專利名稱：具有特定原子排列的聚合物衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及包含特定內(nèi)部結(jié)構(gòu)取向的新聚合試劑，以及涉及這些新聚合試劑的偶聯(lián)物。此外，本發(fā)明涉及合成聚合試劑的方法和將聚合試劑和活性劑及其他物質(zhì)偶聯(lián)的方法。此外，本發(fā)明還涉及藥物制劑以及將偶聯(lián)物給藥于患者的方法。
背景技術(shù)：
科學(xué)家和臨床醫(yī)生在他們?cè)噲D將活性劑開發(fā)成適于傳送至患者的形式中面臨很多挑戰(zhàn)。是多肽的活性劑，例如，通常通過注射而不是口服途徑傳送。以這種方式，將多肽引入全身循環(huán)而不暴露于胃的蛋白水解環(huán)境中。然而，注射多肽具有數(shù)個(gè)缺點(diǎn)。例如，許多多肽半衰期相對(duì)短，因此需要重復(fù)注射，其通常是不方便和疼痛的。此外，一些多肽可能引起一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)，結(jié)果是可能激活患者的免疫系統(tǒng)而降解了多肽。因此，活性劑如多肽的傳送通常存在問題，即使通過注射給予這些藥劑時(shí)。
在解決通過注射傳送活性劑的問題中已經(jīng)獲得了一些成功。例如，將活性劑和水溶性聚合物偶聯(lián)形成免疫原性和抗原性降低的聚合物-活性劑偶聯(lián)物。此外，由于通過腎臟清除降低和/或全身循環(huán)中酶降解降低，這些聚合物-活性劑偶聯(lián)物和它們未偶聯(lián)對(duì)應(yīng)物相比較通常極大地增加了半衰期。由于具有更大的半衰期，聚合物-活性劑偶聯(lián)物需要的服藥頻率較低，其依次減少了疼痛注射的總數(shù)和衛(wèi)生保健醫(yī)生的不方便觀察。此外，僅僅是邊緣可溶的活性劑當(dāng)和水溶性聚合物偶時(shí)通常證明顯著增加了水溶解性。
對(duì)于局部使用和內(nèi)服，由于其證實(shí)的安全性以及其得到了FDA的批準(zhǔn)，聚乙二醇已經(jīng)和活性劑偶聯(lián)。當(dāng)活性劑和聚乙二醇或“PEG”的聚合物偶聯(lián)時(shí)，偶聯(lián)的活性劑通常稱為已經(jīng)“PEG化的”。PEG化活性劑如PEGASYSPEG化的干擾素α-2a(Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ)、PEG-INTRONPEG化的干擾素α-2b(Schering Corp.，Kennilworth，NJ)和NEULASTATMPEG-非格司亭(Amgen Inc.，ThousandOaks，CA)的商業(yè)成功證明，給藥偶聯(lián)形式的活性劑相對(duì)于未結(jié)合對(duì)應(yīng)物可具有顯著優(yōu)勢(shì)。還制得與聚(乙二醇)偶聯(lián)的小分子如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Zalipsky(1993)Bioconjug.Chem.4(4)296-299)與氟尿嘧啶(Ouchi等(1992)Drug Des.Discov.9(1)93-105)。Harris等已經(jīng)提供了聚乙二醇化對(duì)藥物影響的綜述。Harris等(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2(3)214-221。
盡管這些成功，水溶性聚合物和活性劑的偶聯(lián)仍然存在挑戰(zhàn)。這樣的挑戰(zhàn)之一是和相對(duì)長(zhǎng)的聚乙二醇分子連接時(shí)活性劑會(huì)失活。盡管相對(duì)長(zhǎng)的聚乙二醇分子可以為相應(yīng)的活性劑-聚合物偶聯(lián)物提供更大水溶解性，已知帶有這樣長(zhǎng)聚乙二醇部分的偶聯(lián)物在體內(nèi)實(shí)質(zhì)上是無活性的。已經(jīng)假定這些偶聯(lián)物的失活是由于相對(duì)聚乙二醇鏈的長(zhǎng)度，其有效地將它本身纏繞在整個(gè)活性劑周圍，因此阻斷了活性所需的接近潛在配體。
通過使用“支化”形式的聚合物，已經(jīng)部分解決了帶有相對(duì)大聚乙二醇部分偶聯(lián)物失活相關(guān)的問題。這樣“支化”聚合物的實(shí)例描述于Harris等的美國(guó)專利No.5,932,462中。如其中所述，“mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺”可以連接至生物活性蛋白質(zhì)上的可接近氨基(例如，由于構(gòu)象結(jié)構(gòu)沒有物理阻斷的氨基)。該支化聚合物(分子量約40,000道爾頓)從Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)可獲得且具有以下結(jié)構(gòu)
其中mPEG20K表示約20,000道爾頓分子量的甲氧基封端的聚乙二醇衍生物。
該支鏈聚合物和干擾素α-2a的偶聯(lián)形成含有連接干擾素α-2a至聚合物的酰胺鍵的偶聯(lián)物。示意地，偶聯(lián)物可以如下表示 該偶聯(lián)物，可以PEGASYS品牌商業(yè)上獲得的聚乙二醇化干擾素α-2a(Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ)，表明用于治療成人的丙型肝炎。
盡管使用支鏈聚合物可以解決一些與相對(duì)大的線性聚合物相關(guān)的問題，仍然存在制備有用偶聯(lián)物的其它挑戰(zhàn)。例如，偶聯(lián)物的體內(nèi)降解速率通常不可接受地太長(zhǎng)或太短。特別地，在連接活性劑至聚合物的一連串原子一些位點(diǎn)發(fā)生的水解速率通常(盡管不是必需的)部分地控制了體內(nèi)降解速率。因此，相對(duì)快的水解速率可以導(dǎo)致不可接受的具有太短體內(nèi)半衰期的偶聯(lián)物，而相對(duì)慢的水解可以導(dǎo)致不可接受的具有太長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的偶聯(lián)物。因此，具有獨(dú)特系列原子(在聚合物自身以及相應(yīng)偶聯(lián)物中)的聚合物可以導(dǎo)致獨(dú)特的水解速率，其隨后影響了偶聯(lián)物的體內(nèi)降解速率。
某些活性劑和mPEG2-N-羥基琥珀酰亞胺的偶聯(lián)物的水解發(fā)生在將一個(gè)mPEG“支鏈”連接至另一個(gè)的原子鏈中，假定代謝產(chǎn)物之一具有約20,000道爾頓的分子量。原子鏈中用于這樣裂解的一個(gè)可能的位置是直接位于相鄰于聚合物中一個(gè)mPEG部分的 部分中。 部分表示裂解的最可能的位置，因?yàn)閷⒁粋€(gè)mPEG支鏈連接至另一個(gè)的鏈中僅有的其它原子是構(gòu)成亞甲基的一連串碳原子，其在體內(nèi)降解比 部分相對(duì)更穩(wěn)定。裂解后，聚合物分開的形式是mPEG-OH。因此，至少部分基于形成mPEG-OH的偏好，結(jié)果是獨(dú)特的水解速率。
然而，理想的是能夠提供聚合物使得它們的水解速率可以“定制”。例如，關(guān)于通常每周給藥的PEG化干擾素α-2a，更慢的水解速率可以提供給藥之間的甚至更長(zhǎng)時(shí)間段。此外，通過增加偶聯(lián)物的水解敏感性可以改進(jìn)具有太長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的偶聯(lián)物。
具有獨(dú)特水解速率聚合物的展開調(diào)色板(palette)使研究者和科學(xué)家能提供“定制”的活性劑-聚合物偶聯(lián)物來提供(除了其它事情以外)所需的水溶解性和/或體內(nèi)降解速率的增加。此外，具有獨(dú)特水解速率的聚合物不僅可以用于支鏈聚合物，還可以用于其它形式(例如，線性或多臂的)。因此，仍然存在提供(除了其它事情以外)獨(dú)特系列的原子來提供“定制的”降解速率的聚合物的需求。對(duì)申請(qǐng)人知識(shí)的最佳來說，在此所述的聚合物、偶聯(lián)物、制劑，和方法是新的且本技術(shù)完全沒有建議過。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的主要目的是提供含有下列結(jié)構(gòu)的聚合試劑水溶性聚合物 式(I)其中“水溶性聚合物”是水溶性聚合物，每個(gè)“-\\-”獨(dú)立地表示直接共價(jià)鍵或間隔部分；R1是H或有機(jī)基；Z是反應(yīng)基。如式(I)所示，水溶性聚合物和 部分的氮原子接近，反應(yīng)基Z和 部分的羰基碳原子接近。盡管帶有 部分的聚合試劑包括于本發(fā)明中，優(yōu)選具有和 羰基碳原子鄰接的氧原子，因此形成 部分，通常稱為“氨基甲酸酯”或“尿烷”基。其他官能團(tuán)也可以存在于聚合試劑內(nèi)或其上。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供這樣的聚合試劑，其中R1是H。
本發(fā)明還另一個(gè)目的是提供這樣的聚合試劑，其中硫原子和 部分的羰基碳原子連接，因此形成 部分。
本發(fā)明還另一個(gè)目的是提供這樣的聚合試劑，其中-N(R2)-部分和 部分的羰基碳原子連接，因此提供 部分，其中R2是H或有機(jī)基。
本發(fā)明還另一目的是提供聚合試劑，其中水溶性聚合物是聚(烯化氧)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供制備上述聚合試劑的方法，其中該方法包括步驟(i)提供由受保護(hù)反應(yīng)基或反應(yīng)基前體和一個(gè)或多個(gè)羥基組成的前體分子；(ii)激活前體分子一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)來和氨基反應(yīng)形成激活的前體分子；(iii)在共價(jià)偶聯(lián)的條件下將一個(gè)或多個(gè)激活羥基中的至少一個(gè)和具有氨基的水溶性聚合物接觸，因此形成由水溶性聚合物部分和受保護(hù)反應(yīng)基或反應(yīng)基前體組成的聚合物；和(iv)當(dāng)保護(hù)反應(yīng)基存在時(shí)將它去保護(hù)。
本發(fā)明還進(jìn)一步的是提供聚合物偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含水溶性聚合物、 部分，和藥理學(xué)活性劑，其中(i)通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分將水溶性聚合物和 部分的氮原子連接；(ii)通過直接共價(jià)鍵或第二個(gè)間隔部分將藥理學(xué)活性劑和 部分的羰基碳原子連接；和(iii)R1是H或有機(jī)基。
本發(fā)明另外的目的是提供制備偶聯(lián)物的方法，該偶聯(lián)物包含在合適條件下將在此提供的聚合試劑和活性劑接觸因此形成偶聯(lián)物的步驟。通常，活性劑通過聚合試劑上的反應(yīng)基和活性劑上的官能團(tuán)(例如，胺)之間的反應(yīng)和聚合物共價(jià)連接。
本發(fā)明還一個(gè)另外的目的是提供藥物制劑，該制劑包含和藥物賦形劑組合的在此提供的活性劑-聚合物偶聯(lián)物。
另外的目的是提供傳送藥理學(xué)活性劑的方法，該方法包括給予治療有效量的在此提供的活性劑-聚合物偶物聯(lián)的步驟。
在下面的說明中將描述本發(fā)明另外的目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征，且它們部分地，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說根據(jù)以下內(nèi)容將變得顯而易見，或通過實(shí)施本發(fā)明得知。
然后在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了聚合試劑，該聚合試劑包含位于水溶性聚合物和反應(yīng)基之間的 部分。該內(nèi)部結(jié)構(gòu)排列是這樣的(i) 部分的氮和水溶性聚合物接近，(ii) 部分的羰基碳原子和反應(yīng)基接近，和(iii)R1是H或有機(jī)基，其中有機(jī)基通常選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。
本發(fā)明的聚合試劑還包含水溶性聚合物、 部分，和反應(yīng)基，其中(i)通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分，水溶性聚合物和 部分的氮原子連接；(ii)通過直接共價(jià)鍵或第二個(gè)間隔部分，反應(yīng)基和 部分的羰基碳原子連接；和(iii)R1如前定義。
對(duì)于本發(fā)明的聚合試劑來說，任何水溶性聚合物可以用作聚合試劑中的水溶性聚合物，且在這點(diǎn)上本發(fā)明不受限制。然而，優(yōu)選的聚合物是在一端封端的。此外，優(yōu)選具有小于約120,000道爾頓質(zhì)量平均分子量的聚合物。
另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備本發(fā)明聚合試劑的方法。簡(jiǎn)短地說，該方法包括提供由有受保護(hù)反應(yīng)基或反應(yīng)基前體和一個(gè)或多個(gè)羥基組成的前體分子。激活前體分子一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)(因此形成激活的前體分子)使得一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)將和氨基反應(yīng)。此后，在共價(jià)偶聯(lián)的條件下放置激活的前體分子并使其和具有氨基的水溶性聚合物接觸，因此使兩者化學(xué)反應(yīng)。隨后的反應(yīng)導(dǎo)致水溶性聚合物和激活的前體分子之間形成共價(jià)鍵，其依次形成由水溶性聚合物部分和受保護(hù)反應(yīng)基或反應(yīng)基前體組成的聚合物。通常，該聚合物可以進(jìn)一步和各種試劑反應(yīng)以便用例如所需的反應(yīng)基功能化聚合物。當(dāng)前體分子包含受保護(hù)反應(yīng)基時(shí)，該方法有利地包括去保護(hù)步驟來除去保護(hù)反應(yīng)基的基團(tuán)。任意地，進(jìn)行分離聚合物的步驟使得可以以更純的形式提供聚合物。
在本發(fā)明的還另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包括水溶性聚合物、 部分，和活性劑，其中(i)通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分，水溶性聚合物和 部分的氮原子連接；(ii)通過直接共價(jià)鍵或第二個(gè)間隔部分，藥理學(xué)活性劑和 部分的羰基碳原子連接；和(iii)R1是H或有機(jī)基。有利地，可以使用可以和在此提供的聚合試劑偶聯(lián)的任何活性劑，且關(guān)于所用的特定活性劑本發(fā)明不受限制。
在本發(fā)明的還另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備偶聯(lián)物的方法，該方法包括在適于提供偶聯(lián)物的條件下將在此提供的聚合試劑和活性劑接觸的步驟。
在本發(fā)明的還另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了藥物制劑，該制劑包含和藥物賦形劑組合的本發(fā)明偶聯(lián)物。藥物制劑包括所有類型的制劑，尤其是那些適于注射的，例如，可以重構(gòu)的粉末以及懸浮液和溶液。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，提供了給予偶聯(lián)物的方法，該方法包括將治療有效量的在此提供的偶聯(lián)物給予患者的步驟。通常，盡管不是必需的，以藥物制劑的部分來提供偶聯(lián)物。可以使用給予偶聯(lián)物的任何方法，在這點(diǎn)上本發(fā)明不受限制。然而，優(yōu)選通過注射給予偶聯(lián)物。
發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，將要理解本發(fā)明不限于特定聚合物、合成技術(shù)、活性劑，等等，這些可以改變。
必須注意，本說明書和權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an)”和“這個(gè)(the)”包括多個(gè)所指對(duì)象，除非文中明確地另外指出。因此，例如，提到“聚合物”包括單個(gè)聚合物以及兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同的聚合物，提到“偶聯(lián)物”指的是單個(gè)偶聯(lián)物以及兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同的偶聯(lián)物，提到“賦形劑”包括單一種賦形劑以及兩種或更多種相同或不同的賦形劑，等等。
在描述和要求保護(hù)本發(fā)明中，將根據(jù)以下所述的定義使用下列術(shù)語。
如在此所用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”，意思是包括任何水溶性聚(環(huán)氧乙烷)，且可以交換使用。通常，用于本發(fā)明的PEG將包括“-(OCH2CH2)m”或“-O(CH2CH2O)m”，其中(m)是2至4000，且所有PEG的端基和結(jié)構(gòu)可以改變。如在此所用的，根據(jù)末端氧是否被取代，PEG還包括“-CH2CH2-O(CH2CH2O)m-CH2CH2-”和“-(CH2CH2O)m”。當(dāng)PEG進(jìn)一步包括間隔部分時(shí)(以下將更詳細(xì)描述)，包括間隔部分的原子，當(dāng)和水溶性聚合物共價(jià)連接時(shí)，不導(dǎo)致氧-氧鍵(即，“-O-O-”或過氧化物鍵)的形成。貫穿說明書和權(quán)利要求，應(yīng)該記住術(shù)語“PEG”包括具有各種末端或“封端”基團(tuán)等等的結(jié)構(gòu)?！癙EG”意思是含有多數(shù)，也就是說，大于50％，為-CH2CH2O-亞基的聚合物。常用PEG之一是封端PEG。用于本發(fā)明的特定PEG形式包括具有各種分子量、結(jié)構(gòu)或幾何結(jié)構(gòu)(例如，支鏈，線性，分叉PEG，多功能，多臂等等)的PEG，以下將更詳細(xì)描述。
在此可以交換使用術(shù)語“封端”或“末端封頭”以表示具有封端部分的聚合物的末端或端點(diǎn)。通常，關(guān)于PEG，封端部分包括羥基或C1-20烷氧基。因此，封端部分的實(shí)例包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和芐氧基)，以及芳基、雜芳基、環(huán)、雜環(huán)，等等。應(yīng)該記住，當(dāng)結(jié)構(gòu)拉長(zhǎng)時(shí)，末端羥基和烷氧基可以包括重復(fù)環(huán)氧乙烷單體的末端氧原子，取決于如何定義重復(fù)環(huán)氧乙烷單體[例如，“-(OCH2CH2)m”或“-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-”]。此外，可以預(yù)見每個(gè)前述封端部分的飽和、不飽和、取代和未取代形式。此外，封端基團(tuán)還可以是硅烷或脂質(zhì)(例如，磷脂)。封端基團(tuán)還可以有利地包括可檢測(cè)的標(biāo)記。當(dāng)聚合物具有含有可檢測(cè)標(biāo)記的封端基團(tuán)時(shí)，偶聯(lián)所關(guān)心聚合物的聚合物和/或部分(例如活性劑)的數(shù)量或位置可以使用合適的檢測(cè)儀來檢測(cè)。這樣的標(biāo)記包括，無限制，熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶標(biāo)記中所用的部分、比色劑(例如，染料)、金屬離子、放射性部分，等等。合適的檢測(cè)儀包括光度計(jì)、薄層、光譜儀，等等。
關(guān)于聚合物“非天然存在”意思是指不以其整體存在于自然界的聚合物。然而，非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一個(gè)或多個(gè)亞基或亞基的部分，只要全部聚合物結(jié)構(gòu)不存在于自然界。
術(shù)語“水溶性”如在“水溶性聚合物”中是在室溫溶于水的聚合物。通常，水溶性聚合物溶液透過至少約75％，更優(yōu)選至少約95％的光，過濾后通過相同溶液透光?；谥亓?，水溶性聚合物或其部分將優(yōu)選至少約35％(重量)可溶于水，更優(yōu)選至少約50％(重量)可溶于水，還更優(yōu)選約70％(重量)可溶于水，還更優(yōu)選約85％(重量)可溶于水。然而，最優(yōu)選水溶性聚合物或部分是約95％(重量)可溶于水或完全溶于水。
本發(fā)明水溶性聚合物情況下的分子量，如PEG，可以表示為數(shù)均分子量或重均分子量。除非另外指出，在此所有涉及的分子量指的是加權(quán)平均分子量。兩種分子量，數(shù)均和重均的測(cè)定，可以使用凝膠滲透色譜法或其它液體色譜法技術(shù)來測(cè)量。還可以使用測(cè)量分子量值的其它方法，如使用端基分析或測(cè)量依數(shù)性質(zhì)(例如，冰點(diǎn)降低、沸點(diǎn)升高，或滲透壓)來測(cè)定數(shù)均分子量或使用光散射技術(shù)、超離心或粘度測(cè)定法來測(cè)定重均分子量。本發(fā)明的聚合試劑通常是多分散的(即，聚合物的數(shù)均分子量和重均分子量不相等)，具有低的多分散性值，優(yōu)選小于約1.2，更優(yōu)選小于約1.15，還更優(yōu)選小于約1.10，還更優(yōu)選小于約1.05，最優(yōu)選小于約1.03。
如在此所用，術(shù)語“羧酸”是具有 官能團(tuán)的部分[也表示為“-COOH”或“-C(O)OH”]，以及為羧酸衍生物的部分，這樣的衍生物包括，例如，受保護(hù)的羧酸。因此，除非上下文明確地另外指出，術(shù)語羧酸不僅包括酸形式，還包括相應(yīng)的酯和受保護(hù)的形式。羧酸的示范性保護(hù)基和其它保護(hù)基描述于Greene等“PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS，”第6章，第3版，John Wiley和sons，Inc.，New York，1999(p.454-493)中。
術(shù)語“反應(yīng)的”或“激活的”當(dāng)和特定官能團(tuán)結(jié)合使用時(shí)，指的是容易和另一分子上的親電體或親核體反應(yīng)的反應(yīng)官能團(tuán)。這和為了反應(yīng)需要強(qiáng)催化劑或高度不實(shí)用反應(yīng)條件的那些基團(tuán)(即，“不反應(yīng)的”或“惰性”基團(tuán))相反。
術(shù)語“受保護(hù)的”、“保護(hù)基”和“保護(hù)性基團(tuán)”指的是防止或阻斷在特定反應(yīng)條件下分子中特定化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)的反應(yīng)的部分(即，保護(hù)基)的存在。根據(jù)待保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)基的類型以及使用的反應(yīng)條件和分子中存在的另外的反應(yīng)基或保護(hù)基(若有的話)，保護(hù)基將變化。本領(lǐng)域已知的保護(hù)基可以在Greene等，上文中找到。
“激活的羧酸”意思是比母體羧酸更反應(yīng)性的羧酸功能性衍生物，尤其是，就親核?；〈?。激活的羧酸包括但不限制于酸鹵化物(如酸氯化物)、酐、酰胺和酯。
如在此所用的，術(shù)語“官能團(tuán)“或其任何同義詞意思是包括其受保護(hù)形式。
在此所用的術(shù)語“間隔”和“間隔部分”指的是任意用于連接互連部分如水溶性聚合物部分的末端和官能團(tuán)的原子或原子集合。間隔部分可以是水解穩(wěn)定的或可以包括生理上可水解的或酶降解的鍵。
“烷基”指的是烴鏈，通常為約1至20個(gè)原子長(zhǎng)度。這樣的烴鏈優(yōu)選，但不是必需是飽和的并可以是支鏈或直鏈，盡管通常優(yōu)選直鏈。示范性烷基包括乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基(即，2-戊基)、1-乙基丙基(即，3-戊基)、3-甲基戊基，等等。如在此所用的，“烷基”包括環(huán)烷基，當(dāng)涉及三個(gè)或更多碳原子時(shí)。
“低級(jí)烷基”指的是含有1至6個(gè)碳原子的烷基，可以是直鏈或支鏈，實(shí)例為甲基、乙基、正丁基、異丁基，和叔丁基。
“環(huán)烷基”指的是飽和或不飽和環(huán)烴鏈，包括橋接的、稠合的，或螺環(huán)化合物，優(yōu)選由3至約12個(gè)碳原子組成，更優(yōu)選3至約8個(gè)。
“非干擾取代基”是當(dāng)存在于分子中時(shí)，通常和分子中含有的其他官能團(tuán)不反應(yīng)的那些基團(tuán)。
