本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高古龍酸產(chǎn)酸的發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：
目前國內(nèi)生產(chǎn)古龍酸多采用二步發(fā)酵法，二步發(fā)酵法通常采用混合菌系進行發(fā)酵，這種混合菌系最為常用的一種是氧化葡萄糖酸桿菌(俗稱小菌)，另一種是巨大芽孢桿菌(俗稱大菌)，其中小菌為產(chǎn)酸菌，胞內(nèi)分泌L-山梨酮氧化酶，可以將山梨糖氧化成2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，但是單獨培養(yǎng)生長緩慢，產(chǎn)酸能力低；大菌不能產(chǎn)酸，但是可以作為小菌的伴生菌，在發(fā)酵中起輔助作用，促進小菌的生長和產(chǎn)酸。研究證實，大菌胞內(nèi)液和胞外液菌均可以促進小菌生長，縮短小菌生長的延遲期，大菌的胞內(nèi)液主要促進小菌生長，并促進2-KLG的合成，大菌的胞外液對小菌的產(chǎn)酸有促進作用，不影響小菌生長。二步發(fā)酵法采用氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌組成的混菌發(fā)酵體系使得發(fā)酵過程控制更為復(fù)雜，兩種細(xì)菌的比例對于2-KLG的生產(chǎn)具有顯著影響，實際生產(chǎn)中難以對兩菌比例進行控制。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，公開號為CN103627775A，發(fā)明名稱為一種提高2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)效率的方法，公開了一種提高發(fā)酵生產(chǎn)效率的方法，采用流加胰酪蛋白胨的技術(shù)縮短了發(fā)酵周期，但在產(chǎn)酸上未有較大提高。為了解決上述問題，本發(fā)明提出采用通過發(fā)酵罐不同階段流加葡萄糖和牛肉蛋白胨來調(diào)整發(fā)酵過程中大小菌的生長比例，使?fàn)I養(yǎng)條件有利于促進巨大芽孢桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌混菌系細(xì)胞生長，從而能延長氧化葡萄糖酸桿菌的產(chǎn)酸期，增加氧化葡萄糖酸桿菌的數(shù)量，使發(fā)酵終點古龍酸的含量達105～107mg/ml，提高產(chǎn)酸濃度10～17％，2-KLG的生物合成速度比原加式方法提高了0.3～0.5g/l/h，達到提高發(fā)酵產(chǎn)酸，提升發(fā)酵生產(chǎn)效率的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種提高古龍酸產(chǎn)酸的發(fā)酵方法。為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種提高古龍酸產(chǎn)酸的發(fā)酵方法為用巨大芽孢桿菌與氧化葡萄糖酸桿菌混合菌系為生產(chǎn)菌株，以山梨糖為原料進行有氧發(fā)酵，在發(fā)酵過程的前期流加葡萄糖溶液，中后期流加牛肉蛋白胨。具體的，本發(fā)明的提高古龍酸產(chǎn)酸的發(fā)酵方法，包括以下步驟：(1)制備巨大芽孢桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌的混合菌液，并接入到發(fā)酵初始培養(yǎng)基中；(2)第一發(fā)酵階段：控制發(fā)酵液PH值為6.5～6.7，在步驟(1)所得的混合物中流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度為1～3mg/ml，培養(yǎng)5～7h；(3)第二發(fā)酵階段：調(diào)整發(fā)酵液PH值為6.0～6.4，在步驟(2)所得的發(fā)酵液中流加葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度為1～3mg/ml，培養(yǎng)3～5h；(4)第三發(fā)酵階段：在步驟(3)所得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)19～21h；(5)第四發(fā)酵階段：在步驟(4)所得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)5～7h，在培養(yǎng)的過程中流加牛肉蛋白胨；(6)第五發(fā)酵階段：在步驟(5)所得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)至發(fā)酵終點。本申請中發(fā)酵終點的判斷為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，本發(fā)明中當(dāng)耗糖速率小于0.5～0.8mg/ml/h時，即到達發(fā)酵終點。