本發(fā)明涉及通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生生物燃料的方法及適于所述方法的遺傳修飾的微生物。

背景技術(shù)：
丁醇是一種具有廣泛工業(yè)用途的重要的大宗化學(xué)品，其全球每年的產(chǎn)量是450-550萬噸。其可被用作產(chǎn)生丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯（用于涂料、塑料、紡織品、粘合劑等）、乙二醇醚（涂料、電子設(shè)備）和乙酸丁酯（油漆（paints）、油墨、涂料、合成水果調(diào)味劑）以及丁胺（產(chǎn)生殺蟲劑和藥物）和氨基樹脂的前體。其還可直接用作溶劑（用于油墨、染料等）、萃取劑（用于產(chǎn)生藥物和天然物質(zhì)例如生物堿、抗生素、激素和維生素），以及用于防凍液、化妝品和色譜分析中。丁醇還有潛力作為第二代生物燃料，在本文中稱作生物丁醇（&Dürre,2010）。其具有與汽油相似的性質(zhì)，并且其性質(zhì)優(yōu)于乙醇。特別地，由于丁醇具有更高的能量密度其可提高行車?yán)锍?，其可與汽油以任意濃度混合（而乙醇只能摻和最高達(dá)85%）并且不是吸濕性或腐蝕性的?？捎糜谶\輸?shù)纳锶剂鲜怯形Φ钠吞娲?，并且作為低濃度摻和物迅速進(jìn)入燃料市場。源自天然植物源的生物燃料比源自化石資源的燃料（例如汽油）在環(huán)境方面更加可持續(xù)，使用其可降低因燃料燃燒而釋放到大氣中的所謂化石二氧化碳（CO2）氣體的水平。此外，生物燃料可在許多地理條件下局部產(chǎn)生，并且其可減少對進(jìn)口化石能源的依賴。大多數(shù)生物燃料是通過傳統(tǒng)的基于酵母的發(fā)酵過程使用源自作物的碳水化合物作為主要碳源產(chǎn)生的，其被稱為第一代生物燃料。但是，這些作物需要被用作食物并且許多作物還需要肥料形式的高農(nóng)業(yè)投入。這些限制意味著第一代生物燃料被認(rèn)為是不可持續(xù)的，并且可實現(xiàn)的溫室氣體減少是有限的。第二代生物燃料的目標(biāo)是可持續(xù)地使用當(dāng)前作物的非食物部分或其他工業(yè)廢物以減少溫室氣體排放并減少對化石燃料的依賴。近來的1-丁醇生產(chǎn)主要是通過羰基合成（Weiβermel&Arpe,2003）。包括原油的石油化學(xué)品被裂解形成用于羰基合成過程中的丙烯。但是，所述合成過程需要使用不可再生資源，并且受制于價格昂貴和所形成產(chǎn)物的形成中的非特異性。丁醇還可通過生物生產(chǎn)方法產(chǎn)生，最常見的是丙酮-丁醇-乙醇（ABE）發(fā)酵，其從1913年起即已用于工業(yè)（&Dürre,2010）。該方法有不需要的副產(chǎn)物丙酮，通常會產(chǎn)生約為丁醇體積一半的丙酮，因而實質(zhì)上降低了產(chǎn)率。此外，該發(fā)酵方法受限于丁醇對微生物的毒性，這導(dǎo)致在低至1.5%的丁醇濃度下所述微生物的生長幾乎被完全抑制（andDürre2010）。此外，ABE發(fā)酵使用來自玉米、淀粉、木薯和甘蔗的糖作為原料。這導(dǎo)致不合需要地使用耕地用于產(chǎn)生燃料而不是食物。其還可加重森林采伐和荒漠化相關(guān)的問題。已知只有少數(shù)生物可天然地產(chǎn)生丁醇，并且其中沒有生物可從豐富的資源（例如一氧化碳——CO）以高產(chǎn)率產(chǎn)生丁醇。已知可天然地從CO產(chǎn)生丁醇的兩種生物是甲基營養(yǎng)丁酸桿菌（Butyribacteriummethylotrophicum）（其僅合成痕量丁醇（Heiskanenetal,2007））和食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans）（相對于主要發(fā)酵產(chǎn)物乙醇和乙酸，其產(chǎn)生低產(chǎn)率的1-丁醇作為副產(chǎn)物（Liouetal,2005））。多種生物已被遺傳修飾以產(chǎn)生1-丁醇，包括大腸桿菌（E.coli）、枯草桿菌（Bacillussubtilis）、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）或者短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）。但是，所有這些生物仍然依賴于糖作為原料（&Dürre,2010）。盡管已知有超過250個梭菌種，但是只有少數(shù)是遺傳上可用的。在梭菌中沒有已知的天然感受態(tài)（從細(xì)胞環(huán)境中攝入細(xì)胞外DNA），電轉(zhuǎn)化或接合是僅有的用于轉(zhuǎn)化的方法。這些問題是有效轉(zhuǎn)化梭菌種的顯著困難。大多數(shù)梭菌具有一種或多種限制性/甲基化系統(tǒng)以抵御外源DNA和噬菌體DNA，這意味著轉(zhuǎn)化尤其困難和不可預(yù)測。本文所引用出版物的書目細(xì)節(jié)見本說明書末尾部分。本發(fā)明的目標(biāo)是克服現(xiàn)有技術(shù)的一種或多種缺陷，或者至少為公眾提供已知技術(shù)的可用的替代。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，遺傳修飾的微生物能夠使用CO來產(chǎn)生1-丁醇或其前體作為主要的發(fā)酵產(chǎn)物。在第一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的一氧化碳營養(yǎng)的產(chǎn)乙酸重組微生物。在一個相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種能夠通過發(fā)酵從含CO的底物以大于約1mM或0.075g/l升發(fā)酵液的濃度產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體的產(chǎn)乙酸重組微生物。優(yōu)選地，所述微生物包含適于表達(dá)丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶的外源核酸。在一個實施方案中，所述一種或多種酶選自：硫解酶3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶丁酰-CoA脫氫酶電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B優(yōu)選地，所述微生物包含編碼一種或多種所述酶的一種或多種外源核酸。優(yōu)選地，所述編碼一種或多種酶的一種或多種核酸選自核酸SEQIDNO.1到SEQIDNO.6或其功能上等價的變體。優(yōu)選地，所述微生物包含編碼硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B的每一種的一種或多種外源核酸。優(yōu)選地，所述微生物包含編碼硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B中的一種或多種，或者優(yōu)選每一種的質(zhì)粒。在一個實施方案中，所述微生物包含編碼硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶和丁酰-CoA脫氫酶中每一種的一種或多種外源核酸。優(yōu)選地，所述微生物還包含外源的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶啟動子。優(yōu)選地，所述啟動子對應(yīng)于SEQ_IDNo.7或其功能等價變體。優(yōu)選地，所述啟動子被包含在編碼一種或多種上述酶的構(gòu)建體中。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)一種或多種酶的外源核酸，所述酶選自：磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶（Phosphotransbutyrylase）；丁酸激酶；鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶；丁醛脫氫酶；丁醇脫氫酶；雙功能丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶中的一種或多種的外源核酸。優(yōu)選地，所述微生物包含編碼丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶中的一種或多種的外源核酸。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶中的一種或多種的外源核酸。優(yōu)選地，所述微生物包含編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶中的一種或多種的一種或多種外源核酸。在具體實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶中的每一種的外源核酸。在一個實施方案中，編碼所述一種或多種酶的所述一種或多種核酸選自下文表7至10中所列舉的核酸及其功能等價變體。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)丁醇生物合成途徑中至少2種酶、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種所述酶的一種或多種核酸。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B，并表達(dá)丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶之一或兩者（或雙功能酶）的一種或多種核酸。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B，并表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶中至少一種的一種或多種核酸。優(yōu)選地，所述微生物選自一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌。在某些實施方案中，所述微生物選自:自產(chǎn)醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum）、揚氏梭菌（Clostridiumljungdahlii）、拉氏梭菌（Clostridiumragsdalei）、食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans）、Clostridiumdrakei、糞味梭菌（Clostridiumscatologenes）、淤泥丁酸桿菌（Butyribacteriumlimosum）、甲基營養(yǎng)丁酸桿菌（Butyribacteriummethylotrophicum）、伍氏醋酸桿菌（Acetobacteriumwoodii）、Alkalibaculumbacchii、Blautiaproducta、淤泥真桿菌（Eubacteriumlimosum）、熱醋穆爾氏菌（Moorellathermoacetica）、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorellathermautotrophica）、普氏產(chǎn)醋桿菌（Oxobacterpfennigii）和凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi）。優(yōu)選地，所述微生物是自產(chǎn)醇梭菌DSM23693。在一個實施方案中，本發(fā)明的重組微生物具有以登錄號DSM24138保藏在DSMZ（德國微生物菌種保藏中心，德國不倫瑞克（DeutscheSammlungfürMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Braunschweig,Germany））的微生物的鑒別特征。在第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)核苷酸SEQ_IDNO27或其功能等價變體的重組甲基轉(zhuǎn)移酶基因。在第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)SEQ_IDNO28或其功能等價的氨基酸變體的甲基轉(zhuǎn)移酶。在一個相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了包含第二方面的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的重組微生物。所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因可存在于核酸構(gòu)建體中或被整合到所述微生物的基因組中。在第四方面，本發(fā)明提供了以任意順序包含SEQ_IDNo1到6或其功能等價變體的核酸。優(yōu)選地，所述核酸包含具有圖2所示順序的SEQ_IDNo1到6。優(yōu)選地，所述核酸還包含磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶啟動子。優(yōu)選地，所述啟動子對應(yīng)于SEQ_IDNo.7或其功能等價變體。在第五方面，本發(fā)明提供了一種包含一種或多種核酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，其中當(dāng)在產(chǎn)乙酸微生物中表達(dá)時所述構(gòu)建體產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述一種或多種核酸序列編碼1-丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶。優(yōu)選地，所述核酸選自編碼硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和/或電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B的核酸。優(yōu)選地，所述一種或多種核酸序列選自SEQ_IDNO.1到SEQ_IDNO.6或其功能等價變體。在一個實施方案中，所述核酸還可選自編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶的核酸。在一個實施方案中，所述核酸選自下文表7至10中所列核酸及其功能等價變體。在一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼丁醇生物合成途徑中的至少2種酶，至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種、至少12種所述酶。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體還包含磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含另外的高活性啟動子例如丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶啟動子（SEQ_IDNo.48）、Wood-Ljungdahl基因簇啟動子（SEQ_IDNo47）、Rnf操縱子啟動子（SEQ_IDNo49）或者ATP合成酶操縱子啟動子（SEQ_IDNo50）。優(yōu)選地，所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子對應(yīng)于SEQ_IDNo.7或其功能等價變體。在第六方面，本發(fā)明提供了一種包含本文所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因的甲基化構(gòu)建體。在第七方面，本發(fā)明提供了一種包含第五方面的表達(dá)構(gòu)建體和第六方面的甲基化構(gòu)建體的組合物。優(yōu)選地，所述組合能夠產(chǎn)生可產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的重組微生物。在第八方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生重組微生物的方法，包括：a.將（i）表達(dá)構(gòu)建體和（ii）包含甲基轉(zhuǎn)移酶基因的根據(jù)所述第六方面的甲基化構(gòu)建體導(dǎo)入穿梭（shuttle）微生物；b.表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因；c.從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建體；和d.將至少所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。在一個實施方案中，步驟b中表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因是組成型的。在另一個實施方案中，步驟b中表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶是誘導(dǎo)型的。在一個實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體和表達(dá)構(gòu)建體都是在步驟C中分離的。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體是在步驟C中分離的。在一個實施方案中，只有所述表達(dá)構(gòu)建體被導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體和甲基化構(gòu)建體都被導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體如第五方面所定義。