術(shù)語“取代的”，如在例如“取代的烷基”中指的是由一個(gè)或多個(gè)非干擾取代基取代的部分(例如，烷基)，取代基例如但不限制于C3-C8環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基，等等；鹵代，例如，氟代、溴代和碘代；氰基；烷氧基，苯基；取代的苯基；等等?！叭〈姆蓟笔蔷哂幸粋€(gè)或多個(gè)非干擾基團(tuán)作為取代基的芳基。對(duì)于苯環(huán)上的取代，取代基可以是任何方向的(即，鄰位、間位，或?qū)ξ?。
“烷氧基”指的是-O-R基團(tuán)，其中R是烷基或取代的烷基，優(yōu)選C1-C20烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、芐氧基，等)，優(yōu)選C1-C7。
如在此所用的，“烯基”指的是1至15個(gè)原子長(zhǎng)度的支鏈或無支鏈烴基，含有至少一個(gè)雙鍵，如乙烯基、正丙烯基、異丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、辛烯基、癸烯基、四癸烯基，等等。
如在此所用的術(shù)語“炔基”指的是2至15個(gè)碳原子長(zhǎng)度的支鏈或無支鏈烴基，含有至少一個(gè)三鍵，乙炔基、正丁炔基、異戊炔基、辛炔基、癸炔基，等等。
“芳基”意思是一個(gè)或多個(gè)芳環(huán)，每個(gè)為5或6個(gè)核心碳原子。芳基包括可被稠合的多個(gè)芳環(huán)，如在萘基中，或未稠合的，如在聯(lián)苯中。芳環(huán)還可以和一個(gè)或多個(gè)環(huán)烴、雜芳基或雜環(huán)稠合或未稠合。如在此所用的，“芳基”包括雜芳基。
“雜芳基”是含有1至4個(gè)雜原子的芳基，優(yōu)選N、O，或S，或其組合。雜芳環(huán)還可以和一個(gè)或多個(gè)環(huán)烴、雜環(huán)、芳基或雜芳環(huán)稠合。
“雜環(huán)”或“雜環(huán)的”意思是一個(gè)或多個(gè)5-12個(gè)原子的環(huán)，優(yōu)選5-7個(gè)原子，帶有或不帶有不飽和或芳香性并至少一個(gè)環(huán)原子不是碳。優(yōu)選的雜原子包括硫、氧，和氮。
“取代的雜芳基”是具有一個(gè)或多個(gè)非干擾基團(tuán)作為取代基的雜芳基。
“取代的雜環(huán)”是具有一個(gè)或多個(gè)由非干擾取代基形成的側(cè)鏈的雜環(huán)。
“親電體”指的是離子或原子或原子集合，它可以是離子的，具有親電子中心，即電子搜索的中心，能夠和親核體反應(yīng)。
“親核體”指的是離子或原子或原子集合，它可以是離子的，具有親核中心，即搜索親電中心或帶有親電體的中心。
“生理學(xué)上可裂解”或“可水解”或“可降解”鍵是在生理?xiàng)l件下和水反應(yīng)(即，水解)的相對(duì)弱的鍵。鍵在水中水解的傾向不僅將取決于連接兩個(gè)中心原子鍵的一般類型，還取決于和這些中心原子連接的取代基。合適的水解不穩(wěn)定或弱鍵包括但不限制于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、乙縮醛、酮縮醇、酰氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“酶可降解鍵”意思是經(jīng)歷被一種或多種酶降解的鍵。
“水解穩(wěn)定”鍵指的是在水中實(shí)質(zhì)上穩(wěn)定的化學(xué)鍵，通常為共價(jià)鍵，也就是說，在生理?xiàng)l件下在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)不水解成任何可察覺的程度。水解穩(wěn)定鍵的實(shí)例包括但不限制于以下鍵碳-碳鍵(例如，脂肪鏈中)、醚、酰胺、尿烷，等等。通常，水解穩(wěn)定鍵是在生理?xiàng)l件下呈現(xiàn)每天水解速率小于約1-2％每天。代表性化學(xué)鍵的水解速率可以在大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)教科書中找到。
術(shù)語“活性劑”、“生物活性劑”和“藥理學(xué)活性劑”在此可交換使用并定義為包括提供可以在體內(nèi)或體外證明的一些藥理效應(yīng)(通常是有益的)的任何藥劑、藥物、化合物、物質(zhì)的組合物或混合物。這包括食品、食品補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)物、營(yíng)養(yǎng)藥、藥物、疫苗、抗體、維生素，和其他有益的藥劑。如在此所用的，這些術(shù)語進(jìn)一步包括在患者中產(chǎn)生局部或全身作用的任何生理或藥理學(xué)活性物質(zhì)。
“藥物學(xué)上可接受的賦形劑”和“藥物學(xué)上可接受的載體”指的是可以包括于本發(fā)明組合物中且不對(duì)患者引起顯著不良毒理作用的賦形劑。
“藥理學(xué)有效量”、“生理學(xué)有效量”和“治療有效量”在此交換使用，意思是指提供血流中或目標(biāo)組織中希望的活性劑和/或偶聯(lián)物的水平所需要的聚合物-活性劑偶聯(lián)物(通常存在于藥物制劑中)的量。準(zhǔn)確的量取決于多個(gè)因素，例如，特定活性劑、藥物制劑的成分和物理特征、計(jì)劃的患者人數(shù)、患者因素，等等，并本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易確定，基于在此提供的和相關(guān)文獻(xiàn)中可獲得的信息。
本發(fā)明聚合物范圍中的“多功能”意思是指其中具有3個(gè)或更多個(gè)官能團(tuán)的聚合物，其中官能團(tuán)可以相同或不同。本發(fā)明的多功能聚合物通常在聚合物骨架中含有約3-100個(gè)官能團(tuán)，或3至50個(gè)官能團(tuán)，或3至25個(gè)官能團(tuán)，或3至15個(gè)官能團(tuán)，或3至10個(gè)官能團(tuán)，或?qū)⒑?，4，5，6，7，8，9或10個(gè)官能團(tuán)。“雙功能”聚合物意思是其中含有兩個(gè)官能團(tuán)的聚合物，相同(即，同型雙功能的)或不同(即異型雙功能的)。
涉及聚合物幾何構(gòu)造或總體結(jié)構(gòu)的“叉狀”，指的是具有一個(gè)聚合物“臂”(即，單個(gè)水溶性聚合物)的雙功能聚合物，其中兩個(gè)官能團(tuán)(直接或通過一個(gè)或多個(gè)原子)連接至用作分支原子的原子，其依次和水溶性聚合物連接(直接或通過一個(gè)或多個(gè)原子)。
涉及聚合物幾何結(jié)構(gòu)或總體結(jié)構(gòu)的“支化的”，指的是聚合物具有兩個(gè)或更多個(gè)聚合物“臂”的聚合物。支化聚合物可以具有2個(gè)聚合物臂、3個(gè)聚合物臂、4個(gè)聚合物臂、6個(gè)聚合物臂、8個(gè)聚合物臂或更多。一種特定類型的高度支化聚合物是樹枝狀聚合物或樹枝狀物(dendrimer)，其對(duì)于本發(fā)明的目的，認(rèn)為具有與支化聚合物的結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)。
“樹枝狀物”或樹枝狀聚合物是球狀、大小單分散性的聚合物，其中所有鍵以規(guī)則的分支模式和每個(gè)提供一個(gè)分支點(diǎn)的重復(fù)單元從中心焦點(diǎn)或核心放射地呈現(xiàn)。樹枝狀物呈現(xiàn)特定樹枝狀特性如核心包圍，使得它們獨(dú)特于其他類型的聚合物包括支鏈聚合物。
在此所述的堿性或酸性反應(yīng)劑包括其中性、帶電荷的，和其任何相應(yīng)的鹽形式。
術(shù)語“患者”指的是遭受或傾向于通過給藥在此提供的偶聯(lián)物可以防止或治療的狀況的活有機(jī)體。
“有機(jī)基”是可通過共價(jià)鍵和另一個(gè)原子連接的含有碳的部分。示范性有機(jī)基包括選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的那些。
“任意”或“任意地”意思是隨后所述的情況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，使得描述包括情況發(fā)生的實(shí)例和情況不發(fā)生的實(shí)例。
如在此所用的，當(dāng)鹵素和分子連接時(shí)，通常使用“鹵代”命名符(例如，氟代、氯代、碘代、溴代，等等)，而當(dāng)使用離子形式時(shí)使用后綴“化物(ide)”(例如，氟化物、氯化物、碘化物、溴化物，等等，當(dāng)鹵素以其獨(dú)立的離子形式存在時(shí)(例如，當(dāng)離去基團(tuán)離開分子時(shí))。
在本發(fā)明所述范圍內(nèi)，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到關(guān)于一個(gè)結(jié)構(gòu)或式提供的變量定義是適用于不同結(jié)構(gòu)中重復(fù)的相同變量的，除非文中另外指出。因此，例如，關(guān)于聚合試劑的“POLY”、“間隔部分”、“Z”等等的定義同等適用于在此提供的水溶性聚合物偶聯(lián)物。
然后轉(zhuǎn)向本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，提供了獨(dú)特的聚合試劑。盡管不希望受到理論的束縛，申請(qǐng)者認(rèn)為在此所述的聚合試劑不同的特征可歸因于原子的獨(dú)特取向。例如，當(dāng)將在此所述聚合試劑和活性劑偶聯(lián)形成偶聯(lián)物時(shí)，偶聯(lián)物的體內(nèi)水解速率不同于具有相同原子但是以不同次序排列偶聯(lián)物的水解速率。除了提供可選擇的水解速率，在此提供的聚合試劑相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)聚合試劑的另外優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的聚合物包括以特定方式取向的三個(gè)分開的組分。這三個(gè)組分如下含有重復(fù)單體單元的水溶性聚合物；含有和羰基碳原子共價(jià)結(jié)合的氮原子的部分；和反應(yīng)基。將聚合物的三個(gè)組分特定取向，使得上文提到部分的氮原子和聚合物重復(fù)單體部分接近，而碳原子和反應(yīng)基鄰接。將要理解本文中的術(shù)語“接近”指的是沿著連接原子的最接近路徑將要“最近的”而不是就空間或絕對(duì)距離而言的最近。
因此，可以通過下式圖解表示聚合物水溶性聚合物 (式I)其中“水溶性聚合物”是含有重復(fù)單體單元的水溶性聚合物；每個(gè)“-\\-”獨(dú)立地是直接的共價(jià)鍵或間隔部分；R1是H或有機(jī)基；和Z是反應(yīng)基。如式I所示， 部分的氮和水溶性聚合物接近，而羰基的碳原子和反應(yīng)基“Z”接近。
因此本發(fā)明的聚合試劑包含位于水溶性聚合物和反應(yīng)基之間的 部分，其中(i) 部分的氮原子和水溶性聚合物接近，(ii) 部分的羰基碳原子和反應(yīng)基接近，和(iii)R1如上定義。通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分，水溶性聚合物和 部分的氮原子連接。通過直接共價(jià)鍵或第二個(gè)間隔部分，反應(yīng)基和 部分的羰基碳原子連接。
此外，本發(fā)明的聚合試劑可以描述為包含水溶性聚合物， 部分，和反應(yīng)基，其中(i)通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分，水溶性聚合物和 部分的氮原子接近，(ii)通過直接共價(jià)鍵或通過第二個(gè)間隔部分，反應(yīng)基和 部分的羰基碳原子接近，和(iii)R1如上定義。
當(dāng)分離和與鄰近原子分開考慮時(shí)，可以將 部分(其中R1是H或有機(jī)基)認(rèn)為是酰胺部分。然而，必須記住，聚合物中的 部分是更大結(jié)構(gòu)的部分。例如，氧原子可被并且優(yōu)選直接和 部分的羰基碳原子連接，因此提供通常稱為“氨基甲酸酯”或“尿烷”的 部分。同樣，硫原子可以任意和 部分的羰基碳原子連接，因此提供 部分。此外，-N(R2)-部分可以和 部分的羰基碳連接，因此提供 部分，其中R2是H或有機(jī)基。最后，所有涉及制成 部分的例子中，可以取代 部分，因此本發(fā)明不僅僅受限于 部分。
因此，為了此后描述化學(xué)結(jié)構(gòu)的目的，通常提及 部分。然而，為了本發(fā)明描述的目的， 部分(其中氧原子沒有和羰基碳原子連接)、 部分、 部分、 部分、 部分、 部分和 部分中每個(gè)，可以被取代，當(dāng)提及 部分時(shí)。
關(guān)于 部分，氮原子的一個(gè)鍵和鄰接的羰基碳的碳原子(“羰基碳”)連接，另一個(gè)鍵直接和水溶性聚合物或間隔部分連接，第三個(gè)鍵和取代基“R1”連接?！癛1”是任何非干擾取代基。盡管不是必需的，R1通常是H或有機(jī)基。然而，優(yōu)選R1是H。在當(dāng)R1是有機(jī)基時(shí)的那些例子中，優(yōu)選的有機(jī)基包括選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的那些。優(yōu)選有機(jī)基的特定實(shí)例包括選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基，和哌啶酮基的那些。
關(guān)于反應(yīng)基“Z”，該基團(tuán)可以是在合適條件下和合適試劑反應(yīng)的任何基團(tuán)。優(yōu)選的反應(yīng)部分選自親電體和親核體。這樣反應(yīng)基的實(shí)例包括，但不限制于，選自羥基(-OH-)、酯、酯、原酸酯、碳酸酯、碳酸酯、乙縮醛、醛、醛水合物、酮、乙烯酮、酮水合物、硫酮、單硫代水合物、二硫代水合物、半酮縮醇、單酮縮硫醇半酮縮醇、二硫代半酮縮醇、酮縮醇、二硫代酮縮醇、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、砜、胺、酰肼、硫醇、二硫化物、硫醇水合物、羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺 琥珀酰亞胺 苯并三唑 乙烯砜、氯乙基砜、二硫代吡啶、乙烯吡啶、碘乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、硫代磺酸鹽、tresylate、硅烷、-(CH2)rCO2H、-(CH2)r′CO2NS、-(CH2)r′CO2Bt、-(CH2)rCH(OR)2、-(CH2)rCHO、-(CH2)2-NH2、-(CH2)rM、-(CH2)r-S-SO2-R，其中(r)是1-12，(r’)是0-5，R是芳基或烷基，NS是N-琥珀酰亞胺基，Bt是1-苯并三唑基，和M是N-馬來酰亞胺基，以及前述的任體受保護(hù)和激活形式。
關(guān)于任何反應(yīng)基，尤其是馬來酰亞胺和醛，任意銜接物可以連接反應(yīng)基至聚合物。因此，例如，銜接物可以將反應(yīng)基和間隔部分或分支部分(當(dāng)存在時(shí))連接。此外，當(dāng)間隔部分或分支部分都不存在時(shí)，銜接物可以將反應(yīng)基和 部分的羰基碳直接連接。銜接物可以包括含有至少四個(gè)碳原子的直鏈飽和無環(huán)烴，如四亞甲基、1，5-亞戊基，和1，6-亞己基，以及含有至少四個(gè)碳原子的支鏈飽和無環(huán)烴。在一個(gè)實(shí)施方案中，鍵的烴部分具有結(jié)構(gòu)-(CR3R4)g-，其中每個(gè)R3獨(dú)立地是H、烷基或環(huán)烷基，每個(gè)R4獨(dú)立地是H、烷基或環(huán)烷基，和(g)是3至約20，優(yōu)選4至約12。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)R3和R4是H。在支鏈無環(huán)烴實(shí)施方案中，優(yōu)選在最接近反應(yīng)基(例如，馬來酰亞胺)的兩個(gè)碳原子中的一個(gè)或多個(gè)處產(chǎn)生分支，以便最大化位阻。另一實(shí)施方案中，鍵的烴部分包括飽和二價(jià)脂環(huán)烴并具有結(jié)構(gòu)-(CR3R4)p-C3-12環(huán)烷基-(CR3R4)q-，其中p和q各自獨(dú)立地是0至約10，優(yōu)選0至約6(例如，0，1，2，3，4，5或6)，且R3和R4如前定義。二價(jià)環(huán)烷基(例如，亞環(huán)烷基)優(yōu)選C3-C8亞環(huán)烷基，如環(huán)丙二烯(例如，1，1-、順1，2-，或反-1，2-環(huán)丙烯)、環(huán)丁二烯、環(huán)戊二烯、環(huán)己二烯和環(huán)庚二烯的各種異構(gòu)形式。亞環(huán)烷基可以由一個(gè)或多個(gè)烷基，優(yōu)選C1-6烷基取代。
關(guān)于水溶性聚合物，本發(fā)明的聚合試劑還含有至少一個(gè)水溶性聚合物部分。非肽和水溶性，具有2至約300個(gè)末端的水溶性聚合物，對(duì)本發(fā)明尤其有用。合適水溶性聚合物的實(shí)例包括，但不限制于，聚(亞烷基二醇)，如聚(乙二醇)(“PEG”)，具有水溶解性的乙二醇和丙二醇的共聚物，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羥烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羥酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰嗎啉)，如美國(guó)專利No.5,629,384中所述的。在一些期望相對(duì)高水溶解性的應(yīng)用中，水溶性聚合物不是聚(氧化丙烯)。
每個(gè)水溶性聚合物中的重復(fù)單元可以具有多種不同的排列，包括但不限制于，選自均聚物(其中含有水溶性聚合物的每個(gè)單體單元是相同的)、交替共聚物(其中在水溶性聚合物中第一個(gè)單體單元和第二個(gè)單體單元一致地交替)、隨機(jī)共聚物(其中在水溶性聚合物中第一個(gè)單體單元和第二個(gè)單體單元不一致地交替)、嵌段共聚物(其中水溶性聚合物中兩個(gè)或更多個(gè)第一單體單元和兩個(gè)或更多個(gè)第二單體單元交替)、交替三聚物、隨機(jī)三聚物，和嵌段三聚物的那些。
盡管不是必需的，水溶性聚合物優(yōu)選聚(乙二醇)(“PEG”)或其衍生物。然而，應(yīng)該理解，相關(guān)的聚合物也適用于本發(fā)明的實(shí)踐中，術(shù)語“PEG”或“聚(乙二醇)”在這點(diǎn)上意思是包括性的而不是排他性的。因此，術(shù)語“PEG”包括呈其線性、支化或多臂形式的任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、雙功能PEG、叉狀PEG、支化PEG、懸垂PEG，或其中帶有可降解鍵的PEG，以下將更全面描述。
在適用于本發(fā)明的一個(gè)形式中，游離或未結(jié)合的PEG是每端由羥基終止的線性聚合物HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m’-CH2CH2-OH(m’)通常為0至約4,000。
上述聚合物，α-，ω-二羥基聚(乙二醇)，可以以HO-PEG-OH的簡(jiǎn)寫形式來表示，其中不用說-PEG-符號(hào)可以表示以下結(jié)構(gòu)單元-CH2CH2O-(CH2CH2O)m’-CH2CH2-其中(m’)如上定義。
適用于本發(fā)明的另一種類型PEG是甲氧基-PEG-OH，或簡(jiǎn)寫為mPEG，其中一個(gè)末端是相對(duì)惰性的甲氧基，而另一末端是羥基。以下給出mPEG的結(jié)構(gòu)。
CHO3-CH2CH2O-(CH2CH2O)m’-CH2CH2-OH其中(m’)如上定義。
除了上述形式的PEG，還可以用聚合物，包括任何上述聚合物中的一個(gè)或多個(gè)弱的或可降解的鍵制備聚合物。例如，可用聚合物中接受水解的酯鍵制得PEG。如下所示，該水解導(dǎo)致聚合物裂解成更低分子量的片段
適用作聚合物骨架中的可降解鍵的其它水解可降解鍵包括碳酸酯鍵；例如由胺和醛反應(yīng)形成的亞胺鍵(參見，例如Ouchi等(1997)Polymer Preprints38(1)582-3)；例如由醇和磷酸鹽基團(tuán)反應(yīng)形成的磷酸酯鍵；通常由酰肼和醛之間反應(yīng)形成的腙鍵；通常由醛和醇之間反應(yīng)形成的乙縮醛鍵，例如由甲酸鹽和醇反應(yīng)形成的原酸酯鍵；由例如在聚合物如PEG末端的胺基和另一PEG鏈的羧基形成的酰胺鍵；由例如末端為異氰酸酯基團(tuán)的PEG和PEG醇反應(yīng)形成的尿烷；由例如聚合物如PEG末端的胺基和肽的羧基形成的肽鍵；和由例如聚合物末端的氨基磷酸酯基團(tuán)和寡核苷酸的5’羥基形成的寡核苷酸鍵。
本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，術(shù)語聚(乙二醇)或PEG表示或包括全部上述形式的PEG。
盡管水溶性聚合物(以及聚合試劑)的分子量可以改變，但分子量將滿足以下值的一個(gè)或多個(gè)大于100道爾頓；大于200道爾頓；大于400道爾頓；大于500道爾頓；大于750道爾頓；大于900道爾頓；大于1,000道爾頓；大于1,400道爾頓；大于1,500道爾頓；大于1,900道爾頓；大于2,000道爾頓；大于2,200道爾頓；大于2,500道爾頓；大于3,000道爾頓；大于4,000道爾頓；大于4,900道爾頓；大于5,000道爾頓；大于6,000道爾頓；大于7,000道爾頓；大于7,500道爾頓；大于9,000道爾頓；大于10,000道爾頓；大于11,000道爾頓；大于14,000道爾頓；大于15000道爾頓；大于16,000道爾頓；大于19,000道爾頓；大于20,000道爾頓；大于21,000道爾頓；大于22,000道爾頓；大于25,000道爾頓；大于30,000道爾頓。不用說在此適用的任何所給水溶性聚合物的分子量最大限是約300,000道爾頓。
水溶性聚合物(以及整個(gè)聚合試劑)的分子量還可以表示為分子量范圍內(nèi)的值。示范性范圍包括，約100道爾頓至約100,000道爾頓；約500道爾頓至約80,000道爾頓；約1,000道爾頓至約60,000道爾頓；約2,000道爾頓至約50,000道爾頓；和約5,000道爾頓至約40,000道爾頓。
聚合試劑內(nèi)的任何所給水溶性聚合物(以及整個(gè)聚合試劑)的示范性分子量包括約100道爾頓，約200道爾頓，約300道爾頓，約400道爾頓，約500道爾頓，約600道爾頓，約700道爾頓，約750道爾頓，約800道爾頓，約900道爾頓，約1,000道爾頓，約2,000道爾頓，約2,200道爾頓，約2,500道爾頓，約3,000道爾頓，約4,000道爾頓，約4,400道爾頓，約5,000道爾頓，約6,000道爾頓，約7,000道爾頓，約7,500道爾頓，約8,000道爾頓，約9,000道爾頓，約10,000道爾頓，約11,000道爾頓，約12,000道爾頓，約13,000道爾頓，約14,000道爾頓，約15,000道爾頓，20,000道爾頓，22,500道爾頓，25,000道爾頓，約30,000道爾頓，約40,000道爾頓，約50,000道爾頓，60,000道爾頓，約75,000道爾頓，和約80,000道爾頓。
關(guān)于PEG，其中可以提供含有重復(fù)環(huán)氧乙烷單體如“-(CH2CH2O)m-”或“-(OCH2CH2)m-”的結(jié)構(gòu)，(m)優(yōu)選值包括約3至約3,000；約10至約3，000；約15至約3,000；約20至約3,000；約25至約3,000；約30至約3,000；約40至約3,000；約50至約3,000；約55至約3,000；約75至約3,000；約100至約3,000；和約225至約3,000。
如在此所用的術(shù)語“水溶性聚合物”包括那些生物相容和非致免疫的水溶性聚合物，并特別排除不是生物相容的和非致免疫的水溶性聚合物部分。關(guān)于生物相容性，如果如由臨床醫(yī)師例如內(nèi)科醫(yī)生評(píng)價(jià)的，與單獨(dú)使用物質(zhì)或和另一物質(zhì)(例如，活性劑)一起使用結(jié)合活組織(例如，給藥于患者)有關(guān)的有益效果勝于任何有害的效果，則認(rèn)為物質(zhì)是生物相容的。關(guān)于非致免疫性，如果物質(zhì)在體內(nèi)計(jì)劃的使用不產(chǎn)生不期望的免疫反應(yīng)(例如，形成抗體)，或如果產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，如由臨床醫(yī)師評(píng)價(jià)的，不認(rèn)為這樣的反應(yīng)是臨床上有意義的或重要的，則認(rèn)為物質(zhì)是非致免疫的。尤其優(yōu)選在此所述的水溶性聚合物部分以及偶聯(lián)物是生物相容的和非致免疫的。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，上述實(shí)質(zhì)上涉及水溶性聚合物的討論根本不是窮舉且僅僅是說明，以及想到了具有上述性質(zhì)的所有聚合物材料。如在此所用的，術(shù)語“聚合試劑”通常指的是整個(gè)分子，其可包含水溶性聚合物和官能團(tuán)。術(shù)語“水溶性聚合物”通常預(yù)備用于討論更大分子結(jié)構(gòu)如聚合試劑、前體分子、偶聯(lián)物等等的一部分。