其中，所述流加葡萄糖溶液的濃度為300～400mg/ml。其中，步驟(5)牛肉蛋白胨的流加量與發(fā)酵液終體積的質(zhì)量體積比為0.1～0.3g/100ml；優(yōu)選的，牛肉蛋白胨分批流加到發(fā)酵液中；更優(yōu)選的，牛肉蛋白胨分3批流加到發(fā)酵液中。本發(fā)明的技術(shù)方案，步驟(1)～步驟(5)中流加山梨糖，使山梨糖濃度保持在15～20mg/ml，發(fā)酵溫度為28～33℃。其中，所述山梨糖的濃度為200～250mg/ml。本發(fā)明的技術(shù)方案，步驟(1)中所述混合菌液中巨大芽孢桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌數(shù)量比為1:2～1:3。步驟(1)將混合菌液接入到發(fā)酵初始培養(yǎng)基中，接種量為10～15％。所述步驟(1)發(fā)酵初始培養(yǎng)基，按質(zhì)量體積比包括2～2.5mg/100ml的山梨糖、0.9～1.2mg/100ml玉米漿、0.1～0.2mg/100ml的尿素、0.02～0.04mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05～0.08mg/100ml的KH2PO4，發(fā)酵初始培養(yǎng)基PH值為6.7～7.0。優(yōu)選的，所述步驟(1)發(fā)酵初始培養(yǎng)基，按質(zhì)量體積比包括2mg/100ml的山梨糖，1.2mg/100ml的玉米漿、0.2mg/100ml的尿素、0.02mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml的KH2PO4，發(fā)酵初始培養(yǎng)基PH值為6.7。本發(fā)明采用本領(lǐng)域常用的氧化葡萄糖酸桿菌(俗稱小菌)和巨大芽孢桿菌(俗稱大菌)制備菌液，菌液制備和接種采用常規(guī)的制備方法，本發(fā)明對此不做限定。本發(fā)明前期流加葡萄糖，可以讓大菌生長迅速；中后期流加牛肉蛋白胨，可以解決小菌生長緩慢、產(chǎn)酸期短、產(chǎn)酸慢的問題，并結(jié)合溫度、pH、溶氧、低初糖和流加補糖等因素的控制，優(yōu)化混菌發(fā)酵中大小菌的生長比例。本發(fā)明的方法可以提高發(fā)酵終點古龍酸的含量，提高產(chǎn)酸濃度，提升發(fā)酵生產(chǎn)效率，并且成功運用在500L發(fā)酵罐。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如無特別指明，本發(fā)明采用本領(lǐng)域常用的氧化葡萄糖酸桿菌(俗稱小菌，購自菌種保藏中心，保藏號CGMCC1.110)和巨大芽孢桿菌(俗稱大菌，購自菌種保藏中心，保藏號CMCC(B)63103)制備菌液。菌液制備采用常規(guī)的制備方法，可以但不限于以下制備方法：凍存管--搖瓶活化24h--大小菌分別分離(28℃培養(yǎng)小菌2天，大菌2-3天)--選菌落飽滿，邊緣整齊，偏大的小菌單菌落挑一滿環(huán)涂布試管(28℃培養(yǎng)一天)--搭上大菌，選菌落飽滿，邊緣整齊，大小適中的大菌單菌落在已搭過小菌的試管上(28℃培養(yǎng)2天)--用無菌水將試管上的菌苔洗下接種子瓶(28℃，200r/min，培養(yǎng)22h)。固體培養(yǎng)基在進行菌種分離和制備試管時用，液體種子培養(yǎng)基在進行凍存管活化和種子擴大培養(yǎng)時用，固體培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、搖瓶種子培養(yǎng)為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，本發(fā)明的具體選擇如下：固體培養(yǎng)基(種子活化的平板培養(yǎng)基)包括山梨糖1.8mg/100ml、酵母膏0.3mg/100ml、玉米漿0.6mg/100ml、尿素0.3mg/100ml、MgSO4.7H2O0.04mg/100ml、KH2PO40.03mg/100ml、輕質(zhì)CaCO30.5mg/100ml，瓊脂2mg/100ml，PH＝7.0。液體種子培養(yǎng)基(種子擴大培養(yǎng)用的搖瓶培養(yǎng)基)包括：山梨糖1.8mg/100ml、酵母膏0.3mg/100ml、玉米漿0.6mg/100ml、尿素0.3mg/100ml、MgSO4.7H2O0.04mg/100ml、KH2PO40.03mg/100ml、輕質(zhì)CaCO30.5mg/100ml，PH＝7.0。搖瓶種子培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間22h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。