不限于，起始密碼子，5’調(diào)節(jié)區(qū)，編碼序列和3’非翻譯區(qū)。在一些實(shí)施方式中，寡核苷酸約10-100個(gè)核苷酸長(zhǎng)，約15至50個(gè)核苷酸長(zhǎng)，約18至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)，或更長(zhǎng)。寡核苷酸可以包括骨架修飾，如，例如，本領(lǐng)域公知的硫代磷酸酯鍵，和2’-0糖修飾。

或者可以采用基因敲除、嗎啉代寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA或RNAi)、微小RNA或核糖酶，來降低IL-20/IL-20R表達(dá)和/或釋放，這些方法是本領(lǐng)域公知的。RNA干擾(RNAi)是一種方法，其中dsRNA指導(dǎo)信使RNA的同源序列特異性降解。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可通過小干擾RNA(siRNA)的21-核苷酸雙鏈體引發(fā)RNAi，而不激活宿主的干擾素響應(yīng)。用于本文公開方法中的dsRNA可以是siRNA(包含兩個(gè)獨(dú)立和互補(bǔ)的RNA鏈)或短發(fā)夾RNA(即，形成緊密發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA鏈)，可以基于靶基因序列來設(shè)計(jì)這兩者。或者，它可以是微小RNA。

任選地，如上述本文描述方法中待用的核酸分子(如，反義核酸，小干擾RNA或微小RNA)，可包含非天然存在的核糖堿基、糖、或核苷間共價(jià)鍵(骨架)。這樣修飾的寡核苷酸，可賦予期望的性質(zhì)，例如增強(qiáng)的細(xì)胞吸收，改進(jìn)的與靶核酸的親和力，和增加的體內(nèi)穩(wěn)定性。

在一實(shí)施例中，核酸具有修飾的骨架，包括保留磷原子的那些骨架(參見如，美國(guó)專利3,687,808、4,469,863、5,321,131、5,399,676和5,625,050)和不具有磷原子的那些骨架(參見如，美國(guó)專利5,034,506、5,166,315和5,792,608)。含磷修飾骨架的實(shí)例包括但不限于：具有3’-5’連接鍵或2’-5’連接鍵的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亞烷基膦酸酯、5’-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒磷酸酯(selenophosphates)和硼磷酸酯(boranophosphates)。這些骨架也包括具有相反極性即3’-3’、5’-5’或2’-2’連接鍵的那些。不包括磷原子的修飾骨架由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成。這樣的骨架包括：具有嗎啉代鍵(部分從核苷的糖部分形成)的那些骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜的骨架；富馬酰(formacetyl)和硫代富馬酰(thioformacetyl)骨架；亞甲基富馬酰和硫代富馬酰骨架；核糖乙酰(riboacetyl)骨架；含烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨和亞甲基肼骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架和具有混合的N、O、S和CH₂組成部分的其他骨架。

在另一實(shí)施例中，在公開方法中使用的核酸包括一種或多種取代的糖部分。該取代的糖部分在它們的2’位可以包括以下基團(tuán)之一：OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在這些基團(tuán)中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁-C₁₀烷基或C₂-C₁₀-烯基和炔基。它們?cè)谒鼈兊?’位還可以包括雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、用于改善寡核苷酸藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或用于改善寡核苷酸藥效性質(zhì)的基團(tuán)。優(yōu)選的取代的糖部分包括具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基氨氧乙氧基和2’-二甲基氨乙氧基乙氧基的那些。參見Martin等人，Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。

在又一實(shí)施例中，核酸包括一個(gè)或多個(gè)修飾的天然核酸堿基(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。修飾的核酸堿基包括在以下文獻(xiàn)中描述的那些：美國(guó)專利3,687,808；聚合物科學(xué)和工程簡(jiǎn)明百科,第858-859頁,Kroschwitz,J.I.編輯，約翰威利父子公司,1990；Englisch等人，應(yīng)用化學(xué),國(guó)際版,1991,30,613和Sanghvi,Y.S.,第15章,反義研究和應(yīng)用,第289-302頁,CRC出版社,1993。這些核酸堿基中的某些對(duì)增加反義寡核苷酸與其靶核酸的結(jié)合親和力是特別有用的。這些包括5-取代嘧啶，6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和O-6取代嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。參見Sanghvi,等人，eds.,反義研究和應(yīng)用,CRC出版社,Boca Raton,1993,第276-278頁。

可以通過本領(lǐng)域中已知的方法合成任何核酸。參見如，Caruthers等人，1992,酶學(xué)方法211,3-19,Wincott等人，1995,核酸研究.23,2677-2684,Wincott等人，1997,分子生物學(xué)方法.74,59,Brennan等人，1998,生物技術(shù)生物工程,61,33-45和Brennan,美國(guó)專利號(hào)6,001,311。也可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄并分離。

在其他實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑包括至少一種IL-20或IL-20R抑制性化合物。如本文所用，“IL-20抑制性化合物”或“IL-20R抑制性化合物”是指除抗IL-20或抗IL-20R抗體之外的直接或間接地降低、抑制、中和、或消除IL-20/IL-20R生物活性的化合物。IL-20/IL-20R抑制性化合物應(yīng)該表現(xiàn)出以下任何一個(gè)或多個(gè)特征：(a)結(jié)合IL-20或IL-20R并抑制它的生物活性和/或IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游通路；(b)預(yù)防、改善或治療炎性疼痛的任何方面；(c)阻斷或降低IL-20受體活化；(d)增加IL-20或IL-20R的清除；(e)抑制(減少)IL-20或IL-20R合成、產(chǎn)生或釋放。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備其它小分子抑制化合物。

