本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及針對(duì)于PI3K的納米抗體及其編碼序列。

背景技術(shù)：

1993年比利時(shí)科學(xué)家Hamers.R在駱駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)抗體相比，在駱駝血液中的抗體，有一半沒(méi)有輕鏈，只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)（VHH）和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位?？寺≡撝劓溈贵w的可變區(qū)得到最小的抗原結(jié)合片段，即納米抗體（Nanobody，Nb）。納米抗體的單域性質(zhì)使其較普通抗體具有以下獨(dú)特性能：1）分子量小，可穿透血腦屏障，較易作用于病灶區(qū)；2）在原核或者真核系統(tǒng)中可高表達(dá)；3）特異性強(qiáng)、親和力高；4）高耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性；5）對(duì)人的免疫原性弱。其在腫瘤、感染性疾病、腸炎、淀粉樣變疾病、血栓以及動(dòng)脈粥樣硬化病變的診斷和治療方面具有良好的應(yīng)用效果，同時(shí)可以顯著降低成本。納米抗體的以上特性使其在診斷檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年約有100多萬(wàn)婦女患有乳腺癌，平均每13分鐘就有一位女性死于乳腺癌。平均每?jī)煞职腌娂从幸晃慌员辉\斷為乳腺癌患者。我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率以每年3%-4%的速度遞增，其死亡率排在女性癌癥死亡率之首，患者明顯趨向年輕化。調(diào)查顯示，每8位女性中就有1位遭受乳腺癌的威脅。面對(duì)這一嚴(yán)峻形勢(shì)，我國(guó)已將篩查乳腺癌疾病納入全民公共衛(wèi)生服務(wù)項(xiàng)目，以此來(lái)降低患病率及死亡率。在乳腺癌中PI3K-AKT通路的活化率高達(dá)70%，并且其在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中發(fā)生都比較頻繁。目前常規(guī)檢測(cè)是對(duì)患者的活檢組織進(jìn)行定性、半定量方法免疫組化（IHC），但此法耗時(shí)較長(zhǎng)且操作繁瑣。因此為了及時(shí)對(duì)乳腺癌PI3K表達(dá)的特異性檢測(cè)過(guò)表達(dá)患者進(jìn)行個(gè)體化、靶向性有效的治療，制備乳腺癌PI3K的納米抗體來(lái)進(jìn)行疾病檢測(cè)及治療具有廣闊的前景。

目前，也沒(méi)有針對(duì)乳腺癌PI3K為靶標(biāo)的特異性納米抗體及臨床檢測(cè)試劑的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種針對(duì)PI3K的納米抗體，同時(shí)提供該納米抗體的編碼序列及該納米抗體在制備檢測(cè)的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明的技術(shù)方案為：

本發(fā)明的第一方面，提供了一種針對(duì)PI3K重鏈抗體VHH，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)CDR，所述框架區(qū)FR選自下組的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4。

所述互補(bǔ)決定區(qū)CDR選自下組的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

優(yōu)選地，所述的PI3K納米抗體的VHH鏈，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

本發(fā)明第二方面，一種針對(duì)PI3K重鏈抗體VHH，此抗體特異性識(shí)別PI3K抗原，包括一條具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH鏈。

本發(fā)明第三方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述的PI3K重鏈抗體VHH。

優(yōu)選地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列：SEQ ID NO：9。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明將血液中提取的PI3K免疫新疆單峰駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細(xì)胞建立了針對(duì)于PI3K的納米抗體基因庫(kù)，試驗(yàn)中將PI3K偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫性的納米抗體基因庫(kù)（駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫(kù)），從而獲得了針對(duì)PI3K特異性的納米抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗體株。

附圖說(shuō)明

圖1是PI3K納米抗體的基因電泳圖；其中泳道1是DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道2是PCR擴(kuò)增重鏈抗體引導(dǎo)肽和抗體CH2之間的片段，PCR產(chǎn)物條帶約為700bp。

圖2是PI3K納米抗體的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，從左到右凝膠孔的DNA條帶分別是：第一道為1000bp的分子標(biāo)記，其余孔道為PCR擴(kuò)增重鏈抗體可變區(qū)片段產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物條帶約為500bp；

