本發(fā)明屬于農副產品精深加工的技術領域，特別涉及一種抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝。

背景技術：
草菇是世界上重要的栽培食用菌，其總產量在世界四大栽培食用菌中居第三位，我國草菇年產量3萬多噸，占全世界總產量的70％～80％，居世界之首。草菇是食用菌中最不易保鮮貯藏的菇類，采后的后熟作用非常強烈，且采收期的氣溫較高，又不能在較低溫度下貯藏，這些因素制約了新鮮草菇的流通和大規(guī)模生產。人體內的自由基會引起生物細胞氧化性損傷，進而誘發(fā)癌癥、衰老、心血管疾病等慢性病。鑒于傳統(tǒng)合成的抗氧化劑(BHT、BHA)存在毒性和不安全性，而在人們長期食用的食品中，天然抗氧化劑成分的毒性遠遠低于人工合成的抗氧化劑，因此，近年來從自然界尋求天然抗氧化劑的研究日益受到重視。對草菇中的抗氧化活性成分已有一些報道。李樂等研究證明草菇的甲醇和水的粗提物具有自由基清除和抑制大鼠紅細胞溶血的作用。孫延芳等采用微波輔助提取對草菇的多酚含量及抗氧化活性進行研究，結果表明草菇多酚均具有很強的抗氧化能力。Cheung等采用3種不同方法測定了草菇的甲醇提取物和水提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)水提取物中總酚含量高于甲醇提取物，其抗氧化活性也高于甲醇提取物。趙俊霞等用不同有機溶劑對草菇培養(yǎng)液及菌絲體中的代謝成分進行分離提取，代謝提取物均有較高的DPPH·清除率，即較高的抗氧化活性，其有效成分含有粗三萜和黃酮類物質。多糖是食用菌中重要的藥理成分之一。近年研究表明，多糖除了具有抗衰老、抗病毒、抗癌、免疫調節(jié)等功能作用外，還具有抗氧化作用。草菇多糖抗氧化活性的研究目前還未見報道。抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝，加強草菇開發(fā)出系列的深加工產品，改變單一的產品結構，延伸產業(yè)鏈，滿足不同的消費群體，擴大市場的需求。

技術實現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供了一種抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝。技術方案：本發(fā)明提供的一種抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝，該工藝包括草菇預處理、粉碎、酶法提取及酶滅活、離心、超濾法分離、濃縮、干燥得到抗氧化草菇多糖，其中，通過采用纖維素酶提取和多次超濾分離獲得了多糖樣品液。一種抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝，該工藝包括以下步驟：1)草菇預處理：通過干制得到烘干后的草菇，然后進行脫脂得到脫脂草菇；2)粉碎：將步驟1)中脫脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶滅活：通過在草菇粉粒中加入纖維素酶酶解后再升溫滅活得到物料；4)離心：將步驟3)中物料降溫至20-40℃，離心，轉速為3000-4000r/min，離心時間5-10min，棄沉淀，取清液備用；5)超濾法分離：通過超濾分離方法得到截流液為分子量大于100KD和分子量為5-10KD的多糖樣品液；6)濃縮：在步驟5)所述的截流液中分別緩緩加入95％乙醇，加入乙醇過程中不斷攪拌，混合液中乙醇質量濃度控制在70％-80％，靜置沉淀6-24小時后，虹吸上清液至原體積1/5-1/10，下部液體進行離心分離，轉速為3500-4000r/min，離心時間10-15min；7)干燥：在步驟6)所述的沉淀，50-70℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷凍干燥機凍干，含水量低于4％，即得草菇多糖。其中，上述步驟3)酶法提取及酶滅活具體步驟為：草菇粉粒中加入20-30倍草菇重量的水，然后加入0.3％-0.35％纖維素酶，料溫保持50℃-55℃，攪拌，維持溫度90-120min后，將物料升溫至90-100℃，維持5-10min滅活后將得到的物料備用。纖維素酶法提取草菇多糖對·OH和DPPH·有較強的清除作用及還原能力，均高于熱水提取法提取的草菇多糖。