專利名稱：用于將物質(zhì),特別是分子庫(kù)組合合成用單體涂布于支持物的設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于將物質(zhì)，特別是分子庫(kù)組合合成用單體，涂布于支持物的設(shè)備和方法，用于對(duì)結(jié)合于支持物上的分子的光學(xué)屬性，更為特別的是發(fā)光反應(yīng)和折射行為的檢測(cè)。
此處的術(shù)語(yǔ)“分子庫(kù)”代表結(jié)合于支持物確定位置上的多種各不相同的分子的總和，其中各個(gè)各不相同的分子以盡可能緊湊的方式排列。因此，本發(fā)明涉及的分子庫(kù)更為特別的是通過有限數(shù)量單體的組合合成而形成的。組合合成的原理在

圖1中以圖解的形式進(jìn)行了解釋。
術(shù)語(yǔ)“高度復(fù)雜”代表了具有103以上不同的典型個(gè)體的分子庫(kù)，然而，更為特別的代表了具有105以上不同典型個(gè)體的分子庫(kù)。
該復(fù)雜分子庫(kù)能夠被特別方便地涂布于二維支持物，藉此，分子庫(kù)的每一個(gè)成員都可以被定位于支持物上的一個(gè)定址精確的位置上。這意味著一個(gè)定址精確的反應(yīng)，例如染色反應(yīng)，允許對(duì)支持物所結(jié)合的反應(yīng)配偶體得到一個(gè)精確和唯一的結(jié)論。涂布了確定的該分子庫(kù)成員的定址精確的位置也被稱為點(diǎn)(spot)，二維支持物上的分子庫(kù)的全部也被稱為陣列。
二維陣列可以具有一個(gè)光滑的表面，而且該表面基本上不被所用的溶劑滲透。不過，與上述結(jié)構(gòu)相比，它也可以顯示出一個(gè)多孔結(jié)構(gòu)，使得其對(duì)所用溶劑和要偶聯(lián)的物質(zhì)來(lái)說(shuō)呈現(xiàn)三維狀態(tài)。這種類型的支持物是尤其必須的，如果信號(hào)強(qiáng)度與具有光滑表面的支持物相比需要被增強(qiáng)。特別是，例如，在一個(gè)肽陣列要被用病人血清進(jìn)行染色，而且相對(duì)較弱濃度的抗體反應(yīng)性的結(jié)合信號(hào)也需要被檢測(cè)的情況下。
隨后的同義術(shù)語(yǔ)“二維支持物”或“陣列”既表示不同分子基本上僅以二維形式排列的支持物，也表示不同分子存在于一個(gè)附加的第三維度上的多孔支持物，因此不再是真實(shí)意義上的(基本上二維的)陣列。
術(shù)語(yǔ)“固態(tài)聚集態(tài)”也包括過冷的液體。
術(shù)語(yǔ)“屬性”應(yīng)該從最廣義的角度進(jìn)行理解，而且不僅應(yīng)當(dāng)包括特定分子的屬性特征，例如它們的質(zhì)譜，還應(yīng)當(dāng)包括，例如主要僅通過某一特定的反應(yīng)的出現(xiàn)未展示的性能，使得本發(fā)明從而也涉及這樣的方法和設(shè)備，對(duì)它們來(lái)說(shuō)，通過特定的光學(xué)反應(yīng)最初僅僅能夠斷定某物質(zhì)的存在，而不能推斷出其類型(物質(zhì)的類型通過例如其在支持物上的位置進(jìn)行確定)。
術(shù)語(yǔ)“生物的”分子在此引入代表所有類型的分子，特別是在生物學(xué)、藥劑學(xué)和醫(yī)學(xué)中相關(guān)的分子，因而，例如肽、D-肽、L-肽及其混合物，天然存在的寡聚核苷酸、其鏡象異構(gòu)體及其混合物，人工衍生的寡聚核苷酸，如那些用于構(gòu)建aptamer的寡聚核苷酸，寡糖和這些分子的修飾產(chǎn)物。更為特別的，自然界不存在的模式構(gòu)建的寡聚物可能具有特殊的藥理學(xué)相關(guān)性。在這方面，特別應(yīng)當(dāng)提到的是在化學(xué)組合分析的輔助下產(chǎn)生的可以用作生物分子配基的非天然物質(zhì)，更為特別的是有機(jī)化合物，類固醇衍生物等。從許多的這類分子中，可以分離出特定的結(jié)合物分子，用于天然存在的分子以修飾該分子的活性。不過，既然這些結(jié)合物分子通常不能從天然存在的消化酶中分離，因此它們特別適合用作治療方法。
