京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠及其制備方法，首先通過酸降解彈性蛋白制得水溶性彈性蛋白α-彈性蛋白，然后利用α-彈性蛋白的溫敏性通過京尼平對其進行交聯(lián)制備出彈性蛋白水凝膠。通過此方法制得的彈性蛋白水凝膠具有溫敏性：在室溫下為液態(tài)，高于室溫時凝聚形成凝膠。同時本發(fā)明制得的水凝膠具有多孔結構，在藥物釋放方面具有很好的應用前景。
【專利說明】京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子生物材料領域，涉及交聯(lián)改性彈性蛋白的方法，更具體的講，涉及利用京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠及其制備方法。
【背景技術】
[0002]彈性蛋白是一種重要的細胞外基質蛋白，主要存在于韌帶、肺、大動脈及皮膚等經常受力而變形的器官中，主要功能是為所在組織和器官提高抵抗反復壓縮和變形的能力。彈性蛋白作為細胞外基質的主要成分，具有很好的生物相容性，但由于其高度不溶性導致難以加工成形，限制了在生物工程領域的應用。因此通過對彈性蛋白進行酸降解得到的水解產物被頻繁應用于合成彈性蛋白基復合材料。雖然酸降解后的結構存在多樣性，但是其保持了彈性蛋白的氨基酸組成，仍然保持了彈性蛋白的諸多優(yōu)點。
[0003]同時，彈性蛋白酸降解產物具有自組裝和相轉變的特征。當溫度高于某一溫度時，其通過分子間氫鍵作用發(fā)生自組裝，從而導致發(fā)生凝聚，進而發(fā)生相分離。凝聚過程不僅受溫度影響，同時溶液的濃度、PH值、鹽濃度及雜質的影響，這些因素主要通過影響分子間疏水基團作用影響凝聚過程。盡管如此，彈性蛋白基材料依然是一個有待于進一步深入研究的領域。
[0004]彈性蛋白酸降解產物雖然具有溫度敏感性，但是降解后彈性蛋白力學性能較差，故一般需要對降解后彈性蛋白進行改性才能進一步應用。本實驗室成功的采用交聯(lián)方法制備彈性蛋白水凝膠。目前常利用的化學交聯(lián)劑有戊二醛，己二異氰酸酯，碳化二亞胺等，但是都具有很高的細胞毒性或交聯(lián)的組織在植入后產生鈣化現象。而京尼平作為交聯(lián)劑，不僅能形成穩(wěn)定的交聯(lián)制品，與戊二醛相比還具有細胞毒性小和應用領域廣泛等優(yōu)點，是一種非常有前途的交聯(lián)劑。所以本發(fā)明在此基礎上成功利用京尼平對彈性蛋白進行交聯(lián)同時制備出易于加工成形的彈性蛋白基水凝膠材料。
【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的技術目的旨在克服現有技術的不足，采用京尼平交聯(lián)彈性蛋白方法制備彈性蛋白水凝膠，成功的通過交聯(lián)方法制備出易于加工成形的彈性蛋白基水凝膠材料，即在保持彈性蛋白生物相容性的基礎上，首先通過酸降解彈性蛋白制得水溶性彈性蛋白，然后采用京尼平對其進行交聯(lián)，探索彈性蛋白基水凝膠的制備方法及其性能研究。
[0006]本發(fā)明的技術目的通過下述技術方案予以實現:
[0007]京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠，按照下述步驟進行:
[0008]步驟1，將α -彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌下使其完全懸浮于水中；其中α -彈性蛋白溶液濃度為50-200mg/mL，攪拌時間為30min。
[0009]步驟2，將質量分數為1%的京尼平水溶液加入步驟I制得的懸浮液中進行交聯(lián)反應并定形，定形后用蒸餾水清洗表面未反應的京尼平小分子至清洗完全，制得彈性蛋白水凝膠；其中所述京尼平與彈性蛋白質量比為0.5-5%，優(yōu)選0.5-1%;交聯(lián)反應溫度為10-20°C，時間為12-24h ;定形溫度為37°C，時間為2_5h。
[0010]在步驟I中，選用的α-彈性蛋白可購于sigma，分子量為70— 72KD (數均)，也可根據文獻(Partridge S M, DavisH F，Biochem.J., 61, 21 (1955))按照如下步驟進行制備:
[0011](I)用草酸溶液煮沸降解彈性蛋白，脫除脂肪及其他類型蛋白質；