其中，上述步驟5)超濾法分離具體步驟為：將截留分子量為5KD的膜組件組裝于超濾設備，在25℃，入口壓力2～5kg/m2，出入口壓差不要超過1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖樣品液；透過液得到分子量小于5KD的多糖溶液，將分子量大于5KD的多糖溶液經截留分子量為10KD的超濾膜處理，透過液為分子量5-10KD的多糖樣品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，將分子量大于10KD的多糖溶液經截留分子量為100KD的超濾膜處理，截流液為分子量大于100KD的多糖樣品液。其中，上述草菇預處理步驟如下：1a)干制：選擇未開傘的草菇，洗凈、去雜、切片，105℃滅酶10min，60-70℃烘干；1b)脫脂：在步驟1a)干制草菇中加入6-10倍體積95％乙醇溶液，浸泡24-48h脫脂，過濾，浸提2-3次，風干。有益效果：相比與現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：1)本發(fā)明設計的酶法提取草菇多糖提取效率高、抗氧化活性強。纖維素酶提草菇多糖得率為21.38％，高于熱水提多糖15.00％。纖維素酶提草菇多糖對·OH、·、和DPPH·自由基有較強的清除作用及還原能力，均高于熱水提取法提取的草菇多糖。在質量濃度0.1～5mg/mL范圍內，纖維素酶提草菇多糖對·OH、·、DPPH·自由基最大清除率分別為100％、98.32％、82.74％。纖維素酶提多糖具有較強的還原能力，反映出其抗氧化能力較強。2)本發(fā)明設計的超濾法膜分離草菇多糖工藝設備投入少，工藝路線簡單，易于操作，適合大規(guī)模化生產。采用超濾法分離草菇多糖可以增強抗·OH和DPPH·能力。超濾法獲得(MW＞100KD)與(MW5-10kD)草菇多糖對·OH和DPPH·清除活性均高于(MW＞5KD)未分級草菇多糖，對·OH清除活性分別為68.02％、48.41％，對DPPH·清除活性分別為95.50％、95.54％。附圖說明圖1本發(fā)明提取草菇多糖對·OH的清除活性比較；圖2本發(fā)明提取草菇多糖對·的清除活性比較；圖3本發(fā)明提取草菇多糖對DPPH·的清除活性比較；圖4本發(fā)明提取草菇多糖還原力的比較；圖5不同截留分子量草菇多糖對·OH的清除活性比較；圖6不同截留分子量草菇多糖對DPPH·的清除活性比較；圖7纖維素酶提取草菇多糖超濾法分段分離工藝。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1一種抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝，該工藝包括以下步驟：1)草菇預處理：通過干制得到烘干后的草菇，然后進行脫脂得到脫脂草菇；2)粉碎：將步驟1)中脫脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶滅活：草菇粉粒中加入25倍草菇重量的水，然后加入0.3％纖維素酶，料溫保持50℃，攪拌，維持溫度120min后，將物料升溫至90℃，維持10min滅活后將得到的物料備用；4)離心：將步驟3)中物料降溫至20℃，離心，轉速為3000r/min，離心時間10min，棄沉淀，取清液備用；5)超濾法分離：將截留分子量為5KD的膜組件組裝于超濾設備，在25℃，入口壓力2～5kg/m2，出入口壓差不要超過1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖樣品液；透過液得到分子量小于5KD的多糖溶液，將分子量大于5KD的多糖溶液經截留分子量為10KD的超濾膜處理，透過液為分子量5-10KD的多糖樣品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，將分子量大于10KD的多糖溶液經截留分子量為100KD的超濾膜處理，截流液為分子量大于100KD的多糖樣品液；6)濃縮：在步驟5)所述的截流液中分別緩緩加入95％乙醇，加入乙醇過程中不斷攪拌，混合液中乙醇質量濃度控制在70％，靜置沉淀6小時后，虹吸上清液至原體積1/5，下部液體進行離心分離，轉速為3500r/min，離心時間15min；7)干燥：在步驟6)所述的沉淀，50℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷凍干燥機凍干，含水量低于4％，即得草菇多糖。本實施例進行的超濾法分離多糖以及以VC(抗壞血酸)做陽性對照的抗氧化活性的測定結果參見圖5、6。由圖5可以看出，在質量濃度為2.5mg/mL時，不同截留分子量草菇多糖的清除·OH能力差異顯著。