專利名稱：超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶羌捌渲苽浞椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制備殼聚糖領(lǐng)域，特別涉及超支化結(jié)構(gòu)的殼聚糖(Hyperbrached Chitosan)或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?Hyperbrached Glycol Chitosan)及其制備方法。
背景技術(shù)：
自1990年以來(lái)，幾丁質(zhì)和殼聚糖因其優(yōu)越的生化性能使人們對(duì)它們的興趣不斷增加。這些性能主要表現(xiàn)在生物降解特性、免疫活性、抗病毒活性和創(chuàng)傷修復(fù)等方面。近幾年來(lái)，這類聚糖化合物在藥物控釋、細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程等領(lǐng)域的研究中取得了一定成果。殼聚糖及其衍生物由于良好的物理化學(xué)性質(zhì)和醫(yī)藥功能，在藥物研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。此外，殼聚糖作為一種天然陽(yáng)離子聚合物，通過(guò)與DNA以靜電方式作用形成殼聚糖-DNA配合物，能使DNA在體內(nèi)不易被降解，而且具有細(xì)胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和轉(zhuǎn)染效率較高等特點(diǎn)，也引起了大家的重視。
目前，對(duì)殼聚糖及其衍生物的改性主要采取對(duì)糖環(huán)上的氨基和羥基進(jìn)行取代的方法，例如引入糖基、烷基、聚乙二醇等。但由于天然殼聚糖為線性大分子，所以上述改性方法不能改變其主鏈結(jié)構(gòu)。聚合物鏈結(jié)構(gòu)對(duì)其性質(zhì)有著很大的影響，例如，研究表明支化聚乙烯基亞胺(PEI)對(duì)DNA的結(jié)合與轉(zhuǎn)染能力均高于相同分子量的線性PEI，因此人工制備支化殼聚糖及其衍生物不但有利于深入研究分子鏈結(jié)構(gòu)對(duì)其物理化學(xué)性能的影響，也有利于擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。韓國(guó)的Park等人和日本的Sashiwa等人分別利用殼聚糖的氨基與乳二糖酸反應(yīng)制得半乳糖化殼聚糖(Galactosylated chitosan，Galactosyl chitosan)(In-Kyu Park，Jun Yang，Hwan-Jeong Jeong，Hee-Seung Bom，Ichiro Harada，Toshihiro Akaike，Su-Il Kim and Chong-Su Cho，“Galactosylated chitosan as asynthetic extracellular matrix for hepatocytes attachment”，Biomaterials，2003，24，2331-2337； Hitoshi Sashiwa，Jennifer M.Thompson，Sanjoy K.Das，YoshihiroShigemasa，Sasmita Tripathy，and RenéRoy，“Chemical Modification of ChitosanPreparation and Lectin Binding Properties of α-Galactosyl-chitosan Conjugates.Potential Inhibitors in Acute Rejection following Xenotransplantation”，Biomacromolecules，2000，1，303-305)，但是其側(cè)鏈長(zhǎng)度很短，只有一到二個(gè)完整糖環(huán)，且結(jié)構(gòu)單元與主鏈不同。挪威的Tmmeraas等人由亞硝酸降解不完全乙?；臍ぞ厶堑玫蕉替湈锥≠|(zhì)(乙酰化率為100％)，再利用其與高分子量殼聚糖的氨基進(jìn)行反應(yīng)，得到支化的殼聚糖(Kristoffer Tmmeraas，Magnus Kjell M. Bjrn E.Christensen，Per Artursson and OlavSmidsrd，“Preparation and characterisation of chitosans with oligosaccharidebranches”，Carbohydrate Research，2002，337，2455-2462)。但是，由于高分子量幾丁質(zhì)不溶于水，因此他們得到的枝化殼聚糖的側(cè)鏈也很短(最多6個(gè)糖環(huán))，且側(cè)鏈幾丁質(zhì)上的氨基由于被乙?；痪哂蟹磻?yīng)活性。此外，用上述接枝方法對(duì)殼聚糖的改性只能得到梳狀高分子結(jié)構(gòu)而非超支化結(jié)構(gòu)(HitoshiSashiwa，Sei-ichi Aiba，“Chemically modified chitin and chitosan as biomaterials”，Prog.Polym.Sci.，2004，29，887-908)。