優(yōu)選地，所述重組微生物產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括：a.通過根據(jù)SEQ_IDNo28或其功能等價變體的甲基轉(zhuǎn)移酶在體外甲基化表達(dá)構(gòu)建體；b.將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物中；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體如第五方面所定義。優(yōu)選地，所述重組微生物產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述甲基轉(zhuǎn)移酶是通過在微生物中表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶基因（優(yōu)選根據(jù)SEQ_IDNo27或其功能等價變體）并分離所述甲基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的。在另外的相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括：a.將甲基轉(zhuǎn)移酶基因（優(yōu)選根據(jù)SEQ_IDNo27或其功能等價變體）導(dǎo)入穿梭微生物的基因組中；b.將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述穿梭微生物中；c.從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建體；和d.將至少所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體如第五方面所定義。優(yōu)選地，所述重組微生物產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在另外的相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括：a.通過甲基轉(zhuǎn)移酶在體外甲基化根據(jù)第五方面的表達(dá)構(gòu)建體；b.將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物中。優(yōu)選地，所述甲基轉(zhuǎn)移酶是由第二方面定義的甲基轉(zhuǎn)移酶基因或第三方面定義的甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的。優(yōu)選地，所述重組微生物產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在第九方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括：a.將（i）根據(jù)第五方面的表達(dá)構(gòu)建體和（ii）含有甲基轉(zhuǎn)移酶基因的甲基化構(gòu)建體導(dǎo)入穿梭微生物；b.表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因；c.從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建體；和d.將至少所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。在一個實施方案中，步驟b中表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因是組成型的。在另一個實施方案中，步驟b中表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶是誘導(dǎo)型的。在一個實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體和表達(dá)構(gòu)建體都是在步驟C中分離的。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體是在步驟C中分離的。在一個實施方案中，只有所述表達(dá)構(gòu)建體被導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體和甲基化構(gòu)建體都被導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物中。優(yōu)選地，所述重組微生物產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在第十方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生可產(chǎn)生1-丁醇或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的重組微生物的方法，包括：a.將（i）表達(dá)構(gòu)建體和（ii）含有甲基轉(zhuǎn)移酶基因的甲基化構(gòu)建體導(dǎo)入穿梭微生物；b.表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因；c.從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建體；和d.將至少所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。在一個實施方案中，步驟b中表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因是組成型的。在另一個實施方案中，步驟b中表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶是誘導(dǎo)型的。在一個實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體和表達(dá)構(gòu)建體都是在步驟C中分離的。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體是在步驟C中分離的。在一個實施方案中，只有所述表達(dá)構(gòu)建體被導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物。在另一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體和甲基化構(gòu)建體都被導(dǎo)入目標(biāo)微生物中。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體如第五方面所定義。優(yōu)選地，所述甲基化構(gòu)建體如第六方面所定義。在第十一方面，本發(fā)明提供了一種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體的方法，包括使用重組微生物發(fā)酵底物。優(yōu)選地，1-丁醇和/或其前體是主要發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述重組微生物如第八方面至第十方面中任一項所述。優(yōu)選地，1-丁醇和/或其前體的產(chǎn)率為每升發(fā)酵液中約0.075克（g/l）到約20g/l。在一個實施方案中，所述產(chǎn)率為約0.15g/l到約1.54g/l。在其他實施方案中，所述產(chǎn)率是約10g/l、約5g/l或約2g/l。優(yōu)選地，所述1-丁醇的產(chǎn)率最高為丁醇開始對周圍培養(yǎng)基產(chǎn)生毒性時的上限。優(yōu)選地，所述底物含有CO。優(yōu)選地，所述底物是含CO的氣態(tài)底物。在一個實施方案中，所述底物包含工業(yè)廢氣。在某些實施方案中，所述氣體是鋼鐵廠廢氣或合成氣。在一個實施方案中，所述底物通常包含高比例的CO，例如至少約20體積%至約100體積%的CO、20體積%至70體積%的CO、30體積%至60體積%的CO、40體積%至55體積%的CO。在具體實施方案中，所述底物包含約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積%的CO，或約55體積%的CO、或約60體積%的CO。雖然所述底物不必需包含任何氫氣，但是根據(jù)本發(fā)明方法，存在H2應(yīng)不會對產(chǎn)物形成不利。在具體實施方案中，存在氫氣可提高醇產(chǎn)生的整體效率。例如，在具體實施方案中，所述底物可包含約2:1、或1:1、或1:2比例的H2:CO。在一個實施方案中，所述底物包含約30體積%或更低體積的H2、20體積%或更低體積的H2、約15體積%或更低體積的H2、或者約10體積%或更低體積的H2。在其他實施方案中，所述底物流包含低濃度的H2，例如小于5體積%、或小于4體積%、或小于3體積%、或小于2體積%、或小于1體積%、或者基本不含氫氣。例如，所述底物還可包含一些CO2，例如約1體積%至約80體積%CO2、或1體積%至約30體積%CO2。優(yōu)選地，通過前述方面中任一項的方法產(chǎn)生的前體在存在磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶的條件下被轉(zhuǎn)化為1-丁醇。優(yōu)選地，所述微生物在導(dǎo)入外源核酸之前和之后都可產(chǎn)生磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶。優(yōu)選地，通過前述方面中任一項的方法產(chǎn)生的前體在存在丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和/或雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶的條件下被轉(zhuǎn)化為1-丁醇。優(yōu)選地，所述微生物在導(dǎo)入外源核酸之前和之后都可產(chǎn)生丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和/或雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶。在第十二方面，本發(fā)明提供了通過第十一方面的方法產(chǎn)生的1-丁醇或其前體。在第十三方面，本發(fā)明提供了包含本文定義的甲基化構(gòu)建體的穿梭微生物。優(yōu)選地，所述穿梭微生物還包含本文所定義的表達(dá)構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述穿梭微生物是大腸桿菌、枯草桿菌或乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）。優(yōu)選地，前述方面中任一項的甲基化構(gòu)建體包含乳糖（lac）啟動子和甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并且是被異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的。所述甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)還可被其他誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)（例如ara、tet或T7）調(diào)控。在第十四方面，本發(fā)明提供了具有選自SEQ_IDNO8到13的序列的核酸。在第十五方面，本發(fā)明提供了具有選自SEQ_IDNO16到23的序列的核酸。在第十六方面，本發(fā)明提供了至少包含SEQIDNo.7的核酸序列或其功能等價變體的核酸、至少包含SEQIDNo.7的核酸序列或其功能等價變體的核酸構(gòu)建體或載體，以及含有所述核酸或者核酸構(gòu)建體或載體的微生物。在第十七方面，本發(fā)明提供了編碼根據(jù)SEQ_IDNo28的甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸。在第十八方面，本發(fā)明提供了一種核酸，其包含編碼具有選自后文表7到10所列多肽及其任意一種或多種的功能等價變體的氨基酸序列的多肽的核酸。在第十九方面，本發(fā)明提供了含有選自后文表7到10所列核酸及其任意一種或多種的功能等價變體的核酸。在第二十方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明第十八方面或第十九方面核酸的構(gòu)建和微生物。在第二十一方面，本發(fā)明提供了具有選自SEQ_IDNO32到38和123到135的序列的核酸。在第二十二方面，本發(fā)明提供了含有選自后文表7到10所列多肽及其任意一種或多種的功能等價變體的氨基酸序列的多肽。廣義上說，本發(fā)明還可單獨或綜合地包括在本申請說明書中提及或指出的部分、要素和特征，其以兩個或多個所述部分、要素或特征的任意或所有組合，并且當(dāng)本文提及的具體整體在本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域具有已知的等價物時，所述已知的等價物如同單獨被提出一樣納入本文。附圖說明本發(fā)明的這些方面和其他方面——應(yīng)該以其所有新的方面考慮——將通過后文描述（僅作為示例）并參考附圖而變得清楚，其中：圖1示出了從CO的丁醇生物合成途徑。圖2示出了編碼參與1-丁醇生物合成的基因的示例性表達(dá)質(zhì)粒。圖3示出了pMTL85245-thlA-crt-hbd的測序結(jié)果，其證明在所述表達(dá)質(zhì)粒上的1-丁醇生物合成基因不含突變。圖4a、4b和4c示出了自產(chǎn)醇梭菌（CAU）、揚氏梭菌（CLJ）、拉氏梭菌（CRA）和設(shè)計的甲基轉(zhuǎn)移酶（DMT）基因的核苷酸比對。圖4d示出了自產(chǎn)醇梭菌（CAU1+2）、揚氏梭菌（CLJ）、拉氏梭菌（CRA1+2）的甲基轉(zhuǎn)移酶和設(shè)計的甲基轉(zhuǎn)移酶（DMT）的氨基酸比對。圖5示出了本發(fā)明的示例性甲基化質(zhì)粒。圖6示出了分離的質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖像。第1、6、11、16、21和26泳道顯示100bpPlusDNALadder。第2-5泳道顯示用原始甲基化質(zhì)?；旌衔镒鳛槟０宓腜CR，順序如下：ermB、ColE1、thlA、crt。第7-10、12-15、17-20、22-25和27-30泳道顯示以來自4種不同克隆的分離質(zhì)粒作為模板的PCR，每組順序如下：ermB、ColE1、thlA、crt。第32-35泳道顯示從4種不同克隆制備的質(zhì)粒。第36泳道顯示從原始自產(chǎn)醇梭菌DSM23693制備的質(zhì)粒。圖7示出的HPLC結(jié)果顯示了以攜帶丁醇質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的自產(chǎn)醇梭菌的1-丁醇產(chǎn)生。圖8示出了使用實時PCR分析在標(biāo)準(zhǔn)條件下用自產(chǎn)醇梭菌進(jìn)行的典型發(fā)酵過程中200多個基因的表達(dá)，以鑒定表達(dá)異源基因的適合啟動子區(qū)。圖9示出了SEQ_IDNo1、2和3的序列。圖10示出了SEQ_IDNo4、5和6的序列。圖11示出了SEQ_IDNo7、47、48、49和50編碼的啟動子區(qū)的序列。圖12示出了SEQ_IDNo14的序列圖13示出了SEQ_IDNo15的序列圖14示出了SEQ_IDNo24和25的序列圖15示出了SEQ_IDNo26的序列圖16示出了SEQ_IDNo27的序列圖17示出了SEQ_IDNo28的序列圖18示出了SEQ_IDNo29的序列圖19示出了自產(chǎn)醇梭菌（Y18178,GI:7271109）的16srRNA基因。圖20和21示出了SEQ_IDNo31的序列圖22示出了Seq.ID39:自產(chǎn)醇梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的核苷酸序列圖23示出了Seq.ID40:自產(chǎn)醇梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的核苷酸序列圖24示出了Seq.ID41:自產(chǎn)醇梭菌的丁醛脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID42:自產(chǎn)醇梭菌的丁醛脫氫酶的氨基酸序列。圖25示出了Seq.ID43:自產(chǎn)醇梭菌的丁醛脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID44:自產(chǎn)醇梭菌的丁醛脫氫酶的氨基酸序列。圖26示出了Seq.ID45:自產(chǎn)醇梭菌的丁醛脫氫酶的核苷酸序列。