(MW＞100KD)草菇多糖對·OH清除活性最高為68.02％；其次為(MW5-10kD)草菇多糖，清除率為48.41％；(MW10-30KD)草菇多糖最小，清除率為10.81％。分級后(MW＞100KD)與(MW5-10kD)草菇多糖對·OH清除活性均高于未分級(MW＞5kD)草菇多糖。由圖6可以看出，在質量濃度為2.5mg/mL時，不同截留分子量草菇多糖的清除DPPH·能力均較高。(MW5-10kD)草菇多糖對DPPH·清除活性最高為95.54％；其次為(MW＞100KD)草菇多糖，清除率為95.50％；(MW10-30KD)草菇多糖最小，清除率為88.09％。分級后(MW5-10kD)與(MW＞100KD)對DPPH·清除活性均高于未分級(＞5kD)草菇多糖。在人體內，VC作為生物體內對自由基傷害產生的相應保護系統(tǒng)成員之一，是高效抗氧化劑。因此，抗氧化活性的測定以VC做陽性對照。實施例2一種抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝，該工藝包括以下步驟：1)草菇預處理：通過干制得到烘干后的草菇，然后進行脫脂得到脫脂草菇；2)粉碎：將步驟1)中脫脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶滅活：草菇粉粒中加入30倍草菇重量的水，然后加入0.35％纖維素酶，料溫保持55℃，攪拌，維持溫度90min后，將物料升溫至100℃，維持5min滅活后將得到的物料備用；4)離心：將步驟3)中物料降溫至40℃，離心，轉速為4000r/min，離心時間5min，棄沉淀，取清液備用；5)超濾法分離：將截留分子量為5KD的膜組件組裝于超濾設備，在25℃，入口壓力2～5kg/m2，出入口壓差不要超過1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖樣品液；透過液得到分子量小于5KD的多糖溶液，將分子量大于5KD的多糖溶液經截留分子量為10KD的超濾膜處理，透過液為分子量5-10KD的多糖樣品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，將分子量大于10KD的多糖溶液經截留分子量為100KD的超濾膜處理，截流液為分子量大于100KD的多糖樣品液；6)濃縮：在步驟5)所述的截流液中分別緩緩加入95％乙醇，加入乙醇過程中不斷攪拌，混合液中乙醇質量濃度控制在80％，靜置沉淀24小時后，虹吸上清液至原體積1/5-1/10，下部液體進行離心分離，轉速為4000r/min，離心時間10min；7)干燥：在步驟6)所述的沉淀，50-70℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷凍干燥機凍干，含水量低于4％，即得草菇多糖。實施例3一種抗氧化草菇多糖高效提取分離工藝，該工藝包括以下步驟：1)草菇預處理：通過干制得到烘干后的草菇，然后進行脫脂得到脫脂草菇；2)粉碎：將步驟1)中脫脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；3)酶法提取及酶滅活：草菇粉粒中加入27倍草菇重量的水，然后加入0.33％纖維素酶，料溫保持53℃，攪拌，維持溫度100min后，將物料升溫至95℃，維持8min滅活后將得到的物料備用；4)離心：將步驟3)中物料降溫至30℃，離心，轉速為3500r/min，離心時間7min，棄沉淀，取清液備用；5)超濾法分離：將截留分子量為5KD的膜組件組裝于超濾設備，在25℃，入口壓力2～5kg/m2，出入口壓差不要超過1.5kg/m2，截流液得到分子量大于5KD的多糖樣品液；透過液得到分子量小于5KD的多糖溶液，將分子量大于5KD的多糖溶液經截留分子量為10KD的超濾膜處理，透過液為分子量5-10KD的多糖樣品液；截流液得到分子量大于10KD的多糖溶液，將分子量大于10KD的多糖溶液經截留分子量為100KD的超濾膜處理，截流液為分子量大于100KD的多糖樣品液；6)濃縮：在步驟5)所述的截流液中分別緩緩加入95％乙醇，加入乙醇過程中不斷攪拌，混合液中乙醇質量濃度控制在75％，靜置沉淀6-24小時后，虹吸上清液至原體積1/5-1/10，下部液體進行離心分離，轉速為3800r/min，離心時間13min；7)干燥：在步驟6)所述的沉淀，50-70℃烘箱或真空干燥箱烘干，粉碎；或冷凍干燥機凍干，含水量低于4％，即得草菇多糖。實驗例：1熱水提取草菇多糖方法通過干制得到烘干后的草菇，然后進行脫脂得到脫脂草菇；將脫脂草菇粉碎得到草菇粉粒，粉碎粒度40-80目；取草菇粉加入20倍草菇重量的水，沸水提取1h，過濾。