圖3是是構(gòu)建的單域抗體文庫(kù)的插入率檢測(cè)結(jié)果，從左到右凝膠孔的DNA條帶分別是：第一道為DNA分子標(biāo)記，其余孔道為檢測(cè)插入片段的PCR產(chǎn)物，經(jīng)檢測(cè)，該文庫(kù)的插入率達(dá)到90％以上。

圖4是用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法（ELISA）篩選特異性單個(gè)陽(yáng)性克隆的模式圖；其中1是將PI3K蛋白偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，2是納米抗體，3是鼠抗HA抗體，4是山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，5是堿性磷酸酶顯色液。

圖5是表達(dá)的PI3K納米抗體，經(jīng)鎳柱樹(shù)脂凝膠親和層析純化后的SDS-PAGE的電泳圖；其中泳道1是蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)，其余泳道是 250毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫下來(lái)的納米抗體，結(jié)果顯示PI3K納米抗體經(jīng)過(guò)該純化過(guò)程，其純度可達(dá)到95%以上。

圖6是PI3K納米抗體在不同環(huán)境溫度下的耐受性檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明首先將PI3K的可溶性蛋白作為抗原免疫一只新疆單峰駝，經(jīng)過(guò)5次免疫之后提取該單峰駝外周血淋巴細(xì)胞并構(gòu)建了PI3K特異的單域重鏈抗體文庫(kù)。將PI3K偶聯(lián)在NUNC酶標(biāo)板上，展示蛋白質(zhì)的正確空間結(jié)構(gòu)，使得PI3K的抗原表位得以暴露出來(lái)，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選PI3K免疫性的納米抗體基因庫(kù)（駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫(kù)），而獲得了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗體株。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1

針對(duì)于PI3K的納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建：

（1）首先合成抗原PI3K，用于免疫所用的PI3K的濃度為500μg/mL，每次免疫將0.5mgPI3K與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆單峰駝(句容圣龍家畜養(yǎng)殖廠)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐劑（購(gòu)自sigma），剩余幾次全部使用弗式不全佐劑（購(gòu)自sigma），免疫過(guò)程中刺激B細(xì)胞表達(dá)抗原特異性的納米抗體。（2）5次免疫結(jié)束后，提取駱駝外周血淋巴細(xì)胞100mL并提取總RNA參照QIAGEN公司提供的RNA提取試劑盒。（3）按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX試劑盒說(shuō)明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用巢式PCR擴(kuò)增重鏈抗體的可變區(qū)片段：

第一輪PCR：

上游引物GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC

下游:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

擴(kuò)增重鏈抗體引導(dǎo)肽和抗體CH2之間的片段，54℃退火，25個(gè)循環(huán)；結(jié)果如圖1顯示該片段的大小約為700bp，即從左到右的DNA條帶分別是：第一為DNA的分子Marker，第二單域抗體基因電泳帶約為700bp。

第二輪PCR：

以第一輪PCR產(chǎn)物作模板，

上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

擴(kuò)增重鏈抗體FR1區(qū)和長(zhǎng)、短鉸鏈區(qū)之間的片段（長(zhǎng)片段和短片段），60℃退火，17個(gè)循環(huán)，回收目的片段，結(jié)果如圖2顯示，該片段的大小約為500bp，即從左到右的DNA條帶分別是：第一為DNA分子Marker，第二納米抗體基因電泳帶約為500bp。（4）使用限制性的內(nèi)切酶（購(gòu)自NEB）PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌體展示載體（Biovector供應(yīng)）及10μg VHH并用T4 DNA連接酶（購(gòu)自TaKaRa公司）連接兩個(gè)片段。（5）將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞TG1（北京神州紅葉科技有限公司）中，構(gòu)建PI3K的納米抗體噬菌體展示文庫(kù)并測(cè)定庫(kù)容，庫(kù)容的大小為3.1×10⁸。與此同時(shí)，通過(guò)菌落PCR檢測(cè)引物使用第二輪PCR引物，Tm55℃。文庫(kù)構(gòu)建完成后，為檢測(cè)文庫(kù)的插入率，隨機(jī)選取24顆克隆做菌落PCR。結(jié)果顯示插入率已達(dá)到90%以上。

