專利名稱：一種復(fù)合三維組織工程支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種復(fù)合三維組織工程支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)人體組織或器官由于外傷或病變受到損傷以后，在臨床上，人們通常采用自體組織移植、異體組織移植和應(yīng)用人工合成代用品的方法來(lái)對(duì)損傷的組織和器官給予修復(fù)治療。然而，這些方法都存在著這樣那樣的不足，如自體組織移植必須以犧牲人體部分正常組織為代價(jià)來(lái)修復(fù)病理或缺損組織；異體組織移植會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，而且一些組織的供體如腎臟、肝臟嚴(yán)重不足；人工合成代用品近年來(lái)雖然應(yīng)用較為廣泛，但仍然存在異物反應(yīng)、感染等風(fēng)險(xiǎn)。組織工程學(xué)近10多年的發(fā)展成為解決上述問題的ー個(gè)契機(jī)。組織工程學(xué)是應(yīng)用生命科學(xué)與工程原理及方法構(gòu)建ー個(gè)生物裝置來(lái)維護(hù)、增進(jìn)人體細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)，以恢復(fù)受損組織或器官的功能，這有可能從根本上解決組織和器官缺損所致功能障礙或喪失的問題。它是利用了生物可降解材料做成三維支架，使生物體的細(xì)胞在其表面和內(nèi)部繁殖增長(zhǎng)，形成或長(zhǎng)出相應(yīng)的組織或器官，材料在完成這一任務(wù)后就自動(dòng)降解消失，從而解決了異體排斥問題。因而，組織工程學(xué)成為人們近20多年研究的熱點(diǎn)，其中組織工程支架材料及其支架的制備技術(shù)成為目前人們研究的主要對(duì)象之一。PHB (聚0 -羥基丁酸酷)是微生物在不平衡生長(zhǎng)條件下儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)的ー種天然高分子聚合物，廣泛存在于自然界許多原核生物中。它不僅具有優(yōu)良的機(jī)械性能，而且具有良好的生物可降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性、無(wú)毒性、無(wú)刺激性等特殊性質(zhì)。特別是其本身具有ー些有利于細(xì)胞附著和分化的信息，是用來(lái)做仿生細(xì)胞外機(jī)制的理想材料。 因而，PHB這些良好的特點(diǎn)，使其作為組織工程支架用材料在軟骨、皮膚、心臟瓣膜、血管、神經(jīng)等組織工程方面得到應(yīng)用。但是PHB材料本身的ー些不足，如結(jié)晶度高，造成材料在宏觀上表現(xiàn)出較大的脆性及其在體內(nèi)降解速度較慢等。這些缺點(diǎn)限制了 PHB在組織工程中的應(yīng)用發(fā)展。在組織工程中，多孔三維細(xì)胞支架起著非常重要的作用，它不僅影響細(xì)胞的生物學(xué)行為和培養(yǎng)的效率，而且決定著移植后能否與機(jī)體很好的適應(yīng)、結(jié)合和修復(fù)，是限制組織工程能否應(yīng)用于臨床的一個(gè)關(guān)鍵因素。細(xì)胞支架不僅為特定細(xì)胞提供支撐作用，而且還起到模板作用，引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)。因此，在組織工程中，除了考慮材料的化學(xué)性質(zhì)、表面性能外，還應(yīng)考慮支架的結(jié)構(gòu)，如孔隙形態(tài)、大小、連通性、孔隙率等，以利于細(xì)胞的黏附、滲透和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳送及代謝產(chǎn)物的交換，而支架的結(jié)構(gòu)取決于三維支架制備方法及其エ藝。此外，支架在體內(nèi)的降解速率也是ー個(gè)必須要考慮的因素，它必須要與組織部位的生長(zhǎng)修復(fù)速度相一致。因而，研究降解速率可調(diào)控的PHB多孔支架對(duì)PHB多孔支架用于臨床有著非常重要的實(shí)際意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種復(fù)合三維組織工程支架。該支架不但有良好的組織相容性，而且支架降解程度明顯，同時(shí)支架內(nèi)的纖維結(jié)構(gòu)增加了細(xì)胞的附著空間，防止了表層種植細(xì)胞的流失；支架的降解速率可適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的要求，其結(jié)構(gòu)與性能完全適合細(xì)胞鋪展、黏附、生長(zhǎng)和増殖，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了良好的微環(huán)境。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種復(fù)合三維組織工程支架， 其特征在于，由纖維膜一和纖維膜ニ以及設(shè)置于纖維膜和纖維膜ニ之間的多孔膜片復(fù)合制成；所述纖維膜一和纖維膜ニ均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片為PHB多孔膜片、PLLA多孔膜片或PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片；所述親水性PHB纖維束由以下質(zhì)量百分含量的原料經(jīng)混合紡絲制成10% 20%親水性聚合物、0% 45% PLLA和40% 80% PHB, 其中親水性聚合物為甲基丙烯酸聚合物、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚こニ醇、聚氧こ烯、聚こ 烯醇或聚こ烯吡咯烷酮。上述的一種復(fù)合三維組織工程支架，所述PHB多孔膜片是采用PHB為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為50% 90%的多孔膜片；所述PLLA多孔膜片是采用 PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為50% 90%的多孔膜片；所述PHB/ PLLA復(fù)合多孔膜片是采用PHB和PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為 50% 90%的復(fù)合多孔膜片，其中PHB和PLLA的質(zhì)量比為I 10 I 10。