在此所述的聚合試劑的每個(gè)部分(例如，官能團(tuán)、活性劑、水溶性聚合物，等等)和其它結(jié)構(gòu)可以通過直接共價(jià)鍵相互直接連接。然而，更典型地，每個(gè)部分是通過由一個(gè)或多個(gè)原子組成的用來將每個(gè)部分系在一起形成統(tǒng)一整體的間隔部分連接。
在此所述的聚合試劑的各個(gè)部分和其它結(jié)構(gòu)通過其連接的優(yōu)選間隔部分包括由碳、氮、氧，和/或硫原子形成的原子鏈。和該原子鏈連接的，可以是一種或多種其它原子如碳、氮、氧，硫，和氫。鏈可以是短鏈，包括少至兩至五個(gè)原子的鏈。也想到了更長(zhǎng)鏈，例如，10、15，或更多個(gè)原子長(zhǎng)度的鏈。此外，間隔部分可以包括飽和、不飽和以及芳香族的原子環(huán)。存在時(shí)，間隔部分優(yōu)選包括約1-20個(gè)原子的序列，排除任何分支原子。優(yōu)選，形成間隔分子的原子(包括任何分支原子)包括氧、碳、氮、硫和氫原子的一些組合。聚合試劑中的每個(gè)間隔部分(例如，第一個(gè)間隔部分，第二個(gè)間隔部分，第三個(gè)間隔部分，等等)和聚合物中存在的任何其它間隔部分可以是相同的或不同的。
間隔部分的非限制實(shí)例是選自以下的那些-O-，-S-，-C(O)-，-O-C(O)-，-C(O)-O-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-，-C(S)-，-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-，-O-CH2-，-CH2-O-，-O-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-，-O-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-O-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-O-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-O-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-O-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH2-，-CH2-C(O)-O-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-，-C(O)-O-CH2-CH2-，-NH-C(O)-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-C(O)-NH-CH2-，-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-，-NH-CH2-，-NH-CH2-CH2-，-CH2-NH-CH2-，-CH2-CH2-NH-CH2-，-C(O)-CH2-，-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-，-CH2-CH2-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2，-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，-O-C(O)-CH2-，-O-C(O)-CH2-CH2-，-O-C(O)-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，二價(jià)環(huán)烷基，-N(R2)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，O-C(O)-NH[CH2]f-(OCH2CH2)n-，以及上述任意的兩個(gè)或更多個(gè)的組合，其中(f)是0至6，(n)是0至20(優(yōu)選0至10，例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10，更優(yōu)選為4)，R2是H或有機(jī)基。優(yōu)選的二價(jià)環(huán)烷基具有結(jié)構(gòu)-(CR3R4)p-C3-12環(huán)烷基-(CR3R4)q-，其中p和q各自獨(dú)立地為0至約10，優(yōu)選0至約6(例如，0，1，2，3，4，5或6)，每個(gè)R3獨(dú)立地為H、烷基，或另一個(gè)環(huán)烷基，每個(gè)R4獨(dú)立地為H、烷基，或另一個(gè)環(huán)烷基。其它二價(jià)環(huán)烷基(例如，亞環(huán)烷基)包括C3-8環(huán)烷基，如環(huán)丙二烯(例如，1，1-，順-1，2，或反1，2-環(huán)丙烯)、環(huán)丁二烯、環(huán)戊二烯、環(huán)己二烯和環(huán)庚二烯的各種異構(gòu)體。亞環(huán)烷基還可以由一個(gè)或多個(gè)烷基，優(yōu)選C1-C6烷基取代。
對(duì)于任何所給的包括羰基及其鄰接碳原子的間隔部分，間隔部分任意地包括和羰基鄰接的碳原子連接的有機(jī)基。通常，和羰基碳直接連接的碳原子稱為α碳。因此，任何所給間隔部分中的α碳可以具有與其連接的有機(jī)基如小的烷基(例如，甲基)。
聚合試劑的總結(jié)構(gòu)可以采用任何數(shù)量的不同形式。例如，聚合試劑可以是線性、支化、多臂、樹枝狀，或叉狀的。根據(jù)本發(fā)明的線性結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于以下的式II和IIa。然而，優(yōu)選聚合試劑具有支化或多臂結(jié)構(gòu)。一般而言，這樣的聚合物具有兩個(gè)或更多個(gè)水溶性聚合物并圍繞活性劑形成較大的、更密集的聚合物“云”，因此減少了可獲得偶聯(lián)連接位點(diǎn)的有效數(shù)量。以下式III，IIIa，IIIb，和IIIb1的支化結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)水溶性聚合物。支化結(jié)構(gòu)還可以包括三個(gè)水溶性聚合物。另一方面，多臂聚合物包括四個(gè)或更多這樣的水溶性聚合物。聚合物的樹枝狀形式具有數(shù)個(gè)(例如3至50)分開的水溶性聚合物，這些聚合物最終和含有一個(gè)或多個(gè)原子的核心連接。對(duì)于含有兩個(gè)或更多個(gè)水溶性聚合物的任何特定聚合試劑，每個(gè)水溶性聚合物可以是相同的或不同的。此外，當(dāng)聚合試劑包括三個(gè)或更多個(gè)水溶性聚合物時(shí)，可以使用相同或不同的水溶性聚合物的組合，盡管優(yōu)選聚合物中的每個(gè)水溶性聚合物和其它的相同。
關(guān)于聚合試劑的支化形式，聚合物總分子量的示范性合適大小范圍(實(shí)質(zhì)上基于兩個(gè)水溶性聚合物部分的組合重量)包括以下(再次，以分子質(zhì)量表示)約200道爾頓至約200,000道爾頓；約1,000道爾頓至約100,000道爾頓；約2,000道爾頓至約120,000道爾頓；約4,000道爾頓至約100,000道爾頓；約5,000道爾頓至約90,000道爾頓；約10,000道爾頓至約80,000道爾頓；以及約15,000道爾頓至約60,000道爾頓。更特別，本發(fā)明聚合物支化形式的總分子質(zhì)量(道爾頓)對(duì)應(yīng)于以下之一約400；約1,000；約1,500；約2,000；約3,000；約4,000；約10,000；約15,000；約20,000；約30,000；約40,000；約50,000；約60,000；約80,000；約90,000；約100,000；約120,000；約160,000；或約200,000。
考慮在此所述聚合試劑的一般結(jié)構(gòu)時(shí)，將認(rèn)識(shí)到相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所述聚合試劑的某些差異。例如，許多現(xiàn)有技術(shù)的聚合試劑遭遇很多問題，使它們不適于和活性劑偶聯(lián)。例如，一些現(xiàn)有技術(shù)的聚合試劑缺乏容易置換的官能團(tuán)，如反應(yīng)基(例如，酯)。即使試圖和缺少容易置換官能團(tuán)(例如，亞甲基(-CH2-))的聚合試劑偶聯(lián)，這樣做需要的條件將是非?？量痰?例如，強(qiáng)堿性條件)，因此很可能降解活性劑。此外，一些現(xiàn)有技術(shù)的聚合試劑在連接的潛在位點(diǎn)上具有兩個(gè)取代的基團(tuán)(例如，羰基)，其通常由于位阻效應(yīng)導(dǎo)致不完全偶聯(lián)和/或作為基團(tuán)接近的結(jié)果降低了反應(yīng)性。
當(dāng)在聚合物總體結(jié)構(gòu)中僅存在單個(gè)水溶性聚合物時(shí)，聚合物結(jié)構(gòu)優(yōu)選對(duì)應(yīng)于式(II) 式(II)其中POLY1是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；(a)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(b)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；R1是H或有機(jī)基(例如，選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基)；X1，存在時(shí)，是第一個(gè)間隔部分；X2，存在時(shí)，是第二個(gè)間隔部分；和Z是反應(yīng)基。
此外，當(dāng)聚合物在總體結(jié)構(gòu)中僅包含單個(gè)水溶性部分時(shí)，所述結(jié)構(gòu)還對(duì)應(yīng)于式(IIa) 式(IIa)其中POLY1是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；
(a)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(b)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(c)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(d)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；每個(gè)R1獨(dú)立地是H或有機(jī)基(例如，選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基)；X1，存在時(shí)，是第一個(gè)間隔部分；X2，存在時(shí)，是第二個(gè)間隔部分；X3，存在時(shí)，是第三個(gè)間隔部分；X4，存在時(shí)，是第四個(gè)間隔部分；和每個(gè)Z獨(dú)立地是反應(yīng)基。
此外，當(dāng)在聚合試劑總體結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)水溶性聚合物時(shí)，所述結(jié)構(gòu)可對(duì)應(yīng)于式(III) 式(III)POLY1是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；POLY2是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；(a)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(b)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(e)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(f’)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(g’)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(h)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(j)是0至20(即，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)；每個(gè)R1獨(dú)立地是H或有機(jī)基(例如，選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基)；
X1，存在時(shí)，是第一個(gè)間隔部分；X2，存在時(shí)，是第二個(gè)間隔部分；X5，存在時(shí)，是第五個(gè)間隔部分；X6，存在時(shí)，是第六個(gè)間隔部分；X7，存在時(shí)，是第七個(gè)間隔部分；X8，存在時(shí)，是第八個(gè)間隔部分；R5是分支部分；和Z是反應(yīng)基。
具有式II、式IIa、式III包括的結(jié)構(gòu)的優(yōu)選聚合試劑是其中每個(gè)水溶性聚合物(即，POLY1和/或POLY2)是聚(烯化氧)如聚(環(huán)氧乙烷)的那些。優(yōu)選，盡管不是必需的，聚(環(huán)氧乙烷)在一端用基團(tuán)如甲基、芐基或羥基封端。特別優(yōu)選的封端聚(環(huán)氧乙烷)是對(duì)應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)之一的那種H3C-(OCH2CH2)m-或H3C-(OCH2CH2)m-O-C(O)-NH-[CH2]f-(OCH2CH2)n-，其中(m)是2至4000，(f)是0至6，(n)是0至20。
通常關(guān)于間隔部分，將聚合物中出現(xiàn)的和式II、式IIa、式III包括的每個(gè)間隔部分(不管第一個(gè)間隔部分，第二個(gè)間隔部分，或第三個(gè)間隔部分)獨(dú)立地定義如上。然而，優(yōu)選，每個(gè)間隔部分如那些命名為“X1”和“X5”的選自-O-，-O-CH2-，-O-CH2-CH2-，-O-C(O)-NH-CH2-CH2-和-O-C(O)-NH-CH2-CH2-(OCH2CH2)2-。關(guān)于命名為“X2”和“X6”的間隔部分，間隔部分優(yōu)選選自-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2(OR2)-，-CH2-CH(OR2)-CH(OR2)，-NR2-，且R2是H或選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代芳基的有機(jī)基。關(guān)于命名為“X8”的間隔部分，間隔部分優(yōu)選選自-O-，-O-CH2-，-O-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-CH2-，-O-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-，-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-和-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-CH2-，其中(n)是0至20。任意地，X8可以進(jìn)一步包括分支點(diǎn)或數(shù)個(gè)分支點(diǎn)，其中可以存在另外的反應(yīng)基，因此提供“叉狀”排列。可用于本發(fā)明聚合物中的其它“叉狀”排列更全面地描述于國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/US99/05333中。
式III中分支部分R5可以是可提供和至少三個(gè)原子偶聯(lián)的任何分支部分。然而，優(yōu)選，R5選自飽和烷基，取代的飽和烷基， 和 其中(p)是1-10(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)和(q)是1-10(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)。
盡管式II、式IIa、式III中所述的反應(yīng)基“Z”可以是上述的任何反應(yīng)基，優(yōu)選反應(yīng)基選自羧酸、醛、砜、酯、琥珀酰亞胺和馬來酰亞胺。間隔部分(例如，X2、X4和X8)和Z組合的說明性實(shí)例包括……， 和 其中(r)是1-12(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12)，(r1)是0-5(例如，1，2，3，4或5)，且R6是芳基或烷基。
如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包括大量聚合物。以下將提供根據(jù)本發(fā)明聚合物的非限制性實(shí)例。
例如，用式III開始并將R5定義為 中每個(gè)(p)和(q)是1，且每個(gè)(b)和(f’)是0，形成具有對(duì)應(yīng)于以下式(IIIa)結(jié)構(gòu)的聚合物 式(IIIa)
其中POLY1、POLY2、(a)、(c)、(g′)、(j)、h)、R1、X7、X8如上定義。
依次將式(IIIa)進(jìn)一步定義來提供具有對(duì)應(yīng)于式(IIIb)結(jié)構(gòu)的聚合試劑。特別地，從式IIIa開始并將每個(gè)R1定義為H，POLY1和POLY2中的每個(gè)為H3C-(OCH2CH2)m-，其中(m)是2至4000，(a)和(e)中的每個(gè)為1，X1和X5中的每個(gè)為-O-C(O)-NH-[CH2]f-(OCH2CH2)n-，其中(f)為0至6，(n)為0至20，形成具有對(duì)應(yīng)于式IIIb結(jié)構(gòu)的聚合試劑 式(IIIb)其中每個(gè)(m)是2至4000，每個(gè)(f)獨(dú)立地為0至6，每個(gè)(n)獨(dú)立地為0至20，且(g’)、(h)、(j)、X7、X8和Z如上定義。
可以依次將式IIIb進(jìn)一步定義來提供具有對(duì)應(yīng)于式IIIc結(jié)構(gòu)的聚合試劑。特別地，從式IIIb開始并將(g’)和(j)中的每個(gè)定義為0，X8為-CH2-CH2-CH2-，Z為羧酸，形成具有對(duì)應(yīng)于以下式IIIc結(jié)構(gòu)的聚合物。
(式IIIc)其中每個(gè)(m)是2至400。每個(gè)(f)獨(dú)立地為0至6，每個(gè)(n)獨(dú)立地為0至20(例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)。
任意地，式IIIc還可以包括和羧酸α碳或β碳連接的烷基。關(guān)于羧酸α碳上的烷基(例如，甲基)，所述結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于式IIIb1。
(式IIIb1)此外，還可以進(jìn)一步定義式IIIa來提供另一種優(yōu)選的聚合物。特別地，從式IIIa開始并將POLY1和POLY2中的每個(gè)定義為H3C-(OCH2CH2)m-，其中(m)為2至4000，(a)、(c)、(g′)和(j)中的每個(gè)為0，(h)為1，X8為-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-，Z為 形成具有下列結(jié)構(gòu)的聚合物…… (式IIId)其中每個(gè)(m)為2至4000。
本發(fā)明另外的聚合試劑如下









其中所有變量如上定義，其中每個(gè)(n′)為0-100，更優(yōu)選0-40，最優(yōu)選0-20。
某些情況中，本發(fā)明的聚合試劑不包括酮部分，即其中兩個(gè)分開的碳原子中的每一個(gè)都和羰基部分的碳原子連接的部分。此外，在有些情況下優(yōu)選 部分不是帶環(huán)結(jié)構(gòu)(如馬來酰亞胺)的部分。此外，還優(yōu)選 比反應(yīng)基更接近水溶性聚合物，如測(cè)量的，例如，就從水溶性聚合物中最近的原子開始到達(dá)反應(yīng)基需要的原子數(shù)量而言，與從反應(yīng)基中最近的原子開始到達(dá)反應(yīng)基的原子數(shù)量相比較。
本發(fā)明還包括制備在此提供的聚合試劑的方法。該方法包括步驟(i)提供由受保護(hù)反應(yīng)基(未保護(hù)的反應(yīng)基是這樣的反應(yīng)基，或當(dāng)進(jìn)行方法步驟時(shí)它能保持不變)或反應(yīng)基前體和一個(gè)或多個(gè)羥基構(gòu)成的前體分子。一些由受保護(hù)反應(yīng)基或前體反應(yīng)基和一個(gè)或多個(gè)羥基構(gòu)成的前體分子是可購(gòu)得的。此外，可以合成未保護(hù)形式的前體分子，然后使用常規(guī)技術(shù)保護(hù)(如果需要)。
盡管存在許多形式的合適前體分子且本發(fā)明在這方面并無限制，但優(yōu)選的前體分子具有兩個(gè)羥基。優(yōu)選的合適前體分子的實(shí)例對(duì)應(yīng)于式(IV)。
(式IV)其中PG是保護(hù)基。如例如在實(shí)施例1中所述可以合成制得該試劑。
優(yōu)選的保護(hù)基的實(shí)例包括選自甲基、乙基、叔丁基和芐基的那些。特別優(yōu)選的保護(hù)基是甲基。
制備根據(jù)本發(fā)明聚合試劑的方法包括步驟(ii)激活前體分子的一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)和氨基反應(yīng)形成激活的前體分子。盡管可以使用任何合適的本領(lǐng)域已知激活試劑，優(yōu)選使用的激活劑選自二(N-琥珀酰亞胺)碳酸酯(DSC)、N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳化二亞胺、N-(3-二甲基氨丙基)-N’乙基碳化二亞胺、1，1′-羰二咪唑(CDI)、1，1′-羰基(1，2，4-三唑)(CDT)、雙(4-硝基苯基)碳酸酯、對(duì)硝基苯基氯碳酸酯、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、光氣、三光氣、1-羥基苯并三唑(HOBt)、二苯并三唑碳酸酯((diBTC)、N-羥基琥珀酰亞胺和DCC、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺和DCC，和四氫噻唑硫酮。通常將激活劑加入含有前體分子的容器中，使得激活劑和前體分子的一個(gè)或多個(gè)羥基接觸。
制備本發(fā)明聚合試劑的方法的另一步驟包括(iii)在共價(jià)偶聯(lián)條件下將一個(gè)或多個(gè)激活羥基中的至少一個(gè)和具有氨基的水溶性聚合物接觸，因此形成由水溶性聚合物部分和保護(hù)反應(yīng)基或反應(yīng)基前體構(gòu)成的聚合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來測(cè)定適于獲得共價(jià)偶聯(lián)的pH、溫度等條件。例如，可以進(jìn)行數(shù)次偶聯(lián)步驟，每次在不同設(shè)定的條件(例如，不同pH、不同溫度、溶劑，等等)下。通過測(cè)定每組條件下形成的由水溶性聚合物部分和保護(hù)反應(yīng)基構(gòu)成的聚合物量(例如通過大小排阻色譜法)，可能測(cè)定哪組條件最適于進(jìn)行偶聯(lián)步驟。
盡管可以使用大多數(shù)任何具有氨基的水溶性聚合物，尤其優(yōu)選使用以下聚合物之一 和 其中(m)是2至4000?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)從頭合成具有氨基的水溶性聚合物和通過如Nektar Therapeutics(Huntsville，AL)供貨商購(gòu)得。
當(dāng)前體分子中存在保護(hù)基時(shí)，制備聚合試劑的方法還包括步驟(iv)將保護(hù)反應(yīng)基去保護(hù)，因此形成聚合物。使用適于除去特定保護(hù)基的任何方法來進(jìn)行去保護(hù)步驟。對(duì)于任何特定的保護(hù)基，合適的去保護(hù)基方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。此外，合適的去保護(hù)基方法描述于相關(guān)文獻(xiàn)中，如Greene等，上文。使保護(hù)為烷基酯(例如甲酯)的酸基去保護(hù)的優(yōu)選方法是將帶有受保護(hù)基的分子暴露于堿催化的水解中。加入含有帶有受保護(hù)反應(yīng)基的分子的反應(yīng)容器中的合適堿實(shí)例包括，無限制，無機(jī)氫氧化物如氫氧化鈉、氫氧化鉀，和弱酸的金屬鹽如醋酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、檸檬酸鉀、醋酸鉀，等等。酸催化水解還可以用原酸酯來實(shí)現(xiàn)，盡管對(duì)于那些衍生物可以使用的酸催化水解后接著堿催化水解的組合。對(duì)于乙縮醛，酸催化水解是有效的，而堿催化水解是無效的。對(duì)于芐基酯或芐基醚，催化還原是有效的，盡管酸或堿催化水解對(duì)于酯也是有效的。
制備聚合試劑的方法任意包括一旦其形成就將聚合試劑分離的另外步驟?？梢允褂靡阎椒▉矸蛛x聚合物，但尤其優(yōu)選使用色譜法，例如離子交換色譜法或大小排阻色譜法?？商鎿Q的或另外的，方法包括一旦其形成就將聚合物純化的步驟。再次，可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)純化方法來純化聚合物。