實(shí)施例2

針對(duì)PI3K的納米抗體篩選過(guò)程：

（1）將溶解在PBS中的100μg/mL的PI3K包被在NUNC酶標(biāo)板上，4℃放置過(guò)夜，同時(shí)設(shè)立負(fù)對(duì)照。（2）第二天兩個(gè)孔中分別加入200μL1%牛奶，室溫封閉2小時(shí)。（3）2小時(shí)后，加入100μL噬菌體（8×10¹¹tfu免疫駱駝納米抗體噬菌展示基因庫(kù)），在室溫下作用1小時(shí)。(4）用 PBST（PBS中含有0.05%吐溫20）洗5遍，以洗掉不結(jié)合的噬菌體。(5）用三乙基胺（100mM）將與PI3K特異性結(jié)合的噬菌體解離下，并感染處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的大腸桿菌TG1，產(chǎn)生并純化噬菌體用于下一輪的篩選，相同篩選過(guò)程重復(fù)2輪。結(jié)果如圖4顯示：在不斷地篩選的過(guò)程中，陽(yáng)性的克隆將不斷的被富集，從而達(dá)到了利用噬菌體展示技術(shù)篩取抗體庫(kù)中PI3K特異抗體的目的。

實(shí)施例3

用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法（ELISA）篩選特異性單個(gè)陽(yáng)性克隆：

該實(shí)驗(yàn)的原理模式圖如圖4所示，具體檢測(cè)如下：

（1）從3-4輪篩選后含有噬菌體的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，挑選96個(gè)單個(gè)菌落并接種于含有100μg/mL的氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基(1L TB培養(yǎng)基中含有2.3g磷酸二氫鉀，12.52g磷酸氫二鉀，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，加終濃度1mmol的IPTG，28℃培養(yǎng)過(guò)夜。（2）利用滲透法獲得粗提抗體，并將抗體轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置1小時(shí)。（3）用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗體，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），在室溫下放置1小時(shí)。（4）用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自艾美捷科技有限公司），在室溫下放置1小時(shí)。（5）用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在405nm波長(zhǎng)，讀取吸收值。（6）當(dāng)樣品孔OD值大于對(duì)照孔OD值3倍以上時(shí)，判為陽(yáng)性克隆孔。（7）將陽(yáng)性克隆孔的菌轉(zhuǎn)搖在含有100μg/mL的LB液體中以便提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)序列比對(duì)軟件Vector NTI分析各個(gè)克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，最終得到氨基酸序列SEQ ID NO：8所示的納米抗體

實(shí)施例4

納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達(dá)、純化：

（1）將前面測(cè)序分析所獲得兩種納米抗體亞克隆至表達(dá)性的載體PET32a中，并將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基的板上，37℃過(guò)夜。（2）挑選單個(gè)菌落接種在15mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。（3）接種1mL的過(guò)夜菌種至330mLLB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.6-1時(shí)，加入IPTG，28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。（4）第二天，離心收菌。（5）將菌體破碎以獲得抗體粗提液。（6）經(jīng)鎳柱離子親和層析純化抗體蛋白，為獲得高純度的抗體，采用咪唑梯度洗脫法，低濃度咪唑洗脫液（50mmol）用于洗去雜帶，高濃度咪唑洗脫液（250mmol，500mmol）最終可制備純度達(dá)90%以上的蛋白。圖5所示從左到右的條帶分別是：第一為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子，第二第三250mmol咪唑的洗脫液洗脫的蛋白樣品；結(jié)果顯示，納米抗體經(jīng)過(guò)該純化后，其純度可達(dá)到95%以上。

實(shí)施例5

生物素化納米抗體及其純化方法：

（1）將針對(duì)PIK3的納米抗體基因片段亞克隆至pBAD載體上，隨后構(gòu)建好的質(zhì)粒pBAD與質(zhì)粒BirA共轉(zhuǎn)至大腸桿菌WK6中，并將其涂布在含有氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；（2）挑選單個(gè)菌落接種在5mL含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；（3）接種1mL的過(guò)夜菌種至330mL含氨芐青霉素和氯霉素的TB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.4-0.5時(shí)，加入330μl50mM的D-生物素（D-biotion）溶液，37℃慢搖1h；（4）加入終濃度為1mMIPTG，28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；（4）離心，收菌；（5）利用滲透法，獲得抗體粗提液；（6）使用鏈霉親和素磁珠純化偶聯(lián)生物素的納米抗體。