上述的一種復(fù)合三維組織工程支架，所述PHB的粘均分子量為1.5X105 6. 5 X 105，質(zhì)量純度為99%以上；所述PLLA的粘均分子量為0. 5 X IO5 5. 5X105，質(zhì)量純度為99%以上。本發(fā)明還提供了上述復(fù)合三維組織工程支架的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟步驟一、制備多孔膜片以PHB、PLLA或PHB和PLLA為原料，采用溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備PHB多孔膜片、PLLA多孔膜片或PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片；步驟ニ、制備親水性PHB纖維束201、將親水性聚合物溶于有機(jī)溶劑中，攪拌使親水性聚合物完全溶解，得到親水性聚合物濃度為5g/L 25g/L的溶液；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷、ニ氯こ烷、三氯甲烷、ニ 氯甲烷或四氯甲烷；202、向201中所述溶液中加入PHB或PHB和PLLA，然后加入有機(jī)溶劑，攪拌溶解， 得到溶質(zhì)總質(zhì)量濃度為0. 5% 6%的紡絲溶液；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷、ニ氯こ烷、三氯甲烷、ニ氯甲烷或四氯化碳；203、將202中所述紡絲溶液靜置脫泡后送入噴絲板擠出形成紡絲細(xì)流，然后通過溫度為50°C 60°C的熱空氣進(jìn)行熱質(zhì)交換，形成紡絲；204、將203中所述紡絲以40m/min 45m/min的卷繞速度進(jìn)行卷繞；205、用牽伸機(jī)將204中經(jīng)卷繞后的紡絲進(jìn)行牽伸，定型后裁剪，得到親水性PHB纖維束；步驟三、制備纖維膜將205中所述親水性PHB纖維束按30° 90°角度(相鄰兩層纖維束之間的夾角為30° 90° )交叉鋪覆疊加成纖維片，然后將疊加好的纖維片夾在兩塊模板的中間，置于溫度為100°C 130°C的烘箱中進(jìn)行熱定型，冷卻后得到纖維膜；
步驟四、多孔膜片與纖維膜復(fù)合制備復(fù)合三維組織工程支架401、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕步驟一中所述多孔膜片ー側(cè)和步驟三中所述纖維膜ー側(cè)；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷、ニ氯こ烷、三氯甲烷、ニ氯甲烷或四氯化碳；402、將401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的多孔膜片的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面相對(duì)疊放，然后對(duì)疊放的多孔膜片和纖維膜施壓，使多孔膜片和纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料；403、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕402中所述纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)，然后將另一片401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)相對(duì)疊放，施壓使纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料與纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷、ニ氯こ烷、三氯甲烷、 ニ氯甲烷或四氯化碳；404、將403中所述纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料用模板固定后置于真空干燥箱中干燥，以除去有機(jī)溶劑，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合三維組織工程支架。上述的方法，步驟一中所述多孔膜片的制備過程為將原料溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至原料充分溶解得到溶液，向溶液中加入溶液質(zhì)量的35% 85%的致孔劑，攪拌均勻后倒入模具中制成樣片；然后將樣片與模具一同置于空氣中，待溶劑自然揮發(fā)后再置于真空干燥箱內(nèi)干燥，除去殘留的有機(jī)溶劑；接著將樣片從模具中取出置于蒸餾水中浸泡30小吋 60小時(shí)以溶去致孔劑；最后將經(jīng)浸泡后的樣片在室溫下干燥15小吋 30小時(shí)，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥15小吋 30小時(shí)，得到多孔膜片。上述的方法，所述致孔劑為粒度為200目的氯化鈉。上述的方法，所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷、ニ氯こ烷、三氯甲烷、ニ氯甲烷或四氯化碳；所述有機(jī)溶劑的用量為原料質(zhì)量的I 3倍。上述的方法，203中所述噴絲板的溫度為15°C 25°C。上述的方法，205中所述牽伸的牽伸倍率為6 8倍。上述的方法，205中所述定型的溫度為60°C 130°C。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架采用親水性PHB纖維束/多孔膜片/親水性 PHB纖維束復(fù)合“夾芯”的結(jié)構(gòu)，使三維組織工程支架不但有一定的力學(xué)性能，而且富有一定的弾性。2、本發(fā)明采用溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備多孔膜片，制備的多孔膜片孔分布均勻，且多為通孔。3、本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架采用復(fù)合“夾芯”結(jié)構(gòu)，不僅可獲得預(yù)期設(shè)計(jì)的形狀，而且可以通過調(diào)整多孔膜片的孔隙率與復(fù)合纖維的量來(lái)調(diào)節(jié)支架的降解速率。4、本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架不但有良好的組織相容性，而且支架降解程度明顯，同時(shí)支架內(nèi)的纖維結(jié)構(gòu)增加了細(xì)胞的附著空間，防止了表層種植細(xì)胞的流失。5、本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架的降解速率可適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的要求，其結(jié)構(gòu)與性能完全適合細(xì)胞鋪展、黏附、生長(zhǎng)和増殖，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了良好的微環(huán)境。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)ー步的詳細(xì)說(shuō)明。