[0012](2)用草酸溶液煮沸降解(I)制得的彈性蛋白至全部降解，得到水解彈性蛋白。
[0013](3)使用氫氧化鈉溶液調節(jié)(2)所得的溶液pH值，收集沉淀。
[0014](4)清洗(3)收集的沉淀，凍干，得到α-純凈彈性蛋白，備用。
[0015]在上述α-彈性蛋白的制備過程中，所述步驟(I)基質材料為牛頸韌帶經丙酮浸泡進行初步脫脂，浸泡時間為24h，并切成約5mmX5mmX5mm規(guī)則粒狀得到；所述的草酸溶液濃度為0.3-0.7mol/L,降解時間為30_60min ;用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質。
[0016]所述步驟(2)所用草酸溶液濃度為l_2mol/L，降解時間為4_6h。
[0017]所述步驟(3)所用氫氧化鈉溶液濃度為l-6mol/L，調節(jié)pH值到4_5，彈性蛋白凝聚形成沉淀。
[0018]所述步驟(·4)沉淀采用大量蒸餾水除去小分子物質；凍干時間為24h ;凍干后彈性蛋白研磨成細粉狀。
[0019]本發(fā)明的反應原理為:京尼平上的烯碳原子受到彈性蛋白中游離氨基的親核進攻，開環(huán)形成雜環(huán)胺化合物，然后是京尼平上的酯基團與氨基反應生成酰胺，同時釋放出甲醇，從而發(fā)生交聯(lián)反應。
[0020]本發(fā)明將凍干彈性蛋白粉末與交聯(lián)后水凝膠進行掃描電鏡對比分析(如圖1和圖2所示)，發(fā)現交聯(lián)后彈性蛋白水凝膠具有明顯的網狀結構，而未交聯(lián)的彈性蛋白粉末呈現顆粒狀，由此可以證明彈性蛋白與京尼平發(fā)生了交聯(lián)反應形成了網狀結構。
[0021]同時，本發(fā)明對凍干后的水凝膠進行了交聯(lián)度測試，研究發(fā)現當京尼平/彈性蛋白質量比為1.5%時，交聯(lián)度已經達到90%，并且隨著質量比的增大，交聯(lián)度逐步增大。對不同質量配比的水凝膠進行了溶脹動力學研究，研究發(fā)現:隨著交聯(lián)劑質量比的增大溶脹效果逐漸變弱，交聯(lián)劑/彈性蛋白質量比為0.6-0.8%時溶脹效果最佳。
[0022]本發(fā)明技術方案采用的原料價格低廉；制備方法簡單，易于掌握；基于此種方法制備的彈性蛋白水凝膠具有溫敏性，在室溫下為液態(tài)，當溫度高于室溫時形成凝膠，易于加工成形。同時由于水凝膠的多孔結構，為其在藥物釋放上的應用奠定了良好的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是凍干α -彈性蛋白SEM照片(130Χ )。
[0024]圖2是凍干后交聯(lián)彈性蛋白SEM照片(97X )。
【具體實施方式】
[0025]下面結合【具體實施方式】進一步說明本發(fā)明的技術方案:
[0026]實施例1
[0027](I)取新鮮牛頸韌帶，用丙酮浸泡24小時，進行初步脫脂，揮干，并切成約5mmX5mmX5mm規(guī)則粒狀；用0.3mol/L草酸溶液沸騰降解彈性蛋白40分鐘,進一步脫除脂肪及其他類型蛋白質；用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質。
[0028](2)用0.6mol/L草酸溶液沸騰降解步驟(I)得到的彈性蛋白6小時至全部降解，得到水解彈性蛋白。
[0029](3 )使用NaOH濃溶液調節(jié)(2 )制得的溶液pH值至中性。
[0030](4)將(3)所得的溶液進行透析，凍干，得到彈性蛋白酸降解產物，備用。
[0031](5)稱取(4)制備的α -彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌30min使其完全懸浮于水中，濃度為50mg/mL。
[0032](6)將質量比為1%京尼平溶液加入(5)制得的懸浮液中于10°C下交聯(lián)24h，于37°C下定形12h，后用蒸餾水清洗表面未反應的京尼平小分子至清洗完全。制得彈性蛋白水凝膠。
[0033]實施例2
[0034](I)取新鮮牛頸韌帶，用丙酮浸泡24小時，進行初步脫脂，揮干，并切成約5mmX5mmX5mm規(guī)則粒狀；用0.4mol/L草酸溶液沸騰降解彈性蛋白40分鐘,進一步脫除脂肪及其他類型蛋白質；用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質。