在一些實(shí)施方式中，IL-20或IL-20R抑制性化合物是IL-20突變體、IL-19突變體或IL-24突變體，其可以結(jié)合IL-20受體但不誘發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種突變體可以阻斷野生型IL-20結(jié)合至IL-20受體，從而阻止IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在其他實(shí)施方式中，本文描述的IL-20或IL-20R抑制化合物是小分子，其分子量可以為約100至20,000道爾頓、500至15,000道爾頓、或1000至10000道爾頓中任一種。小分子庫是市售的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方式施用小分子，包括吸入、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、口服、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或經(jīng)皮。通常，當(dāng)本發(fā)明的IL-20-拮抗劑是小分子時(shí)，它將以0.1至300毫克/千克患者體重的比率分為一到三個(gè)或更多劑量施用。對(duì)于正常體重的成年患者，可以施用每劑1毫克至5克的劑量。

以上提及的小分子可以從化合物庫中獲得。該庫可以是空間可尋址(spatially addressable)的平行固相或溶液相庫。參見如，Zuckermann等人.J.Med.Chem.37,2678-2685,1994和Lam Anticancer Drug Des.12:145,1997。合成化合物庫的方法是本領(lǐng)域公知的，如，DeWitt等人.PNAS USA90:6909,1993；Erb等人.PNAS USA 91:11422,1994；Zuckermann等人.J.Med.Chem.37:2678,1994；Cho等人.科學(xué)261:1303,1993；Carrell等人.Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994；Carell等人.Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994和Gallop等人.J.Med.Chem.37:1233,1994。化合物庫可存在于溶液中(如，Houghten Biotechniques 13:412-421,1992)，或在珠(Lam Nature 354:82-84,1991)、芯片(Fodor Nature 364:555-556,1993)、細(xì)菌(美國(guó)專利號(hào)5,223,409)、孢子(美國(guó)專利號(hào)5,223,409)、質(zhì)粒(Cull等.PNAS USA 89:1865-1869,1992)，或噬菌體(Scott和Smith科學(xué)249:386-390,1990；Devlin科學(xué)249:404-406,1990；Cwirla等.PNAS USA 87:6378-6382,1990；Felici，J.Mol.Biol.222:301-310,1991和美國(guó)專利號(hào)5,223,409)上。

在其他實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑可以是包含IL-20受體(如IL-20R1、IL-20R2或IL-22R1)的胞外部分的多肽，其中多肽特異性結(jié)合于IL-20并阻斷它和一個(gè)或多個(gè)IL-20受體的相互作用。在一些實(shí)施方式中，IL-20受體的胞外部分融合到抗體的Fc結(jié)構(gòu)域。PCT WO 01/46232中描述了可溶性受體的實(shí)例。

IL-20拮抗劑的鑒定

可以使用本領(lǐng)域已知的方法，通過檢測(cè)和/或測(cè)量IL-20生物活性的降低、改善或中和，來鑒定或表征IL-20拮抗劑。例如，ELISA型試驗(yàn)適合用于通過檢測(cè)通過IL-20級(jí)聯(lián)活化的蛋白的磷酸化，來定性或定量檢測(cè)IL-20介導(dǎo)的激酶激活。實(shí)例包括JNK、ERK、AKT、p38、STAT3和TRAF6。

也可以通過孵育候選試劑和IL-20或IL-20R并監(jiān)測(cè)以下任何一個(gè)或多個(gè)特征來鑒定IL-20拮抗劑：(a)結(jié)合于IL-20或IL-20R并抑制它的生物活性和/或IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游通路；(b)預(yù)防、改善或治療炎性疼痛的任何方面；(c)阻斷或降低IL-20受體的活化；(d)增加IL-20或IL-20R的清除；(e)抑制(減少)IL-20或IL-20R合成、產(chǎn)生或釋放。在一些實(shí)施方式中，通過孵育候選試劑和IL-20或IL-20R并監(jiān)測(cè)結(jié)合以及伴隨的IL-20或IL-20R生物活性的下降或中和，來鑒定IL-20拮抗劑?？梢圆捎眉兓腎L-20或IL-20R多肽、或用天然表達(dá)的或轉(zhuǎn)染并表達(dá)的細(xì)胞，進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。在一實(shí)施方式中，結(jié)合試驗(yàn)是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，其中對(duì)候選抗體與已知IL-20拮抗劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-20或IL-20R的能力進(jìn)行評(píng)估?？梢砸愿鞣N形式，包括ELISA形式進(jìn)行該測(cè)定。在其他實(shí)施方式中，通過孵育候選試劑和IL-20或IL-20R(如，IL-20R1)，并監(jiān)測(cè)伴隨的IL-20R1/IL-20R2復(fù)合物形成或IL-20R2/IL-22R1復(fù)合物形成的抑制，來鑒定IL-20拮抗劑。在初步鑒定后，可以通過已知測(cè)試靶標(biāo)生物活性的生物試驗(yàn)來進(jìn)一步確定并完善候選IL-20拮抗劑的活性。或者，可以采用生物試驗(yàn)直接篩選候選物。