圖I為本發(fā)明復(fù)合三維組織工程支架的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例I制備的PHB多孔膜片的SEM電鏡照片。圖3為將細(xì)胞植入本發(fā)明復(fù)合三維組織工程支架四周后支架的SEM電鏡照片。圖4為將細(xì)胞植入本發(fā)明復(fù)合三維組織工程支架八周后支架的SEM電鏡照片。附圖標(biāo)記說(shuō)明ト纖維膜一；2-纖維膜ニ；3-多孔膜片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I如圖I所示，本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架，由纖維膜一 I和纖維膜ニ 2以及設(shè)置于纖維膜I和纖維膜ニ 2之間的多孔膜片3復(fù)合制成；所述纖維膜一 I和纖維膜ニ 2 均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片3為采用PHB為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為50%的PHB多孔膜片；所述親水性PHB纖維束由以下質(zhì)量百分含量的原料經(jīng)混合紡絲制成20%親水性聚合物和80% PHB，其中親水性聚合物為聚丙烯酰胺；所述PHB的粘均分子量為I. 5X 105，質(zhì)量純度為99%以上。本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架的制備方法為步驟一、制備多孔膜片將PHB溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至PHB充分溶解得到溶液，向溶液中加入溶液質(zhì)量的35%的致孔劑(粒度為200目的氯化鈉)，攪拌均勻后倒入模具中制成樣片；然后將樣片與模具一同置于空氣中，待溶劑自然揮發(fā)后再置于真空干燥箱內(nèi)干燥，除去殘留的有機(jī)溶劑；接著將樣片從模具中取出置于蒸餾水中浸泡30小時(shí)以溶去致孔劑；最后將經(jīng)浸泡后的樣片在室溫下干燥15小時(shí)，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥30小時(shí)，得到孔隙率為50%的PHB多孔膜片；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷；所述有機(jī)溶劑的用量為原料質(zhì)量的2. 8倍。步驟ニ、制備親水性PHB纖維束201、將2克親水性聚合物溶于200毫升有機(jī)溶劑中，攪拌使親水性聚合物完全溶解，得到親水性聚合物濃度為10g/L的透明狀溶液；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷；202、向201中所述溶液中加入8克PHB，然后加入800毫升三氯こ烷，攪拌使PHB 完全溶解，得到溶質(zhì)總質(zhì)量濃度為0. 7%的紡絲溶液；203、將202中所述紡絲溶液靜置脫泡后送入噴絲板擠出形成紡絲細(xì)流，然后通過溫度為60°C的熱空氣進(jìn)行熱質(zhì)交換，形成紡絲；所述噴絲板的溫度為25°C ；204、將203中所述紡絲以40m/min的卷繞速度進(jìn)行卷繞；205、用牽伸機(jī)將204中經(jīng)卷繞后的紡絲進(jìn)行牽伸，牽伸倍率為6倍，然后在溫度為 130°C的條件下定型，得到親水性PHB纖維束；步驟三、制備纖維膜將205中所述親水性PHB纖維束按30°角度交叉鋪覆疊加成纖維片，然后將疊加好的纖維片夾在兩塊模板的中間，置于溫度為130°C的烘箱中進(jìn)行熱定型，冷卻后得到纖維膜；步驟四、多孔膜片與纖維膜復(fù)合制備復(fù)合三維組織工程支架401、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕步驟一中所述多孔膜片ー側(cè)和步驟三中所述纖維膜ー側(cè)；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷；402、將401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的多孔膜片的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面相對(duì)疊放，然后對(duì)疊放的多孔膜片和纖維膜施壓，使多孔膜片和纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料；403、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕402中所述纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)，然后將另一片401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)相對(duì)疊放，施壓使纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料與纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料；所述有機(jī)溶劑為三氯こ烷；404、將403中所述纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料用模板固定后置于真空干燥箱中干燥，以除去有機(jī)溶劑，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合三維組織工程支架。