已經(jīng)知道各種不同的用于合成高度復(fù)雜分子庫(kù)的方法，但它們都有某些缺點(diǎn)。已知的方法的實(shí)施需要昂貴的特殊裝備，而且在發(fā)光信號(hào)的讀出速度上相對(duì)較慢。特別的，如隨后解釋的具有優(yōu)勢(shì)的不同原因，如果非常多的不同分子基團(tuán)要被排列在共同的支持物上然后分別進(jìn)行研究，就需要非常昂貴的機(jī)械用于激活每一個(gè)分子基團(tuán)，這樣不僅費(fèi)用昂貴且易受干擾，而且在極其精密的操作中會(huì)顯示出制造誤差，其大小比足以用于進(jìn)行研究的分子團(tuán)的最低限度要大幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，對(duì)于已知的方法和設(shè)備來(lái)說(shuō)，支持物所能容納的分子或分子基團(tuán)的最大數(shù)量量是有限的，在數(shù)量級(jí)上大約為105分子基團(tuán)。然而，特別是對(duì)于某些血清和DNA分析來(lái)說(shuō)，如果約108到109個(gè)分子能夠被容納和研究于一個(gè)支持物上，將是令人滿意的。
圖2顯示了用于在目前，特別是平板印刷合成方法中作為讀出裝置的共聚焦激光顯微鏡的原理?？梢钥闯觯谠撟x出裝置的工作原理中，陣列每一個(gè)單獨(dú)的點(diǎn)都需要在所有的三個(gè)維度上進(jìn)行搜索，而該過程即消耗時(shí)間又降低了精確性。
已經(jīng)知道平版印刷方法(Lithographische Methode)可以將分子涂布到合適的支持物上，特別是被稱為“診斷芯片”的支持物(圖3)，不過，如在后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)的，在非常精確地定位分子以及可重復(fù)性有目的激活的支持物位置方面存在的困難限制了可以涂布的分子的最大數(shù)量，因?yàn)闊o(wú)法在具有可重復(fù)的精確性條件下知道哪個(gè)分子定位于支持物的哪個(gè)位置上，就不足以在支持物上非常緊密的安排大量的不同分子。特別地，在已知的方法和設(shè)備中，在一個(gè)合理的時(shí)間內(nèi)讀出支持物上的非常多的發(fā)光反應(yīng)并且同時(shí)要求相當(dāng)準(zhǔn)確是一個(gè)問題。在使用與我們有關(guān)的方法和設(shè)備進(jìn)行的方便的染色研究中，所要研究的材料被涂布到固定有不同分子的支持物上，應(yīng)該能夠得到關(guān)于待測(cè)材料中各種物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)論，例如，對(duì)于血清中的特定抗體，固定于支持物上的材料分子或其組份和該抗體形成了結(jié)合鍵，因此就應(yīng)該非常準(zhǔn)確的知道哪一個(gè)分子位于支持物的什么位置上。
另外，所有已知的平版印刷方法(和其它一些方法，例如，通過可控制的帶電單體的排斥或吸引實(shí)現(xiàn)局部的精確合成)還有其它的基本缺陷對(duì)每一種不同的單體，幾乎整個(gè)的偶聯(lián)循環(huán)都必須分別進(jìn)行，即，每一種類型的單體都要被涂布、偶聯(lián)以及洗去過量單體，然后再進(jìn)行下一種類型單體的相同步驟，因此，例如在組合合成層中，每一種情況下每個(gè)肽都必須進(jìn)行20個(gè)偶聯(lián)循環(huán)。該缺點(diǎn)在圖4中進(jìn)行了簡(jiǎn)要圖示。