以下提供的實(shí)施例提供可以用于篩選候選IL-20拮抗劑的一些方法。生物試驗(yàn)包括但不限于：在候選IL-20拮抗劑存在下，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-20到細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，以及腎上皮細(xì)胞內(nèi)L-20誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制。此外，RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR可以用于直接檢測(cè)IL-20表達(dá)或檢測(cè)IL-20上調(diào)的基因如TNFα、MCP-1、IL-1β、IL-6和VEGF的表達(dá)。

藥物組合物

一種或多種上述IL-20拮抗劑可以與藥學(xué)上可接受的載體(賦形劑)(包括緩沖液)混合，從而形成用于緩解炎性疼痛的藥物組合物。“可接受的”是指載體必須與組合物的活性組分相容(優(yōu)選地，能夠穩(wěn)定活性組分)并對(duì)于待治療的對(duì)象無害。包括緩沖液的藥學(xué)上可接受的賦形劑(載體)是本領(lǐng)域已知的。參見如，Remington:藥劑學(xué)科學(xué)和實(shí)踐(The Science and Practice of Pharmacy),第20版.(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover。在一實(shí)施例中，本文描述的藥物組合物包含一種以上識(shí)別靶抗原不同表位的抗IL-20或抗IL-20R抗體。在另一實(shí)施例中，藥物組合物包括至少兩種不同類型的IL-20拮抗劑(如，一抗體和一小分子)。

用于本發(fā)明的藥物組合物可以包括這些在本領(lǐng)域公知凍干制劑或水性溶液形式中的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。(Remington:藥劑學(xué)科學(xué)和實(shí)踐(The Science and Practice of Pharmacy),第20版.(2000)Lippincott Williams和Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度下對(duì)接受者是無毒的，可以包含緩沖液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲芐基氯化銨；氯化六甲雙銨(hexamethonium chloride)；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚，丁基或芐基醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇，和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或右旋糖酐；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬配合物(如Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN^TM,PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。本文進(jìn)一步描述藥學(xué)上可接受的賦形劑。

在一些實(shí)施例中，本文描述的藥物組合物包括：包含IL-20拮抗劑(如抗體)的脂質(zhì)體，可以通過本領(lǐng)域已知的如Epstein,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)和美國(guó)專利號(hào)4,485,045和4,544,545中描述的方法制備。具有增強(qiáng)的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體，在美國(guó)專利號(hào)5,013,556中被公開?？梢酝ㄟ^反相蒸發(fā)法，采用包括磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物，來生成特別有用的脂質(zhì)體。通過特定孔徑的濾器擠出脂質(zhì)體，從而獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。

活性組分(如，IL-20拮抗劑，例如本文描述的抗IL-20抗體或抗IL-20R抗體)也可以包封在微囊(例如，通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微囊，分別例如羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)中或微乳液中。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見如，Remington,藥劑學(xué)科學(xué)和實(shí)踐(The Science and Practice of Pharmacy),第20版,麥克出版社(Mack Publishing)(2000)。

在其他實(shí)施例中，本文描述的藥物組合物可以配制成持續(xù)釋放形式。合適的持續(xù)釋放制劑包括：包含抗體的固態(tài)疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，其中基質(zhì)是定型產(chǎn)品形式，例如，薄膜或微囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯，水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919)，L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)，乙酸異丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

要用于體內(nèi)施用的藥物組合物必須是無菌的。這可容易地通過例如無菌過濾膜過濾完成。治療性抗體組合物通常置于具有無菌存取口的容器中，例如，靜脈內(nèi)溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的小瓶。

本文描述的藥物組合物可以是單位劑型，如片劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、溶液或懸浮液、或栓劑，用于口服，腸胃外或直腸給藥，或通過吸入或吹入施用。

為了制備固體組合物如片劑，主要的活性組分可以與藥物載體混合，所述藥物載體如常規(guī)的片劑成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠(gums)、和其它藥物稀釋劑，例如水，以形成含有本發(fā)明化合物或其無毒的藥學(xué)上可接受的鹽的均勻混合物的固體預(yù)制劑組合物。當(dāng)提及這些預(yù)制劑組合物為均勻時(shí)，是指活性組分在整個(gè)組合物中均勻分散，使得組合物可以容易地再分成等效的單位劑型，如片劑、丸劑和膠囊劑。然后將這種固體預(yù)制劑組合物再分成含有0.1至500毫克本發(fā)明活性組分的上述類型的單位劑型。新型組合物的片劑或丸劑可以被包衣或者另外復(fù)合以提供具有延長(zhǎng)作用優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑或丸劑可以包括內(nèi)劑量和外劑量組分，后者是包裹前者的形式。兩組分可以通過腸溶層分開，腸溶層用于抵抗胃內(nèi)崩解并使內(nèi)組分完整進(jìn)入十二指腸或被延遲釋放。多種材料可用于這樣的腸溶層或包衣，此類材料包括許多聚合酸和聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇和醋酸纖維素等材料的混合物。

合適的表面活性劑包括，特別是，非離子表面活性劑，如聚乙二醇山梨聚糖(例如Tween^TM.20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如Span^TM.20、40、60、80或85)。具有表面活性劑的組合物可常規(guī)地包括0.05-5％的表面活性劑，可以為0.1-2.5％。應(yīng)理解，可以加入其它成分，例如甘露醇或其它藥學(xué)上可接受的載體，如果需要的話。

