本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從丹參干燥藥材(S.miitiurrhizu)中提取分離的丹酚新酸化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丹參是中醫(yī)最常用的藥材之一，有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等多種功效。近年來的研究結(jié)果表明，丹參中起抗菌作用的主要是脂溶性成分，起活血化瘀作用的主要是水溶性成分，水溶性丹參酚酸類是丹參的主要有效成分，具有抗脂質(zhì)過氧化、抗血栓、改善血液循環(huán)等作用，是丹參復(fù)方制劑治療冠心病、心腦血管疾病的主要功能因子。丹參酚酸類可增加體內(nèi)抗氧化物維生素C、維生素K、谷胱甘肽和SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等含量，保護(hù)局限性腦缺血-再灌注所致的線粒體損傷，抑制腦缺血-再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，在防治腦缺血和老年癡呆等急慢性神經(jīng)退行性疾病具有良好的前景。
丹參中的總酚酸含有多種，如原兒茶酸，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，丹酚酸A，丹酚酸B,丹酚酸C，丹酚酸D，丹酚酸E，原紫草酸，紫草酸，異阿魏酸等。其中丹酚酸A和丹酚酸B為主要化學(xué)成分。丹酚酸是一類以丹參素為基本單位的縮合酚酸化合物，屬苯丙素類化合物。
20世紀(jì)80年代以來，我國(guó)科學(xué)家們對(duì)丹參的水溶性成分進(jìn)行了大量的研究工作，證明了不同結(jié)構(gòu)的丹酚酸具有不同的功能活性，例如：丹參素能顯著擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，縮小心肌梗死范圍及減輕病程。丹酚酸A可以抑制脂質(zhì)過氧化，丹酚酸B既具有抗脂質(zhì)氧化，也具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用。
但是，至今尚無關(guān)于本發(fā)明丹酚新酸化合物的公開報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的丹酚酸化合物，命名為丹酚新酸，該丹酚新酸化合物的苯并四氫呋喃結(jié)構(gòu)為順式構(gòu)型，該化合物不僅具有抗脂質(zhì)氧化作用，也具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用，適用于治療冠心病、及防治腦缺血和老年癡呆等急慢性神經(jīng)退行性疾病。
此外，還需要提供一種丹酚新酸化合物的制備方法和應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種結(jié)構(gòu)式(I)的丹酚新酸化合物或其藥用鹽，該化合物中苯并四氫呋喃單元的2位和3位為順式構(gòu)型。
本發(fā)明丹酚新酸化合物中苯并四氫呋喃單元的2位和3位為順式構(gòu)型，而現(xiàn)有報(bào)道的丹酚酸B化合物中苯并四氫呋喃單元的2位和3位為反式構(gòu)型。
所述丹酚新酸化合物中苯并四氫呋喃單元的2位和3位的絕對(duì)構(gòu)型為2R，3S；該化合物的旋光在0.5％鹽酸處理后，由[α]25D＝+85增加到[α]25D＞+120。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，包含安全有效量的上述式(I)化合物或其藥用鹽、以及藥學(xué)上可接受的載體。
上述可接受的載體是無毒的、能輔助施用并且對(duì)式(I)丹酚新酸化合物的治療效果沒有不利影響。此類載體可以是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常能得到的任何固體賦形劑、液體賦形劑、半固體賦形劑或者在氣霧劑組合物中可以是氣體賦形劑。固體藥物賦形劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油硬脂酰酯、氯化鈉、無水脫脂乳等。