對(duì)于通過本方法制得的任何所給聚合物，方法有利地提供了進(jìn)一步轉(zhuǎn)化聚合物的能力(任何去保護(hù)步驟之前或之后)，使得其帶有特定的反應(yīng)基。因此，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可以將聚合物功能化來包括反應(yīng)基(例如，活性酯、硫醇、馬來酰亞胺、醛、酮，等等)。
在合適的溶劑中進(jìn)行制備聚合試劑的各個(gè)步驟。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以測(cè)定是否任何特定溶劑適于任何所給反應(yīng)步驟。然而，通常溶劑優(yōu)選為非極性溶劑或極性溶劑。非極性溶劑的非限制性實(shí)例包括苯、二甲苯和甲苯。特別優(yōu)選的非極性溶劑包括甲苯、二甲苯、二氧己環(huán)、四氫呋喃、叔丁基醇。示范性極性溶劑包括但不限制于二氧己環(huán)、四氫呋喃(THF)、叔丁基醇、DMSO(二甲基亞砜)、HMPA(六甲基磷酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMA(二甲基乙酰胺)，和NMP(N-甲基吡咯烷酮)。
本發(fā)明還包括含有水溶劑聚合物部分、 部分，和藥理學(xué)活性劑的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物具有以下內(nèi)部結(jié)構(gòu)取向(i)通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分，水溶性聚合物部分和 部分的氮原子連接；(ii)通過直接共價(jià)鍵或通過第二個(gè)間隔部分，藥理學(xué)活性劑和 部分的羰基碳原子連接；和(iii)R1是H或有機(jī)基。
當(dāng)偶聯(lián)物全部結(jié)構(gòu)中僅存在單個(gè)水溶性聚合物時(shí)，偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)優(yōu)選對(duì)應(yīng)于式V 活性劑 (式V)其中POLY1是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；(a)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(b)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；R1是H或有機(jī)基(例如，選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基)；X1，存在時(shí)，是第一個(gè)間隔部分；X2，存在時(shí)，是第二個(gè)間隔部分；和活性劑是藥理學(xué)上的活性劑。
此外，當(dāng)偶聯(lián)物的全部結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)水溶性聚合物時(shí)，偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)優(yōu)選對(duì)應(yīng)于式VI 活性劑(式VI)
其中POLY1是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；POLY2是水溶性聚合物(例如，PEG或mPEG)；(a)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(b)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(e)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(f’)是O，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(g’)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(h)是0，1，2或3(且優(yōu)選0或1)；(j)是0至2 0(即，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)；每個(gè)R1獨(dú)立地是H或有機(jī)基(例如，選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基)；X1，存在時(shí)，是第一個(gè)間隔部分；X2，存在時(shí)，是第二個(gè)間隔部分；X5，存在時(shí)，是第五個(gè)間隔部分；X6，存在時(shí)，是第六個(gè)間隔部分；X7，存在時(shí)，是第七個(gè)間隔部分；X8，存在時(shí)，是第八個(gè)間隔部分；R5是分支部分；和活性劑是藥理學(xué)上的活性劑。
在此所述的聚合試劑適用于和生物活性劑或表面偶聯(lián)。適于和在此所述的聚合試劑反應(yīng)的優(yōu)選基團(tuán)是親電子基團(tuán)和親核基團(tuán)。示范性基團(tuán)包括伯胺(例如來自賴氨酸殘基側(cè)鏈的或多肽N-端的伯胺)、醇(例如來自絲氨酸或蘇氨酸殘基側(cè)鏈的伯醇)、硫醇、肼、酰肼和巰基。適于和在此所述的聚合試劑反應(yīng)的這樣的基團(tuán)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。因此，本發(fā)明提供了制備偶聯(lián)物的方法，該偶聯(lián)物包括在偶聯(lián)條件下將活性劑和在此所述的聚合試劑接觸的步驟。
合適的偶聯(lián)條件是足夠?qū)崿F(xiàn)聚合試劑和活性劑之間偶聯(lián)的時(shí)間、溫度、pH、試劑濃度、試劑官能團(tuán)、活性劑上可利用的官能團(tuán)、溶劑，等等的那些條件。如本領(lǐng)域已知的，特定條件取決于，除其它事情以外，活性劑、所需偶聯(lián)物的類型、反應(yīng)混合物中其它物質(zhì)的存在，等等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)閱讀在此公開的、參考相關(guān)文獻(xiàn)，和/或通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以確定任何特定情況中實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的充分條件。
例如，當(dāng)聚合試劑含有N-羥基琥珀酰亞胺活性酯(例如，琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酰亞胺丙酸酯，和琥珀酰亞胺丁酸酯)，和活性劑含有胺基(例如，多肽上的末端胺基和/或含有賴氨酸多肽的ε胺)時(shí)，在室溫約7.5至約9.5的pH可以實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。此外，當(dāng)聚合試劑含有乙烯砜反應(yīng)基或馬來酰亞胺基和藥理學(xué)活性劑含有巰基(例如，含有半胱氨酸或含有蛋氨酸多肽的巰基)時(shí)，在室溫下約7至約8.5的pH可以實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。此外，當(dāng)和聚合試劑相連的反應(yīng)基是醛或酮且藥物學(xué)活性劑含有伯胺時(shí)，通過還原性胺化可以實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)，其中藥理學(xué)活性劑的伯胺和聚合物的醛或酮反應(yīng)。在約6至約9.5pH下發(fā)生的還原性胺化最初形成偶聯(lián)物，其中藥理學(xué)活性劑和聚合物通過亞胺鍵連接。隨后用合適的還原劑如NaCNBH3來處理含有亞胺的偶聯(lián)物將亞胺還原成仲胺。對(duì)于涉及這些和其它偶聯(lián)反應(yīng)的其它信息，參考Hermanson“Bioconjugate Techniques，”Academic Press，1996。
示范性偶聯(lián)條件包括在約4至約10的pH下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，例如約4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，或10.0的pH。允許反應(yīng)進(jìn)行約5分鐘至約72小時(shí)，優(yōu)選約30分鐘至約48小時(shí)，更優(yōu)選約4小時(shí)至約24小時(shí)。偶聯(lián)可發(fā)生的溫度通常，盡管不是必需的，在約0℃至約40℃，經(jīng)常為室溫或更低溫度。通常使用磷酸鹽緩沖液、醋酸鈉，或相似系統(tǒng)來進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。
關(guān)于試劑濃度，通常用過量的聚合試劑和活性劑結(jié)合。然而一些情況中，優(yōu)選具有聚合試劑上反應(yīng)基與活性劑反應(yīng)基的化學(xué)計(jì)量。因此，例如，1摩爾帶有兩個(gè)反應(yīng)基的聚合試劑和兩摩爾的活性劑結(jié)合。聚合試劑與活性劑的示范性比例(聚合試劑∶活性劑)包括約1∶1，1.5∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，8∶1或10∶1的摩爾比。允許偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行直至實(shí)質(zhì)上沒有進(jìn)一步的偶聯(lián)發(fā)生，通常可以通過監(jiān)控隨著時(shí)間的反應(yīng)過程來確定。
通過在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)從反應(yīng)混合物中取出等分試樣，并通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法或任何其它合適的分析方法分析反應(yīng)混合物來監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)程。就形成的偶聯(lián)物的量或殘留的未偶聯(lián)聚合試劑的量而言，一旦達(dá)到了平穩(wěn)狀態(tài)，就假定反應(yīng)完成。通常，偶聯(lián)反應(yīng)大概進(jìn)行數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)(例如，5分鐘至24小時(shí)或更久)。優(yōu)選但不是必需將所得到的產(chǎn)品混合物純化來分離出過量聚合試劑、未偶聯(lián)反應(yīng)物(例如，活性劑)，和不需要的多偶聯(lián)物質(zhì)。然后可以使用分析方法如MALDI、毛細(xì)管電泳、凝膠電泳，和/或色譜法來進(jìn)一步表征所得到的偶聯(lián)物。
可以純化聚合物-活性劑偶聯(lián)物來獲得/分離不同的偶聯(lián)物質(zhì)?；蛘撸瑢?duì)于用于形成偶聯(lián)物的更低分子量(例如，小于約20,000道爾頓，更優(yōu)選小于約10,000道爾頓)聚合試劑，更優(yōu)選將產(chǎn)品混合物純化來獲得每個(gè)活性劑的水溶性聚合物部分的分布。例如，可以將產(chǎn)品混合物純化來獲得每個(gè)活性劑(例如，蛋白質(zhì))大概平均一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)聚合試劑的連接，通常每個(gè)活性劑(蛋白質(zhì))平均約連接。純化最終偶聯(lián)物反應(yīng)混合物的策略將取決于多個(gè)因素，包括，例如，所用聚合試劑的分子量、特定活性劑、所需給藥方案，以及單個(gè)偶聯(lián)物的殘余活性和體內(nèi)特性。
如果需要，使用凝膠過濾色譜法分離具有不同分子量的偶聯(lián)物。也就是說，使用凝膠過濾色譜法分級(jí)分離不同數(shù)量的聚合試劑對(duì)活性劑的比例(例如，1-基體(mer)、2-基體、3-基體等，其中“1-基體”表示1聚合試劑對(duì)活性劑，“2-基體”表示兩個(gè)聚合試劑對(duì)活性劑，等等)，基于其不同的分子量(其中差異基本上對(duì)應(yīng)于水溶性聚合物部分的平均分子量)。例如，示范性反應(yīng)中，100,000道爾頓蛋白質(zhì)和總分子量約20,000道爾頓的支化PEG隨機(jī)偶聯(lián)(其中支化PEG的每個(gè)聚合物“臂”具有約10,000道爾頓的分子量)，所得到的反應(yīng)混合物可以含有未修飾的蛋白質(zhì)(具有約100,000道爾頓的分子量)、單PEG化的蛋白質(zhì)(具有約120,000道爾頓的分子量)、二PEG化的蛋白質(zhì)(具有約140,000道爾頓的分子量)等。
盡管該方法可以用于分離PEG和具有不同分子量的其它聚合物-活性劑偶聯(lián)物，通常該方法對(duì)于分離蛋白質(zhì)中具有不同聚合物連接位點(diǎn)的位置異構(gòu)體是無效的。例如，凝膠過濾色譜法可以用于PEGl-基體、2-基體、3-基體等等混合物的相互分離，盡管每個(gè)回收的PEG-基體組合物可以含有連接至活性劑中不同反應(yīng)氨基(例如，賴氨酸殘基)的PEG。
適用于進(jìn)行這種類型分離的凝膠過濾柱包括SuperdexTM和SephadexTM柱，從Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)可獲得。特定柱的選擇將取決于需要的分級(jí)分離范圍。通常使用合適的緩沖劑如磷酸鹽、醋酸鹽等等進(jìn)行洗脫。通過多種不同方法分析收集的級(jí)分，例如，(i)用于蛋白質(zhì)含量的280nm處光密度(OD)，(ii)牛血清清蛋白(BSA)蛋白質(zhì)分析，(iii)用于PEG含量的碘測(cè)試(Sims等(198O)Anal.Biochem，10760-63)，和(iv)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)，隨后用碘化鋇染色。
通過使用反相高效液體色譜法(RP-HPLC)C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)的反相色譜法或通過使用離子交換柱如從Amersham Biosciences獲得的SepharoseTM離子交換柱的離子交換色譜法進(jìn)行位置異構(gòu)體的分離。每個(gè)方法都可以用來分離具有相同分子量的聚合物-活性劑異構(gòu)體(位置異構(gòu)體)。
在此所述的聚合試劑可以共價(jià)或非共價(jià)和多種實(shí)體連接，這些實(shí)體包括薄膜，化學(xué)分離和純化表面，固體支持物，金屬表面如金、鈦、鉭、鈮、鋁、鋼，及它們的氧化物，氧化硅，大分子(例如蛋白質(zhì)、多肽，等等)，以及小分子。此外，聚合試劑還可以用于生化傳感器、生物電開關(guān)和柵極中。聚合試劑還可以用作肽合成、制備聚合物涂覆的表面和聚合物移植物的載體，來制備用于親和性分離的聚合物-配體偶聯(lián)物，來制備交聯(lián)或非交聯(lián)水凝膠，來制備用于生物反應(yīng)器的聚合物-輔因子加合物。
用于和在此所述聚合試劑偶聯(lián)的生物活性劑可以是下列的任意一種或多種。合適的藥劑可以選自，例如，安眠藥和鎮(zhèn)定劑，精神興奮藥，鎮(zhèn)靜劑，呼吸藥，抗驚厥藥，肌肉松馳藥，抗帕金森氏病藥劑(多巴胺拮抗劑)，止痛劑，抗炎劑，抗焦慮劑(抗焦慮藥)，食欲抑制劑，抗偏頭痛劑，肌肉收縮劑，抗感染劑(抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、疫苗)，抗關(guān)節(jié)炎藥，抗瘧藥，止吐藥，anepileptics，支氣管擴(kuò)張劑，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，抗癌劑，抗血栓形成藥，抗高血壓藥，心血管藥，抗心率失齊藥，抗氧化劑(antioxicant)，抗哮喘藥，激素藥包括避孕藥，擬交感神經(jīng)作用藥，利尿劑，脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑，抗雄激素劑，抗寄生蟲藥，抗凝血?jiǎng)?，腫瘤藥，抗腫瘤藥，低血糖藥，營(yíng)養(yǎng)劑和補(bǔ)充劑，生長(zhǎng)補(bǔ)充劑，抗腸炎藥，疫苗，抗體，診斷劑和造影劑。
更特別地，活性劑可以落入多種結(jié)構(gòu)類別中的一種，包括但不限制于，小分子(優(yōu)選不溶性小分子)，肽，多肽，蛋白質(zhì)，抗體，抗體片段，多糖，類固醇，核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸，脂肪，電解質(zhì)，等等。優(yōu)選，用于和在此所述聚合物偶聯(lián)的活性劑具有天然氨基，或可替代地，被修飾以含有適與在此所述聚合物偶聯(lián)的至少一種反應(yīng)性氨基。
適于共價(jià)連接的活性劑特定實(shí)例包括但不限制于agalsidase，alefacept，天冬酰胺酶(aspariginase)，amdoxovir(DAPD)，抗排卵肽，貝卡普勒明，降鈣素，藍(lán)藻抗病毒蛋白，地尼白介素2，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，EPO激動(dòng)劑(例如，約10-40個(gè)氨基酸長(zhǎng)并含有特定核心序列的肽，如WO 96/40749中所述的)，α鏈道酶，紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP)，凝血因子如因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子XIII，馮威勒布蘭特因子；西利酶，重組葡糖腦苷脂酶，α-葡糖苷酶，膠原，環(huán)孢霉素，α防御素，β防御素，去氨加壓素，exedin-4，粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)，血小板生成素(TPO)，α-1蛋白酶抑制劑，益鈣寧，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)，纖維蛋白原，非格司亭，somatropin，生長(zhǎng)激素人生長(zhǎng)激素(hGH)，生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)，GRO-β，GRO-β抗體，骨形態(tài)發(fā)生蛋白如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6，OP-1；酸性成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子，堿性成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子，CD-40配體，肝素，人血清白蛋白，低分子量肝素(LMWH)，干擾素如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素ω、干擾素σ、共有干擾素；白細(xì)胞介素和白細(xì)胞介素受體如白細(xì)胞介素-1受體，白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-2融合蛋白，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑，白細(xì)胞介素-3，白細(xì)胞介素-4，白細(xì)胞介素-4受體，白細(xì)胞介素-6，白細(xì)胞介素-8，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-13受體，白細(xì)胞介素-17受體；乳鐵蛋白和乳鐵蛋白片段，促黃體生成激素釋放因子(LHRH)，胰島素，胰島素原，胰島素類似物(例如，單酰化胰島素，如美國(guó)專利No.5,922,675中所述的)，胰淀素，C-肽，生長(zhǎng)激素抑制素，生長(zhǎng)激素抑制素類似物包括奧曲肽，后葉加壓素，促卵泡激素(FsH)，流感疫苗，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，促胰島素激素，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，纖維蛋白溶酶原活化因子如阿替普酶，尿激酶，瑞替普酶，鏈激酶，帕米普酶，拉諾普酶，和替奈譜酶；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，骨保護(hù)素，血小板衍生的生長(zhǎng)因子，組織生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，白血病抑制因子，角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF)，T細(xì)胞受體，CD分子/抗原，腫瘤壞死因子(TNF)，單核細(xì)胞化學(xué)吸附蛋白-1，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，甲狀旁腺激素(PTH)，胰高血糖素樣肽，促生長(zhǎng)素，胸腺素α1，拉布立酶，胸腺素α1 IIb/IIIa抑制劑，胸腺素β10，胸腺素β9，胸腺素β4，α-1抗胰蛋白酶，磷酸二酯酶(PDE)化合物，VLA-4(非常遲抗原-4)，VLA-4抑制劑，二膦酸鹽，呼吸合胞體病毒抗體，囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)(CFTR)基因，脫氧核糖核酸酶(DNA酶)，殺菌劑/滲透性增強(qiáng)蛋白(BPI)，以及抗CMV抗體。示范性單克隆抗體包括依那西普(一種由和IgG1 Fc部分連接的人75kD TNF受體的胞外配體結(jié)合部分構(gòu)成的二聚融合蛋白)，阿昔單抗，阿達(dá)木單抗，阿非莫單抗，阿來珠單抗，B淋巴細(xì)胞的抗體，atlizumgb，巴利希單抗，貝伐單抗，比西單抗，bertilimumab，CDP-571，CDP-860，CDP-870，西妥昔單抗，克立昔單抗，達(dá)克珠單抗，eculizumab，依決可單抗，依利佐單抗，依帕珠單抗，fontolizumab，gavilimomab，吉妥珠單抗奧唑米星，替伊莫單抗，英昔單抗，伊諾莫單抗，凱利昔單抗，labetuzumab，樂地單抗，奧利珠單抗，放射性標(biāo)記的lym-1，metelimumab，美泊利單抗，米妥莫單抗，莫羅單抗-CD3，奈巴庫(kù)單抗，那他珠單抗，奧度莫單抗，omalizumab，oregovomab，帕利珠單抗，pemtumomab，pexelizumab，重組人MAb-VEGF，利妥昔單抗，沙妥莫單抗噴地肽，司韋單抗，siplizumab，托西莫單抗，I131托西莫單抗，曲妥珠單抗，妥韋單抗和visilizumab。
適于共價(jià)連接的其它試劑，包括但不限制于，特可林，美金胺，利凡斯的明，加蘭他敏，鹽酸多奈哌齊，左乙拉西坦，瑞格列奈，阿托伐他汀，alefacept，他達(dá)那非，伐地那非，西地那非，膦沙那韋，奧塞米韋，萬乃洛韋和纈更昔洛韋，阿巴瑞克，阿德福韋，阿夫唑嗪，阿洛斯瓊，氨磷汀，胺碘酮，氨基己酸，氨基馬尿酸鈉，氨魯米特，氨基乙酰丙酸，氨基水楊酸，氨氯地平，胺苯吖啶，阿那格雷，阿那曲唑，aprepitant，阿立哌唑，天冬酰胺酶，atazanavir，阿托西汀，蒽環(huán)霉素類，貝卡瑞特，比卡魯胺，博萊霉素，bortezomib，布舍瑞林，白消安，卡麥角林，卡培他濱，卡鉑，卡莫司汀，苯丁酸氮芥(chlorambucin)，西司他丁鈉，順鉑，克拉屈濱，氯膦酸，環(huán)磷酰胺，環(huán)丙氯地孕酮，阿糖胞苷，喜樹堿類，13-順視黃酸，全反式視黃酸；氮烯唑胺，更生霉素，達(dá)托霉素，柔紅霉素，去鐵胺，地塞米松，雙氯芬酸，己烯雌酚，多西紫杉醇，阿霉素，度他替利，依來曲坦，恩曲他濱，enfuvirtide，依普利酮，表柔比星，雌氮芥，炔雌醇，足葉乙甙，依西美坦，ezetimibe，芬太尼，費(fèi)索芳定，氟達(dá)拉賓，氟氫可的松，氟尿嘧啶，氟甲睪酮，氟他米特，氟替卡松(fluticazone)，磺達(dá)肝素，氟維司群，γ-羥基丁酸鹽，吉非替尼，吉西他濱，腎上腺素，L-多巴，羥基脲，艾考糊精，去甲氧柔紅霉素，異環(huán)磷酰胺，伊馬替尼，伊立替康，伊曲康唑，戈舍瑞林，艾杜糖醛酸酶，蘭索拉唑，來曲唑，甲酰四氫葉酸，左旋咪唑，賴諾普利，左甲狀腺素(lovothyroxine)鈉，環(huán)己亞硝脲，二氯甲二乙胺，甲羥孕酮，甲地孕酮，苯丙氨酸氮芥，美金胺，巰嘌呤，甲氧苯酚，重酒石酸間羥胺，氨甲喋呤，滅吐靈，慢心利，miglustat，絲裂霉素，米托坦，米托蒽醌，莫達(dá)非尼，納洛酮，萘普生，奈韋拉平，煙堿，尼魯米特，硝唑尼特，尼替西農(nóng)，炔諾酮，奧曲肽，奧沙利鉑，帕洛諾司瓊，帕米膦酸鹽，培美曲塞，培高利特，噴司他丁，pilcamycin，光卟啉，強(qiáng)的松，甲基芐肼，丙氯拉嗪，恩丹西酮，帕洛諾司瓊，奧沙利鉑，雷替曲塞，羅伐他汀，西羅莫司，鏈脲佐菌素，吡美莫司，硝酸舍他康唑，他克莫司，三苯氧胺，替加色羅，替莫唑胺，替尼泊甙，睪酮，四氫大麻酚，沙利度胺，硫鳥嘌呤，噻替派，噻托溴胺，托吡酯，拓?fù)涮婵?，treprostinil，維甲酸，伐地考昔，塞來昔布，羅非昔布，戊柔比星，長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛，長(zhǎng)春瑞濱，伏立康唑，多拉司瓊，格拉司瓊，福莫特羅，氟替卡松，亮丙瑞林，咪達(dá)唑侖，阿普唑侖，兩性霉素B，鬼臼毒素，核苷類抗病毒藥，芳酰基腙，舒馬曲坦，依來曲坦；大環(huán)內(nèi)酯類如紅霉素，竹桃霉素，醋竹桃霉素，羅紅霉素，克拉霉素，環(huán)酯紅霉素，阿奇霉素，氟紅霉素，地紅霉素，交沙霉素，螺旋霉素，麥迪霉素，氯雷他定，地洛他定，白霉素，miocamycin，羅他霉素，andazithromycin，和swinolide A；氟喹諾酮類如環(huán)丙沙星，氧氟沙星，左氧氟沙星，曲伐沙星，alatrofloxacin，moxifloxicin，諾氟沙星，依諾沙星，加替沙星，吉米沙星，格帕沙星，洛美沙星，司帕沙星，替馬沙星，培氟沙星，阿拉曲沙星，氟羅沙星，托氟沙星，普盧利沙星，irloxacin，帕珠沙星，克林沙星和西他沙星；氨基糖甙類如慶大霉素，奈替米星，草履蟲素，托普霉素，阿米卡星，卡那霉素、新霉素和鏈霉素，萬古霉素，替考拉寧，rampolanin，表地拉寧，粘菌素，達(dá)托霉素，短桿菌肽，多粘菌素E甲磺酸；多粘菌素如多粘菌素B，卷曲霉素，桿菌肽，penems；青霉素類包括青霉素酶敏感藥劑如青霉素G，青霉素V；抗青霉素酶藥劑如二甲氧苯青霉素，苯唑青霉素，鄰氯青霉素，雙氯青霉素，氟氯青霉素，乙氧萘青霉素；革蘭氏陰性微生物活性劑如氨芐青霉素，阿莫西林，海他西林，cillin，和galampicillin；抗假單胞菌青霉素類如羧芐青霉素，羧吩噻青霉素，阿洛西林，美洛西林和哌拉西林；頭孢菌素類如頭孢泊，頭孢丙烯，頭孢布烯(ceftbuten)，頭孢唑肟，頭孢曲松，頭孢菌素，頭孢吡硫，頭孢氨芐，頭孢拉定(cephradrine)，頭孢西丁，頭孢孟多，頭孢唑啉，頭孢菌素II，頭孢克洛，頭孢氨芐，頭孢菌素III，頭孢呋辛，頭孢雷特，頭孢噻肟，頭孢曲秦，氰乙酰頭孢菌素，頭孢吡肟，頭孢克肟，頭孢尼西，頭孢哌酮，頭孢替坦，先鋒美他醇，頭孢他啶，氯碳頭孢和拉氧頭孢，單環(huán)β-內(nèi)酰胺菌素如氨曲南；和碳青霉烯類如亞胺培南，美羅培南和ertapenem，噴他脒，伊西酸鹽(isetionate)，沙丁胺醇硫酸鹽，利多卡因，硫酸異丙喘寧，倍氯米松diprepionate，去炎松乙酰胺，布地奈德丙酮化物，沙美特羅，異丙托溴銨，氟尼縮松，色甘酸鈉和麥角胺酒石酸鹽；紫杉烷類如紫杉醇；SN-38和tyrphostine。
