本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與植物光合作用相關(guān)的CAM01蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物的光合作用幾乎是所有生物生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器。植物胚胎發(fā)育時(shí)期質(zhì)體的發(fā)育及其向葉綠體的轉(zhuǎn)化與胚胎發(fā)生之間有著密切關(guān)系。當(dāng)胚發(fā)育到晚球形期時(shí)，質(zhì)體開始分化形成功能的葉綠體，并通過光合作用為胚的發(fā)育提供能源物質(zhì)。尤其在發(fā)育后期，胚需要儲(chǔ)備足夠的能量和代謝原料以利于種子的萌發(fā)以及幼苗在具備光合能力之前的生長(zhǎng)。此外質(zhì)體合成許多重要的細(xì)胞必需的代謝中間物，如碳骨架、核酸、脂肪酸和氨基酸等，它們參與合成的各種代謝途徑的中間物或終產(chǎn)物，進(jìn)而影響植株整體發(fā)育。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：A1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系不包括繁殖材料。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料的新用途。本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在如下(1)-(5)中至少一種中的應(yīng)用：(1)提高植物葉綠素含量；(2)調(diào)控植物根部發(fā)育；(3)降低植物葉綠體基粒片層數(shù)量；(4)降低植物第一對(duì)真葉的長(zhǎng)寬比；(5)降低植物激素的含量。上述方法中，所述葉綠素具體為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和/或葉綠素a/b；所述植物激素為IAA。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物光合作用中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在培育葉綠素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育葉綠素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育葉綠素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將上述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素含量高于所述受體植物。上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。上述方法中，所述葉綠素為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和/或葉綠素a/b。上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因是通過互補(bǔ)載體pCAMBIA1305-CAM01導(dǎo)入受體植物的。所述互補(bǔ)載體pCAMBIA1305-CAM01為將序列表中序列1所示的DNA分子替換雙元載體pCAMBIA1305的SmaI和NcoI酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持載體pCAMBIA1305的其他序列不變得到的載體。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體為擬南芥。本發(fā)明從擬南芥中發(fā)現(xiàn)一個(gè)與植物光合作用相關(guān)CAM01基因，分析表明：和野生型擬南芥相比，CAM01基因缺失突變體生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、根部發(fā)育停滯、無健全根部，并且新葉有高熒光表型。通過試驗(yàn)證明：CAM01基因參與了葉綠體光合作用蛋白的表達(dá)調(diào)控，高效表達(dá)于心形胚基部，心形胚基部又是胚胎發(fā)生中形成根的部位， 這與突變體的根系發(fā)育缺陷表型相一致，說明CAM01基因通過調(diào)控胚胎發(fā)育進(jìn)而參與了根系發(fā)育的調(diào)控，對(duì)通過轉(zhuǎn)基因途徑、激素調(diào)節(jié)途徑來調(diào)控葉綠體蛋白合成及影響植物體根系發(fā)育具有一定應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為擬南芥突變體cam01和野生型擬南芥在培養(yǎng)基生長(zhǎng)3周后的表型及子葉長(zhǎng)寬比。圖2為擬南芥突變體cam01和野生型擬南芥的葉綠素激發(fā)熒光成像。圖3為擬南芥突變體cam01和野生型擬南芥萌發(fā)10天后的根發(fā)育情況的比較。圖4為擬南芥突變體T-DNA插入的驗(yàn)證結(jié)果。其中，LP，PR和LB為引物。圖5為突變體基因表達(dá)的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果。圖6為突變體植株中CAM01基因組成型表達(dá)的GUS染色分析。圖7為CAM01蛋白的定位分析。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、CAM01基因的獲得一、突變體cam01的發(fā)現(xiàn)及其表型1、突變體cam01的發(fā)現(xiàn)將野生型擬南芥種子(和突變體種子(購(gòu)自擬南芥突變體庫(kù)，編號(hào)為SAIL_564_E05)4℃春化后，分別點(diǎn)播于1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，得到野生型擬南芥植株和突變體植株。與野生型擬南芥植株相比，突變體植株生長(zhǎng)緩慢、植株矮小，根部發(fā)育停滯，無健全根部，分支多、葉心和新葉發(fā)黃，并且有高熒光表型(圖1、圖2和圖3)，將該突變體植株命名為突變體cam01，并將雜合突變體植株命名為HZ，純合突變體植株命名為HM。2、突變體cam01的表型(1)根部發(fā)育觀察生長(zhǎng)10天的野生型擬南芥植株和突變體cam01的根部生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖3所示：和野生型擬南芥植株相比，突變體cam01的根部發(fā)育停滯，無健全根部。(2)長(zhǎng)寬比觀察生長(zhǎng)30天的野生型擬南芥植株和突變體cam01的第一對(duì)真葉的長(zhǎng)寬比，結(jié)果如圖1所示：和野生型擬南芥植株相比，突變體cam01的第一對(duì)真葉的長(zhǎng)寬比明顯提高。