圖27示出了Seq.ID46:自產(chǎn)醇梭菌的丁醛脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID119:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖28示出了Seq.ID120:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID121:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖29示出了Seq.ID122:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID51:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖30示出了Seq.ID52:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID53:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖31示出了Seq.ID54:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID55:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖32示出了Seq.ID56:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID57:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖33示出了Seq.ID58:自產(chǎn)醇梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID59:自產(chǎn)醇梭菌的磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列；和Seq.ID60:自產(chǎn)醇梭菌的磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列。圖34示出了Seq.ID61:自產(chǎn)醇梭菌的乙酸/丁酸激酶的核苷酸序列；和Seq.ID62:自產(chǎn)醇梭菌的乙酸/丁酸激酶的氨基酸序列。圖35示出了Seq.ID63:自產(chǎn)醇梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的核苷酸序列；和Seq.ID64:自產(chǎn)醇梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的氨基酸序列。圖36示出了Seq.ID65:自產(chǎn)醇梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的核苷酸序列；和Seq.ID66:自產(chǎn)醇梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的氨基酸序列。圖37示出了Seq.ID67:揚氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的核苷酸序列。圖38示出了Seq.ID68:揚氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的氨基酸序列。圖39示出了Seq.ID69:揚氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的核苷酸序列。圖40示出了Seq.ID70:揚氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID71:揚氏梭菌的丁醛脫氫酶的核苷酸序列。圖41示出了Seq.ID72:揚氏梭菌的丁醛脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID73:揚氏梭菌的丁醛脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID74:揚氏梭菌的丁醛脫氫酶的氨基酸序列。圖42示出了Seq.ID75:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID76:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID77:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖43示出了Seq.ID78:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID79:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID80:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列。圖44示出了Seq.ID81:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID82:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID83:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖45示出了Seq.ID84:揚氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID85:揚氏梭菌的磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列；和Seq.ID86:揚氏梭菌的磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列；和Seq.ID87:揚氏梭菌的乙酸/丁酸激酶的核苷酸序列。圖46示出了Seq.ID88:揚氏梭菌的乙酸/丁酸激酶的氨基酸序列；和Seq.ID89:揚氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的核苷酸序列；和Seq.ID90:揚氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的氨基酸序列。圖47示出了Seq.ID91:揚氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的核苷酸序列；和Seq.ID92:揚氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的氨基酸序列。圖48示出了Seq.ID93:拉氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的核苷酸序列。圖49示出了Seq.ID94:拉氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的氨基酸序列。圖50示出了Seq.ID95:拉氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的核苷酸序列。圖51示出了Seq.ID96:拉氏梭菌的雙功能丁醇/丁醛脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID97:拉氏梭菌的丁醛脫氫酶的核苷酸序列。圖52示出了Seq.ID98:拉氏梭菌的丁醛脫氫酶的氨基酸序列；Seq.ID99:拉氏梭菌的丁醛脫氫酶核苷酸序列；和Seq.ID100:拉氏梭菌的丁醛脫氫酶的氨基酸序列。圖53示出了Seq.ID101:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID102:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID103:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖54示出了Seq.ID104:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID105:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID106:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列。圖55示出了Seq.ID107:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列；和Seq.ID108:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID109:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的核苷酸序列。圖56示出了Seq.ID110:拉氏梭菌的丁醇脫氫酶的氨基酸序列；和Seq.ID111:拉氏梭菌的磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列；和Seq.ID112:拉氏梭菌的磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列；和Seq.ID113:拉氏梭菌的乙酸/丁酸激酶的核苷酸序列。圖57示出了Seq.ID114:拉氏梭菌的乙酸/丁酸激酶的氨基酸序列；和Seq.ID115:拉氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的核苷酸序列；和Seq.ID116:拉氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的氨基酸序列。圖58示出了Seq.ID117:拉氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的核苷酸序列；和Seq.ID118:拉氏梭菌的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶的氨基酸序列。圖59示出了SEQID136:揚氏梭菌（CP001666.1,GI:300433347）的16SrRNA基因。圖60示出了（A）雙功能丁醇/丁醛脫氫酶（SeqID39）；（B）丁醛脫氫酶（Seq.ID41）；（C）丁醛脫氫酶（Seq.ID45）；（D）丁醇脫氫酶（Seq.ID53）；（E）丁醇脫氫酶（Seq.ID57）；（F）磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶（Seq.ID57）；（G）乙酸/丁酸激酶（Seq.ID59）；（H）醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶（Seq.ID63）；（OI）醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶（Seq.ID65）的基因表達(dá)模式。具體實施方式以下是以一般術(shù)語給出的對本發(fā)明包括其優(yōu)選的實施方案的說明。下文標(biāo)題為“實施例”給出的公開內(nèi)容進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其提供了支持本發(fā)明的實驗數(shù)據(jù)、本發(fā)明多個方面的具體實例以及實施本發(fā)明的方法。其中，近緣微生物自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌已知可被用于從一氧化碳產(chǎn)生乙醇作為生物燃料。為從氣態(tài)底物產(chǎn)生1-丁醇作為生物燃料，開發(fā)了用于這些生物的通用轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并且已證明可從CO產(chǎn)生1-丁醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將編碼1-丁醇生物合成途徑（圖1）中蛋白的具體基因?qū)氘a(chǎn)乙酸微生物中時，所述微生物能夠利用氣態(tài)底物產(chǎn)生1-丁醇或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。雖然一些未被修飾的微生物已知可產(chǎn)生1-丁醇，但是通過這些未修飾的微生物從CO產(chǎn)生1-丁醇的產(chǎn)率是非常低的。結(jié)果由于其低效率并因此缺少商業(yè)可行性，所以它們用于從氣態(tài)底物產(chǎn)生生物燃料的實用性是極其有限的。自產(chǎn)醇梭菌天然地產(chǎn)生乙醇、乙酸、2,3-丁二醇和乳酸，但是未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生1-丁醇。如圖1所示，Wood-Ljungdahl途徑將CO轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA。該化合物在自產(chǎn)乙酸微生物中通過硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶、丁酰-CoA脫氫酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶的作用進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為1-丁醇。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述微生物表達(dá)所述前4種酶，其可被核酸SEQ_IDNo1到4或其功能等價變體編碼。本發(fā)明提供了可通過重組核酸編碼的酶及天然產(chǎn)生的酶的作用促進(jìn)乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為1-丁醇的微生物。本發(fā)明還提供了表達(dá)其他重組核酸序列的微生物的用途，所述其他重組核酸序列編碼Wood-Ljungdahl或丁醇生物合成途徑中其他階段的酶。發(fā)明人還鑒定了數(shù)種新的酶和核酸。由于梭菌中沒有已知的天然感受態(tài)（從細(xì)胞的環(huán)境攝取細(xì)胞外DNA），電轉(zhuǎn)化或接合是僅有的用于轉(zhuǎn)化的方法。這些問題是有效轉(zhuǎn)化梭菌種的重大困難。此外，在梭菌中發(fā)現(xiàn)的限制性/甲基化系統(tǒng)可抵御外源DNA和噬菌體DNA，導(dǎo)致它們的遺傳轉(zhuǎn)化尤其困難。數(shù)種梭菌菌株（丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）ATCC824、解纖維素梭菌（C.cellulolyticum）ATCC35319、肉毒梭菌（C.botulinum）ATCC25765和艱難梭菌（C.difficile）CD3和CD6）的轉(zhuǎn)化表明，只有在轉(zhuǎn)化之前將DNA在大腸桿菌體內(nèi)甲基化或者以特定方式在體外甲基化才可能進(jìn)行所述轉(zhuǎn)化（Mermelsteinetal,1993;Herbertetal,2003;Jennertetal,2000;Davisetal,2000）。但是，由于非特異性的外切核酸酶等，確定正確的甲基化模式經(jīng)常是不可能的。此外，許多梭菌種還具有限制性系統(tǒng)，其消化在特定的（“錯誤的”）位置甲基化的DNA。發(fā)明人在開發(fā)本發(fā)明的重組微生物過程中已經(jīng)克服了上述主要障礙。開發(fā)了一種包括新的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的新甲基化系統(tǒng)以繞過存在于天然產(chǎn)乙酸微生物中的天然存在的限制性障礙。因此，本發(fā)明的甲基化方法和甲基轉(zhuǎn)移酶基因可被用于多種這樣的適合微生物，這些微生物具有可阻止在微生物中有效導(dǎo)入和表達(dá)需要的重組核酸的限制性障礙。定義本文中，“1-丁醇前體”包括丁酰CoA、丁酰磷酸鹽、丁酸和丁醛。本文中，“發(fā)酵液”是含有至少一種營養(yǎng)培養(yǎng)基和細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。本文中，“穿梭微生物”是其中表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶并不同于目標(biāo)微生物的微生物。本文中，“目標(biāo)微生物”是其中表達(dá)所述表達(dá)構(gòu)建體上包括的基因并不同于所述穿梭微生物的微生物。本文中，術(shù)語“主要發(fā)酵產(chǎn)物”意指以最高的濃度和/或產(chǎn)率產(chǎn)生的一種發(fā)酵產(chǎn)物。當(dāng)與發(fā)酵過程關(guān)聯(lián)使用時，術(shù)語“增加效率”、“增加的效率”等包括但不限于增加一種或多種催化所述發(fā)酵的微生物的生長速率、消耗每體積底物（例如糖）產(chǎn)生的需要的產(chǎn)物（例如醇）的體積、需要的產(chǎn)物的產(chǎn)生速率或產(chǎn)生水平、以及產(chǎn)生的需要的產(chǎn)物與所述發(fā)酵的其他副產(chǎn)物相比的相對比例。短語“含一氧化碳的底物”等術(shù)語應(yīng)被理解為包括任意底物，其中一氧化碳可被一種或多種細(xì)菌菌株用于例如生長和/或發(fā)酵。短語“含一氧化碳的氣態(tài)底物”及類似短語和術(shù)語包括含有某一水平一氧化碳的任意氣體。在某些實施方案中，所述底物含有至少約20體積%至約100體積%的CO、20體積%至70體積%的CO、30體積%至60體積%的CO和40體積%至55體積%的CO。在具體實施方案中，所述底物包括約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積%的CO、或約55體積%的CO或約60體積%的CO。雖然所述底物不必需包含任何氫氣，但是存在H2應(yīng)該不會對根據(jù)本發(fā)明方法的產(chǎn)物形成不利。在具體實施方案中，存在氫氣可提高醇產(chǎn)生的整體效率。例如，在具體實施方案中，所述底物可包含約2:1、或1:1或1:2比例的H2:CO。在一個實施方案中，所述底物包含約30體積%或更低體積的H2、20體積%或更低體積的H2、約15體積%或更低體積的H2或者約10體積%或更低體積的H2。在其他實施方案中，所述底物流包含低濃度的H2，例如小于5體積%、或小于4體積%、或小于3體積%、或小于2體積%、或小于1體積%或者基本不含氫氣。例如，所述底物還可包含一些CO2，例如約1體積%至約80體積%的CO2或1體積%至約30體積%的CO2。在一個實施方案中，所述底物包含小于或等于約20體積%的CO2。在具體的實施方案中，所述底物包含小于或等于約15體積%的CO2、小于或等于約10體積%的CO2、小于或等于約5體積%的CO2或者基本不含CO2。