和在此所述聚合物偶聯(lián)的優(yōu)選小分子是具有至少一個(gè)天然存在的氨基的那些。優(yōu)選的分子如這些包括氨基馬尿酸鈉、兩性霉素B、阿霉素、氨基己酸、氨基乙酰丙酸、氨基水楊酸、重酒石酸間羥胺、帕米膦酸二鈉、柔紅霉素、左甲狀腺素鈉、賴諾普利、西司他丁鈉、慢心利、頭孢氨芐、去鐵胺和氨磷汀。
和在此所述聚合物偶聯(lián)的優(yōu)選肽或蛋白質(zhì)包括EPO、IFN-α、IFN-β、共有IFN、因子VIII、B-結(jié)構(gòu)域缺失因子VIII、因子IX、GCSF、GMCSF、hGH、胰島素、FSH、具有GLP-1活性的肽、去氨加壓素、amdoxivir和PTH。
上述示范性生物活性劑意味著包括，可適用的，類似物、激動(dòng)劑、拮抗劑、抑制劑、異構(gòu)體，及其藥物學(xué)上可接受的鹽形式。對(duì)于肽和蛋白質(zhì)，本發(fā)明意欲包括合成的、重組的、天然的、糖基化的，和非糖基化形式，及其生物活性片段。此外，術(shù)語“活性劑”意欲包括偶聯(lián)之前的活性劑以及偶聯(lián)后的活性劑“殘基”。
特別優(yōu)選的藥物學(xué)活性劑是對(duì)胰高血糖素樣肽(GLP-1)受體具有激動(dòng)劑或拮抗劑活性的肽。GLP-1及其藥理學(xué)活性激動(dòng)劑衍生物在體內(nèi)刺激β細(xì)胞分泌胰島素并抑制胰高血糖素的分泌。這樣的GLP-1受體激動(dòng)劑適用于調(diào)節(jié)胰島素產(chǎn)生。
適用作偶聯(lián)物的GLP-1相關(guān)藥劑的實(shí)例包括但不限制于以下物質(zhì)天然GLP-1；exendin-3；exendin-4；exendin-4(1-30)；exendin-4(1-30)酰胺；exendin-4(1-28)酰胺；14Leu，25Pheexendin-4酰胺；14Leu，25Phe exendin-4(1-28)酰胺；14Leu，22Ala，25Phe exendin-4(1-28)酰胺，或其藥理學(xué)活性衍生物。這些和具有GLP-1受體激動(dòng)劑活性的其它藥劑描述于WO99/07404中并包括具有對(duì)應(yīng)以下通式結(jié)構(gòu)的藥劑Xaa1Xaa2Xaa3Gly Thr Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Ser Lys Gln Xaa9Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Leu Lys Asn Gly Gly Xaa14Ser Ser Gly Ala Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18-Z，(SEQ.ID.NO.1)其中Xaa1是His，Arg或Tyr；Xaa2是Ser，Gly，Ala或Thr；Xaa3是Asp或Glu；Xaa4是Phe，Tyr或萘基丙氨酸；Xaa5是Thr或Ser；Xaa6是Ser或Thr；Xaa7是Asp或Glu；Xaa8是Leu，Ile，Val，戊基甘氨酸或Met；Xaa9是Leu，Ile，戊基甘氨酸，Val或Met；Xaa10是Phe，Tyr或萘基丙氨酸；Xaa11是Ile，Val，Leu，戊基甘氨酸，叔丁基甘氨酸或Met；Xaa12是Glu或Asp；Xaa13是Trp，Phe，Tyr，或萘基丙氨酸；Xaa14，Xaa1s，Xaa16和Xaa17獨(dú)立地是Pro，同型脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；Xaa18是Ser，Thr或Tyr；和Z是-OH或-NH2。
其它GLP-1激動(dòng)劑描述于美國(guó)專利No.6,583,111中。該參考文獻(xiàn)中所述的特別優(yōu)選激動(dòng)劑包括NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH(SEQ ID NO2)，NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-lle-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-NH2(SEQ ID NO3)，和NH2-His7-Val-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH(SEQ ID NO4)。
適用作偶聯(lián)物的藥劑其它實(shí)例包括但不限制于WO01/23420中描述的那些。如在此所述的，通過常規(guī)基于固態(tài)的合成技術(shù)(如描述于Peptide Synthesis Protocol(1994)，Vol.35，by MichealW.Pennington&Ben M.Dunn)和/或通過基于重組技術(shù)可以制得以下多肽中的許多。特別優(yōu)選的序列包括
多肽SEQ.ID.No.Ac-HSDAVFTENYTKLRKQNIeAAKKYLNDLKKGGT-NH25Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT-NH26Ac-HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT 7HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT 8Ac-HSDAVFTEN(CH30-Y)TKLRKQNIeAAKKYLNDLKK-NH29HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKK10HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK-NH211HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKGGT 12HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNKLLNGGT 13HSDAVFTDNYTKLRKQLAAKKYLNDILNGGT 14HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGGT 15HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK-NH216HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNDLKKGGT 17HSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDKKGGTSWCEPGWCR 18HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKYLNDIKKGGT 19HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKKGGT 20HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKKGGT 21HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKNGGT 22HSDAVFIDNYTRLRKQLAVKKYLNSIKKGGT 23HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKGGT 24HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDIKNGGT 25HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNSIKNGGT 26HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKGG 27HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKG 28HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKK29HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKQ 30HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKNQ 31HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDIKKKRY 32HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKK33HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKN34HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILK35HSDAVFTDNYTELRKQMAVKKYLNSILN36HSDAVFTDNYTRLREOMAVKKYLNSILN37HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNSILN38HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILN39HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNDILN40HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKN41HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSILK42HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKK43HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKRY 44HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKKR 45HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKKK 46
HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY 47HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKKRY 48HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKKR 49DAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKKK 50HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSIKNKRY 51HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKK52HSDAVFTDNYTRLRKQIAAKKYLQTIKK53HSDGIFTESYSRYRKQMAVKKYLAALKKKRYKQRVKNK 57HSDAVFTENYTRLRKQMAVKKYLNSLKK-NH258HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLSAVRHGQT-NH259HSDGIFTDSYSRYRKOMAVKKYLAAVKQGGT-NH260HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVKKYLAAVRHG-NH261SWCEPGWCRHSDAVFTENYTKLRKQLAAKKYLNDLKKGGT62HSDAVFTDNYTRLRKOLAAKKYLNDILKGGT 63HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNDILNGGT 64HSDAVFTDNYTRLRKQLAVKKYLNDILKGGT 65HSDGIFTDSYSRYRKQLAAKKYLADVKKGGT 66HSDGIFTDSYSRYRKQ;AALLYLADVKK67HSDGIFTDSYSRYRLQLAVKKYLAAVKK68HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVKK69HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKK70HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKR 71HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY 72HSDAVFTDNYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY 73HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSILNKRY 74HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLQSIKNKRY 75HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNTIKNKRY 76HSDAVFTDQYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKRY 77HSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLNTIKNKRY 78HSDAVFTDNYTRLRKQMAAHKYLNSIKNKRY 79HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKHYLNSIKNKRY 80HSDAVFTDQYTRLRKQLAAHKYLNTIKNKRY 81HSDAVFTDQYTRLRKOLAAKHYLNTIKNKRY 82HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKKKR 83HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSKKR84HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLNSIKNKRY 85HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKKR 86HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKKK 87HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSIKNKRY 88HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKRY 89HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKKR 90HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSILKK 91HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNK 92HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLQSILKKRY 93HSDAVFTDNYTRLRKQVAVKKYLOSILKKR 94
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HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNFR 141HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNGR 142HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNHR 143HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNIR 144HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNLR 145HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNMR 146HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNNR 147HSOAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNPR 148HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNQR 149HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNRR 150HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKNSR 151HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNTR 152HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNVR 153HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNWR 154HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNYR 155HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKA 156HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKD 157HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKE 158HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKF 159HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKG 160HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKH 161HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKI 162HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKK 163HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKNKL 164HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKM 165HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKN 166HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKP 167HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKQ 168HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKS 169HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKT 170HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKV 171HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKW 172HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIKNKY 173HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRYSWCEPGWCR174HSDAVFTDDYTRLRKEVAAKKYLFSIKDKRY 175ESDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2176HKDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2177HSKGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2178HSDKIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2179HSDGKFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2180HSDGIKTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2181HSDGIFKDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2182HSDGIFTKSYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2183HSDGIFTDKYSRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2184HSDGIFTTDSKSRYRKOMAVKKYLAAVL-NH2185