因此，對(duì)于一個(gè)五肽分子庫(kù)，上述方法需要進(jìn)行100個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，藉此，專家可以馬上理解在科技發(fā)展的現(xiàn)階段，這對(duì)產(chǎn)生的分子庫(kù)將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的質(zhì)量問題，因?yàn)槊恳粋€(gè)偶聯(lián)循環(huán)中都會(huì)產(chǎn)生假象，用這種方法所產(chǎn)生的五肽文庫(kù)實(shí)際上是不可用的。
這也是為什么平版印刷方法至今幾乎專門用于寡肽陣列合成的原因，因?yàn)樵谶@種情況下，只需要將4種不同的單體偶聯(lián)到支持物上。
平版印刷方法的另一個(gè)副作用是相對(duì)較低的收率，因?yàn)閷?duì)每一個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)都需要將整個(gè)支持物用反應(yīng)單體進(jìn)行均一的覆蓋。
除了平版印刷方法，還有許多可用于進(jìn)行組合合成的印刷方法(圖5、IIa和IIb)。然而到目前為止，這些方法中還沒有一種能達(dá)到平版印刷方法的高分辨率。這主要是由于溶液中相對(duì)較小的單體具有的高擴(kuò)散率。既然單體和支持物的偶聯(lián)反應(yīng)以及單體涂布到支持物的準(zhǔn)確位置都需要一定時(shí)間，因此高滲透率就限制了通過組合合成產(chǎn)生的分子庫(kù)的緊密度及其復(fù)雜程度。
通過與普通彩色噴墨打印機(jī)的比較可以清楚的說(shuō)明上述觀點(diǎn)(圖6)彩色噴墨打印機(jī)的色彩鮮明度是通過將不同彩色顆粒的擴(kuò)散作用控制的盡可能小而實(shí)現(xiàn)的。該過程是通過彩色顆粒相對(duì)于前述單體的巨大體積，以及含有快速揮發(fā)性物質(zhì)的打印調(diào)色劑流體導(dǎo)致彩色顆粒迅速沉淀而實(shí)現(xiàn)的。另外，所用的打印紙具有高度吸收性的非常光滑的表面。
這種紙通常具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，因而通常不適合于作分子庫(kù)的支持物，而且還有兩點(diǎn)也與將分子庫(kù)盡可能緊密的偶聯(lián)到支持物上的要求不一致1.用于組合合成的單體相對(duì)于彩色噴墨打印機(jī)通常所用的彩色生色團(tuán)來(lái)說(shuō)是非常小的，這種情況單獨(dú)作用就大大提高擴(kuò)散率。
2.不僅被打印的單體不能夠溶于高揮發(fā)性的溶劑。甚至幾乎不可能找到一種在所需要的毫微升級(jí)范圍內(nèi)蒸發(fā)足夠慢的溶劑，否則的話偶聯(lián)配偶體會(huì)的濃度就會(huì)以不合希望的方式發(fā)生改變，因?yàn)榕悸?lián)到支持物的偶聯(lián)反應(yīng)(以及將單體涂布到支持物準(zhǔn)確位置的過程)需要一定的時(shí)間。
這也是為什么所有目前所用的點(diǎn)方法在小尺度范圍涂布中容易產(chǎn)生誤差而且非常昂貴的原因。在這種尺度下，總是會(huì)冒著所涂布的點(diǎn)跑得太遠(yuǎn)，單體擴(kuò)散太遠(yuǎn)或溶劑部分或全部揮發(fā)的危險(xiǎn)。
在這個(gè)基礎(chǔ)上，對(duì)本發(fā)明的提出的問題是提供一套方法和設(shè)備，通過它們可以克服在支持物分子庫(kù)合成中的缺點(diǎn)。