在以下的說明書中，從遞送和發(fā)酵“含CO的氣態(tài)底物”方面描述本發(fā)明的實施方案。但是，應(yīng)理解，所述氣態(tài)底物可以其他形式提供。例如，所述含CO的氣態(tài)底物可溶解于液體中提供。實質(zhì)上，將液體用含一氧化碳的氣體飽和，然后將所述液體加入生物反應(yīng)器中。這可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)實現(xiàn)。例如，可使用微泡分散發(fā)生器（Hensirisaket.al.Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation;AppliedBiochemistryandBiotechnologyVolume101,Number3/October,2002）。又例如，可將所述含CO的氣態(tài)底物吸附到固態(tài)支持物上。這些替代方法被術(shù)語“含CO的底物”等所涵蓋。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述含CO的氣態(tài)底物是工業(yè)氣體或廢氣。“工業(yè)廢氣或工業(yè)氣體”應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括工業(yè)過程產(chǎn)生的任何含CO的氣體，并且包括鐵金屬產(chǎn)品制造、非鐵產(chǎn)品制造、石油煉制過程、煤的氣化、生物質(zhì)氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)和焦炭制造所產(chǎn)生的氣體。本文其他部分還提供了另外的實例。除非另有說明，否則本文所用的短語“發(fā)酵”、“發(fā)酵過程”或“發(fā)酵反應(yīng)”等意圖包括所述過程的生長階段和產(chǎn)物生物合成階段。如下所述，在一些實施方案中，所述生物反應(yīng)器可包括第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，向發(fā)酵反應(yīng)中加入金屬或組合物應(yīng)被理解為包括加入到這些反應(yīng)器之一或兩個中。術(shù)語“生物反應(yīng)器”包括由一個或多個容器和/或塔器或管道布置組成的發(fā)酵裝置，其包括連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器（CSTR）、固定化細(xì)胞反應(yīng)器（ICR）、滴流床反應(yīng)器（TBR）、鼓泡塔、氣升式發(fā)酵罐、靜態(tài)混合器或適用于氣-液接觸的其他容器或其他裝置。如下文所述，在一些實施方案中，所述生物反應(yīng)器可包括第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，當(dāng)提到加入底物到所述生物反應(yīng)器或發(fā)酵反應(yīng)中時，如果合適，應(yīng)該理解為加入到這些反應(yīng)器之一或兩個中?！巴庠春怂帷笔窃醋云浔粚?dǎo)入的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意適合的來源，包括但不限于其要被導(dǎo)入的微生物、與其要被導(dǎo)入的生物不同的微生物菌株或種，或者它們可通過人工或重組形成。在一個實施方案中，所述外源核酸代表天然存在于它們將被導(dǎo)入的微生物中的核酸序列，將它們導(dǎo)入以增加具體基因的表達(dá)或過表達(dá)具體基因（例如，通過增加所述序列（例如基因）的拷貝數(shù)）。在另一個實施方案中，所述外源核酸代表非天然存在于它們將被導(dǎo)入的微生物中的核酸序列，可使得表達(dá)并非天然存在于所述微生物中的產(chǎn)物或者增加所述微生物中天然存在的基因的表達(dá)（例如在導(dǎo)入調(diào)節(jié)元件例如啟動子的情況下）。所述外源核酸可適于整合到其將被導(dǎo)入的微生物的基因組中，或者保持染色體外狀態(tài)。應(yīng)理解，可使用序列不同于本文具體示例的序列的核酸實施本發(fā)明，條件是它們可執(zhí)行基本相同的功能。對于編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，這意味著所編碼的蛋白質(zhì)或肽具有基本相同的功能。對于代表啟動子序列的核酸序列，所述變體序列應(yīng)具有啟動一種或多種基因表達(dá)的能力。在本文中，這類核酸可稱為“功能等價變體”。例如，核酸的功能等價變體包括等位基因變體、基因片段、包含突變（缺失、插入、核苷酸置換等）和/或多態(tài)性的基因等。能夠進(jìn)行丁酸或丁醇發(fā)酵的來自其他細(xì)菌的同源基因也可被看作是本文具體示例的序列的功能等價變體的實例。其包括在例如丙酮丁醇梭菌、拜季林斯基氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）、破傷風(fēng)梭菌（Clostridiumtetani）、巴氏梭菌（Clostridiumpasteurianum）、科氏梭菌（Clostridiumkluyveri）、食纖維梭菌（Clostridiumcellulovorans）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）、肉毒梭菌、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）菌株DSM10702、丁酸梭菌菌株ATCC25755、普氏厭氧球菌（Anaerococcusprevotii）DSM20548、騰沖嗜熱厭氧菌（Thermoanaerobactertengcongensis）、多毛短螺旋菌（Brachyspirapilosicoli）、巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、釀膿鏈球菌（Streptococcuspyogenes）和糖乙酸多丁醇梭菌（Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum）的種中的同源基因，其詳細(xì)內(nèi)容可從網(wǎng)站例如Genbank或NCBI公開獲得。短語“功能等價變體”應(yīng)被認(rèn)為還包括為具體生物進(jìn)行密碼子優(yōu)化而產(chǎn)其生序列改變的核酸。本文中，核酸的“功能等價變體”優(yōu)選地與所鑒定的核酸具有至少約70%、優(yōu)選約80%、更優(yōu)選約85%、優(yōu)選約90%、優(yōu)選約95%或更高的核酸序列同一性。在一個具體實施方案中，本文所定義的硫解酶基因的功能等價變體可以是大腸桿菌中的atoAB基因（NC_000913.2;atoA=GeneID:946719;atoB=GeneID:946727）。本文所定義的eftAB基因的功能等價變體可見于TsaiandSaier（1995）。應(yīng)理解，可使用其序列不同于本文具體示例的氨基酸序列的多肽實施本發(fā)明。這些變體在本文中可稱作“功能等價變體”。蛋白質(zhì)或肽的功能等價變體包括與所鑒定的蛋白質(zhì)或肽具有至少40%，優(yōu)選50%、優(yōu)選60%、優(yōu)選70%、優(yōu)選75%、優(yōu)選80%、優(yōu)選85%、優(yōu)選90%、優(yōu)選95%或更高的氨基酸同一性，并與目標(biāo)肽或蛋白質(zhì)具有基本相同功能的那些蛋白質(zhì)或肽。所述變體在其范圍內(nèi)包括蛋白質(zhì)或肽的片段，其中所述片段包括截短形式的多肽，其中可缺失1到5個、1到10個、1到15個、1到20個、1到25個氨基酸，并可在所述多肽的任一末端延伸1到25個殘基，并且其中缺失可以是所述區(qū)域內(nèi)的任意長度；或可以在內(nèi)部位置。本文中具體多肽的功能等價變體還應(yīng)被認(rèn)為包括由其他的細(xì)菌種（例如前段中示例的）中的同源基因表達(dá)的多肽。本文中“基本相同功能”意指核酸或多肽的變體能夠執(zhí)行所述核酸或多肽的功能。例如，本發(fā)明的酶的變體能夠催化與所述酶相同的反應(yīng)。但是，不應(yīng)認(rèn)為多肽或核酸變體與所述多肽或核酸具有相同的活性水平?？梢允褂萌我鈹?shù)量的已知方法評估核酸或多肽的功能等價變體是否具有與所述核酸或多肽基本相同功能。但是，例如，Inuietal(2008)概述的方法可被用于評估酶活性。當(dāng)與本發(fā)明關(guān)聯(lián)使用時，“過表達(dá)”、“過量表達(dá)”及類似術(shù)語和短語應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括，與相同條件下親代微生物蛋白表達(dá)水平相比一種或多種蛋白表達(dá)的任何增加。其不應(yīng)被認(rèn)為意指所述蛋白以任何具體水平表達(dá)?！坝H代微生物”是用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物的微生物。所述親代微生物可以是天然產(chǎn)生的微生物（即野生型微生物）或之前曾被修飾但是不表達(dá)或不過表達(dá)本發(fā)明的一種或多種酶的微生物。因此，本發(fā)明的重組微生物已被修飾以表達(dá)或過表達(dá)在所述親代微生物中不表達(dá)或不過表達(dá)的一種或多種酶。術(shù)語核酸“構(gòu)建體”或“載體”及類似術(shù)語應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括適合用作將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞的載體的任意核酸（包括DNA和RNA）。該術(shù)語應(yīng)被認(rèn)為包括質(zhì)粒、病毒（包括噬菌體）、粘粒和人工染色體。構(gòu)建體或載體可包括一種或多種調(diào)節(jié)元件、復(fù)制起始點、多克隆位點和/或選擇標(biāo)記，以及其他元件、位點或標(biāo)記。在一個具體的實施方案中，所述構(gòu)建體或載體適于使得由所述構(gòu)建體或載體編碼的一種或多種基因表達(dá)。核酸構(gòu)建體或載體包括裸露的核酸，以及用一種或多種可幫助遞送到細(xì)胞的試劑配制的核酸（例如脂質(zhì)體綴合的核酸、其中含有所述核酸的有機(jī)體）。應(yīng)理解，本發(fā)明的核酸可以是任意適合的形式，包括RNA、DNA或cDNA，包括雙鏈核酸和單鏈核酸。在一方面，本發(fā)明提供了能夠利用CO產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物的遺傳修飾的微生物。所述微生物優(yōu)選為產(chǎn)乙酸重組微生物，其產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在一個具體的實施方案中，所述產(chǎn)乙酸重組微生物能夠從含CO的底物通過發(fā)酵以大于約1mM或0.075g/l發(fā)酵液的丁醇濃度產(chǎn)生1-丁醇或其前體。在一個具體的實施方案中，所述微生物包括適于表達(dá)或過表達(dá)丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種外源核酸。在一個實施方案中，所述微生物適于表達(dá)丁醇生物合成途徑中的在所述微生物源自的親代微生物中并不天然存在的一種或多種酶，或者適于過表達(dá)丁醇生物合成途徑中的在親代微生物中天然存在的一種或多種酶。所述微生物可適于通過任意數(shù)量的重組方法表達(dá)或過表達(dá)所述一種或多種酶，所述方法包括例如增加所述微生物中天然基因的表達(dá)（例如通過導(dǎo)入更強(qiáng)的啟動子或組成型啟動子以驅(qū)動基因表達(dá)），通過導(dǎo)入編碼并適于表達(dá)所述酶的外源核酸、導(dǎo)入編碼并適于表達(dá)在所述親代微生物中并不天然存在的酶的外源核酸來增加編碼具體酶的基因的拷貝數(shù)。在某些實施方案中，所述親代微生物可被轉(zhuǎn)化以增加所述親代微生物中天然存在的一種或多種基因的表達(dá)或使其過表達(dá)，并且導(dǎo)入一種或多種所述親代微生物中并不天然存在的基因。優(yōu)選地，所述微生物包含編碼一種或多種酶的一種或多種外源核酸，所述酶選自：硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B。在一個實施方案中，編碼所述一種或多種酶的一種或多種核酸選自SEQIDNO.1到SEQIDNO.6的核酸或其功能等價變體。在一個實施方案中，所述重組微生物適于表達(dá)編碼硫解酶（IUBMB酶命名EC:2.3.1.9）（thlA）、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶（EC:1.1.1.157）（hbd）、巴豆酸酶/巴豆酰-CoA水合酶（EC:1.1.1.157）（crt或cch）和/或丁酰-CoA脫氫酶（EC4.2.1.55）（bcd）的一種或多種基因。在一個實施方案中，所述微生物適于表達(dá)所有這些酶。在另一個實施方案中，所述基因?qū)?yīng)于選自SEQ_IDNo.1到4或其功能等價變體的一種或多種核酸序列。本發(fā)明的重組微生物還可含有兩種電子轉(zhuǎn)移蛋白。在一個實施方案中，所述電子轉(zhuǎn)移蛋白是由SEQ_IDNo.5和6或其功能等價變體編碼的電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白（EC1.3.99.2）（etfAB）。使用這些電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白可增強(qiáng)所述微生物產(chǎn)生1-丁醇的效率。所述黃素蛋白可提供Bcd活性所需的穩(wěn)定的復(fù)合體。在一個具體的實施方案中，所述微生物包括編碼硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B中每一種的一種或多種外源核酸。在一個實施方案中，所述微生物包括編碼硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B中一種或多種或者優(yōu)選每一種的質(zhì)粒。在一個實施方案中，所述微生物替代地或者還包含適于表達(dá)一種或多種酶的外源核酸，所述酶選自：磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶（或者稱為醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶）、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶、雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶中一種或多種的外源核酸。優(yōu)選地，所述微生物包含編碼丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶中一種或多種的一種或多種外源核酸。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶中一種或多種的外源核酸。優(yōu)選地，所述微生物包含編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶中一種或多種的一種或多種外源核酸。在具體實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶中每一種的外源核酸。在一個實施方案中，所述微生物包含適于表達(dá)1-丁醇生物合成途徑中至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種或至少12種酶的一種或多種核酸。在一個實施方案中，所述微生物還包含外源磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶啟動子，但也可以使用其他啟動子。優(yōu)選地，所述啟動子對應(yīng)于SEQ_IDNo.7或其功能等價變體。優(yōu)選地，所述啟動子被包含在編碼本文中上述提及的一種或多種酶的構(gòu)建體中。優(yōu)選地，所述親代微生物選自一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌。在某些實施方案中，所述微生物選自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、Clostridiumdrakei、糞味梭菌、淤泥丁酸桿菌、甲基營養(yǎng)丁酸桿菌、伍氏醋酸桿菌、Alkalibaculumbacchii、Blautiaproducta、淤泥真桿菌、熱醋穆爾氏菌、熱自養(yǎng)穆爾氏菌、普氏產(chǎn)醋桿菌和凱伍熱厭氧菌。在一個具體的實施方案中，所述親代微生物選自產(chǎn)醇、產(chǎn)乙酸梭菌類群，包括自產(chǎn)醇梭菌種、揚氏梭菌種、拉氏梭菌種及相關(guān)分離株。