專利名稱：一種靈芝多糖及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用化學方法從靈芝中提取有效成分，更具體地說從靈芝孢子中提取多糖、確定化學結構及對機體的免疫促進作用。
背景技術：
癌癥疾病不斷威脅人類健康，它已成為人類死亡的主要因素之一，雖經人們的大量研究希望尋找到能克服癌癥疾病的、副作用小的抗癌藥物，但至今仍未找到專一性強、療效好、副作用小的抗癌藥物。
目前使用的腫瘤藥物品種雖很多，但大部分采用化學合成方法制得，毒、副作用較大。近年來有一些抗腫瘤的天然產物問世，但副作用也較大，且多數為粗制品。九十年代后期，生物治療已成為腫瘤治療的重要途徑，免疫促進劑是用于腫瘤生物治療的一類藥物。本發(fā)明提供一種免疫調節(jié)劑即從靈芝孢子中獲得的多糖。
靈芝在傳統(tǒng)醫(yī)藥中是一種良好的滋補品，它的主要活性成分為多糖和靈芝酸。近十年來靈芝特別是靈芝孢子已成為國內外研究的熱點。本發(fā)明從靈芝孢子中提取獲得均一多糖，經化學光譜分析確定了化學結構，并通過藥理試驗證明該化學結構的多糖具有顯著的免疫促進作用，可作為保健品使用，特別作為腫瘤病人的輔助治療藥物。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種從靈芝孢子中提取出具有免疫促進作用的其結構確定的多糖化合物。
本發(fā)明的另一目的是制備該多糖的提取方法及它的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明通過下列步驟實施
破壁的靈芝孢子粉于甲醇或乙醇溶液中浸泡數周，取出風干，風干的殘渣再用沸水回流提取4-5小時，待冷，過濾，殘渣再用相同比例水提取一次，合并兩次水提取濾液，濾液減壓濃縮至小體積，按1∶1體積比加入15％三氯乙酸于4℃下脫蛋白，離心，上清液用1mol/L NaOH中和至中性。對流水透析三天。未透過液減壓濃縮至1/5體積，加入95％乙醇至溶液中乙醇濃度為45-55％，過夜，離心沉淀，干燥得粗多糖。
粗多糖溶于蒸餾水，離心去不溶物，上清液進行DEAE-Cellulose柱層析。水洗脫至糖反應呈陰性，透析，冷凍干燥得固體，固體溶于水，加入乙醇至溶液中乙醇濃度為25-35％，離心，上清液再加入乙醇使溶液中乙醇濃度為45-55％，離心得沉淀，沉淀溶于水，進行Sephacryl S-300柱層析。0.2mol/LNaCl洗脫。示差檢測，多糖部分透析，減壓濃縮至小體積，再按同樣條件Sephacryl S-300柱層析一次，透析，減壓濃縮，冷凍干燥。該樣品經HPLC檢測，結果為一單一對稱峰，證明該多糖FB1為純品。可作為藥理試驗及結構分析之用。
FB1經HPLC檢測其分子量為7.2×105Da。比旋度為[a]D＝-23.37°(C0.860，H2O)。FB1經13CNMR測定，異頭碳區(qū)域只顯示一位于δ104.69的碳信號，說明該多糖的葡萄糖殘基為吡喃環(huán)型，且糖苷健僅有一種β-型連接方式，這與紅外光譜的推測一致。另外，在13CNMR譜中出現強度較大的位于δ86.5的信號，提示FB1的糖鏈中含有大量1，3-連接的吡喃型葡萄糖殘基；信號δ71.7(應歸屬為支鏈葡萄糖殘基的C-6)的存在，提示多糖FB1為一具有分支的聚合物，分支點之一應位于主鏈葡萄糖殘基的C-6位。碳譜中其他信號，δ77.7、75.4、70.3、和62.9可分別歸屬于葡萄糖基C-5、C-2、C-4(主鏈葡萄糖基和C-6。上述結果結合甲基化反應，及高碘酸鹽氧化反應，Smith降解等結果，證明FB1的重復結構為一含有6個葡萄糖殘基，一個葡萄糖殘基的6位上帶有一個末端葡萄糖的β-1，3-葡聚糖。詳細結構如圖所示
藥理試驗1、小鼠脾臟淋巴細胞增殖活性準確稱取FB1 1-2克，溶于生理鹽水，濃度為4mg/ml。使用時稀釋至濃度為10-3、10-2和10-1mg/ml。小鼠以頸椎脫臼致死，無菌條件下取出脾臟并分離脾細胞，以尼龍網過濾，蒸餾水破壞紅細胞，調節(jié)至等滲，用培養(yǎng)液洗滌三次后，計數，調節(jié)細胞濃度為5×106cell/ml。將上述細胞液加樣于96孔板中，每孔100ul，設一對照組，再加入不同濃度的待測樣品及ConA(5ug/L)或LPS(10ug/L)，置于37℃ 5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44小時，加入20ulMTT繼續(xù)培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)終止，向每孔中加入100ul三聯液(二甲基甲酰胺和十二烷基磺酸鈉)，并于37℃放置過夜。次日，測定每孔溶液于570nm處的吸光度。然后用小鼠脾臟細胞作T，B淋巴細胞增殖活性試驗。結果表明對T，B淋巴細胞增殖活性，在濃度10、100ug/ml時P值分別＜0.01及0.001。達顯著。