另一方面，應(yīng)用多官能團(tuán)交聯(lián)劑雖然能夠?qū)ぞ厶菍?shí)行交聯(lián)從而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但形成的凝膠在溶劑中不能溶解(J.Berger，M.Reist，J.M.Mayer，O.Felt，N.A.Peppas and R.Gurny，“Structure and interactions in covalently andionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications”，EuropeanJournal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，57，19-34)。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)制備具有超支化結(jié)構(gòu)的殼聚糖或其衍生物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的一是提供超支化結(jié)構(gòu)的殼聚糖(Hyperbrached Chitosan)或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?Hyperbrached Glycol Chitosan)。
本發(fā)明的再一目的是提供目的一的超支化結(jié)構(gòu)的殼聚糖(HyperbrachedChitosan)或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?Hyperbrached Glycol Chitosan)的制備方法。
本發(fā)明采用線性殼聚糖(Chitosan)或乙二醇?xì)ぞ厶?Glycol Chitosan)等為原料，通過(guò)亞硝酸或亞硝酸鹽降解并引入醛基端基，再進(jìn)行醛基-氨基反應(yīng)形成席夫(Schiff)堿，最后將Schiff堿還原為亞胺，以此在水溶液中制備具有超支化結(jié)構(gòu)的殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶恰１景l(fā)明的特征在于利用殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶墙到夂笮纬傻娜┗嘶c殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶擎溕系氖Ｓ喟被磻?yīng)，由于降解后的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶潜旧硗瑫r(shí)具有氨基和單個(gè)醛基而獲得具有超支化結(jié)構(gòu)的聚合物。通過(guò)改變合成條件或反應(yīng)組分可以控制接枝率及分子量。適用聚合物可以是完全或不完全去乙?；臍ぞ厶?、乙二醇?xì)ぞ厶且约捌渌捎脕喯跛峄騺喯跛猁}降解的羥基或氨基取代的殼聚糖衍生物。由于合成過(guò)程中不對(duì)殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶堑陌被蛄u基進(jìn)行保護(hù)，因此產(chǎn)物本身或經(jīng)簡(jiǎn)單改性后在水溶液中的溶解性良好，有利于其對(duì)DNA的包裹和通過(guò)氨基反應(yīng)對(duì)聚合物進(jìn)行功能化改性。
本發(fā)明的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶堑慕Y(jié)構(gòu)式如下 其中x，y，z及x’，y’，z’為分子鏈中不同鏈段的個(gè)數(shù)，且鏈段呈無(wú)規(guī)排列，x，y，z的數(shù)值可以相同或不同；R＝H或CH2CH2OH；Ri為與上述結(jié)構(gòu)式中虛線部分結(jié)構(gòu)相同的支鏈，但不同支鏈的x’，y’和z’的數(shù)值可以相同或不同，以此類推構(gòu)成超支化結(jié)構(gòu)。當(dāng)結(jié)構(gòu)式中的R為H時(shí)為超支化殼聚糖，當(dāng)結(jié)構(gòu)式中的R為CH2CH2OH時(shí)為超支化乙二醇?xì)ぞ厶?。超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶堑姆肿恿糠秶鸀椤?000Da，優(yōu)選分子量范圍為5000Da～250kDa。
本發(fā)明的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶堑闹苽浞椒ò聪铝许樞蜻M(jìn)行(1).將殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶怯脕喯跛峄騺喯跛猁}降解(G.GrahamAllan，Mark Peyron，“Molecular weight manipulation of chitosan Ikinetics ofdepolymerization by nitrous acid”，Carbohydrate Research，1995，277，257～272)。必要時(shí)降解所得產(chǎn)物可用沉淀法或體積排除色譜法分級(jí)得到更窄分子量分布的一端端基為醛基的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶?分子量分布≤1.5)。所述的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶堑陌被阴；秶稍?～90％，乙二醇?xì)ぞ厶侵械囊叶蓟鶊F(tuán)的接枝率可在大于0小于等于100％。產(chǎn)物也可用透析-冷凍干燥法純化。