其包括但不限于以下菌株：自產(chǎn)醇梭菌JAI-1T（DSM10061）[AbriniJ,NaveauH,NynsE-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov.,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfromcarbonmonoxide.ArchMicrobiol1994,4:345-351]、自產(chǎn)醇梭菌LBS1560（DSM19630）[SimpsonSD,ForsterRL,TranPT,RoweMJ,WarnerIL:Novelbacteriaandmethodsthereof.Internationalpatent2009,WO/2009/064200]、自產(chǎn)醇梭菌LBS1561（DSM23693）、揚氏梭菌PETCT（DSM13528=ATCC55383）[TannerRS,MillerLM,YangD:Clostridiumljungdahliisp.nov.,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroupI.IntJSystBacteriol1993,43:232-236]、揚氏梭菌ERI-2（ATCC55380）[GaddyJL:Clostridiumstainwhichproducesaceticacidfromwastegases.USpatent1997,5,593,886]、揚氏梭菌C-01（ATCC55988）[GaddyJL,ClausenEC,KoC-W:Microbialprocessforthepreparationofaceticacidaswellassolventforitsextractionfromthefermentationbroth.USpatent,2002,6,368,819]、揚氏梭菌O-52（ATCC55989）[GaddyJL,ClausenEC,KoC-W:Microbialprocessforthepreparationofaceticacidaswellassolventforitsextractionfromthefermentationbroth.USpatent,2002,6,368,819]、拉氏梭菌P11T（ATCCBAA-622）[HuhnkeRL,LewisRS,TannerRS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.Internationalpatent2008,WO2008/028055]、相關(guān)分離株例如“C.coskatii”[ZahnJA,SaxenaJ,DoY,PatelM,FisheinS,DattaR,TobeyR:Clostridiumcoskatii,sp.nov.,anAnaerobicBacteriumthatProducesEthanolfromSynthesisGas.PosterSIMAnnualMeetingandExhibition,SanFrancisco,2010]或者突變菌株例如揚氏梭菌OTA-1（Tirado-AcevedoO.ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsingClostridiumljungdahlii.PhDthesis,NorthCarolinaStateUniversity,2010）。這些菌株形成梭菌rRNA類群I中的亞類，并且它們的16SrRNA基因的同一性超過99%并具有相似的低GC含量（約30%）。但是，DNA-DNA重締合和DNA指紋印跡實驗顯示這些菌株屬于不同的種[HuhnkeRL,LewisRS,TannerRS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.Internationalpatent2008,WO2008/028055]。該類群的所有種具有相似的形態(tài)和大?。▽?shù)生長的細(xì)胞為0.5-0.7×3-5μm），其是嗜溫性的（最佳生長溫度介于30-37℃）并且嚴(yán)格厭氧[TannerRS,MillerLM,YangD:Clostridiumljungdahliisp.nov.,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroupI.IntJSystBacteriol1993,43:232-236;AbriniJ,NaveauH,NynsE-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov.,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfromcarbonmonoxide.ArchMicrobiol1994,4:345-351;HuhnkeRL,LewisRS,TannerRS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.Internationalpatent2008,WO2008/028055]。此外，它們都具有相同的主要系統(tǒng)發(fā)育特征，例如相同的pH范圍（pH4-7.5，最佳起始pH為5.5-6）、以相似生長速率以含CO氣體進(jìn)行強(qiáng)的自養(yǎng)生長、相似的代謝譜（以乙醇和乙酸作為主要發(fā)酵終產(chǎn)物，并且在某些條件下產(chǎn)生少量的2,3-丁二醇和乳酸）[TannerRS,MillerLM,YangD:Clostridiumljungdahliisp.nov.,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroupI.IntJSystBacteriol1993,43:232-236;AbriniJ,NaveauH,NynsE-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov.,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfromcarbonmonoxide.ArchMicrobiol1994,4:345-351;HuhnkeRL,LewisRS,TannerRS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.Internationalpatent2008,WO2008/028055]。并且在所有3個種中都觀察到吲哚的產(chǎn)生。但是，所述種在多種糖（例如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡萄糖酸、檸檬酸）、氨基酸（例如精氨酸、組氨酸）或其他底物（例如甜菜堿、丁醇）的底物利用上有差異。此外，所述種中的某些是特定維生素（例如硫胺素、生物素）營養(yǎng)缺陷型的，而其他種不是。在一個實施方案中,所述微生物在導(dǎo)入外源核酸之前和之后都產(chǎn)生磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶和丁醇脫氫酶。在一個實施方案中,所述微生物在導(dǎo)入外源核酸之前和之后都產(chǎn)生丁醛脫氫酶和/或丁醇脫氫酶。在一個具體的實施方案中，所述微生物是自產(chǎn)醇梭菌DSM23693。在一個實施方案中，本發(fā)明的重組微生物具有以登錄號DSM24138保藏在DSMZ(德國微生物菌種保藏中心，德國不倫瑞克)的微生物的鑒別特征。所述一種或多種外源核酸可作為裸露的核酸或與一種或多種可促進(jìn)轉(zhuǎn)化過程的試劑配制為制劑（例如脂質(zhì)體綴合的核酸、其中含有所述核酸的有機(jī)體）而被遞送到親代微生物。合適時，所述一種或多種核酸可以是DNA、RNA或其組合?？墒褂萌我鈹?shù)量的用于產(chǎn)生重組微生物的本領(lǐng)域已知技術(shù)由親代微生物和一種或多種外源核酸制備本發(fā)明的微生物。僅舉例來說，轉(zhuǎn)化（包括轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染）可通過電穿孔、接合或化學(xué)感受態(tài)和天然感受態(tài)實現(xiàn)。適合的轉(zhuǎn)化技術(shù)例如在Sambrooketal,1989中有描述。在某些實施方案中，由于在要轉(zhuǎn)化的微生物中存在具有活性的限制系統(tǒng)，需要使將被導(dǎo)入所述微生物的核酸甲基化。這可使用多種技術(shù)進(jìn)行，所述技術(shù)包括后文描述的那些，其在后文實施例部分進(jìn)一步示例。在另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括以下步驟：a.將(i)表達(dá)構(gòu)建體和(ii)含有甲基轉(zhuǎn)移酶基因的甲基化構(gòu)建體導(dǎo)入穿梭微生物；b.表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因；c.從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建體；以及d.向目標(biāo)微生物中導(dǎo)入所述一種或多種構(gòu)建體；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。在一個實施方案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因是組成型表達(dá)的。在另一個實施方案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)是誘導(dǎo)型的。所述穿梭微生物是可促進(jìn)組成所述表達(dá)構(gòu)建體的核酸序列的甲基化的微生物，優(yōu)選非限制性（restrictionnegative）微生物。在一個具體的實施方案中，所述穿梭微生物是非限制性大腸桿菌、枯草桿菌或乳酸乳球菌。一旦所述表達(dá)構(gòu)建體和甲基化構(gòu)建體被導(dǎo)入所述穿梭微生物，存在于所述甲基化構(gòu)建體上的甲基轉(zhuǎn)移酶基因就被表達(dá)。在一個實施方案中,當(dāng)表達(dá)必須被誘導(dǎo)時，可通過任意適合的啟動子系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)，但在本發(fā)明一個具體的實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型lac啟動子（優(yōu)選地由SEQ_IDNO28編碼）并且可通過加入乳糖或其類似物，更優(yōu)選異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷（IPTG）而被誘導(dǎo)。其他適合的啟動子包括ara、tet或T7系統(tǒng)。在本發(fā)明另一個實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體啟動子是組成型啟動子。在一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體啟動子是組成型啟動子，優(yōu)選地其在適合的發(fā)酵條件下具有高活性。但是，可使用誘導(dǎo)型啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體啟動子選自：磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子、丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶（SEQ_IDNo.48）、Wood-Ljungdahl基因簇（SEQ_IDNo47）、Rnf操縱子（SEQ_IDNo49）或ATP合成酶操縱子（SEQ_IDNo50）。優(yōu)選地，所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子對應(yīng)于SEQ_IDNo.7或其功能等價變體。圖8示出了可操作地連接到這些啟動子的基因在標(biāo)準(zhǔn)條件下在自產(chǎn)醇梭菌中具有高水平的表達(dá)。在一個具體的實施方案中，所述甲基化構(gòu)建體具有所述穿梭微生物類型特異的復(fù)制起始點，以使所述甲基化構(gòu)建體上的任意基因可在所述穿梭微生物中表達(dá)。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體具有所述目標(biāo)微生物類型特異的復(fù)制起始點，以使所述表達(dá)構(gòu)建體上的任意基因可在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)。所述甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)可導(dǎo)致存在于所述表達(dá)構(gòu)建體上的基因甲基化。然后，可根據(jù)許多已知方法中的任一種將所述表達(dá)構(gòu)建體從所述穿梭微生物中分離。僅舉例來說，下文實施例部分描述的方法可被用于分離所述表達(dá)構(gòu)建體。在一個具體的實施方案中，兩種構(gòu)建體被共分離?？墒褂萌我鈹?shù)量的已知方法，將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物。但是，舉例來說，可使用下文實施例部分描述的方法。由于所述表達(dá)構(gòu)建體是甲基化的，存在于所述表達(dá)構(gòu)建體上的核酸序列可被納入所述目標(biāo)微生物并成功表達(dá)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括：a.通過甲基轉(zhuǎn)移酶在體外甲基化表達(dá)構(gòu)建體，所述甲基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選根據(jù)SEQ_IDNo28或其功能等價變體；和b.優(yōu)選地依據(jù)第五方面，將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。可以想到，本發(fā)明的甲基轉(zhuǎn)移酶基因可被導(dǎo)入穿梭微生物并過表達(dá)，所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因優(yōu)選根據(jù)SEQ_IDNo27或其功能等價變體。所產(chǎn)生的甲基轉(zhuǎn)移酶可使用已知的方法收集，并在體外用于甲基化表達(dá)構(gòu)建體，優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體如第五方面所定義。然后，可將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物用于表達(dá)。優(yōu)選地，所述重組微生物產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括：a.將甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)氪┧笪⑸锏幕蚪M，所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因優(yōu)選根據(jù)SEQ_IDNo27或其功能等價變體；b.將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入所述穿梭微生物；c.從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)建體；和d.至少將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)微生物；其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼要在所述目標(biāo)微生物中表達(dá)的酶的一種或多種基因。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將甲基轉(zhuǎn)移酶基因（優(yōu)選根據(jù)SEQ_IDNo27）導(dǎo)入所述穿梭微生物的基因組。所述甲基轉(zhuǎn)移酶可被所述微生物組成型地表達(dá)，并且產(chǎn)生甲基轉(zhuǎn)移酶，其優(yōu)選地根據(jù)SEQ_IDNo28或其功能等價變體。將表達(dá)構(gòu)建體甲基化、分離并導(dǎo)入所述目標(biāo)微生物，其優(yōu)選產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還包括含有本文所描述的重組甲基轉(zhuǎn)移酶基因或甲基化構(gòu)建體的微生物。本發(fā)明還提供了在分析自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌的甲基轉(zhuǎn)移酶核酸序列和限制性障礙系統(tǒng)后開發(fā)的雜合甲基轉(zhuǎn)移酶基因（SEQ_IDNO28）。所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因在穿梭微生物中表達(dá)，這導(dǎo)致產(chǎn)生甲基轉(zhuǎn)移酶，其可甲基化所述表達(dá)構(gòu)建體的序列。所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因可存在于構(gòu)建體上或被整合到所述穿梭微生物的基因組中。所述雜合甲基轉(zhuǎn)移酶基因被針對大腸桿菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并可被納入所述甲基化構(gòu)建體中（圖5）。所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因可被密碼子優(yōu)化以用于另外的適合的微生物種例如枯草桿菌。用于密碼子優(yōu)化的方法是標(biāo)準(zhǔn)的，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的（Carboneetal,2003）。與SEQ_IDNO28具有至少70%、優(yōu)選75%、優(yōu)選80%、優(yōu)選85%、優(yōu)選90%、優(yōu)選95%或更高的核酸序列同一性并且表達(dá)能夠甲基化DNA的多肽的甲基轉(zhuǎn)移酶基因也被納入本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，甲基化方法和甲基轉(zhuǎn)移酶基因可在一系列微生物中應(yīng)用。