2、小鼠體內免疫試驗合格ICR小鼠，分別腹腔注射25ug/ml和50ug/ml FB1，對照組注射生理鹽水0.2ml，每天給藥二次，共給藥9天。小鼠給藥第三天致敏，第五天解剖測定各項免疫參數。結果表明該多糖FB1在上述二個濃度下其P值分別小于0.01和0.001，達顯著。
根據上述藥理試驗的體內體外試驗，表明FB1可作為免疫調節(jié)的藥物使用。
具體實施方法取1Kg破壁赤靈芝孢子粉，加入3L 95％乙醇浸泡在三周。每周更換乙醇一次，取出離心。固體物置于通風處涼干，然后用沸水提取，每次加去離子水4L，共提取兩次，合并兩次濾液，濾液減壓濃縮至1L，冷卻至4℃，加入15％三氯乙酸1L。加畢，靜置3小時，離心，取上清液，上清液用1mol/LNaOH中和至pH6-7，對流動水透析三天。透析袋內液濃縮至0.5L。加入95％乙醇至溶液的乙醇濃度為50％，4℃下靜置過夜，離心得沉淀。沉淀經無水乙醇和丙酮依次洗滌后，于40℃真空干燥，得固體粗多糖9.7g。(得率0.97％)。
取粗多糖5g，溶于蒸餾水中，離心去不溶物，上清液進行DEAE-Cellulose柱層析(柱50×10cm)，用水洗脫。根據糖顏色反應合并陽性反應部分，對蒸餾水透析二天。未透過液減壓濃縮至小體積，冷凍干燥，得棉花狀固體2.1g。固體溶于水，加入乙醇至溶液中乙醇濃度為30％，離心，取上清液，上清液中再加入乙醇至溶液中乙醇濃度為50％，離心，得沉淀1.2g，沉淀溶于水，進行Sephacryl S-300柱(100×2.6cm)層析。0.2mol/L NaCl洗脫。示差檢測，合并多糖部分，透析，濃縮，冷凍干燥得固體。然后再按上述條件再進行Sephacryl S-300柱層析一次，透析，濃縮，冷凍干燥，得FB1。經HPLC檢測，結果為一單一對稱峰，證明FB1多糖為均一組分?？勺鳛槔砘再|、化學結構及藥理試驗之用。
理化性質測定按多糖測定的常規(guī)方法，測定分子量為7.2×105。比旋度為[a]D＝-23.37°。
化學結構測定按多糖的化學結構測定方法，包括光譜方法(13CNMR，1R)及化學方法(全水解、甲基化反應、高碘酸鹽氧化反應、Smith降解、部分水解)證明FB1為一含有6個葡萄糖殘基，并在五個葡萄糖殘基為主鏈的一個葡萄糖殘基的5位上帶有一個分支，分支為末端葡萄糖的β-1，3-葡聚糖。
藥理試驗取上述FB1分別按試驗中提及的藥理試驗方法進行體內體外免疫試驗。結果表明對T，B淋巴細胞的增殖試驗中，濃度為10、100ug/ml的體外試驗可達顯著和非常顯著。25ug/Kg和50ug/Kg時體內試驗分別可達顯著和非常顯著。
權利要求
1.一種從靈芝中提取獲得如下結構的多糖。
2.根據權利要求1所述從靈芝中提取獲得多糖，其特征在于為β-1，3-葡聚糖，重復結構中含6個葡萄糖殘基，其中一個殘基為6位分支的帶有一個末端葡萄糖殘基，分子量為7.2×105，比旋度為[a]D＝-23.37°(C0.860，H2O)。
3.如權利要求1所述從靈芝中提取獲得多糖的方法，其特征在于包括下列步驟(1)、靈芝孢子破壁乙醇脫脂、過濾、風干、沸水提取、減壓濃縮至小體積，加入稀三氯乙酸低溫脫蛋白，去蛋白之上清液用稀堿中和、透析，未透析液減壓濃縮至小體積，加入乙醇至溶液中，沉淀、洗滌，得粗糖。(2)、粗多糖溶于水，以DEAE-Cellulose為載體柱層析，水為流動相，洗脫液透析、減壓濃縮、冷凍干燥得固體。(3)、固體物溶于水，加入乙醇、離心、去沉淀，上清液再加入乙醇，離心得沉淀。(4)、上述沉淀溶于水，凝膠柱層析，流動相為水，流出液經透析，冷凍干燥得均一多糖。
4.根據權利要求3所述從靈芝中提取獲得多糖的方法，其特征在于透析后未透過液濃縮至小體積，加入乙醇使溶液中乙醇濃度為45-55％。
5.根據權利要求3所述從靈芝中提取獲得多糖的方法，其特征在于粗糖經DEAE-Cellulose層析，洗脫液經濃縮后得固體物，固體物再溶于水，加入乙醇使溶液中乙醇濃度為25-35％，離心去沉淀，上清液再加乙醇使溶液中乙醇濃度呈45-55％，離心得沉淀。
6.根據權利要求3所述從靈芝中提取獲得多糖的方法，其特征在于上述沉淀物溶于水后經二次Sephacryl S-300柱層析，多糖部分透析，減壓濃縮，冷凍干燥得均一多糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從靈芝孢子中提取得到FB1多糖以及提取的方法。經生物試驗該多糖具有免疫促進作用，可作為腫瘤等免疫功能低下疾病的輔助治療藥物。
文檔編號C08B37/00GK1537867SQ0311640
公開日2004年10月20日 申請日期2003年4月14日 優(yōu)先權日2003年4月14日
發(fā)明者方積年, 鮑幸峰 申請人:中國科學院上海藥物研究所