按此步驟共提取2次，合并提取液。2草菇多糖的濃縮干燥將草菇提取液60℃減壓濃縮至原體積的1/5，4000rpm離心10min，去除沉淀。濃縮液中緩緩加入95％乙醇，加入乙醇過程中不斷攪拌，混合液中乙醇質量濃度控制在70％，靜置沉淀12小時后，虹吸上清液至原體積1/5，下部液體進行離心分離，轉速為3500r/min，離心時間10min。沉淀物用蒸餾水溶解，溶解液透析(分子截留量為5kDa)，冷凍干燥，得熱水提草菇多糖。熱水提草菇多糖得率為15.02％。3抗氧化活性的測定3.1·OH清除活性的測定分別吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL樣液1.0mL，依次加入2mmol/LFeSO4溶液3.0mL，1mmol/LH2O2溶液3.0mL，靜置10min。再加入6moL/L水楊酸溶液3mL，37℃水浴30min，在510nm處測定吸光度，以VC(抗壞血酸)做陽性對照。清除率計算公式：清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。式中：Ai為不同多糖濃度下的吸收度；Aj為用蒸餾水代替水楊酸時測得的不同多糖濃度本底吸光度；A0用水代替多糖樣品時測得空白對照吸光度。每個濃度平行做3次，求清除率的平均值。該纖維素酶提多糖樣液采用的是實施例1中的方法提取的。參見圖1。表1草菇多糖清除·OH活性在質量濃度0.1～5mg/mL范圍內，熱水提取草菇多糖對·OH最大清除率為62.49％。3.2·清除活性測定取濃度50mmol/LTris-HCl緩沖溶液(pH8.2)4.5mL，分別加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL樣液1.0mL，25℃水浴20min，立即加入25℃預熱過的25mmol/L鄰苯三酚溶液0.4mL，25℃水浴5min，加入8mmol/LHCl1mL終止反應，在320nm處測定吸光度，以VC(抗壞血酸)做陽性對照。清除率計算公式：清除率(％)＝(1-Ai/A0)×100％。式中：Ai為不同多糖濃度下的吸收度；A0為用水代替多糖樣品時測得空白對照吸光度。每個濃度平行做3次，求清除率的平均值。該纖維素酶提多糖樣液采用的是實施例2中的方法提取的。參見圖2。表2草菇多糖清除·活性在質量濃度0.1～5mg/mL范圍內，熱水提取草菇多糖對·OH無清除活性。3.3DPPH·清除活性測定分別吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL樣液與0.2mmol/LDPPH溶液各4.0mL，加入具塞試管中搖勻，黑暗條件下37℃放置30min，3000r/min離心10min，取上清液在517nm處測吸光度，以VC(抗壞血酸)做陽性對照。清除率計算公式：清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。式中：Ai為多糖濃度下的吸收度；Aj為用無水乙醇代替DPPH溶液時測得的不同多糖濃度本底吸光度；A0為用水代替多糖樣品時測得空白對照吸光度。每個濃度平行做3次，求清除率的平均值。該纖維素酶提多糖樣液采用的是實施例3中的方法提取的。參見圖3。表3草菇多糖清除DPPH·活性在質量濃度0.1～5mg/mL范圍內，熱水提取草菇多糖對DPPH·最大清除率為82.71％。3.4還原力測定分別吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0mg/mL樣液2.5mL，依次加0.2moL/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)、1％K3Fe(CN)6溶液各2.5mL，混勻后50℃水浴20min。加入10％TCA溶液2.5mL終止反應，3000r/min離心10min。取上清液5.0mL，分別加入蒸餾水5.0mL、0.1％FeCl31.0mL，靜置10min，在700nm處測定吸光度，每個濃度平行做3次，以EDTA做陽性對照。該纖維素酶提多糖樣液采用的是實施例1中的方法提取的。參見圖4。表4草菇多糖還原力測定比較草菇多糖具有一定的還原力，在質量濃度0.1～5mg/mL范圍內，2種不同方法提取草菇多糖隨著質量濃度增加而還原力增加，且具有明顯的量效關系。草菇多糖的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關性，還原能力的高低可以間接反映抗氧化能力的強弱。