在一個實施方案中，所述目標(biāo)微生物選自：自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、Clostridiumdrakei、糞味梭菌、淤泥丁酸桿菌、甲基營養(yǎng)丁酸桿菌、伍氏醋酸桿菌、Alkalibaculumbacchii、Blautiaproducta、淤泥真桿菌、熱醋穆爾氏菌、熱自養(yǎng)穆爾氏菌、普氏產(chǎn)醋桿菌和凱伍熱厭氧菌。在一個具體的實施方案中，所述目標(biāo)微生物選自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌。在一個具體的實施方案中，所述微生物是自產(chǎn)醇梭菌DSM23693。本發(fā)明還提供了上文中所描述的本發(fā)明第4、5、14、15、16、18、19和21方面所概述的多種核酸或核酸構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了包含編碼一種或多種酶的一種或多種核酸的表達(dá)構(gòu)建體，所述酶選自：硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶和電子轉(zhuǎn)移蛋白或其功能等價變體。優(yōu)選地，所述電子轉(zhuǎn)移蛋白是電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A或電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B。在具體的實施方案中，電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B都包括在所述表達(dá)構(gòu)建體上。每個基因及對應(yīng)的酶的示例性序列信息在GenBank提供，詳見下文表1。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解可使用的另外的基因和酶。在一個實施方案中，所述酶由SEQ_IDNo1到6的核酸編碼，所述核酸可以任意順序或以圖2所示順序存在于所述構(gòu)建體上。SEQ_IDNo8到13和SEQ_IDNo16到23是用于克隆和測序下一段中所提及基因的新序列。為從前體獲得1-丁醇，可能需要丁醛脫氫酶（EC1.2.1.10）、醇脫氫酶（EC1.1.1.1）、磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶（EC2.3.1.19）、丁酸激酶（EC2.7.2.7）、醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶（EC1.2.7.5）以及醇脫氫酶（EC1.1.1.1）中一種或多種的活性。本發(fā)明的醇脫氫酶是丁醇脫氫酶。在某些實施方案中，需要丁醛脫氫酶（EC1.2.1.10）和醇脫氫酶（EC1.1.1.1）；或者磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶（EC2.3.1.19）、丁酸激酶（EC2.7.2.7）、醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶（EC1.2.7.5）和醇脫氫酶（EC1.1.1.1）；或者這兩組酶的結(jié)合。在一個實施方案中，所述丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶活性是由雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶提供的。這些酶顯示于圖1示出的丁醇生物合成途徑中。在一些微生物中，丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶、磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶和/或醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶是由所述微生物天然表達(dá)的，從而催化丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為1-丁醇。因此，在一個實施方案中，除硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶和電子轉(zhuǎn)移蛋白中的一種或多種之外或替代它們，所述表達(dá)構(gòu)建體包括編碼磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶、鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶和雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶中一種或多種的核酸。適合的酶以及氨基酸和核酸序列信息的實例包括但不限于：丁醛脫氫酶，例如來自拜季林斯基氏梭菌（ABR35947,GI:149905114）、糖丁酸梭菌（C.saccharobutylicum）（CAQ57983,GI:189310620）或糖乙酸多丁醇梭菌（AAP42563,GI:31075383）的Ald；丁醇脫氫酶，例如來自丙酮丁醇梭菌（NP_349891,GI:15896542）的BdhB；雙功能丁醛/丁醇脫氫酶，例如來自丙酮丁醇梭菌（NP_149325,GI:15004865）的AdhE1或來自丙酮丁醇梭菌（NP_149199,GI:15004739）、拜季林斯基氏梭菌（YP_001307449,GI:150015195）的AdhE2；磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶例如來自丙酮丁醇梭菌（NP_348368）的Ptb；丁酸激酶，例如來自丙酮丁醇梭菌（AAK81015.1）的Buk；來自丙酮丁醇梭菌（NP_348637）的醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶AOR。本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地理解本發(fā)明使用的適合酶的其他實例。發(fā)明人還鑒定了可用于本發(fā)明的多個新的酶和基因，其詳細(xì)內(nèi)容在下文的實施例部分提供（尤其參見表7到10）。本發(fā)明還包括這些酶和基因的功能等價變體，以及它們用于本發(fā)明方法的用途。包括這些基因中的一種或多種可幫助完全避免同時產(chǎn)生丁酸，增加1-丁醇產(chǎn)生的效率。本發(fā)明還提供了包含一種或多種核酸的重組微生物，所述核酸適于表達(dá)一種或多種所述酶或者增加一種或多種所述酶的表達(dá)。在一個實施方案中，所述核酸編碼選自下文中表7到10所列的酶及其任意一種或多種功能等價物。在具體的實施方案中，所述核酸選自下文中表7到10所列的核酸及其任意一種或多種功能等價物。在一個實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體編碼丁醇生物合成途徑中的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11種或至少12種酶。優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體還包含上文所述的適合的啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子是磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶啟動子。優(yōu)選地，所述啟動子對應(yīng)于SEQ_IDNo.7或其功能等價變體。在優(yōu)選的實施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體包含編碼所有所述酶的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述表達(dá)構(gòu)建體可包含編碼另外的電子轉(zhuǎn)移蛋白的核酸。要在所述重組微生物中表達(dá)的所述基因可被裝配到所述表達(dá)構(gòu)建體中受任意適合的啟動子的控制。在具體實施方案中，所述啟動子可使得受其控制的基因基本上組成型表達(dá)。在具體的實施方案中，所述啟動子是磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶（SEQ_IDNO7）啟動子?？捎糜诒景l(fā)明的其他啟動子包括來自產(chǎn)醇梭菌（或揚氏梭菌）的啟動子。本發(fā)明人還鑒定了可操作地連接到基因的多種其他啟動子，所述基因在自產(chǎn)醇梭菌中在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下高表達(dá)（圖8）。在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下使用實時PCR分析200多個基因的表達(dá)，鑒定了多個適合的啟動子。其包括丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶啟動子（SEQ_IDNo.48）、Wood-Ljungdahl基因簇啟動子（SEQ_IDNo47）、Rnf操縱子啟動子（SEQ_IDNo49）和ATP合成酶操縱子啟動子（SEQ_IDNo50）。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可指導(dǎo)表達(dá)（優(yōu)選在適合的發(fā)酵條件下高水平表達(dá)）的其他啟動子也可有效作為現(xiàn)有優(yōu)選實施方案的替代。在一個實施方案中，本發(fā)明包括構(gòu)建體、重組微生物或核酸序列，其包括圖2所示順序的核酸SEQ_IDNO1到6。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，當(dāng)所述核酸序列以任意順序存在以及缺少一種或多種所述序列時可仍具有需要的用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括含有SeqIDNo.7所代表的啟動子序列的核酸或其功能等價變體、包括所述啟動子的構(gòu)建體以及包括其的重組微生物。應(yīng)理解，除所述啟動子以及適于表達(dá)另外的蛋白的額外基因外，如果需要，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可含有任意數(shù)量的調(diào)節(jié)元件。在一個實施方案中，所述構(gòu)建體包括一種啟動子。在另一個實施方案中，所述構(gòu)建體包括兩種或多種啟動子。在一個具體的實施方案中，所述構(gòu)建體的每個要表達(dá)的基因包括一個啟動子。在一個實施方案中，所述構(gòu)建體包括一個或多個核糖體結(jié)合位點，優(yōu)選每個要表達(dá)的基因均有核糖體結(jié)合位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文定義的核酸序列和構(gòu)建體序列可含有標(biāo)準(zhǔn)接頭核苷酸，例如核糖體結(jié)合位點和/或限制位點所需要的標(biāo)準(zhǔn)接頭核苷酸。這些接頭序列不應(yīng)被解釋為必需的，也不應(yīng)限制所述定義的序列。當(dāng)本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體在產(chǎn)乙酸微生物中表達(dá)時，所述微生物產(chǎn)生1-丁醇或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物?？梢韵氲?，編碼可催化Wood-Ljungdahl生物合成途徑或丁醇生物合成途徑中不同步驟的酶的其他基因也可納入所述表達(dá)構(gòu)建體中以產(chǎn)生1-丁醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物?？梢韵氲剑蓪⑸鲜鏊x的表達(dá)構(gòu)建體和甲基化構(gòu)建體結(jié)合以提供物質(zhì)組合。這種組合尤其可用于繞過多種微生物的限制性障礙機(jī)制，但是在優(yōu)選實施方案中，應(yīng)用所述組合產(chǎn)生的重組微生物可產(chǎn)生1-丁醇或其前體作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。核酸和核酸構(gòu)建體（包括本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體）可使用任意數(shù)量的本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建。例如，可使用化學(xué)合成或重組技術(shù)。所述技術(shù)描述于例如Sambrooketal（1989）。另外的示例性技術(shù)描述于下文中實施例部分。實質(zhì)上，所述個體基因和調(diào)節(jié)元件將被可操作地相互連接，使得所述基因可被表達(dá)以形成所需的蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可知曉適合用于本發(fā)明的載體。但是，舉例來說，下述載體可能是適合的：pMTL80000穿梭載體、pIMP1、pJIR750和下文中實施例部分所示例的質(zhì)粒。本發(fā)明提供了新的核酸和核酸載體，還提供了能夠與本文所述核酸、與本文所述核酸的任一種互補(bǔ)的核酸或本文所述核酸中任一種的功能等價變體的至少一部分雜交的核酸。所述核酸優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下可與這類核酸、與其任一種互補(bǔ)的核酸或其任一種的功能等價變體雜交?！皣?yán)格雜交條件”意指核酸能夠在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件例如Sambrooketal（1989）中描述的雜交條件下與目標(biāo)模板雜交。應(yīng)理解，所述核酸的最小大小是能夠在給定核酸和被設(shè)計用于雜交的互補(bǔ)序列之間形成穩(wěn)定雜交的大小。因此，所述大小取決于所述核酸組合物和所述核酸與其互補(bǔ)序列之間的同源性百分比，以及所用的雜交條件（例如溫度和鹽濃度）。在一個實施方案中，所述核酸長度為至少個10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸或至少30個核苷酸。應(yīng)理解，本發(fā)明的核酸可以是任意適合的形式，包括RNA、DNA或cDNA，包括雙鏈核酸和單鏈核酸。本發(fā)明還提供了含有本文所述任意一種或多種核酸的宿主生物，尤其是微生物，包括病毒、細(xì)菌和酵母。本發(fā)明提供了一種通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體的方法，包括使用重組微生物發(fā)酵含CO的氣態(tài)底物。在某些實施方案中，1-丁醇或其前體是與另外的發(fā)酵產(chǎn)物（例如乙醇）一起產(chǎn)生的。在一個實施方案中，所述1-丁醇或其前體是主要發(fā)酵產(chǎn)物。在一個實施方案中，所述重組微生物如前文中所述。在一個實施方案中，1-丁醇和/或其前體的產(chǎn)率為約0.075克/升發(fā)酵液（g/l）到約20g/l。在一個實施方案中，所述產(chǎn)率為約0.15g/l到約1.54g/l。在其他實施方案中，所述產(chǎn)率是約10g/l、約5g/l或約2g/l。優(yōu)選地，1-丁醇產(chǎn)率最高為丁醇開始對所述細(xì)菌產(chǎn)生毒性時的上限。優(yōu)選地，所述發(fā)酵包括使用本文所述的重組微生物在生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵底物以產(chǎn)生1-丁醇和/或其前體的步驟。本文中提及1-丁醇的前體時，可以想到，其可任選地在存在丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶、雙功能丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶、磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶和/或鐵氧還蛋白依賴的醛氧化還原酶下被轉(zhuǎn)化為1-丁醇。優(yōu)選地，在導(dǎo)入重組核酸之前或其后，所述微生物產(chǎn)生一種或多種這些酶。在本發(fā)明的實施方案中，被所述微生物發(fā)酵的氣態(tài)底物是含CO的氣態(tài)底物。所述氣態(tài)底物可以是作為工業(yè)過程副產(chǎn)物或者從某其他來源例如汽車廢氣獲得的含CO的廢氣。在某些實施方案中，所述工業(yè)過程選自鐵金屬產(chǎn)品制造例如鋼鐵廠、非鐵產(chǎn)品制造、石油煉制過程、煤的氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)和焦炭制造。在這些實施方案中，可在所述含CO的氣體被排放到大氣之前使用任意方便的方法從所述工業(yè)過程中將其捕獲。所述CO可以是合成氣（含一氧化碳和氫氣的氣體）的組分。從工業(yè)過程產(chǎn)生的CO通常被燃燒掉來產(chǎn)生CO2，因此本發(fā)明可尤其用于減少CO2溫室氣體排放并產(chǎn)生用作生物燃料的丁醇。依據(jù)所述含CO的氣態(tài)底物的組成，還可能需要對其進(jìn)行處理以在將其導(dǎo)入所述發(fā)酵之前除去任何不需要的雜質(zhì)例如塵粒。例如，可使用已知的方法將所述氣態(tài)底物過濾或洗滌。應(yīng)理解，為使所述細(xì)菌生長并發(fā)生CO到1-丁醇的發(fā)酵，除所述含CO的底物氣體外，需要將適合的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)料至所述生物反應(yīng)器。