圖2為本實(shí)施例制備的PHB多孔膜片的SEM電鏡照片，從圖中可以看出，多孔膜片孔分布均勻，且多為通孔，適宜用作組織工程支架材料。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例I相同，其中不同之處在于所述親水性聚合物為甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、聚こニ醇、聚氧こ烯、聚こ烯醇或聚こ烯吡咯烷酮。實(shí)施例3如圖I所示，本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架，由纖維膜一 I和纖維膜ニ 2以及設(shè)置于纖維膜I和纖維膜ニ 2之間的多孔膜片3復(fù)合制成；所述纖維膜一 I和纖維膜ニ 2 均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片3為采用PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為90%的多孔膜片；所述親水性PHB纖維束由以下質(zhì)量百分含量的原料經(jīng)混合紡絲制成14. 3%親水性聚合物、28. 6% PLLA和57. I % PHB ;所述親水性聚合物為聚こニ醇；所述PLLA的粘均分子量為0. 5 X 105，質(zhì)量純度為99%以上；所述PHB的粘均分子量為6. 5X105，質(zhì)量純度為99%以上。本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架的制備方法為步驟一、制備多孔膜片將PLLA溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至PLLA充分溶解得到溶液， 向溶液中加入溶液質(zhì)量的85%的致孔劑(粒度為200目的氯化鈉)，攪拌均勻后倒入模具中制成樣片；然后將樣片與模具一同置于空氣中，待溶劑自然揮發(fā)后再置于真空干燥箱內(nèi)干燥，除去殘留的有機(jī)溶劑；接著將樣片從模具中取出置于蒸餾水中浸泡60小時(shí)以溶去致孔劑；最后將經(jīng)浸泡后的樣片在室溫下干燥30小時(shí)，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥20小時(shí)，得到孔隙率為90%的PLLA多孔膜片；所述有機(jī)溶劑為ニ氯こ烷；所述有機(jī)溶劑的用量為原料質(zhì)量的I. 2倍。步驟ニ、制備親水性PHB纖維束201、將5克親水性聚合物溶于600毫升有機(jī)溶劑中，攪拌使親水性聚合物完全溶解，得到親水性聚合物濃度為8. 3g/L的透明狀溶液；所述有機(jī)溶劑為四氯化碳；202、向201中所述溶液中加入20克PHB和10克PLLA，然后加入400毫升四氯化碳，攪拌使PHB和PLLA完全溶解，得到溶質(zhì)總質(zhì)量濃度為2. I %的紡絲溶液；203、將202中所述紡絲溶液靜置脫泡后送入噴絲板擠出形成紡絲細(xì)流，然后通過溫度為50°C的熱空氣進(jìn)行熱質(zhì)交換，形成紡絲；所述噴絲板的溫度為15°C ；204、將203中所述紡絲以45m/min的卷繞速度進(jìn)行卷繞；
205、用牽伸機(jī)將204中經(jīng)卷繞后的紡絲進(jìn)行牽伸，牽伸倍率為8倍，然后在溫度為 60°C的條件下定型，得到親水性PHB纖維束；步驟三、制備纖維膜將205中所述親水性PHB纖維束按45°角度交叉鋪覆疊加成纖維片，然后將疊加好的纖維片夾在兩塊模板的中間，置于溫度為110°C的烘箱中進(jìn)行熱定型，冷卻后得到纖維膜；步驟四、多孔膜片與纖維膜復(fù)合制備復(fù)合三維組織工程支架401、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕步驟一中所述多孔膜片ー側(cè)和步驟三中所述纖維膜ー側(cè)；所述有機(jī)溶劑為ニ氯こ烷；402、將401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的多孔膜片的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面相對(duì)疊放，然后對(duì)疊放的多孔膜片和纖維膜施壓，使多孔膜片和纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料；403、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕402中所述纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)，然后將另一片401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)相對(duì)疊放，施壓使纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料與纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料；所述有機(jī)溶劑為ニ氯こ烷；404、將403中所述纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料用模板固定后置于真空干燥箱中干燥，以除去有機(jī)溶劑，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合三維組織工程支架。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例3相同，其中不同之處在于所述親水性聚合物為甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚氧こ烯、聚こ烯醇或聚こ烯吡咯烷酮。實(shí)施例5如圖I所示，本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架，由纖維膜一 I和纖維膜ニ 2以及設(shè)置于纖維膜I和纖維膜ニ 2之間的多孔膜片3復(fù)合制成；所述纖維膜一 I和纖維膜ニ 2均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片3為采用PHB和PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為70%的多孔膜片，其中PHB和PLLA的質(zhì)量比為I : 10 ;所述親水性PHB纖維束由以下質(zhì)量百分含量的原料經(jīng)混合紡絲制成17. 