(2).將步驟(1)所得產(chǎn)物以0.5～100mg/ml的濃度溶解于酸性、中性、堿性溶劑和/或緩沖液等中，待完全溶解后滴加堿或酸溶液調(diào)節(jié)pH值為3～11，在反應(yīng)液中無(wú)沉淀出現(xiàn)的前提下盡可能控制pH值接近中性。
(3).一次或多次向步驟(2)的產(chǎn)物中加入總量不低于反應(yīng)物中醛基摩爾數(shù)0.5倍的NaCNBH3、NaBH4或二者混合物(較好為NaCNBH3)的還原試劑，在0～80℃下進(jìn)行反應(yīng)(一般為室溫反應(yīng))。
(4).將步驟(3)得到的反應(yīng)液經(jīng)過(guò)透析法透析、凍干和/或經(jīng)過(guò)沉淀劑沉淀、沉淀物洗滌、干燥得到超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶恰１匾獣r(shí)用色譜方法對(duì)純化產(chǎn)物分級(jí)。
所述的步驟(2)反應(yīng)溶液中可以加入部分帶有未取代氨基的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶恰?br> 所述的沉淀劑為氨水、NaOH、KOH、NaHCO3水溶液、水溶性醇、丙酮或它們的任意混合液等。洗滌液為上述沉淀劑或水。
用沉淀分級(jí)法或體積排除色譜法分級(jí)步驟(1)所得到的降解產(chǎn)物，和/或用沉淀分級(jí)法或體積排除色譜法分級(jí)步驟(4)所得到的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?，能夠得到較窄分子量分布的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?分子量分布≤2.0)。
所述的酸性溶劑是HCl、HBr、HI、H2SO4、H2SO3、甲酸、乙酸、苯磺酸或它們的任意混合物等。
所述的中性溶劑選自水、鹽水、醇/水中的一種或一種以上的混合溶液等；所述的鹽可為NaCl、KCl、NaSO4、NaSO3、NaCO3、NaNO2等無(wú)機(jī)鹽或它們的任意混合物；所述的醇是甲醇、乙醇或它們的混合液。
所述的堿性溶劑是NaOH、KOH、NaHCO3、氨水或它們的任意混合物等。
所述的緩沖液是醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、硼酸緩沖液或它們的任意混合液等。
所述的酸是HCl、HBr、HI、H2SO4、H2SO3、甲酸、乙酸、苯磺酸或它們的任意混合物等。
所述的堿性是NaOH、KOH、NaHCO3、氨水或它們的任意混合物等。
本發(fā)明的產(chǎn)品及其制備方法具有如下特點(diǎn)I.實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備、操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)步驟少，反應(yīng)條件溫和。
II.可簡(jiǎn)單地通過(guò)改變反應(yīng)物濃度、組分和反應(yīng)時(shí)間等來(lái)控制產(chǎn)品的支化率和分子量。
III.產(chǎn)品中仍可保留大量氨基，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的功能化(如與DNA形成配合物)或化學(xué)改性(如四級(jí)胺化)等。


圖1.本發(fā)明實(shí)施例1的亞硝酸降解產(chǎn)物和超支化乙二醇?xì)ぞ厶堑哪z色譜圖。
圖2.本發(fā)明實(shí)施例1中經(jīng)硝酸降解后得到產(chǎn)物的NMR圖。
圖3.本發(fā)明實(shí)施例3中四級(jí)胺化的超支化殼聚糖的NMR圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.超支化乙二醇?xì)ぞ厶堑闹苽湟叶細(xì)ぞ厶?Mw＝250kDa，GPC/光散射法)溶解于0.2M醋酸中。0～4℃并高速攪拌下加入相當(dāng)于氨基摩爾數(shù)5％的NaNO2的水溶液，在0～4℃下繼續(xù)反應(yīng)15小時(shí)后用3倍體積的丙酮沉淀。沉淀物用丙酮、甲醇洗滌多次后真空干燥。干燥后得到低分子量帶有醛基端基的乙二醇?xì)ぞ厶?，其重均分子量?500(GPC/光散射法)，其核磁共振譜圖見(jiàn)圖2，其中化學(xué)位移5.05處的峰為醛基H。上述亞硝酸降解的低分子量乙二醇?xì)ぞ厶?Mw＝5500)溶解于0.1M醋酸水溶液(5mg/mL)，25℃室溫下攪拌1小時(shí)后滴加0.1MNaOH水溶液至pH為6.5，繼續(xù)攪拌2小時(shí)后加入相當(dāng)于醛基摩爾數(shù)0.5倍的NaCNBH3，25℃室溫下反應(yīng)24小時(shí)后再加入相同量的NaCNBH3，繼續(xù)反應(yīng)48小時(shí)。