液體和半固體賦形劑可以選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括那些源于石油、動(dòng)物、植物或人工合成的油，例如，花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的丹酚新酸化合物或其藥用鹽以治療上的有效量施用，其施用方式可以是口服、全身施用(例如透過皮膚的或鼻吸入的)或腸胃外施用(例如肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。優(yōu)選的施用方式是口服，它可根據(jù)疾病程度調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的丹酚新酸化合物或其藥用鹽的實(shí)際施用量(即活性組分)依賴于許多因素，如待治療疾病的嚴(yán)重性、治療對(duì)象的年齡和相對(duì)健康程度、所使用的化合物的效能、施用途徑和形式，以及其他因素。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。例如使該丹酚新酸化合物或其藥用鹽(活性成分)與一種或者多種載體混合，然后將其制成所需的劑型，如片劑、 藥丸、膠囊、半固體、粉末、緩釋劑型、溶液、混懸液、配劑、氣霧劑等等。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種丹酚新酸化合物的制備方法，包括以下步驟：
丹參干燥藥材切片后，用藥材5－10倍量的0％-90％乙醇溶劑在20-90℃下進(jìn)行加熱提取1-3次，每次0.5-2h，得到提取液；
提取液在壓力10-98Kpa，溫度50-90℃下減壓濃縮，制成濃縮液；
濃縮液過濾后以等體積的有機(jī)溶劑提取三次，去除脂溶性成分；
水相溶液濃縮得丹參總酚酸濃縮液，該丹參總酚酸濃縮液用等量硅膠拌樣，用硅膠柱層析分離，依次用氯仿:甲醇:甲酸為6:1:0.01－4:1:0.01的洗脫劑梯度洗脫，得到餾分1，餾分2，餾分3，餾分4，餾分5；餾分5用Sephadex LH-20分離，9:1-3:7的甲醇:水洗脫，得丹酚新酸。
優(yōu)選的，在丹參干燥藥材用乙醇溶劑加熱提取過程中，采用超聲波以提高收率。
所述用于去除濃縮液中脂溶性成分的有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、二氯甲烷、或二氯乙烷。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述丹酚新酸化合物在制備預(yù)防或治療急慢性心腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
所述急慢性心腦血管疾病包括冠心病、腦出血、腦中風(fēng)等。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述丹酚新酸化合物在制備預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。
所述神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病等。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述丹酚新酸化合物的自由基清除劑。
本發(fā)明的丹酚新酸化合物，是一個(gè)具有新構(gòu)型的丹酚酸類化合物，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，該化合物不僅具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化、抗血栓、改善血液循環(huán)的作用，而且還有顯著的抑制和清除羥自由基的作用，非常適用于治療冠心病、急慢性心腦血管疾病，在防治腦缺血和老年癡呆等急慢性神經(jīng)退行性疾病方面也具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 丹酚新酸的制備
丹參干燥藥材(S.miitiurrhizu)20公斤切片后以用藥材10倍量(V/W)即200公斤50％乙醇溶劑在70℃下進(jìn)行加熱提取3次，每次0.5小時(shí)，得到提取液。提取液在壓力10-98Kpa，溫度60-70℃下減壓濃縮，制成濃縮液40L。加水稀釋到80L后過濾，以等體積的乙酸乙酯提取三次，去除脂溶性成分。減壓濃縮到3L，濃縮液用等量硅膠拌樣，用硅膠柱層析進(jìn)行分離，依次用氯仿:甲醇:甲酸(6:1:0.01-4:1:0.01)梯度洗脫，得到餾分1，餾分2，餾分3，餾分4，餾分5；餾分5用Sephadex LH-20分離，甲醇:水(9:1-3:7)洗脫，得丹酚新酸2克。
實(shí)施例2 丹酚新酸的制備