6%親水性聚合物、41. 2% PLLA和41. 2% PHB ;所述親水性聚合物為聚氧こ烯；所述PLLA的粘均分子量為5. 5X 105， 質(zhì)量純度為99%以上；所述PHB的粘均分子量為4. OX 105，質(zhì)量純度為99%以上。本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架的制備方法為步驟一、制備多孔膜片將PHB和PLLA溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至PHB和PLLA充分溶解得到溶液，向溶液中加入溶液質(zhì)量的50%的致孔劑(粒度為200目的氯化鈉)，攪拌均勻后倒入模具中制成樣片；然后將樣片與模具一同置于空氣中，待溶劑自然揮發(fā)后再置于真空干燥箱內(nèi)干燥，除去殘留的有機(jī)溶劑；接著將樣片從模具中取出置于蒸餾水中浸泡48 小時(shí)以溶去致孔劑；最后將經(jīng)浸泡后的樣片在室溫下干燥20小時(shí)，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥30小時(shí)，得到孔隙率為70%的PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片；所述有機(jī)溶劑為四氯化碳；所述有機(jī)溶劑的用量為原料質(zhì)量的2倍。步驟ニ、制備親水性PHB纖維束201、將15克親水性聚合物溶于600毫升有機(jī)溶劑中，攪拌使親水性聚合物完全溶解，得到親水性聚合物濃度為25g/L的透明狀溶液；所述有機(jī)溶劑為ニ氯甲烷；
202、向201中所述溶液中加入35克PHB和35克PLLA，然后加入400毫升ニ氯甲烷，攪拌使PHB和PLLA完全溶解，得到溶質(zhì)總質(zhì)量濃度為6%的紡絲溶液；203、將202中所述紡絲溶液靜置脫泡后送入噴絲板擠出形成紡絲細(xì)流，然后通過溫度為55°C的熱空氣進(jìn)行熱質(zhì)交換，形成紡絲；所述噴絲板的溫度為20°C ；204、將203中所述紡絲以42m/min的卷繞速度進(jìn)行卷繞；205、用牽伸機(jī)將204中經(jīng)卷繞后的紡絲進(jìn)行牽伸，牽伸倍率為7倍，然后在溫度為 90°C的條件下定型，得到親水性PHB纖維束；步驟三、制備纖維膜將205中所述親水性PHB纖維束按60°角度交叉鋪覆疊加成纖維片，然后將疊加好的纖維片夾在兩塊模板的中間，置于溫度為130°C的烘箱中進(jìn)行熱定型，冷卻后得到纖維膜；步驟四、多孔膜片與纖維膜復(fù)合制備復(fù)合三維組織工程支架401、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕步驟一中所述多孔膜片ー側(cè)和步驟三中所述纖維膜ー側(cè)；所述有機(jī)溶劑為ニ氯甲烷；402、將401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的多孔膜片的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面相對(duì)疊放，然后對(duì)疊放的多孔膜片和纖維膜施壓，使多孔膜片和纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料；403、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕402中所述纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)，然后將另一片401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)相對(duì)疊放，施壓使纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料與纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料；所述有機(jī)溶劑為ニ氯甲烷；404、將403中所述纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料用模板固定后置于真空干燥箱中干燥，以除去有機(jī)溶劑，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合三維組織工程支架。實(shí)施例6本實(shí)施例與實(shí)施例5相同，其中不同之處在于所述親水性聚合物為甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚こニ醇、聚こ烯醇或聚こ烯吡咯烷酮。實(shí)施例I如圖I所示，本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架，由纖維膜一 I和纖維膜ニ 2以及設(shè)置于纖維膜I和纖維膜ニ 2之間的多孔膜片3復(fù)合制成；所述纖維膜一 I和纖維膜ニ 2 均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片3為采用PHB和PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/ 粒子浙濾法制備的孔隙率為80%的多孔膜片，其中PHB和PLLA的質(zhì)量比為I : I ;所述親水性PHB纖維束由以下質(zhì)量百分含量的原料經(jīng)混合紡絲制成10%親水性聚合物、60% PHB 和30% PLLA ;所述親水性聚合物為聚こ烯吡咯烷酮；所述PLLA的粘均分子量為3. 5X 105， 質(zhì)量純度為99%以上；所述PHB的粘均分子量為3. OX 105，質(zhì)量純度為99%以上。本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架的制備方法為步驟一、制備多孔膜片將PHB和PLLA溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至PHB和PLLA充分溶解得到溶液，向溶液中加入溶液質(zhì)量的78%的致孔劑(粒度為200目的氯化鈉)，攪拌均勻后倒入模具中制成樣片；然后將樣片與模具一同置于空氣中，待溶劑自然揮發(fā)后再置于真空干燥箱內(nèi)干燥，除去殘留的有機(jī)溶劑；接著將樣片從模具中取出置于蒸餾水中浸泡50 小時(shí)以溶去致孔劑；最后將經(jīng)浸泡后的樣片在室溫下干燥15小時(shí)，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥30小時(shí)，得到孔隙率為80%的PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片；所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷；所述有機(jī)溶劑的用量為原料質(zhì)量的I倍。