此處搖瓶種子培養(yǎng)是將培養(yǎng)好的大小菌試管接入種子搖瓶進行培養(yǎng)的，目的是為了擴大培養(yǎng)。實施例1發(fā)酵初始培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比，包括山梨糖2mg/100ml，玉米漿1.2mg/100ml、KH2PO40.05mg/100ml、MgSO4.7H2O0.02mg/100ml、尿素0.2mg/100ml，初始PH為6.7，其中流加濃度為200mg/ml的山梨糖，初始山梨糖與其它培養(yǎng)基分開滅菌。本實施例提高古龍酸產(chǎn)酸的發(fā)酵方法包括以下步驟：(1)將培養(yǎng)好的氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌的混合菌液3L接入到10L含有2mg/100ml的山梨糖，1.2mg/100ml玉米漿、0.2mg/100ml的尿素、0.02mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.05mg/100ml的KH2PO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵容器采用30L自動發(fā)酵罐。(2)第一發(fā)酵階段：控制發(fā)酵液PH值為6.7，攪拌轉(zhuǎn)速350rpm，通氣比1：0.6vvm，在步驟(1)所得的混合物中流加300mg/ml葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度保持在1～3mg/ml，培養(yǎng)6h；(3)第二發(fā)酵階段：控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速350rpm，通氣比1：0.6vvm，在步驟(2)所得的發(fā)酵液中流加300mg/ml的葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度保持在1～3mg/ml，培養(yǎng)4h；(4)第三發(fā)酵階段：在步驟(3)所得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速380rpm，通氣比1：0.8vvm，培養(yǎng)20h；(5)第四發(fā)酵階段：在步驟(4)所得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速450rpm，通氣比1：1.2vvm，培養(yǎng)6h，在培養(yǎng)的過程中流加牛肉蛋白胨，牛肉蛋白胨分三批流加到發(fā)酵液中，培養(yǎng)開始時加入第一批，隔2小時后加入第二批，再隔2小時后加入第三批，所述三批牛肉蛋白胨的總流加量與發(fā)酵液終體積的質(zhì)量體積比為0.1g/100ml；(6)第五發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速450rpm，通氣比1：1.2vvm，培養(yǎng)至發(fā)酵終點，用時10h。在整個發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)?山梨糖)降低到15mg/ml時，流加200mg/ml的山梨糖，使山梨糖濃度保持在15～20mg/ml，溫度控制30℃。發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量95.1mg/ml，發(fā)酵周期46h，產(chǎn)酸速率2.0g/l/h。實施例2本實施例的制備方法與實施例1相同，不同之處僅為發(fā)酵初始培養(yǎng)基。本發(fā)明的發(fā)酵初始培養(yǎng)基，按質(zhì)量體積比包括2.5mg/100ml的山梨糖、0.9/100ml玉米漿、0.1/100ml的尿素、0.04mg/100ml的MgSO4·7H2O、0.08mg/100ml的KH2PO4，發(fā)酵初始培養(yǎng)基PH值為7.0，其中流加濃度為250mg/ml的山梨糖，初始山梨糖與其它培養(yǎng)基分開滅菌。本實施中，發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量93.2mg/ml，發(fā)酵周期47h，產(chǎn)酸速率1.98g/l/h。實施例3本實施例的制備方法與實施例1相同，不同之處僅為第一發(fā)酵階段，控制發(fā)酵液PH值為6.5，第二發(fā)酵階段～第五發(fā)酵階段控制發(fā)酵液PH值為6.4。本實施例中，發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量94.3mg/ml，發(fā)酵周期45h，產(chǎn)酸速率2.0g/l/h。實施例4本實施例的制備方法與實施例1相同，不同之處僅為第一發(fā)酵階段，發(fā)酵7h，第二發(fā)酵階段，發(fā)酵5h，第三發(fā)酵階段，發(fā)酵19h，第四發(fā)酵階段，發(fā)酵5h，第五發(fā)酵階段至發(fā)酵終點。