合適的乳液可使用市售的脂肪乳劑，例如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM和Lipiphysan^TM來制備?；钚越M分可以或者溶解在預(yù)混合乳液組合物中，或者也可以溶解在油(如大豆油，紅花油，棉籽油，芝麻油，玉米油或杏仁油)以及與磷脂(如卵磷脂，大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合就可形成的乳液中。應(yīng)理解，可以加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以調(diào)整該乳液的張力。合適的乳液通常含有至多20％的油，例如，5至20％。脂肪乳劑可包含0.1-1.0.im，特別是0.1-0.5.im的脂肪滴，pH為5.5-8.0的范圍。

乳液組合物可以是通過將IL-20拮抗劑與Intralipid^TM或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制備的那些。

用于吸入或吹入的藥物組合物，包括在藥學(xué)上可接受的水性或有機(jī)溶劑或它們的混合溶劑中的溶液和懸浮液，以及粉劑。液體或固體組合物可含有合適的上述藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實(shí)施方式中，通過口服或鼻吸途徑施用組合物以達(dá)到局部或全身效果。

在優(yōu)選無菌的藥學(xué)上可接受的溶劑中的組合物，可以通過使用氣體來霧化。霧化的溶液可以直接從霧化設(shè)備吸入，或霧化設(shè)備可以接到面罩、帳幕或間歇正壓呼吸機(jī)?？梢詮囊赃m當(dāng)?shù)姆绞竭f送制劑的設(shè)備施用溶液、懸浮液或粉末組合物，優(yōu)選口服或經(jīng)鼻。

IL-20拮抗劑用于治療炎性疼痛

為了實(shí)施本文公開的方法，將有效量的上述藥物組合物通過合適的途徑施用于需要治療的對(duì)象(如人)，如靜脈內(nèi)給藥，如作為大藥丸，或通過連續(xù)輸注一段時(shí)間，通過肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦脊髓內(nèi)，皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜內(nèi)，鞘內(nèi)，口服，吸入或局部途徑。市售的液體制劑噴霧器，包括噴射噴霧器和超聲噴霧器對(duì)于給藥是有用的。液體制劑可以直接霧化，凍干粉可重構(gòu)后進(jìn)行霧化。或者，可以使用氟碳制劑和計(jì)量劑量吸入器來氣霧化IL-20拮抗劑，或作為凍干和研磨的粉末吸入。

待用本發(fā)明方法治療的對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人。哺乳動(dòng)物包括，但不限于：農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，運(yùn)動(dòng)動(dòng)物，寵物，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，馬，狗，貓，小鼠和大鼠。需要治療的人類對(duì)象是患有疼痛的人。疼痛是與實(shí)際或潛在的組織損傷相關(guān)的不愉快的感覺和情緒體驗(yàn)。它是許多疾病的主要癥狀，可以顯著影響一個(gè)人的生活質(zhì)量。疼痛包括急性或傷害性疼痛和慢性疼痛，急性或傷害性疼痛是通過物理傷害對(duì)周圍神經(jīng)纖維的刺激引起的；慢性疼痛包括炎癥性疼痛、神經(jīng)性疼痛、和病理性疼痛。

在一些實(shí)施例中，如本文所述的任何方法的治療對(duì)象是患有炎性疼痛(也被稱為炎性傷害性疼痛)的病人。炎性疼痛與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)引起的組織損傷有關(guān)。炎性疼痛包括，但不限于：急性炎癥或慢性炎癥引起的神經(jīng)疾病疼痛，急性炎癥或慢性炎癥引起的缺血性疼痛，與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎性疼痛，急性炎癥或慢性炎癥引起的肌肉疼痛，急性炎癥、慢性炎癥或化療引起的神經(jīng)痛。

在其它實(shí)施例中，如本文所述的任何方法的治療對(duì)象是患有神經(jīng)性疼痛的病人，所述神經(jīng)性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)(包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng))中神經(jīng)元的損傷引起的。在某些情況下，神經(jīng)性疼痛也可以由慢性或急性炎癥引起?；蛘?，所述對(duì)象也可以患有病理性疼痛，這是一種由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能異常如功能失調(diào)所導(dǎo)致的疾病狀態(tài)，例如纖維肌痛、腸易激綜合癥、緊張型頭痛、與神經(jīng)病相關(guān)的疼痛等。

如本文所用，“有效量”是指賦予對(duì)象治療效果所需的各活性劑的量，所述各活性劑或者單獨(dú)使用或者與一種或多種其它活性劑組合使用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，根據(jù)治療的具體病況，病況的嚴(yán)重程度，個(gè)體患者參數(shù)包括年齡、身體狀況、身高、性別和體重，治療的持續(xù)時(shí)間，并行治療的性質(zhì)(如果有的話)，給藥的具體途徑和保健醫(yī)生知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)范圍內(nèi)的類似因素，有效量可以改變。這些因素對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來說是公知的，可以用不超過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來解決。通常優(yōu)選的是使用最大劑量的各組分或它們的組合，也就是基于合理醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。但本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將會(huì)理解，出于醫(yī)學(xué)原因、心理原因或?qū)嶋H上任何其他原因，患者可能堅(jiān)持要求較低劑量或可耐受的劑量。