實(shí)施例6

PI3K納米抗體溫度耐受性檢測(cè)：

（1）將PI3K納米抗體分別放置于不同溫度條件下：25℃ 24h，30℃ 24h，37℃ 24h，45℃ 24h，75℃ 1h，95℃ 1h；（2）將PI3K蛋白經(jīng)碳酸鹽透析后包被在酶標(biāo)板上，同時(shí)做空白孔對(duì)照（只包被NaHCO₃）；（3）將不同處理的PI3K納米抗體分別轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置1h；（4）用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗體，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），在室溫下放置1h；（5）用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自艾美捷科技有限公司），在室溫下放置1h；（6）用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，放置于ELISA酶標(biāo)儀上，在405nm波長(zhǎng)讀取吸光度值。結(jié)果如圖6所示，PI3K納米抗體有較好的溫度耐受性，PI3K納米抗體的耐高溫特性也為我們之后結(jié)合光電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行高特異性和高靈敏度的檢測(cè)提供了可能。

實(shí)施例7

利用電阻抗檢測(cè)PIK3

(1)將玻碳電極先后用0.3和0.05μm的氧化鋁打磨，超聲，待用；(2)運(yùn)用傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)，首先將電極放置在0.5M的H2SO4中反應(yīng)，使之修飾帶有羧基官能團(tuán)；之后用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)處理電極表面，使其在電極表面形成酰胺鍵。(3)在電極上滴加20μL溶解在pH7.4PBS中(100μg/mL)鏈霉親和素，室溫放置1h，在電 極上修飾鏈霉親和素。(4)在電極上孵育0.5％的BSA，室溫放置0.5h。(5)在電極表面修飾20μL上述添加生物素的納米抗體(100μg/mL)，室溫放置1h。(6)在不同電極上分別滴加20μL梯度稀釋的PIK3(抗原濃度為0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、100ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)，室溫孵育1小時(shí)；(6)通過(guò)電化學(xué)工作站，測(cè)量不同濃度抗原所對(duì)應(yīng)的循環(huán)伏安(CV)和電阻抗值(EIS)。對(duì)電阻抗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到PIK3的檢測(cè)線性?；诒緦?shí)驗(yàn)，本發(fā)明所制備的納米抗體可以應(yīng)用于制備醫(yī)學(xué)檢測(cè)和診斷試劑用于定性或定量的檢測(cè)PIK3含量。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供一個(gè)PI3K納米抗體，每個(gè)納米抗體提供骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，其中所述的骨架區(qū)FR1、FR2、FR3、FR4和互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸和氨基酸序列分別為：

PI3K納米抗體

骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的核苷酸序列：

FR1:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT

FR2: TGGTTCCGACAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTGGGTCGCAGGT

FR3:TGCAGTGCCGCCTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTTCCAAGACGTCGCCAAGAACACGGTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCGTATACTACTGT

FR4: TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

CDR1: GGATACACCTCCAGTAGCAACTACATGGGA

CDR2: ATTGAAGCTCGTGCTGGTGGCACA

CDR3:GCGGCAGATTGGGTCCGGGGTGATTTTTGCTCAGGCGATGTTGACTTTCGTTAT

骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列：

FR1: QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAAS

FR2: WFRQAPGKQREWVAG

FR3: CSAASVKGRFTIFQDVAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC

FR4: WGQGTQVTVSS

CDR1: GYTSSSNYMG

CDR2: IEARAGGT

CDR3: AADWVRGDFCSGDVDFRY

整體核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACACCTCCAGTAGCAACTACATGGGATGGTTCCGACAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTGGGTCGCAGGTATTGAAGCTCGTGCTGGTGGCACATGCAGTGCCGCCTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTTCCAAGACGTCGCCAAGAACACGGTGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCGTATACTACTGTGCGGCAGATTGGGTCCGGGGTGATTTTTGCTCAGGCGATGTTGACTTTCGTTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

整體氨基酸序列： QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTSSSNYMGWFRQAPGKQREWVAGIEARAGGTCSAASVKGRFTIFQDVAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AADWVRGDFCSGDVDFRY WGQGTQVTVSS