(3)葉綠體超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察生長(zhǎng)30天的野生型擬南芥植株和突變體cam01的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：和野生型擬南芥植株相比，突變體cam01的基粒片層明顯增多，基粒間的排列不規(guī)則。3、突變體cam01的分子鑒定以野生型擬南芥植株(WT)、純合突變體cam01(HM)和雜合突變體cam01(HZ)的DNA為模板，分別以LP和RP、LB和RP為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：LP：TTTGTACCTGGCAACCAAATC；RP：TGACATTTTCTCTTCCGTTCG；LB：TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC。結(jié)果如圖4所示：以LP和RP為引物時(shí)，在野生型擬南芥植株(WT)與雜合突變體cam01(HZ)中均都擴(kuò)增出1042bp條帶，而純合突變體cam01(HM)則在對(duì)應(yīng)位置沒有擴(kuò)增出條帶；以LB和RP為引物時(shí)，野生型擬南芥植株(WT)沒有擴(kuò)增出條帶，則在純合突變體cam01(HM)和雜合突變體cam01(HZ)中都可以擴(kuò)增出459bp條帶。說明突變體中確認(rèn)T-DNA插入在CAM01基因內(nèi)。4、突變體cma01的RT-PCR驗(yàn)證以野生型擬南芥植株和突變體cam01的cDNA為模板，分別采用如下引物：RT-F和RT-R、RT1-F和RT1-R、RT2-F和RT2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定突變體中目的基因的轉(zhuǎn)錄情況。以Actin的擴(kuò)增作為一個(gè)內(nèi)參。RT-PCR引物序列如下：RT-F:5'-ATGGCGGGAGTGATTAGGGCTAAG-3'；RT-R:5'-AGTTCAGATTCTGGCCACGAATTC-3'；Actinsense：5’-AACTGGGATGATATGGAGAA-3’；Actinantisense：5’-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3’；RT1-F:5'-ATGGCGGGAGTGATTAGGGCTAAG-3'；RT1-R:5'-CTGCATAGATGACATTCCCAGGTC-3'；RT2-F:5'-ACAATCCTGAAAGAGGGTTTAGTG-3'；RT2-R:5'-CACAACTTCTGAATCACTCTTAAC-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖5所示：結(jié)果表明：對(duì)照基因Actin在野生型擬南芥植株和突變體cam01中均能正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而用三段不同引物擴(kuò)增均只能在野生型中有擴(kuò)增條帶，說明由于T-DNA插入導(dǎo)致CAM01基因不能正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。5、突變體cma01激素含量的測(cè)定分別測(cè)定生長(zhǎng)7天和28天的野生型擬南芥植株(wt)和突變體cam01(cam)中 各個(gè)激素(GA、IAA、ZR、ABA、IPA、BR和JA)含量，激素含量的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)“Mechanismofphytohormoneinvolvementinfeedbackregulationofcottonleafsenescenceinducedbypotassiumdeficiency.JournalofExperimentalBotany,Vol.63,695–709,(2012)。和Comparisonbetweenconventionalindirectcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay(icELISA)andsimplifiedicELISAforsmallmolecules.AnalyticaChimicaActa571(2006)79–85”中的方法。結(jié)果如表1所示：在突變體cma01的生長(zhǎng)后期，IAA的含量較野生型有很大的提高，由此表明CAM01基因的突變引起了生長(zhǎng)素含量的變化，進(jìn)而引起了植物葉形的變化與分支的增多。表1、野生型植株與突變體植株中各個(gè)激素含量二、CAM01基因的獲得以野生型擬南芥的基因組DNA為模板，采用引物cam-NcoI-F3和引物cam-SmaI-R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。并將PCR產(chǎn)物切膠純化后連接T-easy載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR酶切、測(cè)序。引物序列如下：cam-NcoI-F3：CCCCCATGGCAACTTCTGAATCACTC；cam-SmaI-R3:CCCCCCGGGCGGGAGTGATTAGG。測(cè)序結(jié)果表明：PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為PSF基因，PSF基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。三、CAM01蛋白的定位分析1、融合表達(dá)載體的構(gòu)建以序列1所示的CAM01基因插入pPUC18載體(購(gòu)于Taraka公司，貨號(hào)D3218)的SalI和NcoI酶切位點(diǎn)間，得到pPUC18-CAM01-GFP融合表達(dá)載體。2、原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)選擇3-4周的野生型擬南芥幼苗的第5、6、7片真葉，用鋒利的刀片將葉片的中間部分切成0.5-1mm的細(xì)條，放入酶解液中消化，黑暗中消化葉片3-4h，離心原生質(zhì)體，用PEG法將步驟1獲得的pPUC18-CAM01-GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體， 過夜光下培養(yǎng)。3、用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510META，Zeiss)觀察葉肉細(xì)胞中GFP的表達(dá)，觀察時(shí)物鏡放大倍數(shù)為40倍，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，帶通BP505～530nm，長(zhǎng)通LP560nm。結(jié)果如圖7所示：CAM01蛋白定位于葉綠體中。