經(jīng)驗(yàn)的考慮，如半衰期，通常將有助于劑量的確定。例如，與人免疫系統(tǒng)相容的抗體，如人源化抗體或完全人抗體，可以用于延長(zhǎng)抗體的半衰期并防止抗體被人免疫系統(tǒng)攻擊?？梢源_定給藥頻率并在治療期間，通常但不必須，根據(jù)炎性疼痛的治療和/或抑制和/或改善和/或延遲進(jìn)行調(diào)整?；蛘?，IL-20拮抗劑的持續(xù)釋放制劑可能是合適的。實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放的各種制劑和裝置是本領(lǐng)域已知的。

在一實(shí)施例中，對(duì)于已經(jīng)給予一次或多次的IL-20拮抗劑施用的個(gè)體，可以經(jīng)驗(yàn)性地確定本文描述的IL-20拮抗劑的劑量?？山o予個(gè)體遞增劑量的拮抗劑。為評(píng)價(jià)拮抗劑的效力，可以關(guān)注炎性疼痛的指標(biāo)(如痛覺超敏)。

通常，為施用本文描述的任何抗體，初始候選劑量可以是約2mg/kg。出于本公開內(nèi)容的目的，典型的日劑量可以是從約0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或更高的范圍，取決于上文提及的因素。對(duì)于在幾天或更長(zhǎng)時(shí)間中的反復(fù)給藥，取決于病情，治療是持續(xù)的直到出現(xiàn)所需的癥狀被抑制或直到獲得足夠的治療水平從而減輕炎性疼痛，或其癥狀。典型的劑量方案包括：施用初始劑量為約2mg/kg，隨后每周抗體維持劑量為約1mg/kg，或隨后每隔一周抗體維持劑量為約1mg/kg。但是，其他劑量方案可以是有用的，取決于醫(yī)生希望獲得的藥代動(dòng)力學(xué)衰減模式。例如，計(jì)劃一周1-4次的劑量。在一些實(shí)施方式中，可以使用約3μg/mg-約2mg/kg(如約3μg/mg、約10μg/mg、約30μg/mg、約100μg/mg、約300μg/mg、約1mg/kg和約2mg/kg)的劑量范圍。在一些實(shí)施方式中，給藥劑量頻率是每天、每周、每2周、每4周、每8周、每2月或每3月或更長(zhǎng)時(shí)間一次。通過常規(guī)技術(shù)和分析，容易監(jiān)測(cè)該治療進(jìn)程。劑量方案(包括使用的抗體)可以隨時(shí)間改變。

當(dāng)IL-20拮抗劑不是抗體時(shí)，可以以約0.1-300mg/kg患者體重的比率分為1-3個(gè)劑量施用，或如本文所公開的。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于正常體重的成年患者，可以施用的劑量范圍為約0.3-5.00mg/kg。特定的劑量方案，即劑量、時(shí)間設(shè)置和重復(fù)，將取決于特定的個(gè)體、個(gè)體的醫(yī)療史以及個(gè)別藥劑的性質(zhì)(如藥劑的半衰期和本領(lǐng)域已知的其他考慮因素)。

出于本公開的目的，IL-20拮抗劑的適當(dāng)劑量將取決于采用的具體IL-20拮抗劑(或其組合物)、炎性疼痛的類型和嚴(yán)重程度、施用拮抗劑是否用于預(yù)防或治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對(duì)拮抗劑的響應(yīng)、以及主治醫(yī)師的判斷。通常臨床醫(yī)師會(huì)施用IL-20拮抗劑，例如抗IL-20或抗IL-20R抗體，直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)期望結(jié)果的劑量。IL-20拮抗劑的施用可以是連續(xù)的或間歇性的，這取決于，例如，接受者的生理?xiàng)l件，施用目的是治療性還是預(yù)防性，和本領(lǐng)域技術(shù)從業(yè)者所知的其他因素。IL-20拮抗劑(例如如果IL-20拮抗劑是抗IL-20抗體)的施用，可以是在一段預(yù)選的時(shí)間中基本上連續(xù)或可以是一系列間隔劑量，如，在發(fā)生炎性疼痛之前、期間或之后。

如本文所用，術(shù)語“治療”是指將包括一種或多種活性劑的組合物應(yīng)用或施用于對(duì)象，其中所述對(duì)象患有炎性疼痛、有炎性疼痛癥狀或易感該疾病，從而治病、治愈、緩解、減輕、改變、矯正、緩解、改善或影響炎性疼痛、炎性疼痛的癥狀或?qū)ρ仔蕴弁吹囊赘行浴?/p>

在一些實(shí)施方式中，本文描述的IL-20拮抗劑(如，抗IL-20抗體或抗IL-20R抗體，如抗IL-20R1抗體)，以足以緩解疼痛的量被施用于需要治療的對(duì)象。

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知的常規(guī)方法，根據(jù)要治療的疾病/病情類型或疾病/病情的部位，可用于將藥物組合物給予對(duì)象。該組合物也可以通過其他常規(guī)途徑給藥，如通過口服、腸胃外給藥、通過吸入噴霧、局部、直腸、經(jīng)鼻、頰、陰道或通過植入的容器給藥。術(shù)語“腸胃外”用于本文包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。此外，它可以通過可注射的儲(chǔ)器(depot)途徑來給予對(duì)象，例如使用1、3或6個(gè)月的可注射或可生物降解的材料和方法。