HSDGIFTDSYKRYRKQMAVKKYLAAVL-NH2186HSDGIFTDSYSEYRKQMAVKKYLAAVL-NH2187HSDGIFTDSYSRKRKQMAVKKYLAAVL-NH2188HSDGIFTDSYSRYEKQMAVKKYLAAVL-NH2189HSDGIFTDSYSRYREOMAVKKYLAAVL-NH2190HSDGIFTDSYSRYRKKMAVKKYLAAVL-NH2191HSDGIFTDSYSRYRKOKAVKKYLAAVL-NH2192HSDGIFTDSYSRYRKQMKVKKYLAAVL-NH2193HSDGIFTDSYSRYRKQMAKKKYLAAVL-NH2194HSDGIFTDSYSRYRKQMAVEKYLAAVL-NH2195HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKEYLAAVL-NH2196HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKKLAAVL-NH2197HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYKAAVL-NH2198HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLKAVL-NH2199HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAKVL-NH2200HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAKL-NH2201HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVK-NH2202HSDAVFTDNYTRLRKOMAAKKYLNSIKNRI 322HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIKNRI 323HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIKNRI 324HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIKNRI 325HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIKNRI 326HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIPNRI 327HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIPNRI 328HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIPNRI 329HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIPNRI 330HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIPNRI 331HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIQNRI 332HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIQNRI 333HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIONRI 334HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIQNRI 335HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIQNRI 336HSDAVFTDNYTRLRKQMAAKKYLNSIRNRI 337HSDAVFTDNYTRLRKQMAGKKYLNSIRNRI 338HSDAVFTDNYTRLRKQMAKKKYLNSIRNRI 339HSDAVFTDNYTRLRKQMARKKYLNSIRNRI 340HSDAVFTDNYTRLRKQMASKKYLNSIRNRI 341
具有GLP-1活性的肽激動(dòng)劑的進(jìn)一步實(shí)例描述于美國(guó)專利No.6,528,486中，包括，例如，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO342)，H-Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO343)，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2(SEQ ID NO344)，H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2(SEQ ID NO345)，H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2(SEQ ID NO346)，H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO347)，H-(Lys)6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO348)，和H-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2(SEQ ID NO349)。
所有氨基酸縮寫使用常規(guī)和普遍接受的形式，如下苯丙氨酸為Phe或F；亮氨酸為L(zhǎng)eu或L；異亮氨酸為Ile或I；蛋氨酸為Met或M；纈氨酸為Val或V；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P；蘇氨酸為Thr或T；丙氨酸為Ala或A；酪氨酸為Tyr或Y；組氨酸為His或H；谷氨酰胺為Gln或Q；天冬酰胺為Asn或N；賴氨酸為L(zhǎng)ys或K；天冬氨酸為Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys或C；色氨酸為Trp或W；精氨酸為Arg或R；以及甘氨酸為Gly或G。?；膸в星熬Y“Ac”。
本發(fā)明還包括藥物制劑，該制劑含有與藥物賦形劑結(jié)合的在此提供的偶聯(lián)物。通常，偶聯(lián)物自身將呈固態(tài)(例如，沉淀物)，其可以和可呈固態(tài)或液態(tài)的適合的藥物賦形劑結(jié)合。
示范性賦形劑包括，無限制，選自碳水化合物、無機(jī)鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩沖液、酸、堿，及其組合的那些。
碳水化合物如糖，衍生的糖如醛醇、醛糖酸、酯化糖，和/或糖聚合物可以作為賦形劑存在。特定的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖，如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖，等等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉，等等；以及醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇，等等。
賦形劑還可以包括無機(jī)鹽或緩沖液如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，及其組合物。
制劑還可以包括抗微生物劑用來防止或阻止微生物生長(zhǎng)。適于本發(fā)明的抗微生物劑非限制性實(shí)例包括潔而滅、氯化芐乙氧銨、苯甲醇、氯化十六烷吡啶鎓、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、乙基汞硫代水楊酸鈉，及其組合物。
制劑的還可以存在抗氧化劑?？寡趸瘎┯糜诜乐寡趸虼朔乐沽酥苿┲信悸?lián)物或其它成分的變質(zhì)。用于本發(fā)明的合適抗氧化劑包括，例如，抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、次磷酸、一硫代丙三醇、沒食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛化次硫酸鈉、焦亞硫酸鈉，及其組合物。
表面活性劑可以以賦形劑存在。示范性表面活性劑包括聚山梨酯，如“吐溫20”和“吐溫80”，和普如蘭尼克如F68和F88(兩者都可以從BASF，Mount Olive，New Jersey獲得)；山梨聚糖酯；脂質(zhì)，如磷脂如卵磷脂和其它磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺(盡管優(yōu)選不呈脂質(zhì)體形式)，脂肪酸和脂肪酯；類固醇，如膽固醇；和螯合劑，如EDTA、鋅和其它這樣合適的陽離子。
酸和堿可以作為賦形劑存在于制劑中?？梢允褂玫乃岬姆窍拗菩詫?shí)例包括選自鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸，及其組合的那些酸。合適堿的實(shí)例包括，無限制，堿選自氫氧化鈉、醋酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、醋酸銨、醋酸鉀、磷酸鈉、硫酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、磷酸鉀、富馬酸鉀，及其組合的堿。
藥物制劑包括所有類型的制劑，尤其是那些適于注射的，例如可以重構(gòu)的粉末以及懸浮劑和溶液。組合物中的偶聯(lián)物的量(即，活性劑和在此所述聚合物形成的偶聯(lián)物)根據(jù)多種因素而改變，當(dāng)組合物保存于單位劑量的容器(例如，小瓶)中時(shí)，最佳將為治療有效劑量。此外，藥物制劑可以放入注射器中?？赏ㄟ^重復(fù)給藥遞增量的偶聯(lián)物來實(shí)驗(yàn)測(cè)定治療有效劑量，以便確定哪個(gè)量產(chǎn)生了臨床所需的終點(diǎn)。
組合物中任何單個(gè)賦形劑的量可以根據(jù)賦形劑的活性和組合物的特定需要而改變。通常，通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定任何單個(gè)賦形劑的最佳量，即通過制備含有改變量的賦形劑(從低至高)的組合物、測(cè)定穩(wěn)定性和其它參數(shù)，然后確定在獲得最佳性能而無顯著不良作用的范圍。
然而，通常，存在于組合物中的賦形劑量為約1％至約99％重量，優(yōu)選約5-98％重量，更優(yōu)選約15-95％重量，最優(yōu)選濃度小于30％重量。
這些前述的藥物賦形劑和其他賦形劑一起描述于“RemingtonThe Science&Practice of Pharmacy”，第19版，Williams&Williams，(1995)，the“Physician′s Desk Reference″，第52版，MedicalEconomics，Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，Handbookof Pharmaceutical Excipients，第3版，American PharmaceuticalAssociation，Washington，D.C.，2000中。
盡管不是必需的，本發(fā)明的藥物制劑通常通過注射給藥并因此通常在給藥之前即時(shí)為液體溶液或懸浮液。藥物制劑還可以采用其它形式如糖漿、霜?jiǎng)?、軟膏、片劑、粉末，等等。給藥的其它方式也被包括，如肺、直腸、透皮、透粘膜、口服、鞘內(nèi)、皮下、動(dòng)脈內(nèi)，等等。
如前所述，通過靜脈內(nèi)注射胃腸外注射給藥偶聯(lián)物，或較少優(yōu)選通過肌內(nèi)或通過皮下注射。用于胃腸外給藥的合適劑型包括即可注射的溶液、使用前和溶劑結(jié)合的干粉、即可注射的懸浮液、使用前和載體結(jié)合的干的不溶組合物，以及給藥前稀釋的乳劑和液體濃縮物，除了其它的外。
本發(fā)明還提供了將在此提供的偶聯(lián)物給藥于患者的方法，該患者遭受對(duì)用偶聯(lián)物治療起反應(yīng)的狀況。該方法包括通常通過注射給藥治療有效量的偶聯(lián)物(優(yōu)選作為藥物制劑的部分來提供)。給藥的方法可以用來治療通過給藥特定偶聯(lián)物可以治療或防止的任何狀況。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員懂得特定偶聯(lián)物可以有效治療哪些狀況。給藥的實(shí)際劑量將根據(jù)受試者年齡、體重，和一般情況以及待治療狀況的嚴(yán)重程度、衛(wèi)生護(hù)理專業(yè)人員的判斷和將給藥的偶聯(lián)物而改變。治療有效量對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的和/或描述于有關(guān)參考文本和文獻(xiàn)中。通常，治療有效量為約0.O01mg至100mg，優(yōu)選劑量為O.01mg/天至75mg/天，更優(yōu)選劑量為0.10mg/天至50mg/天。
任何所給偶聯(lián)物(再次，優(yōu)選作為藥物制劑的一部分提供)的單位劑量可以根據(jù)臨床醫(yī)生的判斷、患者的需要等等以多種給藥方案給藥。特定給藥方案是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的或可以使用常規(guī)方法實(shí)驗(yàn)確定。示范性給藥方案包括，無限制，一天給藥五次、一天四次、一天三次、一天兩次、一天一次、每周三次、每周兩次、每周一次、每月兩次、每月一次，及其任意的組合。一旦獲得臨床終點(diǎn)，就停止組合物的給藥。
本發(fā)明偶聯(lián)物給藥的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是單個(gè)水溶性聚合物部分可被裂解下來。當(dāng)由于聚合物大小，當(dāng)從體內(nèi)清除是潛在問題時(shí)，這樣的結(jié)果是有利的。最佳地，通過使用生理可裂解和/或酶可降解鍵如尿烷、酰胺、碳酸酯或含有酯的鍵，促進(jìn)每個(gè)水溶性部分裂解。以這種方式，通過選擇將提供所需清除特性的聚合物分子大小和官能團(tuán)類型，可以調(diào)節(jié)偶聯(lián)物的清除(通過單個(gè)水溶性聚合物部分的裂解)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定合適的聚合物分子大小以及可裂解官能團(tuán)。例如，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以確定合適分子大小以及可裂解官能團(tuán)，首先制備具有不同聚合物重量和可裂解官能團(tuán)的多種聚合物衍生物，然后通過將聚合物衍生物給藥于患者和采取周期性血樣和/或尿樣來獲得清除特征(例如，通過周期性血或尿取樣)。一旦獲得每個(gè)測(cè)試偶聯(lián)物的系列清除特征，可以確定合適的偶聯(lián)物。
應(yīng)該理解雖然已經(jīng)結(jié)合其優(yōu)選的特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，前述的說明以及下列的實(shí)施例意欲說明而非限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修飾對(duì)本發(fā)明涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
在此提及的所有文獻(xiàn)、書本、專利、專利申請(qǐng)，和出版物在此以其整體引入作為參考。
實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)踐將使用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)有機(jī)合成等等的常規(guī)技術(shù)，除非另外指出。這樣的技術(shù)全部描述于文獻(xiàn)中。參見，例如，J.March，Advanced Organic ChemistryReactions Mechanisms andStructure，第4版(New YorkWiley-Interscience，1992)，上文。
以下實(shí)施例中，已經(jīng)作出努力來確保涉及的所用數(shù)字(例如，量、溫度，等等)的準(zhǔn)確性，但是一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差必須說明。除非另外指出，溫度為℃，壓力是海平面大氣壓或接近海平面大氣壓。所有試劑可以購(gòu)得除非另外指出。說明書中在此和別處使用下列縮寫。
實(shí)施例1制備基于甘油的前體分子
基于甘油的前體分子(化合物8-02)將甲苯(100ml)中的順-1，3-O-苯亞甲基甘油(7.2g，0.040摩爾)(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)溶液通過蒸餾掉甲苯來共沸干燥。將干燥的化合物溶解于無水甲苯(100ml)中，并加入叔丁醇(6Oml，0.060摩爾)中的1.0M叔丁氧鉀溶液和1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三氧雜二環(huán)[2，2，2]辛烷(14.0g，0.0558摩爾)。在氬氣氛下于100℃辛烷將混合物攪拌過夜。將混合物過濾，并在減壓下蒸發(fā)掉溶劑獲得15.7g固體產(chǎn)物(化合物5-02)。NMR(d6-DMSO)0.74ppm(s，3H)，1.61ppm(m，4H)，1.88ppm(m，2H)，3.44ppm(t，2H)，3.81ppm(s，6H)，4.05ppm(m，4H)，5.55ppm(s，1H)，7.37ppm(m，5H)。
圖解表示該反應(yīng)如下 5-02的水解。將化合物5-02(15.0g)溶解于乙腈(150ml)和蒸餾水(35ml)的混合物中。接著，加入10％H3PO4溶液將pH調(diào)節(jié)至4.5。在pH＝4.5將該混合物攪拌1小時(shí)。加入NaCl(2g)并將pH調(diào)節(jié)至7.5。用CH2Cl2(600和150ml)抽提產(chǎn)物。
將提取物干燥(MgSO4)并在減壓下蒸餾掉溶劑來獲得固體產(chǎn)物(化合物6-02)。測(cè)定產(chǎn)量為14.2g。NMR(d6-DMSO)0.78ppm(s，3H)，1.79ppm(m，2H)，2.41ppm(t，2H)，3.25ppm(m，6H)，3.49ppm(t，2H)，4.05ppm(m，4H)，4.48ppm(t，3H)，5.56ppm(s，1H)，7.37ppm(m，5H)
圖解表示該反應(yīng)如下 將化合物6-02(14.2g)溶解于乙腈(80ml)和蒸餾水(80ml)的混合物中。接著，加入6％NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至12.5。在12.3-12.8pH下將溶液攪拌5.5小時(shí)，間歇加入6％NaOH溶液來維持pH。加入NaCl(5g)并用5％H3PO4將pH調(diào)節(jié)至7.5。用CH2Cl2抽提非酸性雜質(zhì)(兩次處理，第一次使用300ml，第二次使用200ml)。用H3PO4將溶液pH調(diào)節(jié)至3，用CH2Cl2抽提產(chǎn)物(兩次處理，第一次使用200ml，第二次使用100ml)。
將提取物干燥(MgSO4)并在減壓下蒸餾掉溶劑。所得到產(chǎn)物(化合物7-02)產(chǎn)量為8.7g。NMR(d6-DMSO)1.76ppm(m，2H)，2.31ppm(t，2H)，3.46ppm(t，2H)，4.05ppm(m，4H)，5.56ppm(s，1H)，7.37ppm(m，5H)。
圖解表示該反應(yīng)如下 將化合物7-02(8.0g)溶解于無水甲醇中(120ml)并在溶解后加入濃H2SO4(1.6ml)。在室溫下將溶液攪拌4小時(shí)。加入NaHCO3(8％溶液)將混合物的pH調(diào)節(jié)至7.5。用CH2Cl2抽提產(chǎn)物(兩次處理，每次使用100ml)。
將提取物干燥(MgSO4)并在減壓(0.05mmHg)60℃下蒸餾掉揮發(fā)性化合物。所得到的產(chǎn)物(化合物8-02)產(chǎn)量為4.8g。NMR(d6-DMSO)1.72ppm(m，2H)，2.37ppm(t，2H)，3.20ppm(m，1H)，3.42ppm(bm，4H)，3.49ppm(t，2H)，3.59ppm(s，3H)，4.46ppm(t，2H)。
圖解表示該反應(yīng)如下 實(shí)施例2制備“mPEG2(40K)丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯” (其中mPEG2(20K)表示具有20,000道爾頓分子量的PEG)“mPEG2(40K)丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯”激活前體分子中的羥基。將化合物8-02(2.0g，0.0208當(dāng)量)溶解于無水乙腈(50ml)中，并加入無水吡啶(2.2ml，0.272摩爾)和N，N-二琥珀酰亞胺碳酸鹽(5.86g，0.0229摩爾，DSC)。在氬氣氛下于室溫將溶液攪拌過夜。接著，將混合物過濾并蒸餾掉溶劑。將粗制產(chǎn)物溶解于CH2Cl2(50ml)中，并用5％H3PO4溶液洗滌。然后將溶液干燥(MgSO4)，并蒸餾掉溶劑。所得到的產(chǎn)物(化合物9-02)產(chǎn)量為2.8g。NMR(d6-DMSO)1.76ppm(m，2H)，2.35ppm(t，2H)，2.82ppm(s，8H)，3.56ppm(t，2H)，3.58ppm(s，3H)，3.96ppm(m，1H)，4.37ppm(m，2H)，4.52ppm(m，2H)。
圖解表示該反應(yīng)如下
將激活的前體和含有胺的水溶性聚合物偶聯(lián)。將化合物9-02(0.119g，0.00050摩爾)加入mPEG(20K)-胺(11g，0.00055摩爾)(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)、乙腈(70ml)和三乙胺(0.15ml)的混合物中。在氬氣氛下于室溫將混合物攪拌3小時(shí)。接著，在減壓下蒸餾掉溶劑。
圖解表示該反應(yīng)如下 PEG2(40K)丁酸的去保護(hù)步驟和色譜純化。將獲得的化合物10-2(在此指的是PEG2(40K)-丁酸，甲酯)溶解于150ml蒸餾水中并用5％NaOH溶液將溶液的pH調(diào)節(jié)至12.2。在12.0-12.2的pH下將溶液攪拌1.5小時(shí)。接著，加入NaCl(10g)并用5％H3PO4溶液將pH調(diào)節(jié)至2.5。用CH2Cl2處理來抽提產(chǎn)物。將提取物干燥(MgSO4)，并在減壓下蒸餾掉溶劑獲得9g固體產(chǎn)物。離子交換色譜法PEG2(40K)-丁酸85％，mPEG(20K)胺10％。通過描述于美國(guó)專利No.5,932,462中的離子交換色譜法純化產(chǎn)物，獲得了100％純產(chǎn)物。NMR(d6-DMsO)1.72ppm(q，2H)2.24ppm(t，2H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，7.19ppm(t，2H)。
圖解表示該反應(yīng)如下……
mPEG2(40K)-丁酸可以用作聚合試劑用于反應(yīng)來形成聚合物-活性劑偶聯(lián)物。此外，mPEG2(40K)-丁酸可以進(jìn)一步反應(yīng)來提供具有羧酸以外的官能團(tuán)的聚合試劑。例如，如下所述制備mPEG2(40K)-丁酸相應(yīng)的N-羥基琥珀酰亞胺酯以及醛、馬來酰亞胺，和硫醇衍生物。
制備mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯 將mPEG2(40K)-丁酸(9.0g，0.000225摩爾)(上述制得的)溶解于無水二氯甲烷(70ml)中，并加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.0285g，0.000248摩爾)和l，3-雙環(huán)carboimide(0.0510g，0.000247摩爾)。在氬氣氛下于室溫將混合物攪拌過夜。接著，在減壓下蒸發(fā)掉部分溶劑并在室溫用異丙醇沉淀產(chǎn)物并在真空下干燥獲得8.6g白色粉末。NMR(d6-DMSO)1.81ppm(q，2H)2.70ppm(t，2H)，2.81ppm(s，4H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG backbone)，3.99ppm(m，4H)，7.22ppm(t，2H)。
實(shí)施例3制備“mPEG2(40K)-丁醛”制備四(乙二醇)單丁醛，二乙基乙縮醛HO-(CH2CH2O)4CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2通過減壓下蒸餾掉(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)甲苯共沸干燥四(乙二醇)(97.1g，0.500摩爾)和甲苯(200ml)混合物。將干燥的四(乙二醇)溶解于無水甲苯中(180ml)，并加入1.0M叔丁氧鉀的叔丁醇(120.0ml，0.120摩爾)溶液和4-氯丁醛二乙基乙縮醛(18.1g，0.100摩爾)(Alfa Aesar，Ward Hill，MA)。在氬氣氛下于95-100℃將混合物攪拌過夜。冷卻至室溫后，將混合物過濾并在減壓下蒸餾掉溶劑。將粗制產(chǎn)物溶解于1000ml去離子水中并通過活性炭過濾所得到的溶液。加入氯化鈉(100g)并用二氯甲烷(250，200和150ml)提取產(chǎn)物。將提取物干燥(通過MgSO4)并在減壓下蒸餾掉溶劑(通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)。
將粗制產(chǎn)品溶解于300ml 10％磷酸鹽緩沖液中(pH＝7.5)并用乙酸乙酯(2×50ml)抽提雜質(zhì)。用二氯甲烷(200，150和100ml)抽提所得到產(chǎn)物。將提取物干燥(通過MgSO4)并在減壓下蒸餾掉溶劑(通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)。產(chǎn)量2O.3g。NMR(d6-DMSO)1.10ppm(t，CH3-C-)1.51ppm(m，C-CH2-CH2-)，3.49ppm(bm，-OCH2CH2O-)，4.46ppm(t，-CH，乙縮醛)，4.58ppm(t，-OH)。純度～100％(無未反應(yīng)原料的信號(hào))制備四(乙二醇)-α-甲磺酸鹽-ω-丁醛，二乙基乙縮醛CH3-S(O)2-O-(CH2CH2O)4CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2在減壓下通過蒸餾掉甲苯(通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀)來共沸干燥四(乙二醇)單丁醛，二乙基乙縮醛(12.5g，0.037摩爾)和甲苯(120ml)混合物。將干燥四(乙二醇)單丁醛，二乙基乙縮醛溶解于無水甲苯(100ml)中。將20ml無水二氯甲烷和5.7ml三乙胺(0.041摩爾)加入溶液中。然后逐滴加入4.5g甲磺酰氯化物(0.039摩爾)。在氮?dú)夥障掠谑覝貙⑷芤簲嚢柽^夜。接著加入碳酸鈉(5g)，并將混合物攪拌1小時(shí)。然后過濾溶液并在減壓下蒸餾掉溶劑(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀)。