[0035](2)用0.8mol/L草酸溶液沸騰降解步驟(I)得到的彈性蛋白5.5小時至全部降解，得到水解彈性蛋白。
[0036](3 )使用NaOH濃溶液調節(jié)(2 )制得的溶液pH值至中性。
[0037](4)將(3)所得的溶液進行透析，凍干，得到彈性蛋白酸降解產物，備用。
[0038](5)稱取(4)制備的α -彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌30min使其完全懸浮于水中，濃度為75mg/mL。
[0039](6)將質量比為2%京尼平溶液加入(5)制得的懸浮液中于15°C下交聯(lián)20h，于37°C下定形10h，后用蒸餾水清洗表面未反應的京尼平小分子至清洗完全。制得彈性蛋白水凝膠。
[0040]實施例3
[0041](I)取新鮮牛頸韌帶，用丙酮浸泡24小時，進行初步脫脂，揮干，并切成約5mmX5mmX5mm規(guī)則粒狀；用0.5mol/L草酸溶液沸騰降解彈性蛋白30分鐘,進一步脫除脂肪及其他類型蛋白質；用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質。
[0042](2)用l.0mol/L草酸溶液沸騰降解步驟(I)得到的彈性蛋白3.5小時至全部降解，得到水解彈性蛋白。
[0043](3 )使用NaOH濃溶液調節(jié)(2 )制得的溶液pH值至中性。
[0044](4)將(3)所得的溶液進行透析，凍干，得到彈性蛋白酸降解產物，備用。
[0045](5)稱取(4)制備的α -彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌30min使其完全懸浮于水中，濃度為100mg/mL。
[0046](6)將質量比為0.5%京尼平溶液加入(5)制得的懸浮液中于20°C下交聯(lián)12h，于37°C下定形10h，后用蒸餾水清洗表面未反應的京尼平小分子至清洗完全。制得彈性蛋白水凝膠。
[0047]實施例4
[0048](I)取新鮮牛頸韌帶，用丙酮浸泡24小時，進行初步脫脂，揮干，并切成約5mmX5mmX5mm規(guī)則粒狀；用0.6mol/L草酸溶液沸騰降解彈性蛋白30分鐘,進一步脫除脂肪及其他類型蛋白質；用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質。
[0049](2)用1.2mol/L草酸溶液沸騰降解步驟(I)得到的彈性蛋白3小時至全部降解，得到水解彈性蛋白。
[0050](3 )使用NaOH濃溶液調節(jié)(2 )制得的溶液pH值至中性。
[0051](4)將(3)所得的溶液進行透析，凍干，得到彈性蛋白酸降解產物，備用。
[0052](5)稱取(4)制備的α -彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌30min使其完全懸浮于水中，濃度為150mg/mL。
[0053](6)將質量比為5%京尼平溶液加入(5)制得的懸浮液中于10°C下交聯(lián)20h，于37°C下定形15h，后用蒸餾水清洗表面未反應的京尼平小分子至清洗完全。制得彈性蛋白水凝膠。
[0054]以上對本發(fā)明做了示例性的描述，應該說明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領域技術人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的 保護范圍 。
【權利要求】
1.京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠，其特征在于，按照下述步驟進行: 步驟1，將α-彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌下使其完全懸浮于水中；其中α -彈性蛋白溶液濃度為50-200mg/mL，攪拌時間為30min ； 步驟2，將質量分數為1%的京尼平水溶液加入步驟I制得的懸浮液中進行交聯(lián)反應并定形，定形后用蒸餾水清洗表面未反應的京尼平小分子至清洗完全，制得彈性蛋白水凝膠；其中所述京尼平與彈性蛋白質量比為0.5-5% ;交聯(lián)反應溫度為10-20°C，時間為12-24h ;定形溫度為37°C，時間為2-5h。