為了解決上述問題提出了一種高度復(fù)雜分子庫(kù)并行合成的方法，其特征在于組合合成所用的單體在轉(zhuǎn)印到支持物上之前或之后溶解于第一種溶劑中，該溶劑在-5℃以下，優(yōu)選的在20℃以下以固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)存在，而且其汽化點(diǎn)高于100℃，優(yōu)選的高于150℃。該方法的另一特征是該固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)可以通過在單體與支持物實(shí)際的偶聯(lián)反應(yīng)中提供能量或提供第二種溶劑，在很短時(shí)間內(nèi)優(yōu)選的被轉(zhuǎn)換成液態(tài)，優(yōu)選的是凝膠態(tài)聚集態(tài)。
結(jié)果是1.單體的擴(kuò)散被顯著抑制，而且2.所用的第一種溶劑在單體的涂布過程或偶聯(lián)反應(yīng)過程中被防止發(fā)生部分或全部蒸發(fā)。
這在如果不同單體涂布到支持物的精確位置的過程需要相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，的情況下是尤其重要的，這種情況下包括，例如，當(dāng)高度復(fù)雜的多肽庫(kù)是通過不同氨基酸衍生物的組合合成方法在噴墨打印機(jī)的輔助下產(chǎn)生時(shí)。
本方法可以非常方便的被實(shí)施使得在一個(gè)反復(fù)性過程中所述的顆?；蛭镔|(zhì)被反復(fù)涂布到支持物的精確位置上，在每一種情況下，接著進(jìn)行上述的被固定物質(zhì)的活動(dòng)化(Beweglich-machen)，偶聯(lián)物質(zhì)到支持物，洗去未偶聯(lián)的物質(zhì)以及去掉臨時(shí)性的保護(hù)基團(tuán)。如果使用一個(gè)經(jīng)過改進(jìn)的彩色激光打印機(jī)或彩色激光復(fù)印機(jī)，支持物在整個(gè)重復(fù)性過程中如果相對(duì)于打印機(jī)或復(fù)印機(jī)的支承輥或傳墨輥固定不動(dòng)將是非常方便的。
一個(gè)包含許多可有目的控制的光源(gezielt ansteuerbarenLichtquelle)的陣列，特別是一個(gè)微激光陣列，也可以被方便的使用，以代替單激光。作為電磁波作用于顆?；蛑С治锏慕Y(jié)果，它們被在精確的位置上被帶上靜電荷或被加熱，這樣就會(huì)導(dǎo)致顆粒被定址精確轉(zhuǎn)印或定址精確固定。
如果顆粒含有可用于組合合成單體，雙體或三體的前體，那么偶聯(lián)到支持物上的分子可以被另外的單體、雙體或三體加長(zhǎng)，該過程通過偶聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)或幾個(gè)進(jìn)一步循環(huán)完成。同樣也可以通過非必要相同反應(yīng)的一個(gè)或幾個(gè)循環(huán)來(lái)修飾偶聯(lián)到支持物上的分子。經(jīng)過成功的合成以后，保護(hù)基可以被從合成的寡聚物上分離下來(lái)，而合成的分子仍然結(jié)合在支持物上。
顆粒和/或固定的物質(zhì)可以通過另外的物質(zhì)被融化或溶解或者變成一種凝膠狀態(tài)。
通過電磁波，特別是激光，或通過施加電壓或提供熱能或提供溶劑以活動(dòng)化該被固定的物質(zhì)將是非常有利的。從而使固定物質(zhì)的活動(dòng)化過程可以被限制在特定的區(qū)域內(nèi)。沒有被活動(dòng)化或偶聯(lián)的物質(zhì)可以用一種溶劑、優(yōu)選的是加熱的溶劑從支持物上洗脫、或用機(jī)械方法，特別是在氣流的輔助下從支持物上被去掉。
不同的材料可以用于作為支持物。特別的，聚苯乙烯薄膜、紙、CDs、MODs、DVDs或FMDs都可以被使用。