營養(yǎng)培養(yǎng)基含有足以使所使用微生物生長的維生素和礦物質(zhì)。適合用于使用CO發(fā)酵以產(chǎn)生丁醇的厭氧培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的。例如，Biebel（2001）描述了適合的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述培養(yǎng)基如下文中實施例部分所描述的。所述發(fā)酵應(yīng)需要在用于發(fā)生CO到丁醇發(fā)酵的合適條件下進(jìn)行。應(yīng)考慮的反應(yīng)條件包括：壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)基氧化還原電勢、攪拌速率（如果使用連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器）、接種物水平、確保所述液相中的CO不成為限制的最大氣體底物濃度以及避免產(chǎn)物抑制的最大產(chǎn)物濃度。此外，通常需要增加底物流中的CO濃度（或氣態(tài)底物中的CO分壓），從而增加CO作為底物時發(fā)酵反應(yīng)的效率。在增加的壓力下操作可顯著增加CO從氣相轉(zhuǎn)移到液相的速率，在液相中其可被所述微生物攝取作為碳源用于產(chǎn)生丁醇。這繼而意味著，當(dāng)生物反應(yīng)器保持在提高的壓力而非大氣壓力下時，可減少保留時間（定義為生物反應(yīng)器中的液體體積除以輸入氣體流速）。最佳反應(yīng)條件將部分地取決于本發(fā)明使用的具體微生物。但是，一般來說，優(yōu)選所述發(fā)酵在高于環(huán)境壓力的壓力下進(jìn)行。并且，因為給定的CO到丁醇的轉(zhuǎn)化率部分地是所述底物保留時間的函數(shù)，并且實現(xiàn)需要的保留時間進(jìn)而規(guī)定了生物反應(yīng)器需要的體積，所以使用增壓系統(tǒng)可大大地減少所需生物反應(yīng)器的體積，從而減少所述發(fā)酵設(shè)備的資金成本。依據(jù)美國專利no.5,593,886提供的實例，反應(yīng)器體積可相對于反應(yīng)器內(nèi)操作壓力的增加以線性比例減少，即以10個大氣壓操作的生物反應(yīng)器僅需具有以1個大氣壓操作的生物反應(yīng)器的十分之一體積。在升高的壓力下進(jìn)行氣體到乙醇發(fā)酵的益處已在別處描述。例如，WO02/08438描述了在30psig和75psig壓力下進(jìn)行的氣體到乙醇發(fā)酵，獲得的乙醇產(chǎn)率分別為150g/l/天和369g/l/天。但是，在大氣壓下使用相似的培養(yǎng)基和輸入氣體組成進(jìn)行的示例性發(fā)酵被發(fā)現(xiàn)每天每升僅產(chǎn)生1/20到1/10的乙醇。用于進(jìn)料至發(fā)酵反應(yīng)的氣流組成對所述反應(yīng)的效率和/或成本有顯著影響。例如，O2可降低厭氧發(fā)酵過程的效率。在發(fā)酵之前或之后處理發(fā)酵過程一些階段中不需要或者不必要的氣體可增加所述階段的負(fù)擔(dān)（例如在所述氣流進(jìn)入生物反應(yīng)器之前將其壓縮，不必要的能量可能被用于壓縮氣體，其在發(fā)酵中是不需要的）。因此，可能需要處理底物流，尤其是來自工業(yè)來源的底物流，以除去不需要的組分并增加需要的組分的濃度。在某些實施方案中，本發(fā)明的細(xì)菌培養(yǎng)物被維持在含水性培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，所述水性培養(yǎng)基是基本的厭氧微生物生長培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的，并且被描述于例如美國專利no.5,173,429和no.5,593,886以及WO02/08438中，如下文中實例部分所述。可通過本領(lǐng)域已知的方法從所述發(fā)酵液中回收丁醇或含丁醇和一種或多種其他醇的混合醇流，所述方法例如分餾或蒸發(fā)、滲透蒸發(fā)以及萃取發(fā)酵包括例如液-液萃取。也可使用本領(lǐng)域已知的方法從所述發(fā)酵液中回收副產(chǎn)物例如酸包括丁酸。例如，可使用包括活性炭過濾器的吸附系統(tǒng)或電滲析?；蛘?，還可使用連續(xù)氣提。在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中，可通過從所述生物反應(yīng)器中持續(xù)地除去部分發(fā)酵液、從所述發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞（方便地通過過濾）并從所述發(fā)酵液中回收丁醇和任選的酸來從所述發(fā)酵液中回收丁醇及副產(chǎn)物。例如，可通過蒸餾方便地回收醇，可通過例如吸附在活性炭上來回收酸。所述分離的微生物細(xì)胞優(yōu)選被返回至所述發(fā)酵生物反應(yīng)器。除去醇和酸后剩余的無細(xì)胞滲透物也優(yōu)選被返回至所述發(fā)酵生物反應(yīng)器?？蓪⒘硗獾臓I養(yǎng)物（例如B族維生素）加入到所述無細(xì)胞滲透物中以在其返回所述生物反應(yīng)器之前補(bǔ)充所述營養(yǎng)培養(yǎng)基。同樣地，如果所述發(fā)酵液的pH被按上述進(jìn)行調(diào)整以增強(qiáng)乙酸吸附到活性炭，那么應(yīng)在其返回所述生物反應(yīng)器之前將所述pH重新調(diào)整到與所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中發(fā)酵液類似的pH。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用萃取發(fā)酵步驟從所述發(fā)酵反應(yīng)中回收丁醇，其中丁醇被回收至所述反應(yīng)器中的油相。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解用于實現(xiàn)這一點的技術(shù)。實施例:以下將參照如下非限制性實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。遺傳修飾是使用含有合成操縱子的質(zhì)粒進(jìn)行的，所述合成操縱子由控制來自丙酮丁醇梭菌的硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶和2種電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白基因的強(qiáng)天然自產(chǎn)醇梭菌啟動子組成（圖1-2）。使用新的甲基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)甲基化該質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化到自產(chǎn)醇梭菌DSM23693中。在不同的工業(yè)氣流（鋼鐵廠廢氣、合成氣）上表明了產(chǎn)生1-丁醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:本發(fā)明使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)，其描述于Sambrooketal,1989和Ausubeletal,1987。所用的丙酮丁醇梭菌ATCC824的丁醇生物合成基因的DNA序列從NCBI獲得（表1）。將所述自產(chǎn)醇梭菌DSM10061的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子測序，用于表達(dá)靶基因（表1）。RT-PCR實驗表明該啟動子以高水平組成性表達(dá)（圖8）。Cition表1:1-丁醇途徑基因的來源使用由BertramandDürre（1989）改良的方法，分離了丙酮丁醇梭菌ATCC824和自產(chǎn)醇梭菌DSM10061的基因組DNA。收獲100-ml過夜培養(yǎng)物（6,000×g,15min,4℃），用磷酸鉀緩沖液（10mM,pH7.5）洗滌并懸浮于1.9mlSTE緩沖液（50mMTris-HCl,1mMEDTA,200mM蔗糖;pH8.0）中。加入300μl溶菌酶（約100,000U），將所得混合物在37℃孵育30min，然后加入280μl的10%（w/v）SDS溶液并且再孵育10min。加入240μlEDTA溶液（0.5M,pH8）、20μlTris-HCl（1M,pH7.5）和10μlRNaseA（Fermentas）在室溫消化RNA。然后，加入100μl蛋白酶K（0.5U）并在37℃保持1-3h進(jìn)行蛋白酶解。最后，加入600μl高氯酸鈉（5M），然后進(jìn)行酚-氯仿提取和異丙醇沉淀。通過分光光度計檢測DNA數(shù)量和質(zhì)量。使用iProof高保真DNA聚合酶（Bio-RadLabratories）以表2中的寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增丁醇生物合成基因和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶啟動子，所用程序如下：98℃初始變性30s，然后32個循環(huán)的變性（98℃，10s）、退火（50-62℃，30-120s）和延伸（72℃，45s），最后是延伸步驟（72℃，10min）。表2:用于克隆的寡核苷酸使用NotI和NdeI限制位點和菌株DH5α-T1R（Invitrogen）將所擴(kuò)增的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子的498bp啟動子區(qū)（Ppta-ack）克隆到大腸桿菌-梭菌穿梭載體pMTL85141（Seq.ID14;FJ797651.1;NigelMinton,UniversityofNottingham;Heapetal.,2009）中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒pMTL85145和所述硫解酶基因的1,194bp的PCR產(chǎn)物都用NdeI和EcoRI酶切。將連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-BlueMRF’Kan（Stratagene），得到質(zhì)粒pMTL85145-thlA。隨后，使用KpnI和BamHI以及大腸桿菌ABLEK（Stratagene）將所擴(kuò)增的丙酮丁醇梭菌ATCC824的crt-bcd-etfB-etfA-hbd操縱子的4,764bp的PCR片段克隆到該載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMTL85145-thlA-crt-hbd。最后，將抗生素抗性盒由氯霉素改變?yōu)榭死顾?。因此，使用限制酶PmeI和FseI使ermB盒從載體pMTL82254（Seq.ID15;FJ797646.1;NigelMinton,UniversityofNottingham;Heapetal.,2009）中釋放，并與質(zhì)粒pMTL85145-thlA-crt-hbd的catP盒交換。使用表3中給出的寡核苷酸將所得表達(dá)質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的插入物(SEQ_IDNo.31)完全測序，結(jié)果確定所述丁醇生物合成基因中不含突變（圖3）。表3:用于測序的寡核苷酸寡核苷酸名稱DNA序列(5｀到3｀)SEQ_IDNO.seq-ThlA-hbd-3562-4162CAGAGGATGTTAATGAAGTC16seq-ThlA-hbd-4163-4763GCATCAGGATTAAATGACTG17seq-ThlA-hbd-4764-5364ATAGCGAAGTACTTG18seq-ThlA-hbd-5365-5965GATGCAATGACAGCTTTC19seq-ThlA-hbd-5966-6566GGAACAAAAGGTATATCAGC20seq-ThlA-hbd-7168-7768CGGAGCATTTGATAAAGAA21seq-ThlA-hbd-7769-8369GCTGATTGTACATCACTTGA22seq-ThlA-hbd-8370-8870CCAGAATTAATAGCTCAAGT23DNA甲基化:通過比對自產(chǎn)醇梭菌（SEQ_IDNo.24）、揚氏梭菌（SEQ_IDNo.25）和拉氏梭菌（SEQ_IDNo.26）的甲基轉(zhuǎn)移酶基因，設(shè)計了融合到誘導(dǎo)型lac啟動子的雜合甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Seq.ID28）（圖4a、4b和4c）。甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)產(chǎn)生依據(jù)SEQ_IDNo.28的甲基轉(zhuǎn)移酶。甲基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列比對數(shù)據(jù)見圖4d。所述雜合甲基轉(zhuǎn)移酶基因（SEQ_IDNo.27）是化學(xué)合成的，使用EcoRI將其克隆到載體pGS20（Seq.ID29;ATG:biosyntheticsGmbH,Merzhausen,Germany）中（圖5）。將所得甲基化質(zhì)粒pGS20-甲基轉(zhuǎn)移酶與所述表達(dá)質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd共轉(zhuǎn)化至所述非限制性的大腸桿菌XL1-BlueMRF’Kan（Stratagene）中。通過加入1mMIPTG誘導(dǎo)體內(nèi)甲基化，并使用PureLinkTMHiPurePlasmidMaxiprepKit（Invitrogen）分離甲基化的質(zhì)粒。所得甲基化的質(zhì)粒組合物被用于轉(zhuǎn)化自產(chǎn)醇梭菌DSM23693。轉(zhuǎn)化:在整個轉(zhuǎn)化實驗中，使用Hungate（1969）和Wolfe（1971）所述的標(biāo)準(zhǔn)厭氧技術(shù)，在37℃下在含有10g/l果糖和作為碳源的30psi鋼鐵廠廢氣（取自NewZealandSteelsiteinGlenbrook,NZ;組分:44%CO、32%N2、22%CO2、2%H2）的PETC培養(yǎng)基（表4）中培養(yǎng)自產(chǎn)醇梭菌DSM23693和揚氏梭菌（DSM13528）。表4:PETC培養(yǎng)基（ATCC培養(yǎng)基1754;http://www.atcc.org/Attachments/2940.pdf）培養(yǎng)基組分每1.0L培養(yǎng)基中濃度NH4Cl1gKCl0.1gMgSO4.7H2O0.2gNaCl0.8gKH2PO40.1gCaCl20.02g微量金屬溶液1OmlWolfe′s維生素溶液1Oml酵母提取物1g刃天青(2g/L原液)0.5mlNaHCO32g還原劑0.006-0.008%(v/v)蒸餾水至1L,pH5.5(用HCl調(diào)節(jié))WOlfe's維生素溶液每L原液生物素2mg葉酸2mg鹽酸吡哆醇1Omg鹽酸硫胺素5mg核黃素5mg煙酸5mg鈣D-(+)-泛酸5mg維生素B120.1mg對氨基苯甲酸5mg硫辛酸5mg蒸餾水至1L微量金屬溶液每升原液氮川三乙酸2gMnsO4·H2O1gFe(S04)2(NH4)2·6H2O0.8gCOCl2·6H2OO.2gZnSO4·7H2O0.2mgcucl2·2H2O0.02gNaMoO4·2H2O0.02gNa2SeO3O02gNiCl2·6H2O0.02gNa2WO4·2H2O0.02g蒸餾水1L還原劑原液每1OOmL原液NaOH0.9g鹽酸半脫氨酸4gNa2s4g蒸餾水至100mL為制備感受態(tài)細(xì)胞，將50ml自產(chǎn)醇梭菌DSM23693培養(yǎng)物和50ml揚氏梭菌DSM13528培養(yǎng)物在新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)連續(xù)3天。使用這些細(xì)胞以0.05的OD600nm接種含40mMDL-蘇氨酸的50mlPETC培養(yǎng)基。當(dāng)所述培養(yǎng)物OD600nm達(dá)到0.4時，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到厭氧培養(yǎng)室中，并在4℃以4,700×g收獲。將所得培養(yǎng)物用冰冷的電穿孔緩沖液（270mM蔗糖、1mMMgCl2、7mM磷酸鈉,pH7.4）洗滌2次，最后用600μl新的電穿孔緩沖液重懸。將所得混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電穿孔杯（電極間隙為0.4cm）中，所述電穿孔杯中含1μg甲基化的質(zhì)?；旌衔铮ㄊ褂脫P氏梭菌時含有1μl1型限制性抑制劑(EpicentreBiotechnologies)），然后立即用GenepulserXcellelectroporationsystem(Bio-Rad)進(jìn)行沖擊，其設(shè)置如下：2.5kV,600Ω和25μF。達(dá)到了3.7-4.0ms的時間常數(shù)。將所述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到5ml新的培養(yǎng)基中。使用配備有管支架的SpectronicHeliosEpsilonSpectrophotometer（Thermo）在600nm波長下監(jiān)測所述細(xì)胞的恢復(fù)。在生物量初始下降以后，細(xì)胞開始再次生長。當(dāng)生物量相比該點加倍后收獲細(xì)胞，在200μl新的培養(yǎng)基中懸浮，并鋪板到含有4μg/μl克拉霉素的選擇性PETC板（含1.2%BactoTMAgar(BD)）上。