丹參干燥藥材(S.miitiurrhizu)20公斤切片后以用藥材5倍量(V/W)即100公斤90％乙醇溶劑在20℃下進(jìn)行加熱提取2次，每次1小時(shí)，得到提取液。提取液在壓力10-98Kpa，溫度50-60℃下減壓濃縮，制成濃縮液40L。加水稀釋到80L后，以等體積的二氯甲烷提取三次，去除脂溶性成分。減壓濃縮到3L，濃縮液用等量硅膠拌樣，用硅膠柱層析進(jìn)行分離，依次用氯仿:甲醇:甲酸(6:1:0.01-4:1:0.01)梯度洗脫，得到餾分1，餾分2，餾分3，餾分4，餾分5；餾分5用Sephadex LH-20分離，甲醇:水(9:1-3:7)洗脫，得丹酚新酸2克。
實(shí)施例3 丹酚新酸的制備
丹參干燥藥材(S.miitiurrhizu)20公斤切片后以用藥材8倍量(V/W)即160公斤純水在90℃下進(jìn)行加熱提取1次，每次2小時(shí)，得到提取液。提取液加入160L酒精,放置過濾,提取液在壓力10-98Kpa，溫度80-90℃下減壓濃縮，制成濃縮液40L。加水稀釋到80L后，以等體積的二氯乙烷提取三次，去除脂溶性成分。減壓濃縮到3L，濃縮液用等量硅膠拌樣，用硅膠柱層析進(jìn)行分離，依次用氯仿:甲醇:甲酸(6:1:0.01-4:1:0.01)梯度洗脫，得到餾分1，餾分2，餾分3，餾分4，餾分5；餾分5用Sephadex LH-20分離，甲醇:水(9:1-3:7)洗脫，得丹酚新酸2克。
將實(shí)施例1-3制得的丹酚新酸進(jìn)行理化性質(zhì)和波譜特征檢測(cè)，結(jié)果如下。
丹酚新酸的理化性質(zhì)和波譜特征：
白色無定型粉末，[α]25D＝+85(c＝0.05,EtOH)
1H NMR(氘代丙酮,400MHz)δ7.61(1H,d,J＝16.0Hz,CH＝CHCO2CH3),7.22(1H,d,J＝8.4Hz,ArH),6.92(1H,d,J＝8.8Hz,ArH),6.81-6.71(4H,m,ArH×4),6.65-6.60(4H,m,ArH×4),6.38(1H,d,J＝8.4Hz,ArH),6.28(1H,d,J＝16.0Hz,CH＝CHCO2CH3),5.85(1H,d,J＝4.4Hz,ArOCHAr),5.15-5.13(2H,m,ArCH2CHCO2H×2),4.43(1H,d,J＝4.4Hz,ArCHCO2R),3.07-2.84(4H,m,ArCH2CHCO2H×2)；
13C NMR(Acetone-d6,400MHz)δ171.6,170.8,170.7,166.4,147.9,145.5,145.4,145.0,144.9,144.2,144.1,144.0,142.5,132.4,128.2,127.8,125.5,123.4,121.1,121.0,120.8,117.5,117.2,116.6,116.5,115.7,115.6,115.5,115.4,112.7,86.7,74.3,73.4,56.4,36.7,36.4.
CD(c 0.06,EtOH)(nm)+10204(340),+8761(320),+6592(300),-3009(283),-13629(265),+25614(255),+9692(240),+3647(223)。
經(jīng)過化學(xué)降解和關(guān)聯(lián)證明，該化合物具有2R，3S的絕對(duì)構(gòu)型。
實(shí)施例4 丹酚新酸的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證
(1)雙氫丹酚新酸的合成
2克丹酚新酸(化合物1)溶解于50毫升干燥的THF中，加入20毫克10％的鈀碳，用氫氣反復(fù)驅(qū)除反應(yīng)瓶中的空氣后，使反應(yīng)液在氫氣氛下常溫?cái)嚢?小時(shí)，過濾，濃縮，得雙氫丹參新酸(化合物2)1.98克,[α]25D＝+25(c＝0.25,EtOH)，化合物2的波譜特征如下：
1H NMR(acetone-d6,400MHz)δ6.81(3H,m,ArH×3),6.75-6.65(5H,m,ArH×5),6.62(1H,d,J＝8.0Hz,ArH),6.52(1H,d,J＝8.4Hz,ArH),6.47(1H,d,J＝7.6Hz,ArH),5.73(1H,d,J＝5.2Hz,ArOCHAr),5.28(1H,dd,J＝3.6and 9.0Hz,ArCH2CHCO2H),5.09(1H,dd,J＝4.4Hzand 8.4Hz,ArCH2CHCO2H),4.30(1H,d,J＝5.2Hz,ArCHCO2R),3.13-2.91(4H,m,ArCH2CHCOOH×2),2.73-2.50(4H,m,ArCH2CH2CO2R).