步驟ニ、制備親水性PHB纖維束201、將I克親水性聚合物溶于200毫升有機(jī)溶劑中，攪拌使親水性聚合物完全溶解，得到親水性聚合物濃度為5g/L的透明狀溶液；所述有機(jī)溶劑為ニ氯こ烷；202、向201中所述溶液中加入6克PHB和3克PLLA，然后加入1387毫升ニ氯こ 烷，攪拌使PHB和PLLA完全溶解，得到溶質(zhì)總質(zhì)量濃度為0. 5%的紡絲溶液；203、將202中所述紡絲溶液靜置脫泡后送入噴絲板擠出形成紡絲細(xì)流，然后通過溫度為50°C的熱空氣進(jìn)行熱質(zhì)交換，形成紡絲；所述噴絲板的溫度為20°C ；204、將203中所述紡絲以45m/min的卷繞速度進(jìn)行卷繞；205、用牽伸機(jī)將204中經(jīng)卷繞后的紡絲進(jìn)行牽伸，牽伸倍率為8倍，然后在溫度為 80°C的條件下定型，得到親水性PHB纖維束；步驟三、制備纖維膜將205中所述親水性PHB纖維束按90°角度交叉鋪覆疊加成纖維片，然后將疊加好的纖維片夾在兩塊模板的中間，置于溫度為120°C的烘箱中進(jìn)行熱定型，冷卻后得到纖維膜；步驟四、多孔膜片與纖維膜復(fù)合制備復(fù)合三維組織工程支架401、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕步驟一中所述多孔膜片ー側(cè)和步驟三中所述纖維膜ー側(cè)；所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷；402、將401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的多孔膜片的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面相對(duì)疊放，然后對(duì)疊放的多孔膜片和纖維膜施壓，使多孔膜片和纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料；403、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕402中所述纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)，然后將另一片401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)相對(duì)疊放，施壓使纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料與纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料；所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷；404、將403中所述纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料用模板固定后置于真空干燥箱中干燥，以除去有機(jī)溶劑，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合三維組織工程支架。實(shí)施例8本實(shí)施例與實(shí)施例7相同，其中不同之處在于所述親水性聚合物為甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚こニ醇、聚氧こ烯或聚こ烯醇。實(shí)施例9如圖I所示，本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架，由纖維膜一 I和纖維膜ニ 2以及設(shè)置于纖維膜I和纖維膜ニ 2之間的多孔膜片3復(fù)合制成；所述纖維膜一 I和纖維膜ニ 2 均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片3為采用PHB和PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/ 粒子浙濾法制備的孔隙率為60%的多孔膜片，其中PHB和PLLA的質(zhì)量比為10 I ;所述親水性PHB纖維束由以下質(zhì)量百分含量的原料經(jīng)混合紡絲制成15%親水性聚合物、45% PLLA和40% PHB ;所述親水性聚合物為聚こ烯醇；所述PLLA的粘均分子量為2. 5X 105，質(zhì)量純度為99%以上；所述PHB的粘均分子量為2. 5X 105，質(zhì)量純度為99%以上。本實(shí)施例的復(fù)合三維組織工程支架的制備方法為
步驟一、制備多孔膜片將PHB和PLLA溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至PHB和PLLA充分溶解得到溶液，向溶液中加入溶液質(zhì)量的45%的致孔劑(粒度為200目的氯化鈉)，攪拌均勻后倒入模具中制成樣片；然后將樣片與模具一同置于空氣中，待溶劑自然揮發(fā)后再置于真空干燥箱內(nèi)干燥，除去殘留的有機(jī)溶劑；接著將樣片從模具中取出置于蒸餾水中浸泡40 小時(shí)以溶去致孔劑；最后將經(jīng)浸泡后的樣片在室溫下干燥20小時(shí)，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥15小時(shí)，得到孔隙率為60%的PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片；所述有機(jī)溶劑為ニ氯甲烷；所述有機(jī)溶劑的用量為原料質(zhì)量的3倍；步驟ニ、制備親水性PHB纖維束201、將15克親水性聚合物溶于800毫升有機(jī)溶劑中，攪拌使親水性聚合物完全溶解，得到親水性聚合物濃度為18. 