根據(jù)本發(fā)明制造的支持物可以被用于科學(xué)研究、特別是醫(yī)學(xué)研究的各種不同的方面。為此目的，支持物通常被用于與待測(cè)流體相接觸。該流體可以是，例如、血液、血清、尿液、排泄物、淋巴液、唾液、羊水、胃液、嘔吐物、汗液、精液、乳汁、淚液、含有抗體的流體或者上述流體的提取物。如果待測(cè)流體是血清，可以被方便和一種特定的免疫球蛋白檢測(cè)試劑相接觸，特別是檢測(cè)IgE、IgM、IgG或IgA類免疫球蛋白的試劑。同樣也可以將支持物和待測(cè)DNA相接觸。如果檢測(cè)DNA或含有免疫球蛋白的流體，在與支持物接觸之前或之后，待測(cè)流體或待測(cè)DNA和一種可以與免疫球蛋白或DNA反應(yīng)，特別是形成鍵的材料相接觸將是非常有利的。在與待測(cè)流體或待測(cè)DNA接觸之前，可以和免疫球蛋白或DNA反應(yīng)的材料可以用一種可被激活發(fā)光的材料進(jìn)行染色/或偶聯(lián)到另外一種可發(fā)光的材料上，特別是用酶或發(fā)光材料的前體。上述的其他材料可以方便的是酶，特別是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶或熒光素酶、或各種酶的結(jié)合。
作為可激活發(fā)光的材料，更為合適的是使用一種可以被電磁波輻射，特別是激光或發(fā)光二極光發(fā)射的光波激發(fā)熒光的染料。
這樣的研究結(jié)果可以有利于病理樣品的系統(tǒng)分類和分節(jié)段(segmentation)，特別是有利于確定診斷性標(biāo)記物，該標(biāo)記物用于對(duì)測(cè)試人群的檢驗(yàn)方法的實(shí)施以及確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對(duì)正常分布的偏離量。
例如，可以從每個(gè)測(cè)試者體內(nèi)采樣取得血清樣品，然后用上述的方法之一檢測(cè)這些樣品。相對(duì)于正常分布的偏移量可以，例如，對(duì)那些在取樣前或取樣后患有癌癥、特別是特殊類型的癌癥、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、傳染性疾病、自身免疫病、特別是Crohn氏病、或患有心力衰竭或中風(fēng)或者曾患過敏癥或?qū)⒂凶儜?yīng)性疾病的測(cè)試者進(jìn)行確定。
以這種方式得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以被自動(dòng)分類以確定信號(hào)以何種診斷模式被用于確定與分子庫(kù)中相應(yīng)分子的結(jié)構(gòu)參數(shù)的關(guān)系，可以發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性，尤其是使獲得對(duì)未知樣品模式診斷性評(píng)估成為可能的相關(guān)性。同樣也可以尋找可用于確定已發(fā)現(xiàn)的分子的結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)性。如此定義的所發(fā)現(xiàn)分子的結(jié)構(gòu)特征可以被用作指導(dǎo)性結(jié)構(gòu)用于發(fā)展其它功能性同源的分子，特別是可用于治療的分子。因此，一個(gè)以重疊肽形式覆蓋了已知人類基因產(chǎn)物的肽陣列可以被有利的使用。
在一個(gè)附加的方法中，用于組合合成的單體以0.2μm到200μm，優(yōu)選的2μm到40μm大小的單體調(diào)色劑(Toner)顆粒形式被采用，其在室溫下呈現(xiàn)固態(tài)聚集態(tài)。術(shù)語(yǔ)“室溫”描述了一個(gè)介于-10℃到80℃的溫度范圍，優(yōu)選的介于0℃到40℃。這些顆粒的另外一個(gè)特征是使用上述第一種溶劑時(shí)它們含有一種相對(duì)于偶聯(lián)反應(yīng)來(lái)說(shuō)是惰性的組份，其聚集體狀態(tài)可以通過上述的方法改變。優(yōu)選的該顆粒還含有磁性組分或偶聯(lián)到含有磁性組分的顆粒上。在圖7中上述的單體調(diào)色劑顆粒和普通的發(fā)色團(tuán)調(diào)色劑顆粒進(jìn)行了圖示比較。