期間控制pH值不高于8.0。反應(yīng)溶液在水中透析48小時(shí)(更換10次)，凍干得到超支化乙二醇?xì)ぞ厶?，其重均分子量?5kDa(GPC/光散射法)。原始反應(yīng)物(乙二醇?xì)ぞ厶?，亞硝酸降解產(chǎn)物和超支化乙二醇?xì)ぞ厶堑哪z色譜圖見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2.超支化殼聚糖的制備50g殼聚糖溶解于1000mL5％的醋酸水溶液并冷卻至0～4℃。將5gNaNO2溶解于50mL水后滴加入上述殼聚糖溶液，0～4℃下反應(yīng)9小時(shí)，加入濃NaOH水溶液至沉淀全部析出，過(guò)濾，并用甲醇和水洗滌多次，真空干燥得到的帶有醛基端基的低分子量殼聚糖。低分子量殼聚糖經(jīng)甲醇沉淀分級(jí)后的產(chǎn)物(Mw＝2300，Mw/Mn＝1.5，GPC/光散射法)溶解于0.1M醋酸(2mg/mL)，10℃下攪拌1小時(shí)后滴加0.1M NaOH水溶液至pH為5.5。繼續(xù)攪拌2小時(shí)后加入相當(dāng)于醛基摩爾數(shù)1.0倍的NaCNBH3，10℃下反應(yīng)24小時(shí)后再加入相同量的NaCNBH3，繼續(xù)反應(yīng)72小時(shí)。期間控制pH值不高于6.5。反應(yīng)液用砂芯漏斗過(guò)濾，濾液用3倍甲醇沉淀，并用甲醇、水多次洗滌。洗滌后的產(chǎn)物40℃下真空干燥。干燥后的產(chǎn)物溶解于醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH＝4.0)，用Sephadex G-100凝膠色譜拄(顆粒尺寸40～120μm，分級(jí)范圍Dextran標(biāo)樣1k-100kDa)分級(jí)。收集的產(chǎn)物由GPC/光散射法測(cè)定分子量及分子量分布，其中最初級(jí)份(約占25％總重)的分子量為32kDa，分子量分布為1.9。
實(shí)施例3.四級(jí)胺化的超支化殼聚糖的制備5g殼聚糖溶解于50mL0.2M的醋酸水溶液并冷卻至0～4℃。將0.15gNaNO2溶解于1mL水后滴加入上述殼聚糖溶液，0～4℃下反應(yīng)15小時(shí)，加入濃NaOH至沉淀全部析出，過(guò)濾、并用甲醇和水洗滌多次，真空干燥得到的帶有醛基端基的低分子量殼聚糖(Mw＝3700，GPC/光散射法)。得到的低分子量殼聚糖溶解于0.1M醋酸(2mg/mL)，60℃下攪拌1小時(shí)后滴加0.1MNaOH水溶液至pH為5.0。繼續(xù)攪拌2小時(shí)后加入相當(dāng)于醛基摩爾數(shù)2.0倍的NaCNBH3，60℃下反應(yīng)72小時(shí)。期間控制pH值不高于6.0。反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入濃氨水至pH值8.5，將所得沉淀物過(guò)濾后用甲醇、稀氨水、水多次洗滌，真空干燥。所得產(chǎn)物的分子量為48kDa，分子量分布2.0(GPC/光散射法)。將干燥后的產(chǎn)物(超支化殼聚糖)分散于含有2mg/mLNaI的N甲基吡咯烷酮和飽和NaOH的乙醇溶液(5∶1v/v)中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入3倍于超支化殼聚糖氨基摩爾數(shù)的碘甲烷(CH3I)，36℃下反應(yīng)6小時(shí)后得到亮棕黃色溶液。向溶液中倒入不少于3倍體積的乙醚，分離沉淀并用乙醚多次洗滌，洗滌后的沉淀物可溶解于水或稀酸。該產(chǎn)物所含碘離子經(jīng)氯離子置換后得到穩(wěn)定的四級(jí)胺化超支化殼聚糖。所得產(chǎn)物的四級(jí)胺化率為66％(NMR法，見(jiàn)圖3)。
權(quán)利要求
1.一種超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?，其特征是，所述的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶墙Y(jié)構(gòu)式為 其中Ri為與結(jié)構(gòu)式中 結(jié)構(gòu)相同的支鏈；x，y，z及x’，y’，z’為分子鏈中不同鏈段的個(gè)數(shù)，且鏈段呈無(wú)規(guī)排列，x，y，z的數(shù)值相同或不同；R＝H或CH2CH2OH；Ri支鏈中的x’，y’和z’鏈段的個(gè)數(shù)相同或不同；當(dāng)結(jié)構(gòu)式中的R為H時(shí)為超支化殼聚糖，當(dāng)結(jié)構(gòu)式中的R為CH2CH2OH時(shí)為超支化乙二醇?xì)ぞ厶牵怀Щ瘹ぞ厶腔虺Щ叶細(xì)ぞ厶堑姆肿恿繛椤?000Da。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?，其特征是所述的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶欠肿恿繛?000Da～250kDa。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?