可注射組合物可包含各種載體，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇，液態(tài)聚乙二醇等)。對(duì)于靜脈內(nèi)注射，水溶性抗體可以通過滴注方法給藥，由此輸注含有抗體和生理學(xué)上可接受的賦形劑的藥物制劑。生理學(xué)上可接受的賦形劑可包括，例如，5％葡萄糖、0.9％生理鹽水、林格氏溶液或其他合適的賦形劑。肌內(nèi)制劑，例如，抗體的合適的可溶鹽形式的無菌制劑，可以溶解在藥用賦形劑如注射用水、0.9％生理鹽水、或5％葡萄糖溶液中，并進(jìn)行給藥。

在一實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑通過位點(diǎn)特異性或靶向局部遞送技術(shù)進(jìn)行給藥。位點(diǎn)特異性或靶向局部遞送技術(shù)的實(shí)例包括：IL-20拮抗劑的各種可植入的儲(chǔ)器源(depot sources)或局部輸送導(dǎo)管、如輸液導(dǎo)管、留置導(dǎo)管、或針導(dǎo)管、合成移植物、外膜包裹、分流器和支架或其他可植入裝置、位點(diǎn)特異性載體、直接注射、或直接應(yīng)用。參見如，PCT公開號(hào)WO 00/53211和美國(guó)專利號(hào)5,981,568。

也可以使用包含反義多核苷酸、表達(dá)載體、或亞基因組多核苷酸的治療組合物的靶向遞送。受體介導(dǎo)的DNA遞送技術(shù)在例如以下文獻(xiàn)中有描述：Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11:202；Chiou等人，“基因療法：直接基因轉(zhuǎn)移的方法的應(yīng)用(Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)”(J.A.Wolff,編輯)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263:621；Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269:542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266:338。包含多核苷酸的治療組合物在基因治療方案中以約100ng到約200mgDNA的量用于局部給藥。在一些實(shí)施方式中，在基因治療方案期間，也可以使用約500ng-約50mg、約1μg-約2mg,約5μg-約500μg和約20μg-約100μgDNA或更高的濃度范圍。

可以使用基因遞送載體遞送本文描述的治療性多核苷酸和多肽?；蜻f送載體可以是病毒或非病毒來源的(通常參見Jolly,癌癥基因治療(1994)1:51；Kimura,人基因治療(1994)5:845；Connelly,人基因治療(1995)1:185和Kaplitt,自然遺傳學(xué)(1994)6:148)。可以使用內(nèi)源哺乳動(dòng)物或異源啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子誘導(dǎo)這樣的編碼序列的表達(dá)。編碼序列的表達(dá)可以是組成型或調(diào)控型。

用于遞送所需多核苷酸并在所需細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的病毒基載體是本領(lǐng)域已知的。示例性的病毒基載體包括但不限于：重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(參見如，PCT公開號(hào)WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、U.S專利號(hào)5,219,740和4,777,127、GB專利號(hào)2,200,651和EP專利號(hào)0345242)，甲病毒基載體(如，辛德畢斯(Sindbis)病毒載體，塞姆利基(Semliki)森林病毒(ATCC VR-67，ATCC VR-1247)，羅斯河(Ross River)病毒(ATCC VR-373，ATCC VR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923，ATCC VR-1250，ATCC VR 1249，ATCC VR-532))和腺相關(guān)病毒(AAV)載體(參見如，PCT公開號(hào)WO 94/12649，WO 93/03769，WO 93/19191，WO 94/28938，WO 95/11984和WO 95/00655)。也可以使用如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147中描述的連接到滅活腺病毒的DNA進(jìn)行給藥。

也可以使用非病毒遞送載體和方法，包括但不限于：連接或未連接到單獨(dú)的滅活腺病毒的聚陽離子縮合DNA(參見如，Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)，配體連接的DNA(參見如，Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)，真核細(xì)胞遞送載體細(xì)胞(參見如，美國(guó)專利號(hào)5,814,482，PCT公開號(hào)WO 95/07994，WO 96/17072，WO 95/30763和WO 97/42338)和核電荷中和或與細(xì)胞膜融合。也可以采用裸DNA。典型的裸DNA導(dǎo)入方法在PCT公開號(hào)WO 90/11092和美國(guó)專利號(hào)5,580,859中有描述。可以作為基因遞送載體的脂質(zhì)體在美國(guó)專利號(hào)5,422,120，PCT公開號(hào)WO 95/13796，WO 94/23697，WO 91/14445和EP專利號(hào)0524968中有描述。其他方法在Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581中有描述。

顯然，表達(dá)載體可用于指導(dǎo)本文描述的任何蛋白類的IL-20拮抗劑(如，抗IL-20抗體或抗IL-20R抗體)的表達(dá)。例如，能阻斷(從部分到完全阻斷)IL-20和/或IL-20生物活性的其他IL-20受體片段是本領(lǐng)域已知的。