2.根據權利要求1所述的京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠，其特征在于，在所述步驟2中，京尼平與彈性蛋白質量比為0.5-1%。
3.根據權利要求1所述的京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠，其特征在于，所述α-彈性蛋白購于sigma，分子量為70— 72KD (數均)。
4.根據權利要求1所述的京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠，其特征在于，所述α-彈性蛋白按照如下步驟進行制備: (1)用草酸溶液煮沸降解彈性蛋白，脫除脂肪及其他類型蛋白質； (2)用草酸溶液煮沸降解(I)制得的彈性蛋白至全部降解，得到水解彈性蛋白。 (3)使用氫氧化鈉溶液調節(jié)(2)所得的溶液pH值，收集沉淀； (4)清洗(3)收集的沉淀，凍干，得到純凈α-彈性蛋白，備用； 在上述彈性蛋白的制備過程.中，所述步驟(I)基質材料為牛頸韌帶經丙酮浸泡進行初步脫脂，浸泡時間為24h，并切成約5mmX5mmX5mm規(guī)則粒狀得到；所述的草酸溶液濃度為0.3-0.7mol/L,降解時間為30_60min ;用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質； 所述步驟(2)所用草酸溶液濃度為l-2mol/L，降解時間為4_6h ； 所述步驟(3)所用氫氧化鈉溶液濃度為l_6mol/L，調節(jié)pH值到4-5，彈性蛋白凝聚形成沉淀； 所述步驟(4)沉淀采用大量蒸餾水除去小分子物質；凍干時間為24h ;凍干后彈性蛋白研磨成細粉狀。
5.京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于，按照下述步驟進行: 步驟1，將α-彈性蛋白粉末后加入蒸餾水磁力攪拌下使其完全懸浮于水中；其中α -彈性蛋白溶液濃度為50-200mg/mL，攪拌時間為30min ； 步驟2，將質量分數為1%的京尼平水溶液加入步驟I制得的懸浮液中進行交聯(lián)反應并定形，定形后用蒸餾水清洗表面未反應的京尼平小分子至清洗完全，制得彈性蛋白水凝膠；其中所述京尼平與彈性蛋白質量比為0.5-5% ;交聯(lián)反應溫度為10-20°C，時間為12-24h ;定形溫度為37°C，時間為2-5h。
6.根據權利要求5所述的京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于，在所述步驟2中，京尼平與彈性蛋白質量比為0.5-1%。
7.根據權利要求5所述的京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于，所述α -彈性蛋白購于sigma，分子量為70— 72KD (數均)。
8.根據權利要求5所述的京尼平交聯(lián)彈性蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于，所述α-彈性蛋白按照如下步驟進行制備: (I)用草酸溶液煮沸降解彈性蛋白，脫除脂肪及其他類型蛋白質；(2)用草酸溶液煮沸降解(I)制得的彈性蛋白至全部降解，得到水解彈性蛋白。 (3)使用氫氧化鈉溶液調節(jié)(2)所得的溶液pH值，收集沉淀； (4)清洗(3)收集的沉淀，凍干，得到純凈α-彈性蛋白，備用； 在上述彈性蛋白的制備過程中，所述步驟(I)基質材料為牛頸韌帶經丙酮浸泡進行初步脫脂，浸泡時間為24h，并切成約5mmX5mmX5mm規(guī)則粒狀得到；所述的草酸溶液濃度為0.3-0.7mol/L,降解時間為30_60min ;用蒸餾水洗凈表面油脂及其他類型蛋白質； 所述步驟(2)所用草酸溶液濃度為l-2mol/L，降解時間為4_6h ； 所述步驟(3)所用氫氧化鈉溶液濃度為l-6mol/L，調節(jié)pH值到4-5，彈性蛋白凝聚形成沉淀； 所述步驟(4)沉淀采用大量蒸餾水除去小分子物質；凍干時間為24h ;凍干后彈性蛋白研磨成細粉 狀。
【文檔編號】C08K5/1545GK103435821SQ201310389232
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權日:2013年8月29日
【發(fā)明者】侯信, 閆玉芳, 尚躍再 申請人:天津大學