在37℃輸入30psi的鋼鐵廠氣體4-5天后，每個平板上清晰可見15-80個克隆。將所述克隆用于接種含4μg/μl克拉霉素的2mlPETC培養(yǎng)基。當(dāng)出現(xiàn)生長后，將所述培養(yǎng)物放大到5ml，然后放大到50ml含4μg/μl克拉霉素和作為唯一的碳源的30psi鋼鐵廠氣體的PETC培養(yǎng)基。成功轉(zhuǎn)化的確認(rèn):自產(chǎn)醇梭菌:為驗證所述DNA轉(zhuǎn)化，使用QIAprepSpinMiniprepKit（Qiagen）從10ml培養(yǎng)物體積進(jìn)行小量質(zhì)粒提取。由于梭菌的外切核酸酶活性（BurchhardtandDürre,1990），從4個分析的克隆中分離的質(zhì)粒DNA部分地被降解，在瓊脂糖凝膠上只產(chǎn)生彌散條帶，而從原始自產(chǎn)醇梭菌DSM23693菌株中分離的質(zhì)粒未產(chǎn)生任何信號（圖6）。但是，所分離的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量足以用于使用4組引物進(jìn)行對照PCR，所述引物覆蓋了所述質(zhì)粒的所有相關(guān)的不同區(qū)域（表5）。所述PCR是以illustraPuReTaqReady-To-GoTMPCRBeads（GEHealthcare）使用標(biāo)準(zhǔn)條件（95℃5min;32個循環(huán)（95℃30s,50℃30s,72℃1min）;72℃10min）進(jìn)行的。所有4種分析的轉(zhuǎn)化子的PCR均產(chǎn)生了與原始甲基化的質(zhì)?；旌衔镒鳛槟０鍟r相同的信號（圖6）。作為另外的對照，將1μl每種部分降解的分離的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-BlueMRF’Kan（Stratagene）中，從中可干凈地分離所述質(zhì)粒并通過限制酶切消化驗證。為確定所述4個克隆的同一性，從40ml每種培養(yǎng)物中分離（見上文）基因組DNA，并使用illustraPuReTaqReady-To-GoTMPCRBeads（GEHealthcare）和標(biāo)準(zhǔn)條件（95℃5min;32個循環(huán)（95℃30s,50℃30s,72℃1min）;72℃10min）對16srRNA基因再次進(jìn)行PCR（表5；Weisbergetal.,1991）。將各個PCR產(chǎn)物純化并測序。所有克隆的序列與自產(chǎn)醇梭菌16SrRNA基因（Seq.ID30;Y18178,GI:7271109）顯示至少99.9%的同一性。相應(yīng)的菌株于2010年10月26日保藏于DSMZ（德國微生物菌種保藏中心，德國不倫瑞克），登錄號為DSM24138。揚氏梭菌：使用相同的方法和引物組對揚氏梭菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了確認(rèn)。測序所得的16SrRNA基因序列與揚氏梭菌的16S基因（Seq.ID119;CP001666,GI:300433347）100%匹配。表5:用于質(zhì)粒和種的PCR確認(rèn)的寡核苷酸1-丁醇產(chǎn)生:為證明從作為唯一能量和碳源的CO的1-丁醇產(chǎn)生，制備了不含酵母提取物和果糖的PETC培養(yǎng)基，并用攜帶丁醇質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的新的自產(chǎn)醇梭菌和揚氏梭菌菌株接種。將瓶用30psi的兩種工業(yè)來源的含CO的氣流加壓，所述兩種工業(yè)來源為：鋼鐵廠廢氣（從NewZealandSteelsiteinGlenbrook,NZ收集；組成:44%CO、32%N2、22%CO2、2%H2）和合成氣（RangeFuelsInc.,Broomfield,CO;組成:29%CO、45%H2、13%CH4、12%CO2、1%N2）?？勺C明兩種菌株和兩種氣體混合物在多個繼代培養(yǎng)階段都產(chǎn)生1-丁醇。還觀察到共產(chǎn)生丁酸。在相同條件下，在未經(jīng)修飾的自產(chǎn)醇梭菌DSM23693和揚氏梭菌DSM13528菌株的樣品中既未檢測到1-丁醇又未檢測到丁酸。使用配備有RID（反射指數(shù)檢測器，在35℃運行）和AlltechIOA-2000Organicacidcolumn（150×6.5mm,顆粒大小5μm，保持在60℃）的Agilent1100SeriesHPLCsystem通過HPLC進(jìn)行代謝物分析。使用弱酸性水（0.005MH2SO4）作為流動相，流速為0.7ml/min。為除去蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞殘余物，將400μl樣品與100μl的2%(w/v)5-磺基水楊酸混合，并在14,000×g離心3min以分離沉淀的殘余物。然后，將10μl上清注入HPLC中進(jìn)行分析。在血清瓶實驗中，在攜帶丁醇質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的自產(chǎn)醇梭菌的2種靜態(tài)培養(yǎng)物中觀察到最高的1-丁醇產(chǎn)生。在這些培養(yǎng)物中，1-丁醇是主要發(fā)酵終產(chǎn)物，檢測為1.54g/l（25.66mM）（表6，圖7）。與原始自產(chǎn)醇梭菌菌株DSM23693相比，其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生減少，只產(chǎn)生乙醇、乙酸和2,3-丁二醇。雖然碳流轉(zhuǎn)向1-丁醇產(chǎn)生，但是被納入代謝終產(chǎn)物的總碳的量幾乎相同（表6）。20%的少量增加可能是因為分別與乙醇和乙酸相比由產(chǎn)生1-丁醇和丁酸而卸下了額外的還原當(dāng)量。通常作為電子穴的2,3-丁二醇的產(chǎn)生被完全消除。表6:與原始自產(chǎn)醇梭菌DSM23693相比攜帶丁醇質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的自產(chǎn)醇梭菌的代謝物產(chǎn)生和碳平衡在攜帶丁醇質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的揚氏梭菌DSM13528的培養(yǎng)物中還觀察到顯著量1-丁醇的產(chǎn)生，高達(dá)0.36g/L（6mM），但這低于攜帶相同質(zhì)粒的自產(chǎn)醇梭菌DSM23693。這可被解釋為，自產(chǎn)醇梭菌DSM23693是具有改良醇產(chǎn)生的菌株，因此未經(jīng)修飾的自產(chǎn)醇梭菌DSM23693菌株比未經(jīng)修飾的揚氏梭菌DSM13528菌株產(chǎn)生更多的乙醇和更少的乙酸（兩種菌株都不產(chǎn)生丁醇和丁酸）。與自產(chǎn)醇梭菌相比，攜帶丁醇質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的揚氏梭菌具有更低的1-丁醇：丁酸比率。但是，1-丁醇：丁酸比率可被處理條件改變。這使得在自產(chǎn)醇梭菌和揚氏梭菌兩種菌株中，產(chǎn)生1-丁醇作為主要發(fā)酵產(chǎn)物，但也產(chǎn)生丁酸作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在血清瓶實驗中，自產(chǎn)醇梭菌中觀察到的1-丁醇：丁酸摩爾比介于50:1到1:30，揚氏梭菌中觀察到的1-丁醇：丁酸摩爾比介于20:1和1:30。與靜態(tài)培養(yǎng)物相比，在搖動下孵育的培養(yǎng)物通常產(chǎn)生更高的丁酸和更低的1-丁醇水平。還發(fā)現(xiàn)，頂部空間（headspace）中的CO（和H2）的濃度可影響1-丁醇：丁酸比率。在頂部空間中具有較少CO的培養(yǎng)物中，更利于產(chǎn)生丁酸，并且其產(chǎn)生作為主要發(fā)酵產(chǎn)物。相應(yīng)地，在進(jìn)行的血清瓶實驗中，對于含較多CO的鋼鐵廠氣體（44%CO）比含較少CO的合成氣（29%CO）觀察到更高的1-丁醇滴度。以攜帶pMTL85245-thlA-crt-hbd質(zhì)粒的自產(chǎn)醇梭菌觀察到1.08g/l（12.8mM）丁酸的最大值，以攜帶相同質(zhì)粒的揚氏梭菌觀察到1.03g/L（12.5mM）的水平。該效應(yīng)可被解釋為是由于進(jìn)入該系統(tǒng)的額外的碳以及通過一氧化碳脫氫酶（CODH）從CO氧化所產(chǎn)生的額外還原力。丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁酸和丁醇:所述表達(dá)質(zhì)粒僅包含從乙酰-CoA產(chǎn)生丁酰-CoA所必需的基因。然后，可通過丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶的作用將丁酰-CoA直接轉(zhuǎn)化為丁醇（圖1）。第二種可能性是經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶和丁酸激酶將丁酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁酸（圖1），在此情形中經(jīng)底物水平磷酸化（SLP）獲得ATP。由于Wood-Ljungdahl途徑的運行需要ATP，產(chǎn)乙酸細(xì)胞依賴于來自SLP的ATP，這也反映在每種已知產(chǎn)乙酸細(xì)菌都產(chǎn)生乙酸的事實中（Drakeetal.,2006）。但是，所述重組細(xì)胞也可通過產(chǎn)生丁酸經(jīng)SLP產(chǎn)生ATP。然后，可經(jīng)醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶（AOR）將丁酸進(jìn)一步還原為丁醛（圖1）。該反應(yīng)可被還原的鐵氧還蛋白驅(qū)動，所述還原的鐵氧還蛋白是在Wood-Ljungdahl途徑的起始步驟中經(jīng)一氧化碳脫氫酶氧化CO產(chǎn)生（CO+Fdred->CO2+Fdox）。然后，可經(jīng)丁醇脫氫酶將丁醛轉(zhuǎn)化為丁醇（圖1）。通過自產(chǎn)醇梭菌培養(yǎng)物將外部添加的丁酸轉(zhuǎn)化為丁醇已經(jīng)被證明（WO2009/113878）。發(fā)明人已經(jīng)在自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌中鑒定了具有丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶、磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、丁酸激酶和醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶活性的各個基因/酶（表7-10）。使用BLAST（Altschuletal,1990）、COG（Tatusovetal,2003）和TIGRFAM（Haftetal,2002）數(shù)據(jù)庫通過與已經(jīng)表征的基因和酶比較預(yù)測了可能的基因和酶。針對PROSITE（Huloetal.,2008）、Pfam（Finnetal.,2010）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了基序掃描。自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌的基因組含有多個編碼具有醇和醛脫氫酶活性的酶的基因。如表7到10所示，這些中的一些被發(fā)現(xiàn)與丙酮丁醇梭菌、拜季林斯基氏梭菌或糖丁酸梭菌中已經(jīng)表征的丁醛和丁醇脫氫酶具有超過70%的高同源性，而另外一些與這些酶具有至少約40%的同一性。所有3個基因組都正確編碼一種具有磷酸乙酰/丁酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶和一種具有乙酸/丁酸激酶活性的酶。自產(chǎn)醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌中每一種具有2個醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶基因。表7:可能提貢獻(xiàn)醛脫氫酶和丁醇脫氫酶活性的自產(chǎn)醇梭菌基因表8:可能貢獻(xiàn)丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶活性的揚氏梭菌基因表10:可能貢獻(xiàn)丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶活性的拉氏梭菌基因基因表達(dá)研究進(jìn)行了基因表達(dá)研究以確定在攜帶丁醇質(zhì)粒pMTL85245-thlA-crt-hbd的自產(chǎn)醇梭菌中成功表達(dá)導(dǎo)入的硫解酶、3-羥基丁烷酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白A和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白B基因。此外，還發(fā)現(xiàn)在自產(chǎn)醇梭菌基因組中鑒定的推定丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶、磷酸乙?；?丁?；D(zhuǎn)移酶、乙酸/丁酸激酶和醛：鐵氧還蛋白氧化還原酶基因（表7）可在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件下表達(dá)（圖60）。通過離心（6,000×g,5min,4℃）收獲樣品。通過將細(xì)胞沉淀懸浮于100μL溶菌酶溶液（50,000U溶菌酶,0.5μL10%SDS,10mMTris-HCl,0.1mMEDTA;pH8）而分離RNA。5min后，加入350μL裂解緩沖液（含10μL2-巰基乙醇）。將所得細(xì)胞懸浮物通過18-21口徑針頭5次進(jìn)行機(jī)械破壞。然后，使用PureLinkTMRNAMiniKit（Invitrogen）分離RNA，并在100μL不含RNA酶的水中洗脫。經(jīng)PCR和凝膠電泳檢查RNA，用分光光度計定量，如果需要可用DNaseI（Roche）處理。使用BioAnalyzer（AgilentTechnologies）檢查RNA的質(zhì)量和完整性。使用SuperScriptIIIReverseTranscriptaseKit（Invitrogen）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟。在MyiQSingleColourReal-TimePCRDetectionSystem（Bio-RadLabratories）中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，15μL反應(yīng)體積中含有25ngcDNA模板、67nM的每種引物（表11）和1×iQSYBRGreenSupermix（Bio-RadLabratories,Hercules,CA94547,USA）。鳥苷酸激酶和甲酸四氫葉酸連接酶被用作看家基因，還包括非模板對照。反應(yīng)條件是：95℃3min，然后40個循環(huán)（95℃15s,55℃15s和72℃30s）。RTPCR完成后立即進(jìn)行融解曲線分析（1℃/s從58℃到95℃共38個循環(huán)），用于檢測引物二聚體和其他擴(kuò)增假象。所有異源基因的mRNA都可被成功檢測到，表明所述基因被表達(dá)。所有基因的信號處于相似的水平。表11:用于qRT-PCR的寡核苷酸本文已參照一些優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，以使得讀者無需過多實驗即可實施本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地認(rèn)識到，在不背離本發(fā)明范圍的前提下，許多組分和參數(shù)可作一定程度的變化或修改或者被替換為已知的等價物。應(yīng)理解，這樣的修改物和等價物如同單獨提出一樣被納入本文。提供名稱、標(biāo)題等目的是增強(qiáng)讀者對該文件的理解，而不應(yīng)當(dāng)被解讀為是限制本發(fā)明的范圍。如果有的話，上文和下文引用的所有申請、專利和出版物的全部公開內(nèi)容均以引用方式納入本文。但是，本說明書中對任何申請、專利和出版物的引用不是也不應(yīng)被理解為承認(rèn)或以任何形式暗示其在世界上任何國家構(gòu)成有效的現(xiàn)有技術(shù)或者形成公知常識的部分。在整個該說明書以及以下的任何權(quán)利要求中，除非上下文另有說明，詞語“包含（comprise）”、“包括（comprising）”等應(yīng)以與排除意義相反的包括意義來解釋，也就是說，“包含但不限于”的意思。參考文獻(xiàn)：AltschulSF,GishW,MillerW,MyersEW,LipmanDJ(1990)BasiclocalalignmentsearchtoolJMolBiol215:403-410.AusubelFM,BrentR,KingstonRE,MooreDD,SeidmanJG,SmithJA,StruhlK(1987)Currentprotocolsinmolecularbiology.JohnWiley&Sons,Ltd.,Hoboken,NJ.BertramJ，DürreP(1989)ConjugaltransferandexpressionofstreptococcaltransposonsinClostidiumaceto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