本文描述方法中使用的具體的給藥方案，即劑量、時(shí)間設(shè)置和重復(fù)，將取決于具體的對(duì)象和對(duì)象的醫(yī)療史。

在一些實(shí)施方式中，多于一種IL-20拮抗劑，如抗體和小分子IL-20抑制化合物，可以給予需要治療的對(duì)象。拮抗劑可以是相同類型或彼此不同。至少一、至少二、至少三、至少四、至少五種不同的IL-20拮抗劑可以共同給藥。通常，這些IL-20拮抗劑具有不會(huì)產(chǎn)生不利相互影響的互補(bǔ)活性。IL-20拮抗劑也可以與用于增強(qiáng)和/或補(bǔ)足藥劑有效性的其他藥劑聯(lián)用。

在一些實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑例如抗IL-20抗體或抗IL20R1抗體，可以與治療劑(例如化療劑)聯(lián)用，以緩解由治療劑引起的疼痛(如化療引起的外周神經(jīng)病變)。有效量的所述IL-20拮抗劑和有效量的治療劑可共同給予需要所述治療的人類癌癥患者。可能引起外周神經(jīng)病的化療劑包括，但不限于：鉑藥物如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑；紫杉烷類，包括紫杉醇，多西紫杉醇，和卡巴他賽；埃坡霉素，如伊沙匹隆；植物生物堿，如長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春瑞濱，和依托泊苷(VP-16)；沙利度胺，來那度胺和泊馬度胺；硼替佐米和卡非佐米；和艾日布林(Eribulin)。因此，本文所述的任一IL-20拮抗劑(例如抗IL-20抗體或抗IL20-R1抗體)可以與那些化療劑聯(lián)用，以緩解由其引起的外周神經(jīng)病。

“共同施用”或“聯(lián)合給藥”是指以在時(shí)間上相關(guān)聯(lián)的方式，將兩種或多種藥施用于受試者/治療對(duì)象，聯(lián)合給藥可以通過在相同的劑型中提供兩種或多種藥物，從而進(jìn)行合用?；蛘?，聯(lián)合用藥包含以不同的劑型服用兩種或多種藥物，但是在指定的周期內(nèi)，例如在1周內(nèi)，1天內(nèi)，或在1小時(shí)內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑可以被施用到人類癌癥患者，在其被觀察到發(fā)展中的由化療劑引起的神經(jīng)病之后。

可以通過本領(lǐng)域公知的方法評(píng)價(jià)治療功效，如監(jiān)控治療中的患者所經(jīng)歷的疼痛水平，和/或治療中的患者體內(nèi)的炎性細(xì)胞因子水平。

用于緩解疼痛的試劑盒

本發(fā)明還提供用于緩解疼痛例如炎性疼痛的試劑盒。該試劑盒可以包括包含IL-20拮抗劑(如抗體，如mAb7E或其功能性變體，mAb7GW或其功能性變體，或mAb51D或其功能性變體)的一個(gè)或多個(gè)容器。在一些實(shí)施方式中，IL-20拮抗劑是本文描述的能干擾IL-20信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的任何抗體。在其他實(shí)施方式中，試劑盒包含IL-20拮抗劑，所述拮抗劑是除了剛剛提到的抗體之外的拮抗劑。

在一些實(shí)施方式中，試劑盒可以包括用于根據(jù)本文描述的任何方法的說明書。所包括的說明書可包括：對(duì)根據(jù)本文所述任何方法給予IL-20拮抗劑以治療、延遲發(fā)作或緩解疼痛的描述。試劑盒還可包括基于鑒別個(gè)體是否患有疼痛例如炎性疼痛來選擇適合治療的個(gè)體的描述。

關(guān)于IL-20拮抗劑應(yīng)用的說明書通常包括信息，如用于所需治療的劑量、給藥時(shí)間安排和給藥途徑。容器可以是單位劑量，大包裝(bulk package)(如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本發(fā)明試劑盒內(nèi)提供的說明書通常是寫在標(biāo)簽或包裝插頁(如試劑盒內(nèi)包含的紙頁)上的說明，但機(jī)器可讀的說明(例如，載入磁或光存儲(chǔ)盤上的說明)也是可以接受的。

標(biāo)簽或包裝插頁表明，該組合物用于治療、延遲發(fā)作和/或緩解炎性疼痛。可以為實(shí)施本文所述任何方法提供說明書。

本發(fā)明的試劑盒在合適的包裝中。合適的包裝包括但不限于：小瓶，瓶，廣口瓶，軟包裝(例如密封的聚脂薄膜或塑料袋)和類似包裝。還包括在本發(fā)明內(nèi)的是將包裝與特定設(shè)備組合使用，例如吸入器，經(jīng)鼻給藥裝置(例如，霧化器)或輸液設(shè)備，諸如微型泵。試劑盒可以具有無菌存取口(例如所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有皮下注射針可刺穿的塞子的小瓶)。容器也可以具有無菌存取口(例如所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有皮下注射針可刺穿的塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性試劑是IL-20拮抗劑，例如抗IL-20抗體。

試劑盒可任選地提供額外的組分，例如緩沖液和解釋性信息。通常，試劑盒包括容器和在容器上或與容器相連的標(biāo)簽或包裝插頁。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括上述試劑盒內(nèi)容的制品。

無需進(jìn)一步詳盡說明，據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)上面的描述，利用本發(fā)明至其最大限度。因此，以下具體實(shí)施方式應(yīng)解釋為僅僅是說明性的，并不以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部分。本文引用的所有出版物為提及的目的或內(nèi)容而通過引用并入本文。