本實施例中，發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量92.8mg/ml，發(fā)酵周期47h，產(chǎn)酸速率1.97g/l/h。實施例5本實施例的制備方法與實施例1相同，不同之處僅為第一發(fā)酵階段，發(fā)酵5h，第二發(fā)酵階段，發(fā)酵3h，第三發(fā)酵階段，發(fā)酵21h，第四發(fā)酵階段，發(fā)酵7h，第五發(fā)酵階段至發(fā)酵終點。本實施例中，發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量94.6mg/ml，發(fā)酵周期48h，產(chǎn)酸速率1.97g/l/h。實施例6發(fā)酵初始培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比，包括山梨糖2mg/100ml，玉米漿1.2mg/100ml、KH2PO40.05mg/100ml、MgSO4.7H2O0.02mg/100ml、尿素0.2mg/100ml，初始PH為6.7，其中流加濃度為200mg/ml的山梨糖，初始山梨糖與其它培養(yǎng)基分開滅菌。本發(fā)明提高古龍酸產(chǎn)酸的發(fā)酵方法包括以下步驟：(1)將培養(yǎng)好的氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌的混合菌液52L接入到180L含有2mg/100ml的山梨糖，1.2mg/100ml玉米漿、0.2mg/100ml尿素、0.02mg/100mlMgSO4·7H2O、0.05mg/100mlKH2PO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵容器采用500L自動發(fā)酵罐；(2)第一發(fā)酵階段：控制發(fā)酵液PH值為6.5～6.7，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣比1：0.4vvm，在步驟(1)所得的混合物中流加400mg/ml葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度保持在1～3mg/ml，培養(yǎng)6h；(3)第二發(fā)酵階段：控制發(fā)酵液PH值為6.0～6.4，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣比1：0.4vvm，在步驟(2)所得的發(fā)酵液中流加400mg/ml的葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度保持在1～3mg/ml，培養(yǎng)4h；(4)第三發(fā)酵階段：在步驟(3)所得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速240rpm，通氣比1：0.6vvm，培養(yǎng)20h；(5)第四發(fā)酵階段：在步驟(4)所得發(fā)酵液的基礎(chǔ)上，用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速280rpm，通氣比1：0.8vvm，培養(yǎng)6h，在培養(yǎng)的過程中流加牛肉蛋白胨，牛肉蛋白胨的流加量與發(fā)酵液終體積的質(zhì)量體積比為0.2g/100ml；(6)第五發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速280rpm，通氣比1：0.8vvm，培養(yǎng)至發(fā)酵終點，用時9h。在整個發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)?山梨糖)降低到15mg/ml時，流加250mg/ml的山梨糖，使山梨糖濃度保持在15～20mg/ml，溫度控制30℃。發(fā)酵液終點2--酮基-L-古龍酸含量107mg/ml，發(fā)酵周期45h，產(chǎn)酸速率2.37g/l/h。對比例1本對比例中發(fā)酵初始培養(yǎng)基與實施例1相同，具體的制備方法包括如下步驟：(1)將培養(yǎng)好的氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌的混合菌液3L，接入到10L含有2mg/100ml的山梨糖、1.2mg/100ml玉米漿、0.2mg/100ml尿素、0.02mg/100mlMgSO4·7H2O、0.05mg/100mlKH2PO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵容器采用30L自動發(fā)酵罐。