，其特征是所述的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶欠肿恿糠植肌?.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶堑闹苽浞椒ǎ涮卣魇?，該方法按下列順序進(jìn)行(1).將殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶怯脕喯跛峄騺喯跛猁}降解，得到高分子鏈一端端基為醛基的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶牵粴ぞ厶腔蛞叶細(xì)ぞ厶堑陌被阴；秶?～90％；(2).將步驟(1)所得產(chǎn)物以0.5～100mg/ml的濃度溶解于酸性、中性、堿性溶劑和/或緩沖液中，待完全溶解后滴加堿或酸溶液調(diào)節(jié)pH值為3～11，在反應(yīng)液中無(wú)沉淀出現(xiàn)的前提下控制pH值接近中性；(3).一次或多次向步驟(2)的產(chǎn)物中加入總量不低于反應(yīng)物中醛基摩爾數(shù)0.5倍的NaCNBH3、NaBH4或二者混合物的還原試劑，在0～80℃下進(jìn)行反應(yīng)；(4).將步驟(3)得到的反應(yīng)液經(jīng)過(guò)透析法透析、凍干和/或經(jīng)過(guò)沉淀劑沉淀、沉淀物洗滌、干燥得到超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶恰?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的步驟(2)反應(yīng)溶液中加入部分帶有未取代氨基的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶恰?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的沉淀劑為氨水、NaOH、KOH、NaHCO3水溶液、水溶性醇、丙酮或它們的混合液；洗滌液為上述沉淀劑或水。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是用沉淀分級(jí)法或體積排除色譜法分級(jí)步驟(1)所得到的高分子鏈一端端基為醛基的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶墙到猱a(chǎn)物，和/或用沉淀分級(jí)法或體積排除色譜法分級(jí)步驟(4)所得到的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?，能夠得到分子量分布?.0的超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶恰?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的酸性溶劑是HCl、HBr、HI、H2SO4、H2SO3、甲酸、乙酸、苯磺酸或它們的任意混合物；所述的中性溶劑選自水、鹽水、醇/水中的一種或一種以上的混合溶液；所述的堿性溶劑是NaOH、KOH、NaHCO3、氨水或它們的任意混合物；所述的緩沖液是醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、硼酸緩沖液或它們的任意混合液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是所述的鹽是NaCl、KCl、NaSO4、NaSO3、NaCO3、NaNO2無(wú)機(jī)鹽或它們的任意混合物；所述的醇是甲醇、乙醇或它們的混合液。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的酸是HCl、HBr、HI、H2SO4、H2SO3、甲酸、乙酸、苯磺酸或它們的任意混合物；所述的堿性是NaOH、KOH、NaHCO3、氨水或它們的任意混合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于制備殼聚糖領(lǐng)域，特別涉及超支化結(jié)構(gòu)的殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶羌捌渲苽浞椒?。包括將殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶怯脕喯跛峄騺喯跛猁}降解，降解所得產(chǎn)物用沉淀法或體積排除色譜法分級(jí)得到更窄分子量分布的高分子鏈一端端基為醛基的殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶?；溶解于弱酸性或中性等溶液中形成Schiff堿；利用還原劑還原Schiff堿得到超支化殼聚糖或超支化乙二醇?xì)ぞ厶?，結(jié)構(gòu)為其中R
文檔編號(hào)C08B37/00GK101058612SQ20061001175
公開(kāi)日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月19日
發(fā)明者屈小中, 楊振忠 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所