13C NMR(acetone-d6,400MHz)δ172.0,171.3,170.9,170.1,147.6,145.5,145.3,145.0,144.2,144.1,139.9,133.1,129.2,128.3,128.1,124.0,121.2,121.1,121.1,117.6,117.3,116.7,116.5,115.5,115.4,112.7,86.9,73.9,73.2,56.5,36.6,36.5,34.0,26.7。
(2)全甲基化雙氫丹酚新酸(化合物3)的制備
80毫克化合物2溶解于2毫升THF中，加入25毫升重氮甲烷乙醚溶液，室溫?cái)嚢?天，減壓濃縮，純化后得12毫克化合物3，[α]25D＝+17.5(c＝0.4,CHCl3)，化合物3的波譜特征如下：
1H NMR(acetone-d6,400MHz)δ7.00(1H,s,ArH),6.93-6.86(5H,m,ArH×5),6.77-6.76(3H,m,ArH×3),6.61-6.59(2H,m,ArH×2),5.90(1H,d,J＝6.26Hz,ArOCHAr),5.37(1H,dd,J＝4.0and 8.5Hz,ArCH2CHCO2CH3),5.12(1H,dd,J＝4.8and 8.3Hz,ArCH2CHCO2CH3),4.44(1H,d,J＝6.28Hz,ArCHCO2R),3.86-3.68(27H,m,OCH3×9),3.18-3.00(4H,m,ArCH2CHCOOMe×2),2.72-2.48(4H,m,ArCH2CH2CO2R)。
(3)全甲基化丹酚酸B(化合物4)的制備。
40mg(0.0557mmol)的丹酚酸B(salvianolic acid B，現(xiàn)有的丹酚酸B化合物)和20當(dāng)量154mg(1.11mmol)的K2CO3懸浮于5mL的干燥丙酮中，向反應(yīng)瓶中加入30當(dāng)量(0.158mL，1.67mmol)的硫酸二甲脂。反應(yīng)混合物在60度下攪拌反應(yīng)5小時(shí)。過濾除去無機(jī)鹽，濾液濃縮后粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析分離，得到28mg的白色固體產(chǎn)物化合物4(62％)，化合物4的波譜特征如下：
1H NMR(Acetone-d6,400MHz)δ7.72(1H,d,J＝15.6Hz,CH＝CHCO2CH3),7.36(1H,d,J＝8.4Hz,ArH),7.07-7.03(3H,m,ArH×3),7.00(1H,d,J＝8.4Hz,ArH),6.38(1H,d,J＝15.6Hz,CH＝CHCO2CH3),6.02(1H,d,J＝5.6Hz,ArOCHAr),4.64(1H,d,J＝5.6Hz,ArCHCO2CH3),3.92(3H,s,OCH3),3.82(3H,s,OCH3),3.80(3H,s,OCH3),3.79(3H,s,CO2CH3),3.76(3H,s,CO2CH3)。
(4)全甲基化雙氫丹酚酸B(化合物5)的制備
30mg的化合物4(0.035mmol)溶解于2毫升THF中，向溶液中加入6mg的10％Pd/C。置換空氣為氫氣后，反應(yīng)混合物在室溫條件下攪拌2小時(shí)。過濾并用THF洗滌濾餅后,合并后的THF溶液濃縮干燥后得到的粗產(chǎn)品。在乙腈和水為流動(dòng)相的條件下經(jīng)過制備液相純化，凍干后得到29毫克的白色固體產(chǎn)物化合物5(97％)，化合物5的波譜特征如下：
1H NMR(acetone-d6,400MHz)δ6.97(1H,s,ArH),6.91-6.83(5H,m,ArH×5),6.77-6.74(m,3H,ArH×3),6.59-6.57(2H,m,ArH×2),5.87(1H,d,J＝6.12Hz,ArOCHAr),5.34(1H,dd,J＝4.4and 8.4Hz,ArCH2CHCO2CH3),5.09(1H,dd,J＝4.64and 8.32Hz,ArCH2CHCO2CH3),4.41(1H,d,J＝6.12Hz,ArCHCO2R),3.84-3.76(27H,m,OCH3×9),3.16-2.94(4H,m,ArCH2CHCOOCH3×2),2.70-2.48(4H,m,ArCH2CH2CO2R)。