NMR(d6-DMSO)1.10ppm(t，CH3-C-)1.51ppm(m，C-CH2-CH2-)，3.17ppm(s，CH3-甲磺酸鹽)，3.49ppm(bm，-OCH2CH2O-)，4.30ppm(m，-CH2-甲磺酸鹽)，4.46ppm(t，-CH，乙縮醛)。純度～100％。
四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基乙縮醛H2N-(CH2CH2O)4CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2將四(乙二醇)-α-甲磺酸鹽-ω-丁醛，二乙基乙縮醛(14.0g)、濃氫氧化銨(650ml)，和乙醇(60ml)的混合物在室溫下攪拌42小時(shí)。接著，在減壓下蒸餾掉所有揮發(fā)性物質(zhì)。將粗制產(chǎn)物溶解于150ml去離子水中并用1.0M NaOH將溶液的pH調(diào)節(jié)至12。用二氯甲烷(3×100ml)抽提產(chǎn)物。將提取物干燥(MgSO4)并在減壓下蒸餾掉溶劑(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀)。產(chǎn)量10.6g。NMR(D2O)1.09ppm(t，CH3-C-)1.56ppm(m，C-CH2-CH2-)，2.69ppm(t，CH2-N)，3.56ppm(bm，-OCH2CH2O-)，4.56ppm(m，-CH，乙縮醛)。純度～100％。
支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基乙縮醛 將四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基乙縮醛(0.050g，0.000148摩爾)和三乙胺(0.035ml)加入mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(實(shí)施例2)(5.0g，0.000125摩爾)的二氯甲烷溶液中(100ml)，并在氬氣氛下于室溫將反應(yīng)混合物攪拌過夜。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸發(fā)至干。將粗制產(chǎn)物溶解于二氯甲烷中并用異丙醇沉淀。在減壓下干燥濕產(chǎn)物。產(chǎn)量4.8g。NMR(d6-DMSO)1.10ppm(t，6H)，1.51ppm(m，4H)，1.67ppm(m，2H)，2.12ppm(t，2H)，3.12ppm(q，4H)，3.24ppm(s，3H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，4.46ppm(t，1H，乙縮醛).7.22ppm(t，2H)，7.82ppm(t，1H)。
取代度～100％。
支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛
將支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基乙縮醛(4.8g)溶解于100ml水中并用稀釋的磷酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至3。在室溫下將溶液攪拌3小時(shí)，接著加入足夠?qū)⑷芤簆H調(diào)節(jié)至約7的0.5M氫氧化鈉。將產(chǎn)物(支化mPEG2(40.3KDa)-丁醛)用二氯甲烷抽提，用無水硫酸鎂干燥提取物。并在減壓下蒸餾掉溶劑。產(chǎn)量4.2g。NMR(d6-DMSO)1.67ppm(m，2H)，1.76ppm(p，-CH2-CH2-CHO-，2H)，2.11ppm(t，2H)，2.44ppm(dt，-CH2-CHO)，3.24ppm(s，-OCH3，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)3.99ppm(m，4H)，7.24ppm(t，2H)，7.83ppm(t，1H)，9.66ppm(t，-CHO)。取代度～100％。
實(shí)施例4制備“mPEG2(40K)-馬來酰亞胺” 將N-(3-馬來酰亞胺丙酰胺基)亞乙基二酰胺以三氟乙酸鹽(0.042g，0.000129摩爾)的形式和三乙胺(0.050ml)加入mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(實(shí)施例2)(5.0g，0.000125摩爾)的無水乙腈(100ml)溶液中，并在氬氣氛下于室溫將混合物攪拌過夜。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸發(fā)至干。將粗制產(chǎn)品溶解于小量二氯甲烷中，并用異丙醇沉淀。在減壓下干燥濕產(chǎn)物。產(chǎn)量4,7g。NMR(d6-DMSO)1.69ppm(m，2H)，2.09ppm(t，2H)2.31ppm(t，2H)，3.03ppm(q，4H)，3.12ppm(q，4H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，7.00ppm(s，2H，馬來酰亞胺)，7.21ppm(t，2H)，7.75ppm(t，1H)，7.96ppm(t，1H)。
實(shí)施例5制備“mPEG2(40K)-硫醇” 將胱氨二鹽酸(0.0142g，0.000126當(dāng)量)和三乙胺(0.040ml)加入mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(實(shí)施例2)(5.0g，0.000125摩爾)的二氯甲烷(50ml)溶液中，并在氬氣氛下于室溫將混合物攪拌過夜。接著加入二硫蘇糖醇(0.054g，0.000350摩爾)和三乙胺(0.25ml)，并在氬氣氛下于室溫將混合物攪拌3小時(shí)。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸發(fā)至干。將粗制產(chǎn)品溶解于小量二氯甲烷中，并用異丙醇沉淀。在減壓下干燥濕產(chǎn)物。產(chǎn)量4.8g。NMR(CDCl3)1.68ppm(m，-SH，1H)，1.35ppm(t，2H)，2.65ppm(q，-CH2SH，2H)，3.15ppm(q，6H)，3.36ppm(s，6H)，3.65ppm(s，PEG骨架)，4.15ppm(m，4H)。
取代度～100％。
實(shí)施例6制備具有季戊四醇銜接物的“mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯”制備化合物1-04
化合物1-04通過在減壓下蒸餾掉甲苯來共沸干燥季戊四醇乙氧基化物(15/4EO/OH，Mn＝797，sigma-Aldrich)(100g，0.125摩爾)和甲苯(200ml)的混合物。將干燥的季戊四醇乙氧基化物溶解于無水甲苯中(150ml)，并加入1.0M叔丁氧鉀的叔丁醇(30ml，0.03摩爾)溶液和1-(3-溴丙基)-4-甲基-2，6，7-三氧雜二環(huán)[2，2，2]辛烷(6.3g，0.025摩爾)。接著，在氬氣氛于80-85℃攪拌混合物。冷卻至室溫后，將混合物過濾并在減壓下蒸餾掉溶劑。將粗制產(chǎn)品溶解于800ml去離子水中。用5％磷酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至2并在室溫下將溶液攪拌15分鐘。接著用1M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至12并將溶液攪拌2小時(shí)，通過定期添加1M氫氧化鈉來保持pH在12。加入氯化鈉(40g)并用二氯甲烷抽提未反應(yīng)的季戊四醇乙氧基化物。接著用5％磷酸將pH調(diào)節(jié)至3并用二氯甲烷抽提產(chǎn)物。用無水硫酸鎂干燥提取物并在減壓下蒸餾掉溶劑。產(chǎn)量15g。NMR(d6-DMSO)1.72ppm(q，2H)2.24ppm(t，2H)，3.51ppm(s，60H)，4.57ppm(t，3H)。
制備化合物2-04
化合物2-04將化合物1-04(15g，0.017摩爾)溶解于無水甲醇中(300ml)并加入濃硫酸(4ml)。將溶液在室溫下攪拌4小時(shí)。加入NaHCO3(8％溶液)將混合物的pH調(diào)節(jié)至7.5。用CH2Cl2抽提產(chǎn)物。將提取物干燥(MgSO4)并在減壓下蒸餾掉揮發(fā)性化合物。產(chǎn)量13.5g。NMR(d6-DMSO)1.72ppm(q，2H)2.37ppm(t，2H)，3.51ppm(s，60H)，4.57ppm(t，3H)。
制備化合物3-04 化合物3-04將化合物2-04(13.5g，0.0444當(dāng)量)溶解于無水乙腈(100ml)中，并加入無水吡啶(4.4ml，0.544摩爾)和N，N-二琥珀酰亞胺碳酸鹽(12.40g，0.0484摩爾)。在氬氣氛下將溶液在室溫下攪拌過夜。接著，將混合物過濾并將溶劑蒸餾掉。將粗制產(chǎn)品溶解于CH2Cl2(200ml)并用5％H3PO4溶液洗滌。然后將溶液干燥(MgSO4)并將溶劑蒸餾掉。產(chǎn)量16.5g.NMR(d6-DMSO)1.72ppm(m，2H)，2.37ppm(t，2H)，2.82ppm(s，12H)，3.50ppm(s，48H)，3.70ppm(m，6H)，4.45(m，6H)。
制備化合物4-04，(PEG3(60K)-丁酸，甲酯)。將化合物3-04(0.259g，0.00060當(dāng)量)加入mPEG(20K)胺(15g，0.00075摩爾)(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)、乙腈(70ml)和三乙胺(0.15ml)的混合物中。在氬氣氛下將混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。接著，在減壓下蒸餾掉溶劑。
PEG3(60K)-丁酸的去保護(hù)步驟和色譜純化。將化合物4-04(在此稱作“PEG3(60K)-丁酸，甲酯”)溶解于150ml去離子水中并用5％NaOH溶液將溶液的pH調(diào)節(jié)至12.2。在12.0-12.2的pH下將溶液攪拌1.5小時(shí)。接著加入NaCl(10g)并用5％H3PO4溶液將pH調(diào)節(jié)至2.5。用CH2Cl2處理來抽提產(chǎn)物。將提取物干燥(MgSO4)，并在減壓下蒸餾掉溶劑獲得13.8g固體產(chǎn)物。離子交換色譜法PEG3(60K)-丁酸82％，M-PEG(20K)-胺18％。通過描述于美國(guó)專利No.5,932,462的離子交換色譜法將產(chǎn)物純化，獲得100％純產(chǎn)物。NMR(d6-DMSO)1.72ppm(q，2H)2.24ppm(t，2H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，6H)，7.19ppm(t，3H)。
制備PEG3(60K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯。將獲得的mPEG3(60K)-丁酸(前-步驟)(9.0g，0.000225摩爾)溶解于無水二氯甲烷(70ml)中，并加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.0285g，0.000248摩爾)和1，3-雙環(huán)碳化二亞胺(0.0510g，0.000247摩爾)。在氬氣氛下于室溫將混合物攪拌過夜。接著，在減壓下蒸餾掉部分溶劑，用異丙醇在室溫下沉淀產(chǎn)物并在真空下干燥獲得8.6g白色粉末。NMR(d6-DMSO)1.81ppm(q，2H)2.70ppm(t，2H)，2.81ppm(s，4H)，3.24ppm(s，6H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.99ppm(m，4H)，7.22ppm(t，2H)。
實(shí)施例7
制備單官能mPEG制備含有單個(gè)水溶性聚合物的本發(fā)明聚合物。按照實(shí)施例2的方法，除了用3-羥基-丙酸，甲酯替代了化合物8-02。
3-羥基-丙酸，甲酯發(fā)現(xiàn)所得到的化合物(“mPEG-丙酸，甲酯”)具有以下結(jié)構(gòu) mPEG(20K)-丙酸，甲酯mPEG(20K)-丙酸，甲酯可以提供相應(yīng)的羧酸。例如，可將甲酯溶解于蒸餾水中并使用NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至12。此后，加入鹽如氯化鈉，然后使用合適的酸將pH調(diào)節(jié)至約3?？捎枚燃淄樘幚沓樘嵯鄳?yīng)的羧酸(mPEG(20K)-丙酸)、干燥，并蒸餾掉任何殘余的溶劑。
mPEG(20K)-丙酸可以用作聚合試劑來反應(yīng)形成聚合物-活性劑偶聯(lián)物。此外，mPEG(20K)-丙酸可以進(jìn)一步反應(yīng)來提供具有羧酸以外的官能團(tuán)的聚合試劑。例如，使用之前所述的技術(shù)，可以制得mPEG(20K)丙酸相應(yīng)的N-羥基琥珀酰亞胺酯(參見實(shí)施例2)、醛(參見實(shí)施例3)、馬來酰亞胺(參見實(shí)施例4)，以及硫醇(參見實(shí)施例5)衍生物。
實(shí)施例8制備同型雙官能PEG制備含有單個(gè)水溶性聚合物部分的本發(fā)明同型雙官能聚合物。按照實(shí)施例7的方法，除了用胺-PEG(20K)-胺替代了mPEG(20K)-胺。發(fā)現(xiàn)所得到的化合物具有以下結(jié)構(gòu)
mPEG(20K)-丙酸甲酯(雙功能聚合物)mPEG(20K)-丙酸，甲酯可以提供相應(yīng)的二羧酸。例如，將mPEG(20K)-丙酸，甲酯溶解于蒸餾水中并使用NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至12。此后，加入鹽如氯化鈉，然后使用合適的酸將pH調(diào)節(jié)至約3。用二氯甲烷處理抽提相應(yīng)的二羧酸(mPEG(20K)-二丙酸)、干燥，并蒸餾掉任何殘余的溶劑。
mPEG(20K)-二丙酸可以用作聚合試劑來反應(yīng)形成聚合物-活性劑偶聯(lián)物(含有兩個(gè)活性劑)。此外，mPEG(20K)-丙酸可以進(jìn)一步反應(yīng)來提供具有羧酸以外的官能團(tuán)的聚合試劑。例如，使用之前所述的技術(shù)，可以制得mPEG(20K)-丙酸相應(yīng)的二N-羥基琥珀酰亞胺酯(參見實(shí)施例2)、二醛(參見實(shí)施例3)、二馬來酰亞胺(參見實(shí)施例4)，以及二硫醇(參見實(shí)施例5)衍生物。
實(shí)施例9偶聯(lián)將具有巰基選擇性反應(yīng)基的mPEG2(40K)-馬來酰亞胺(實(shí)施例4)和SEQ.ID.NOS.1-349中提供的每個(gè)多肽序列反應(yīng)。
其中上述結(jié)構(gòu)中(m)為約454和/或每個(gè)水溶性聚合物的分子量為約20,000道爾頓，因此提供了具有約40,000道爾頓分子量的試劑。
就缺少巰基的任何特定多肽(例如缺少蛋氨酸和半胱氨酸殘基的多肽)而言，可以使用常規(guī)合成技術(shù)將蛋氨酸或半胱氨酸殘基加至多肽。參見，例如，WO90/12874。
對(duì)于每個(gè)多肽，將過量的聚合物加入含有多肽的反應(yīng)容器中。反應(yīng)條件包括室溫下約7至約8的pH。約5小時(shí)后，產(chǎn)生了多肽和聚合物的偶聯(lián)物。
實(shí)施例10多臂聚合物如下制得含有至少一個(gè)反應(yīng)基的多臂聚合物。
將三當(dāng)量的碳酸二-(2，5-二氧代-吡咯烷-1基)酯和三乙胺中的甲基-D-葡糖吡喃糖苷結(jié)合來產(chǎn)生第一個(gè)中間產(chǎn)物，如下所示 然后將第一個(gè)中間產(chǎn)物在三乙胺存在下暴露于輕微過量的mPEG(10K)-胺來產(chǎn)生第二個(gè)中間產(chǎn)物，如下所示
然后將第二個(gè)中間產(chǎn)物進(jìn)行酸催化的水解來產(chǎn)生醛和半縮醛形式，如下所示。
醛由三個(gè)，10K PEGs構(gòu)成，因此提供總體為30K的支化結(jié)構(gòu)。任意地依次將醛通過酸(例如，當(dāng)醛暴露于溫和的氧化條件下時(shí)形成的羧酸)轉(zhuǎn)化成其它衍生物。
該方法可以用來提供兩個(gè)臂以及四個(gè)臂。
任何所給方法過程中，可以制得物質(zhì)的混合物(例如，雙重取代的和一些四重取代的)。此外，任何聚合物的位置異構(gòu)體也是可能的。
實(shí)施例11制備聚合物-EPO偶聯(lián)物-隨機(jī)PEG化的EPO將重組促紅細(xì)胞生成素，“EPO”(由大腸桿菌(E.coli)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源產(chǎn)生的)和支化mPEG2(40KDa)丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將EPO(～2mg)溶解于1ml 50mM磷酸鹽緩沖液中(pH7.6)并以5倍EPO摩爾濃度加入支化mPEG2(40KDa)-丁醛。加入還原劑NaCNBH3，并將溶液在室溫下攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將支化mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物來確定偶聯(lián)的程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。增大PEG對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了偶聯(lián)的程度。
上述證明了本發(fā)明說明性蛋白質(zhì)的隨機(jī)PEG化產(chǎn)生了PEG化EPO產(chǎn)品的分布。如果需要，如下所述可以進(jìn)一步分離反應(yīng)混合物來分離單個(gè)的異構(gòu)體。
通過凝膠過濾色譜法分離具有不同分子量的PEG偶聯(lián)物。基于其不同的分子量(這種情況下，偏離約為40,000道爾頓)將不同PEG偶聯(lián)物分級(jí)分離。特別地，使用適于觀察到的分子量范圍內(nèi)的產(chǎn)物有效分離的連續(xù)柱系統(tǒng)來進(jìn)行分離，例如，SuperdexTM200柱(AmershamBiosciences)。用10ml醋酸鹽緩沖液以1.5ml/分鐘的流速洗脫產(chǎn)物。通過280nm處的OD分析收集級(jí)分(1ml)的蛋白質(zhì)含量，還使用碘測(cè)試來分析PEG含量(Sims等(1980)Anal.Biochem.10760-63)。此外，通過運(yùn)行SDS PAGE膠可以呈現(xiàn)結(jié)果，隨后用碘化鋇染色。收集對(duì)應(yīng)于洗脫峰的級(jí)分，使用膜超濾濃縮，并凍干。該方法使得具有相同分子量的偶聯(lián)物分離/純化，但不提供具有相同分子量但PEG化位點(diǎn)不同的偶聯(lián)物(即，位置異構(gòu)體)的分離。
通過反相色譜法使用RP-HPLC C18柱(Amersham Biosciences或Vydac)進(jìn)行位置異構(gòu)體的分離。該方法有效分離具有相同分子量的PEG-生物分子異構(gòu)體(位置異構(gòu)體)。使用RP-HPLC C18制備柱進(jìn)行反相色譜法并用水/0.05％TFA(洗脫液A)和乙腈/0.05％TFA(洗脫液B)梯度洗脫。
收集對(duì)應(yīng)于洗脫峰的級(jí)分，蒸發(fā)除去乙腈和TFA，接著除去溶劑并分離單個(gè)位置PEG異構(gòu)體。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成EPO偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例12制備聚合物-EPO偶聯(lián)物-N-末端PEG化EPO將重組促紅細(xì)胞生成素，“EPO”(由大腸桿菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源產(chǎn)生的)和支化mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將EPO(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍EPO摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃下攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物來測(cè)定偶聯(lián)程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)來除去游離的EPO和更高分子量物質(zhì)。
通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大PEG對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了偶聯(lián)的程度，產(chǎn)生了聚偶聯(lián)的蛋白質(zhì)。
上述證實(shí)本發(fā)明說明性蛋白質(zhì)PEG化以產(chǎn)生主要是N-末端單個(gè)PEG化的蛋白質(zhì)。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成EPO偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例13GCSF的N端PEG化將重組粒細(xì)胞集落刺激因子，“GCSF”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將GCSF(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH)并以5倍GCSF摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)丁醛。加入還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃下攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物來測(cè)定偶聯(lián)程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)GCSF的混合物。通過柱色譜純化單偶聯(lián)的物質(zhì)來除去游離GCSF和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大PEG對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了產(chǎn)生聚偶聯(lián)蛋白質(zhì)的偶的程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成GCSF偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例14干擾素α的N-端PEG化將重組粒干擾素α，“IFN-α”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將IFN-α(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍IFN-α摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE分析反應(yīng)混合物來測(cè)定偶聯(lián)程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)并除來游離干擾素-α和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大PEG對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了產(chǎn)生聚偶聯(lián)IFN-α的偶聯(lián)程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成IFN-α偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例15人生長(zhǎng)激素的N-端PEG化將重組人生長(zhǎng)激素，“hGH”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將hGH(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍hGH摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩爾的過量還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法分析反應(yīng)的進(jìn)程來測(cè)定偶聯(lián)程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)以及其它物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)來除去游離hGH和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大mPEG2(40KDa)-丁醛對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了產(chǎn)生聚偶聯(lián)hGH群的偶聯(lián)程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成hGH偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例16干擾素β的N-端PEG化將重組干擾素-β，“IFN-β”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將IFN-β(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍IFN-β摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法分析反應(yīng)進(jìn)程來測(cè)定偶聯(lián)程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)來除去游離IFN-β和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大mPEG2(40KDa)-丁醛對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了產(chǎn)生聚偶聯(lián)IFN-β群的偶聯(lián)程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成IFN-β偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例17