(2)第一發(fā)酵階段：控制發(fā)酵液PH值為6.7，攪拌轉(zhuǎn)速350rpm，通氣比1：0.6vvm，培養(yǎng)6h；(3)第二發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速350rpm，通氣比1：0.6vvm，培養(yǎng)4h；(4)第三發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速380rpm，通氣比1：0.8vvm，培養(yǎng)20h；(5)第四發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速450rpm，通氣比1：1.2vvm，培養(yǎng)至發(fā)酵終點，用時20h。在整個發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)?山梨糖)降低到15mg/ml時，流加200mg/ml的山梨糖，使山梨糖濃度保持在15～20mg/ml，溫度控制30℃。本對比例中，發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量82.26mg/ml，發(fā)酵周期50h，產(chǎn)酸速率1.65g/l/h。實施例1中，發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量95.1mg/ml，發(fā)酵周期46h，產(chǎn)酸速率2.0g/l/h。實施例1較對比例1產(chǎn)酸提高12.84％，周期縮短4h，產(chǎn)酸速率提高0.35g/l/h，產(chǎn)酸速率提高了21.2％。在發(fā)酵過程中通過鏡檢觀察對比例1和實施例1大小菌的比例(如表1)，可以發(fā)現(xiàn)在前期流加葡萄糖和在中后期流加牛肉蛋白胨可以優(yōu)化大小菌的比例關(guān)系，提高產(chǎn)酸。表1發(fā)酵過程中大小菌的比例關(guān)系項目10h(大菌：小菌)20h(大菌：小菌)30h(大菌：小菌)40h(大菌：小菌)對比例16：45：54：62：8實施例17：35：53：71：9對比例2本對比例中發(fā)酵初始培養(yǎng)基與實施例6相同，具體的制備方法包括如下步驟：(1)將培養(yǎng)好的氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌的混合菌液52L，接入到180L含有2mg/100ml的山梨糖、1.2mg/100ml玉米漿、0.2mg/100ml尿素、0.02mg/100mlMgSO4·7H2O、0.05mg/100mlKH2PO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵容器采用500L自動發(fā)酵罐。(2)第一發(fā)酵階段：控制發(fā)酵液PH值為6.7，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣比1：0.4vvm，培養(yǎng)6h；(3)第二發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣比1：0.4vvm，培養(yǎng)4h；(4)第三發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速240rpm，通氣比1：0.6vvm，培養(yǎng)20h；(5)第四發(fā)酵階段：用碳酸鈉溶液控制發(fā)酵液PH值為6.4，攪拌轉(zhuǎn)速450rpm，通氣比1：1.2vvm，培養(yǎng)至發(fā)酵終點，用時18h。在整個發(fā)酵過程中當(dāng)殘?zhí)?山梨糖)降低到15mg/ml時，流加250mg/ml的山梨糖，使山梨糖濃度保持在15～20mg/ml，溫度控制30℃。對比例2發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量90mg/ml，發(fā)酵周期48h，產(chǎn)酸速率1.875g/l/h。實施例6發(fā)酵液終點2-酮基-L-古龍酸含量107mg/ml，發(fā)酵周期45h，產(chǎn)酸速率2.37g/l/h。實施例6較對比例2產(chǎn)酸提高17％，周期縮短3h，產(chǎn)酸速率較對照組提高0.5g/l/h，產(chǎn)酸速率提高了26.4％。在發(fā)酵過程中通過鏡檢觀察對比例2和實施例6大小菌的比例(如表2)，可以發(fā)現(xiàn)在前期流加葡萄糖和在中后期流加牛肉蛋白胨可以優(yōu)化大小菌的比例關(guān)系，提高產(chǎn)酸。表2發(fā)酵過程中大小菌的比例關(guān)系項目10h(大菌：小菌)20h(大菌：小菌)30h(大菌：小菌)40h(大菌：小菌)對比例26：45：54：62：8實施例67：35：53：71：9由此可見，本發(fā)明可以提高發(fā)酵終點古龍酸的含量，提高產(chǎn)酸濃度，提升發(fā)酵生產(chǎn)效率，并且成功運用在500L發(fā)酵罐。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。