四、CAM01基因組成型分析1、將序列表中序列3所示的CAM01基因的啟動(dòng)子替換pCAMBIA1305載體的SalI和NcoI酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持pCAMBIA1305載體的其他序列不變，得到重組載體。pCAMBIA1305載體含有GUS基因，CAM01基因的啟動(dòng)子位于GUS基因上游。2、將步驟1得到的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105(購(gòu)自上海邁其生物科技有限公司，貨號(hào)CH5002B)中，得到重組菌。3、采用花序滴定法用步驟2獲得的重組菌侵染轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，得到T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥，并采用PCR鑒定的方法篩選陽(yáng)性苗，PCR鑒定的引物如下：camPGUSSalI-F：5'-CCCGTCGACTGTACCTTCCAAGCTAAGAGAACC-3'；camPGUSNcoI-R：5'-CCCCCATGGTAAAAGCTTCTTCTTCTCATGCC-3'。4、GUS基因檢測(cè)檢測(cè)由CAM01基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的GUS基因表達(dá)情況，GUS基因檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)“LeslieE.SieburthetalPlantCell,1997,9,355-365”中的方法。GUS基因表達(dá)染色結(jié)果如圖6所示：其中，a為胚芽、b為子葉及下胚軸、c為蓮座葉、d為花序、e為柱頭、f為花器官、g為胚。從圖中可以看出，GUS基因在不同組織中均有很強(qiáng)表達(dá)。用CAM01基因啟動(dòng)子控制的GUS基因表達(dá)于植株的不同時(shí)期中，說明CAM01基因是一個(gè)持家基因，對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。實(shí)施例2、互不植株的獲得及其葉綠體發(fā)育分析一、互補(bǔ)植株的獲得1、互補(bǔ)載體的構(gòu)建以序列表中序列1所示的CAM01基因?yàn)槟０澹捎胏am-NcoI-F3和cam-SmaI-R3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。引物序列如下：cam-NcoI-F3：5’-CCCCCATGGCGGGAGTGATTAGG-3’；cam-SmaI-R3:5’-CCCCCCGGGCAACTTCTGAATCACTC-3’?；厥誔CR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶SmaI和NcoI雙酶切PCR產(chǎn)物和雙元載體 pCAMBIA1305(雙元載體購(gòu)自Cambia公司，型號(hào)VZC0568)，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、鑒定出含有目的片段的互補(bǔ)載體pCAMBIA1305-CAM01。對(duì)互補(bǔ)載體pCAMBIA1305-CAM01進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明：互補(bǔ)載體pCAMBIA1305-CAM01為將序列表中序列1所示的DNA分子替換雙元載體pCAMBIA1305的SmaI和NcoI酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且保持載體pCAMBIA1305的其他序列不變得到的載體。2、重組菌的獲得將步驟1獲得的互補(bǔ)載體pCAMBIA1305-CAM01導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105(購(gòu)自上海邁其生物科技有限公司，貨號(hào)CH5002B)中，得到重組菌。3、采用花序滴定法用步驟2得到的重組菌侵染轉(zhuǎn)化實(shí)施例1中的擬南芥突變體cam01，培養(yǎng)，得到T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子，將T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子經(jīng)表面滅菌后均勻地播撒于含潮霉素的MS培養(yǎng)基上，一周后將生長(zhǎng)正常的陽(yáng)性苗移入土中生長(zhǎng)，培養(yǎng)，收種子，即得到T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥(擬互補(bǔ)植株)，將表型恢復(fù)的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗挑選出來用于后續(xù)鑒定。4、互補(bǔ)植株的獲得對(duì)表型恢復(fù)的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行PCR鑒定(PCR鑒定的引物cam-NcoI-F3：5’-CCCCCATGGCGGGAGTGATTAGG-3’和cam-SmaI-R3:5’-CCCCCCGGGCAACTTCTGAATCACTC-3’)，PCR擴(kuò)增獲得大小為1317bp的植株為陽(yáng)性T1代轉(zhuǎn)CAM01擬南芥，即為成功導(dǎo)入CAM01基因的擬南芥突變體cam01的互補(bǔ)植株，將其命名為互補(bǔ)植株CAM01-com。二、互不植株的葉綠素含量檢測(cè)分別檢測(cè)互補(bǔ)植株CAM01-com和突變體cam01的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和葉綠素a/b的含量。具體步驟如下：用80％冷丙酮提取互補(bǔ)植株CAM01-com和突變體cam01葉片的葉綠素，分別測(cè)定OD663和OD646的值，按照文獻(xiàn)“Porraet.al.,BiochimBiophysActa,975:384-394(1989)”中的方法測(cè)定葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和葉綠素a/b的含量。檢測(cè)結(jié)果如表2所示：從表中可以看出：互補(bǔ)植株CAM01-com的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和葉綠素a/b的含量均高于突變體cam01，說明CAM01基因具有調(diào)控葉綠素含量的功能，進(jìn)而對(duì)光合作用產(chǎn)生影響。表2、互補(bǔ)植株CAM01-com和擬南芥突變體cam01的葉綠素含量當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3