FSH的N-端PEG化將重組促卵泡激素，“FSH”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將FSH(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍FSH摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法分析反應(yīng)進(jìn)程來測(cè)定偶聯(lián)的程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)來除去游離FSH和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大mPEG2(40KDa)-丁醛對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了產(chǎn)生聚偶聯(lián)FSH群的偶聯(lián)程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成FSH偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例18因子VIII的N-端PEG化將重組因子VIII，“F8”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將F8(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍F8摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法分析反應(yīng)進(jìn)程來測(cè)定偶聯(lián)程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)來除去游離F8和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大mPEG2(40KDa)-丁醛對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了產(chǎn)生聚偶聯(lián)F8群的偶聯(lián)程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成F8偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例19B-結(jié)構(gòu)域缺失因子VIII的N-端PEG化將重組B-結(jié)構(gòu)域缺失因子VIII，“BDD F8”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將BDD F8(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉緩沖液中(pH5)并以5倍BDD F8摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩爾過量的還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法分析反應(yīng)混合物來測(cè)定偶聯(lián)的程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)并除去游離BDD F8和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大mPEG2(40KDa)-丁醛對(duì)蛋白質(zhì)的比例能增加產(chǎn)生聚偶聯(lián)BDD F8群的偶聯(lián)程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明的聚合試劑用于形成BDD F8偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例20使用mPEG2(40K)丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯的因子VIII的PEG化將重組因子VIII，“F8”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(如實(shí)施例2所述制得的)偶聯(lián)。
將F8溶解于水液體中，以一至十倍F8的摩爾濃度加入mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯來形成反應(yīng)溶液。將反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約8至9.5，并將溫度維持于室溫。將反應(yīng)溶液攪拌數(shù)小時(shí)使聚合試劑通過胺鍵和F8偶聯(lián)。通過測(cè)試反應(yīng)溶液，測(cè)定偶聯(lián)在N-端和賴氨酸位點(diǎn)都發(fā)生了偶聯(lián)。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成F8偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例21使用mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯的B結(jié)構(gòu)域缺失因子VIII的PEG化將重組B結(jié)構(gòu)域缺失因子VIII，“BDD F8”(在大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或另一來源中產(chǎn)生的)和mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(如實(shí)施例2所述制得的)偶聯(lián)。
將BDD F8溶解于水液體中，以一倍至十倍BDD F8的摩爾濃度加入mPEG2(40K)-丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯來形成反應(yīng)溶液。將反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約8至9.5，并將溫度維持于室溫。將反應(yīng)溶液攪拌數(shù)小時(shí)使聚合試劑通過胺鍵和BDD F8偶聯(lián)。通過測(cè)試反應(yīng)溶液，測(cè)定偶聯(lián)在N-端和賴氨酸位點(diǎn)都發(fā)生了偶聯(lián)。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成BDD F8偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例22去氨加壓素的N-端PEG化將去氨加壓素和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將去氨加壓素(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍BDD F8的摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩爾的過量還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法分析反應(yīng)進(jìn)程來測(cè)定偶聯(lián)程度。通過基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法進(jìn)行偶聯(lián)程度的證實(shí)。天然和單偶聯(lián)物質(zhì)顯示的峰值相差約40,000道爾頓。所得到的反應(yīng)混合物主要含有天然和單偶聯(lián)蛋白質(zhì)的混合物。通過柱色譜法純化單偶聯(lián)的物質(zhì)來除去游離去氨加壓素和更高分子量物質(zhì)。通過肽作圖進(jìn)行N-末端PEG化的證實(shí)。增大mPEG2(40KDa)-丁醛對(duì)蛋白質(zhì)的比例增加了產(chǎn)生聚偶聯(lián)去氨加壓素群的偶聯(lián)程度。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用于形成去氨加壓素偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例23使用mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯的去氨加壓素的PEG化將去氨加壓素和mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(如實(shí)施例2所述制得的)偶聯(lián)。
將去氨加壓素溶解于水液體中，以一至十倍去氨加壓素的摩爾濃度加入mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯來形成反應(yīng)溶液。將反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約8至9.5，并將溫度維持于室溫。將反應(yīng)溶液攪拌數(shù)小時(shí)使聚合試劑通過胺鍵和去氨加壓素偶聯(lián)。通過測(cè)試反應(yīng)溶液，測(cè)定已經(jīng)發(fā)生了偶聯(lián)。
實(shí)施例24amdoxivir(DAPD)的PEG化將amdoxivir(DAPD)和mPEG2(40KDa)-丁醛(如實(shí)施例3所述制得的)偶聯(lián)。
將amdoxivir(～2mg)溶解于1ml 0.1mM醋酸鈉中(pH5)并以5倍amdoxivir的摩爾濃度加入mPEG2(40KDa)-丁醛。加入5至20倍摩爾的過量還原劑NaCNBH3，并將溶液在4℃攪拌24小時(shí)來通過胺鍵將mPEG2(40KDa)-丁醛試劑和蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
通過SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法分析反應(yīng)進(jìn)程。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用來形成amdoxivir偶聯(lián)物的能力。
實(shí)施例25使用mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯的amdoxivir(DAPD)的PEG化將amdoxivir和mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(如實(shí)施例2所述制得的)偶聯(lián)。
將amdoxivir溶解于水液體中，以一至十倍amdoxivir的摩爾濃度加入mPEG2(40K)-丁酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯來形成反應(yīng)溶液。將反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約8至9.5，并將溫度維持于室溫。將反應(yīng)溶液攪拌數(shù)小時(shí)使聚合試劑通過胺鍵和amdoxivir偶聯(lián)。通過測(cè)試反應(yīng)溶液，測(cè)定已經(jīng)發(fā)生了偶聯(lián)。
該實(shí)施例證明了本發(fā)明聚合試劑用來形成amdoxivir偶聯(lián)物的能力。
權(quán)利要求
1.聚合試劑，它含有位于水溶性聚合物和反應(yīng)基之間的 部分，其中(i) 部分中的氮原子和所述水溶性聚合物鄰接，(ii) 部的羰基碳原子和所述反應(yīng)基接近；和(iii)R1是H或有機(jī)基。
2.權(quán)利要求1的聚合試劑，其中R1是H。
3.權(quán)利要求2的聚合試劑，其中R1是有機(jī)基，選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。
4.權(quán)利要求2的聚合試劑，其中R1選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基，和哌啶酮基。
5.權(quán)利要求1的聚合試劑，其中所述水溶性聚合物部分是選自聚(烯化氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰嗎啉)，和聚(氧乙烯化多元醇)的聚合物。
6.權(quán)利要求1的聚合試劑，其中所述水溶性聚合物部分是聚(烯化氧)。
7.權(quán)利要求6的聚合試劑，其中聚(烯化氧)是聚(乙二醇)。
8.權(quán)利要求7的聚合試劑，其中聚(乙二醇)被用選自羥基和烷氧基的封端部分末端封端。
9.權(quán)利要求7的聚合試劑，其中聚(乙二醇)被用甲氧基末端封端。
10.權(quán)利要求8的聚合試劑，其中聚(乙二醇)具有約100道爾頓至約100,000道爾頓的分子量。
11.權(quán)利要求10的聚合試劑，其中聚(乙二醇)具有約1,000道爾頓至約60,000道爾頓的分子量。
12.權(quán)利要求13的聚合試劑，其中聚(乙二醇)具有約2,000道爾頓至約50,000道爾頓的標(biāo)稱平均分子質(zhì)量。
13.權(quán)利要求1的聚合試劑，其中所述水溶性聚合物是同型聚合物。
14.權(quán)利要求1的聚合試劑，其中 部分的氮原子通過直接共價(jià)鍵和所述水溶性聚合物連接。
15.權(quán)利要求1的聚合試劑，其中 部分的氮原子通過第一個(gè)間隔部分和水溶性聚合物連接。
16.權(quán)利要求1的聚合試劑，其中所述反應(yīng)基選自羥基、酯、酯、原酸酯、碳酸酯、碳酸酯、乙縮醛、醛、醛水合物、酮、乙烯酮、酮水合物、硫酮、單硫代水合物、二硫代水合物、半酮縮醇、單酮縮硫醇半酮縮醇、二硫代半酮縮醇、酮縮醇、二硫代酮縮醇、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、砜、胺、酰肼、硫醇、二硫化物、硫醇水合物、羧酸、異氰酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺、苯并三唑、乙烯砜、氯乙基砜、二硫代吡啶、乙烯吡啶、碘乙酰胺、環(huán)氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、硫代磺酸鹽、tresylate、硅烷、-(CH2)rCO2H、-(CH2)r′CO2NS、-(CH2)r′CO2Bt、-(CH2)rCH(OR)2、-(CH2)rCHO、-(CH2)2-NH2、-(CH2)rM、-(CH2)r-S-SO2-R，其中r是1-5，r’是0-5，R是芳基或烷基，NS是N-琥珀酰亞胺基，Bt是1-苯并三唑基，和M是N-馬來酰亞胺基，以及前述的任何受保護(hù)和激活形式。
17.權(quán)利要求1的聚合試劑，它包含結(jié)構(gòu) (式II)其中POLY1是水溶性聚合物；(a)是0，1，2或3；(b)是0，1，2或3；R1是H或有機(jī)基；X1，存在時(shí)，是第一個(gè)間隔部分；X2，存在時(shí)，是第二個(gè)間隔部分；和Z是反應(yīng)基。
18.權(quán)利要求1的聚合試劑，它包含結(jié)構(gòu) (式III)其中POLY1是水溶性聚合物；POLY2是水溶性聚合物；(a)是0，1，2或3；(b)是0，1，2或3；(e)是0，1，2或3；(f)是0，1，2或3；(g)是0，1，2或3；(h)是0，1，2或3；(j)是0至20；每個(gè)R1獨(dú)立地是H或選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基的有機(jī)基；X1，存在時(shí)，是第一個(gè)間隔部分；X2，存在時(shí)，是第二個(gè)間隔部分；X5，存在時(shí)，是第五個(gè)間隔部分；X6，存在時(shí)，是第六個(gè)間隔部分；X7，存在時(shí)，是第七個(gè)間隔部分；X8，存在時(shí)，是第八個(gè)間隔部分；R5是分支部分；和Z是反應(yīng)基。
19.權(quán)利要求18的聚合試劑，其中R5選自…… 和 其中(p)是1-8，(q)是1-8。其中POLY1、X、(a)、(c)、Q和Z如上定義。根據(jù)權(quán)利要求18的聚合試劑，它含有結(jié)構(gòu)…… (式IIb)其中(m)是2至4000，(f)是0至6，(n)是0至20。根據(jù)權(quán)利要求20的聚合試劑，其中(f)是2至4，(n)是0至4。根據(jù)權(quán)利要求1的聚合試劑，它含有選自以下的結(jié)構(gòu) 和 其中每個(gè)(m)是2至4000。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的聚合試劑，它含有選自以下的結(jié)構(gòu) 其中每個(gè)(m)是2至4000。
24.權(quán)利要求1的聚合試劑，它含有選自以下的結(jié)構(gòu)
25.權(quán)利要求1的聚合試劑，它含有選自以下的結(jié)構(gòu) 和 其中每個(gè)(m)是2至4000，每個(gè)(n)是0至20。
26.制備聚合試劑的方法，該方法包括步驟(i)提供任意由受保護(hù)反應(yīng)基和一個(gè)或多個(gè)羥基構(gòu)成的前體分子；(ii)激活所述前體分子一個(gè)或多個(gè)羥基中的至少一個(gè)來和氨基反應(yīng)形成激活的前體分子；(iii)在共價(jià)偶聯(lián)的條件下將一個(gè)或多個(gè)激活羥基中的至少一個(gè)和具有氨基的水溶性聚合物接觸，因此形成由水溶性聚合物部分和受保護(hù)反應(yīng)基構(gòu)成的聚合物；和(iv)當(dāng)受保護(hù)反應(yīng)基存在時(shí)，將它去保護(hù)，因此形成聚合試劑。
27.權(quán)利要求26的方法，它還包括分離所述聚合試劑的步驟。
28.權(quán)利要求27的方法，其中通過進(jìn)行色譜法來進(jìn)行所述分離步驟。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述受保護(hù)前體分子含有一個(gè)羥基或其受保護(hù)形式。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述受保護(hù)前體分子含有兩個(gè)羥基或其受保護(hù)形式。
31.權(quán)利要求26的方法，其中所述受保護(hù)前體分子含有三個(gè)羥基或其受保護(hù)形式。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所述受保護(hù)前體分子具有下列結(jié)構(gòu) 其中PG是保護(hù)基。
33.權(quán)利要求26的方法，其中所述受保護(hù)前體包括選自甲基、乙基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫甲基(MTM)、四氫吡喃基(THP)、芐氧甲基、苯甲酰甲基、N-苯二甲酰亞氨基甲基、2，2，2-三氯乙基、2-鹵代乙基、2-(對(duì)-甲苯磺酰)乙基、叔丁基、肉桂基、苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、二(鄰-硝基苯基)甲基、9-蒽甲基、2-(9，10-二氧代)蒽甲基、胡椒基、三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基的保護(hù)基。
34.權(quán)利要求26的方法，其中所述激活劑是二(N-琥珀酰亞胺基)碳酸鹽(DSC)、N，N′-雙環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳化二亞胺、N-(3-二甲基氨丙基)-N’乙基碳化二亞胺、1，1′-羰二咪唑(CDI)、1，1′-羰基(1，2，4-三唑)(CDT)、二(4-硝基苯基)碳酸鹽、對(duì)硝基苯基氯碳酸鹽、光氣、三光氣、1-羥基苯并三唑(HOBt)、二苯并三唑碳酸鹽((diBTC)、N-羥基琥珀酰亞胺和DCC、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺和DCC，以及四氫噻唑硫酮。
35.權(quán)利要求26的方法，其中所述含有氨基的水溶性聚合物選自 和 其中(m)是2至4000。
36.權(quán)利要求26的方法，其中所述去保護(hù)步驟包括選自堿促進(jìn)的水解、酸催化的水解和還原的方法。
37.權(quán)利要求26的方法，它包括將所述反應(yīng)基轉(zhuǎn)化成不同反應(yīng)基的任意步驟。
38.權(quán)利要求26的方法，它包括進(jìn)行增加所述反應(yīng)基反應(yīng)性的步驟的任意步驟。
39.偶聯(lián)物，它包含水溶性聚合物、 部分，和藥理學(xué)活性劑，其中(i)通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分，所述水溶性聚合物和 部分的氮原子連接；(ii)通過直接共價(jià)鍵或通過第二個(gè)間隔部分，所述藥理學(xué)活性劑和 部分的羰基碳原子連接；和(iii)R1是H或有機(jī)基。
40.制備偶聯(lián)物的方法，該方法包括在合適條件下將根據(jù)權(quán)利要求1的聚合試劑和活性劑接觸因此提供藥物偶聯(lián)物的步驟。
41.藥物制劑，它含有和藥物賦形劑結(jié)合的根據(jù)權(quán)利要求40制得的偶聯(lián)物。
42.權(quán)利要求41的藥物制劑，其中所述賦形劑是糖。
43.權(quán)利要求41的藥物制劑，呈凍干形式。
44.權(quán)利要求41的藥物制劑，它進(jìn)一步含有液體稀釋劑。
45.權(quán)利要求44的藥物制劑，其中所述液體稀釋劑選自用于注射的抑菌水、5％葡萄糖水溶液、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液、鹽水溶液、無菌水、去離子水，及其組合。
46.權(quán)利要求41的藥物制劑，呈單位劑量形式。
47.權(quán)利要求41的藥物制劑，放置于玻璃小瓶中。
48.傳送偶聯(lián)物的方法，該方法包括將治療有效量的根據(jù)要求39的偶聯(lián)物給藥于患者的步驟。
50.聚合物，它含有水溶性聚合物、 部分，和反應(yīng)基，其中(i)通過直接共價(jià)鍵或通過第一個(gè)間隔部分，所述水溶性聚合物和 部分的氮原子連接；(ii)通過直接共價(jià)鍵或通過第二個(gè)間隔部分，所述反應(yīng)基和 部分的羰基碳原子連接；和(iii)R1是H或有機(jī)基。
全文摘要
提供了聚合試劑，它含有以特定次序排列的原子部分，其中該部分位于水溶性聚合物和反應(yīng)基之間。本發(fā)明聚合試劑特別適用于，除了其它事情以外，形成聚合物－活性劑偶聯(lián)物。還提供了相關(guān)的方法、組合物、制劑等等。
文檔編號(hào)C08G65/329GK1747748SQ200480004064
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月23日
發(fā)明者J·M·哈里斯, A·科茲洛夫斯基, S·P·麥克馬納斯, M·D·本特利, S·A·查爾斯 申請(qǐng)人:尼克塔治療亞拉巴馬公司