實(shí)施例1：在CFA誘導(dǎo)的炎性疼痛小鼠模型上用抗IL-20抗體抑制炎性疼痛

該研究中，使用IRC小鼠(7-10周齡)。在這些小鼠中，炎性疼痛是通過左爪注射10μl完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)產(chǎn)生。機(jī)械異常性疼痛采用馮·弗雷微絲進(jìn)行測(cè)試。用一系列馮弗雷微絲之一，以垂直于足底表面方式按壓爪子，所述一系列馮弗雷微絲具有呈對(duì)數(shù)遞增(0.02-2.56g；立體定位儀(Stoelting))的剛度。每個(gè)微絲在老鼠上按壓1秒。50％撤回(回縮)閾值，是由迪克森的上下法進(jìn)行確定。

抗IL-20抗體mAb7E(10微克)或?qū)φ誌gG抗體(10微克)，通過鞘內(nèi)(IT)或爪(PL)注射至用CFA處理的小鼠。如圖1所示，mAb7E能夠，但I(xiàn)gG對(duì)照不能夠，顯著增加CFA處理小鼠的爪的撤回閾值，這表明CFA誘導(dǎo)的機(jī)械異常性疼痛被抗IL-20抗體mAb7E顯著抑制。另外，如圖2所示，通過鞘內(nèi)注射的抗IL-20抗體mAb7E(從12微克到24微克)，觀察到了劑量依賴性效應(yīng)。

總之，從本研究獲得的結(jié)果證明了抗IL-20抗體的鎮(zhèn)痛效果，這表明IL-20信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制可有效緩解疼痛，如炎性疼痛。

實(shí)施例2：在化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病小鼠模型中抗IL-20抗體的神經(jīng)保護(hù)作用

在該研究中使用C57BL/6小鼠(6周齡，14-15克)。研究方案在圖3中示意性地概述。化學(xué)療法引起的神經(jīng)病變是由給予四次紫杉醇注射(4.5mg/kg)(隔日給藥)引起的。為了測(cè)試體內(nèi)抗IL-20抗體(IL-20抗體)的神經(jīng)保護(hù)效果，在每次注射紫杉醇6h之前，通過腹腔內(nèi)注射抗IL-20抗體(mAb7E；5mg/kg)。在注射紫杉醇或載體前，進(jìn)行每種神經(jīng)測(cè)試的基線測(cè)量，并且在治療后一個(gè)月內(nèi)的每個(gè)星期，記錄4次額外的測(cè)試。機(jī)械異常性疼痛通過電子式的馮弗雷(von Frey)毛進(jìn)行評(píng)估(ALMEMO，德國(guó))。小鼠置于具有絲網(wǎng)平臺(tái)的單個(gè)有機(jī)玻璃容器，每次測(cè)試之前要求馴化30分鐘。鈍端的馮弗雷長(zhǎng)絲被用于向上壓到后爪的表面中間足底5秒鐘或直到發(fā)生撤回(回縮)反應(yīng)，對(duì)左和右后爪分別四次記錄最大壓力響應(yīng)。撤回力是一只老鼠的每次的平均值，并且代表為每次處理中后爪的機(jī)械閾值。尾熱超敏是由尾浸泡法測(cè)定。手持每一只老鼠，將大約1cm尾巴尖浸泡在維持48度的水浴，為鼠撤回它的尾巴的等待時(shí)間進(jìn)行評(píng)分(截止的響應(yīng)是10秒)。

在完成四次注射后，紫杉醇處理的小鼠表現(xiàn)出機(jī)械閾值的急劇下降，即發(fā)展為異常性疼痛(圖4)。研究發(fā)現(xiàn)，這種紫杉醇誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺超敏的過敏癥，可以通過抗IL-20抗體預(yù)處理得到緩解(圖4)。第4周得到的數(shù)據(jù)分析表明，抗IL-20抗體處理對(duì)緩解異常性疼痛(圖5)有顯著效果。

關(guān)于尾部浸漬試驗(yàn)，一段時(shí)間之后，由于學(xué)習(xí)效應(yīng)，小鼠對(duì)熱刺激變得更加敏感。然而，相比于對(duì)照組，紫杉醇處理的小鼠表現(xiàn)出增加的熱響應(yīng)等待時(shí)間，這表明紫杉醇處理誘導(dǎo)了熱閾值的增加(圖6)。用抗IL-20抗體預(yù)處理小鼠表現(xiàn)出與對(duì)照組類似的熱響應(yīng)，這說明抗IL-20抗體拯救了紫杉醇所引起的熱不敏感性(圖6)。對(duì)第四個(gè)星期獲得的數(shù)據(jù)的分析也支持這一觀點(diǎn)(圖7)。

總之，從本研究獲得的結(jié)果表明，抗IL-20抗體針對(duì)由化療劑如紫杉醇引起的神經(jīng)病是具有保護(hù)作用的。

其他實(shí)施方式

本說明書中披露的全部特征可以任何組合方式進(jìn)行組合。在本說明書中公開的每個(gè)特征可由起到相同、等同或類似目的的替代特征所代替。因此，除非另外明確說明，否則公開的每個(gè)特征僅是一般系列的等同或類似特征的一個(gè)例子。

本領(lǐng)域技術(shù)人員從以上描述中容易確定本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下可以對(duì)本發(fā)明作出各種變化和修改以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此其他實(shí)施方式也可在權(quán)利要求范圍內(nèi)。