75g/L的透明狀溶液；所述有機(jī)溶劑為三氯甲烷；202、向201中所述溶液中加入40克PHB和45克PLLA，然后加入470毫升三氯甲烷，攪拌使PHB和PLLA完全溶解，得到溶質(zhì)總質(zhì)量濃度為5%的紡絲溶液；203、將202中所述紡絲溶液靜置脫泡后送入噴絲板擠出形成紡絲細(xì)流，然后通過溫度為60°C的熱空氣進(jìn)行熱質(zhì)交換，形成紡絲；所述噴絲板的溫度為25°C ；204、將203中所述紡絲以40m/min的卷繞速度進(jìn)行卷繞；205、用牽伸機(jī)將204中經(jīng)卷繞后的紡絲進(jìn)行牽伸，牽伸倍率為6倍，然后在溫度為 100°c的條件下定型，得到親水性PHB纖維束；步驟三、制備纖維膜將205中所述親水性PHB纖維束按30°角度交叉鋪覆疊加成纖維片，然后將疊加好的纖維片夾在兩塊模板的中間，置于溫度為100°c的烘箱中進(jìn)行熱定型，冷卻后得到纖維膜；步驟四、多孔膜片與纖維膜復(fù)合制備復(fù)合三維組織工程支架401、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕步驟一中所述多孔膜片ー側(cè)和步驟三中所述纖維膜ー側(cè)；所述有機(jī)溶劑為四氯化碳；402、將401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的多孔膜片的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面相對(duì)疊放，然后對(duì)疊放的多孔膜片和纖維膜施壓，使多孔膜片和纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料；403、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕402中所述纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)，然后將另一片401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)相對(duì)疊放，施壓使纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料與纖維膜貼合牢固， 得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料；所述有機(jī)溶劑為四氯化碳；404、將403中所述纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料用模板固定后置于真空干燥箱中干燥，以除去有機(jī)溶劑，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合三維組織工程支架。實(shí)施例10本實(shí)施例與實(shí)施例9相同，其中不同之處在于所述親水性聚合物為甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚こニ醇、聚氧こ烯或聚こ烯吡咯烷酮。將本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架植入兔子體內(nèi)進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架不但有良好的組織相容性，而且支架降解程度明顯，同時(shí)支架內(nèi)的纖維結(jié)構(gòu)增加了細(xì)胞的附著空間，防止了表層種植細(xì)胞的流失。將細(xì)胞植入本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架內(nèi)，采用SEM電鏡觀察支架的形態(tài)，
12如圖3所示，細(xì)胞植入四周后支架上黏附的細(xì)胞量大幅増加，支架有降解的趨勢(shì)，如圖4所示，細(xì)胞植入八周后細(xì)胞生長(zhǎng)良好，支架完全降解，說(shuō)明本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架的降解速率可適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的要求，其結(jié)構(gòu)與性能完全適合細(xì)胞鋪展、黏附、生長(zhǎng)和增殖，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了良好的微環(huán)境。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明做任何限制，凡是根據(jù)發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合三維組織工程支架，其特征在于，由纖維膜一(I)和纖維膜二(2)以及設(shè)置于纖維膜(I)和纖維膜二(2)之間的多孔膜片(3)復(fù)合制成；所述纖維膜一(I)和纖維膜二(2)均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片(3)為PHB多孔膜片、PLLA多孔膜片或PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片；所述親水性PHB纖維束由以下質(zhì)量百分含量的原料經(jīng)混合紡絲制成10% 20%親水性聚合物、O % 45% PLLA和40% 80% PHB，其中親水性聚合物為甲基丙烯酸聚合物、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種復(fù)合三維組織工程支架，其特征在于，所述PHB多孔膜片是采用PHB為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為50% 90%的多孔膜片；所述 PLLA多孔膜片是采用PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為50% 90%的多孔膜片；所述PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片是采用PHB和PLLA為原料經(jīng)溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備的孔隙率為50% 90%的復(fù)合多孔膜片，其中PHB和PLLA的質(zhì)量比為I 10 I 10。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種復(fù)合三維組織工程支架，其特征在于，所述PHB的粘均分子量為I. 5 X IO5 6. 5 X 105，質(zhì)量純度為99%以上；所述PLLA的粘均分子量為O. 5 X IO5 .5.5X105，質(zhì)量純度為99%以上。