通過比較化合物3和化合物5的偶合常數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)化合物3的J2，3＝6.28Hz，化合物5的J2，3＝6.12Hz,因此可以推斷化合物3的2，3位構(gòu)型為順式構(gòu)型，化合物5的2，3位構(gòu)型為反式構(gòu)型。
實(shí)施例5 丹酚新酸絕對(duì)構(gòu)型的確定
化合物6的制備。
30mg的化合物2(0.035mmol)溶解于5毫升Et2O中，向溶液中加入80當(dāng)量的Me3SiCHN2。反應(yīng)混合物在室溫條件下攪拌7天。溶液濃縮干燥后得到粗產(chǎn)品。在乙腈和水 為流動(dòng)相的條件下經(jīng)過制備液相純化，凍干后得到19毫克的白色固體產(chǎn)物化合物6，化合物6的波譜特征如下：
1H NMR(acetone-d6,400MHz)δ7.02(1H,s,ArH),6.93(1H,s,ArH),6.91(1H,s,ArH),6.90(1H,d,J＝8.4Hz,ArH),6.75(1H,d,J＝8.4Hz,ArH),5.92(1H,d,J＝5.6Hz,ArOCHAr),4.46(1H,d,J＝5.6Hz,ArCHCO2CH3),3.85-3.76(12H,m,OCH3×4),3.56(3H,s,OCH3),2.84-2.74(2H,m,CH2CO2CH3),2.57-2.52(2H,m,ArCH2).13C NMR(acetone-d6,400MHz)δ172.8,172.5,149.9,143.5,133.3,130.4,124.9,121.5,118.4,113.9,111.9,110.0,109.9,87.4,55.8,55.4,52.2,51.0,34.4,27.1。
化合物6的ORD光譜和CD光譜分別在288nm和265nm處顯示正的Cotton效應(yīng)，因此可以推定丹酚新酸具有2R，3S構(gòu)型。
實(shí)施例6 丹酚新酸抗脂質(zhì)過氧化作用
1.微粒體制備：大鼠禁食一夜，斷頭處死，先用冷的TMS緩沖液(Tris-HCl 0.05mmol/L，蔗糖0.2mmol/L-1.MgCl33.0mmol/L，PH 7.4)經(jīng)門靜脈沖洗肝臟，于0℃下取肝臟制成勻漿4℃離心20min，再將上清液1.05×105/g離心60min，沉淀即為微粒體。將肝微粒體重懸于TMS緩沖液中，稀釋至蛋白含量分別為15g/L(用lowry法測(cè)蛋白)，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。
2.測(cè)定脂質(zhì)過氧化物丙二醛的含量:反應(yīng)體系中上述微粒體溶液0.1ml，溶劑或不同濃度的待測(cè)藥物0.01m1，半胱氨酸(0.01mol/ml)0.02ml，硫酸亞鐵(1mmol/L)0.05ml(空白管不加硫酸亞鐵)，用pH 7.4的0.1mol/L的PBS補(bǔ)充至總體積為1ml。37℃培養(yǎng)30min后，加三氯乙酸和TBA顯色劑，測(cè)定脂質(zhì)過氧化物丙二醛的含量。結(jié)果表明丹酚新酸對(duì)丙二醛(MDA，以光密度表示)生成有明顯抑制作用，有量效關(guān)系，其作用優(yōu)于Vit E(見表1)。
表1丹酚新酸抑制脂質(zhì)過氧化物丙二醛的生成
實(shí)施例7 丹酚新酸抑制和清除羥自由基的作用
苯甲酸3mmol/L，K2HPO4/KH2PO4150mmol/L，pH 7.4，F(xiàn)e2+-EDTA(其中Fe2+0.19mmol/L,EDTA-2Na 0.59mmol/L)，H2O20.29mmol/L及各種濃度的藥物，總反應(yīng)體積為3.5ml，加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，室溫條件下攪拌5h后測(cè)定熒光值。按下式計(jì)算清除率：s％(清除率)＝(F空－F測(cè))/F空×100％。結(jié)果丹酚新酸與維生素E相比，可顯著清除羥自由基(見表2)。
表2丹酚新酸清除羥自由基的作用
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。