4.一種制備如權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述復(fù)合三維組織工程支架的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟步驟一、制備多孔膜片以PHB、PLLA或PHB和PLLA為原料，采用溶劑澆鑄/粒子浙濾法制備PHB多孔膜片、PLLA多孔膜片或PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片；步驟二、制備親水性PHB纖維束.201、將親水性聚合物溶于有機(jī)溶劑中，攪拌使親水性聚合物完全溶解，得到親水性聚合物濃度為5g/L 25g/L的溶液；所述有機(jī)溶劑為三氯乙烷、二氯乙烷、三氯甲烷、二氯甲烷或四氯甲烷；.202、向201中所述溶液中加入PHB或PHB和PLLA，然后加入有機(jī)溶劑，攪拌溶解，得到溶質(zhì)總質(zhì)量濃度為O. 5% 6%的紡絲溶液；所述有機(jī)溶劑為三氯乙烷、二氯乙烷、三氯甲烷、二氯甲烷或四氯化碳；.203、將202中所述紡絲溶液靜置脫泡后送入噴絲板擠出形成紡絲細(xì)流，然后通過溫度為50V 60°C的熱空氣進(jìn)行熱質(zhì)交換,形成紡絲；.204、將203中所述紡絲以40m/min 45m/min的卷繞速度進(jìn)行卷繞；.205、用牽伸機(jī)將204中經(jīng)卷繞后的紡絲進(jìn)行牽伸，定型后裁剪，得到親水性PHB纖維束；步驟三、制備纖維膜將205中所述親水性PHB纖維束按30° 90°角度交叉鋪覆疊加成纖維片，然后將疊加好的纖維片夾在兩塊模板的中間，置于溫度為100°C 130°C的烘箱中進(jìn)行熱定型，冷卻后得到纖維膜；步驟四、多孔膜片與纖維膜復(fù)合制備復(fù)合三維組織工程支架.401、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕步驟一中所述多孔膜片一側(cè)和步驟三中所述纖維膜一側(cè)；所述有機(jī)溶劑為三氯乙烷、二氯乙烷、三氯甲烷、二氯甲烷或四氯化碳；.402、將401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的多孔膜片的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面相對(duì)疊放，然后對(duì)疊放的多孔膜片和纖維膜施壓，使多孔膜片和纖維膜貼合牢固，得到纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料；[403、用有機(jī)溶劑潤(rùn)濕402中所述纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)，然后將另一片401中經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜的潤(rùn)濕面與經(jīng)有機(jī)溶劑潤(rùn)濕的纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料的多孔膜片側(cè)相對(duì)疊放，施壓使纖維膜/多孔膜片復(fù)合材料與纖維膜貼合牢固，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料；所述有機(jī)溶劑為三氯乙烷、二氯乙烷、三氯甲烷、二氯甲烷或四氯化碳；[404、將403中所述纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合材料用模板固定后置于真空干燥箱中干燥，以除去有機(jī)溶劑，得到纖維膜/多孔膜片/纖維膜復(fù)合三維組織工程支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟一中所述多孔膜片的制備過程為 將原料溶于有機(jī)溶劑中，攪拌至原料充分溶解得到溶液，向溶液中加入溶液質(zhì)量的35% 85%的致孔劑，攪拌均勻后倒入模具中制成樣片；然后將樣片與模具一同置于空氣中，待溶劑自然揮發(fā)后再置于真空干燥箱內(nèi)干燥，除去殘留的有機(jī)溶劑；接著將樣片從模具中取出置于蒸餾水中浸泡30小時(shí) 60小時(shí)以溶去致孔劑；最后將經(jīng)浸泡后的樣片在室溫下干燥 15小時(shí) 30小時(shí)，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱中干燥15小時(shí) 30小時(shí)，得到多孔膜片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述致孔劑為粒度為200目的氯化鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為三氯乙烷、二氯乙烷、三氯甲烷、二氯甲烷或四氯化碳；所述有機(jī)溶劑的用量為原料質(zhì)量的I 3倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，203中所述噴絲板的溫度為15°C 25°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，205中所述牽伸的牽伸倍率為6 8倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，205中所述定型的溫度為60°C 130°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合三維組織工程支架，其特征在于，由纖維膜一和纖維膜二以及設(shè)置于纖維膜和纖維膜二之間的多孔膜片復(fù)合制成；所述纖維膜一和纖維膜二均由親水性PHB纖維束排列制成；所述多孔膜片為PHB多孔膜片、PLLA多孔膜片或PHB/PLLA復(fù)合多孔膜片。本發(fā)明的復(fù)合三維組織工程支架不但有良好的組織相容性，而且支架降解程度明顯，同時(shí)支架內(nèi)的纖維結(jié)構(gòu)增加了細(xì)胞的附著空間，防止了表層種植細(xì)胞的流失；復(fù)合三維組織工程支架的降解速率可適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的要求，其結(jié)構(gòu)與性能完全適合細(xì)胞鋪展、黏附、生長(zhǎng)和增殖，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了良好的微環(huán)境。
文檔編號(hào)C08J9/26GK102580155SQ201210061840
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月11日
發(fā)明者楊青芳, 艾玉峰, 董兆麟 申請(qǐng)人:楊青芳