顆粒定址精確地轉(zhuǎn)印到支持物的過程，使用市售激光打印機(jī)(laserdruker)(圖8)或激光復(fù)印機(jī)來(lái)完成，更為特別的是彩色激光打印機(jī)(圖9)或彩色激光復(fù)印機(jī)，其中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)印顆粒的激光，特別是在使用激光復(fù)印機(jī)時(shí)，可以被被一維或二維微激光陣列所替代。
然后，涂布于精確位置的單體，如上所述被從固態(tài)聚集態(tài)轉(zhuǎn)換成液態(tài)聚集態(tài)，優(yōu)選的是凝膠狀態(tài)，藉此，一個(gè)定址精確的偶聯(lián)反應(yīng)就開始進(jìn)行了。
通過這種方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，在組合合成方法的輔助下，十分簡(jiǎn)便地、分子十分緊密地排列在支構(gòu)物上從而產(chǎn)生了高度復(fù)雜的、相對(duì)無(wú)假象的分子庫(kù)。
激光打印機(jī)的技術(shù)特征將進(jìn)一步闡明該理論市售激光打印機(jī)Ep具有600dpi(點(diǎn)/英寸，dot per inch)的打印分辨率。這相當(dāng)于每個(gè)打印像素的直徑為約40μm，或者說(shuō)這樣的激光打印機(jī)在普通的打印過程中可以在DIN A4紙上(約20×30cm)輸出約4500×7000個(gè)點(diǎn)。這相應(yīng)于約3千萬(wàn)個(gè)點(diǎn)/DIN A4紙(圖10)。
圖11顯示了這樣的高分辨率在普通打印過程中使用普通調(diào)色劑可以幾乎無(wú)誤差和可重復(fù)地“收獲”。實(shí)際上，圖11在最大放大率狀態(tài)下也沒有顯示出一個(gè)錯(cuò)誤設(shè)置的像素。
因此上百萬(wàn)的點(diǎn)可以容納在一張DINA4的紙上，而且可以被分辨開。不過，這肯定遠(yuǎn)遠(yuǎn)不到一個(gè)明顯處于快速發(fā)展階段的技術(shù)的終點(diǎn)。目前市售具有2,400dpi分辨率的激光打印機(jī)可以在DIN A4紙上輸出約5億個(gè)像素，因此可以在一張DIN A4紙上獨(dú)立容納更多的點(diǎn)。
因此，市售激光打印機(jī)正照著使具有所有可能代表的五肽或六肽分子庫(kù)的合成成為可能的數(shù)量級(jí)方向發(fā)展。相對(duì)數(shù)量如圖12所示。
在一個(gè)可選的附加方法中，用于組合合成的單體被以流體聚集態(tài)形式以本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)涂布于支持物的精確位置上，例如，在一種主要市售噴墨打印機(jī)或其它打印方法的輔助下。
為了此目的，一種溶劑混合物被制備出來(lái)，在該混合物中除了用于組合合成的單體和上述第一種溶劑(例如，二苯基甲酰胺)外，至少還加入有第二種溶劑(例如，N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇或異丙醇)，該溶劑在室溫下將該組份從固態(tài)聚集態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)聚集態(tài)(即，將其溶解)。該室溫條件描述了介于-10℃到80℃的溫度范圍，優(yōu)選的介于0℃到40℃。
該溶劑混合物的另一個(gè)特征是在室溫條件下上述第二種溶劑與第一種相比是高度揮發(fā)性的，即，兩種溶劑的汽化點(diǎn)差大于80℃。
因而上述第二種溶劑的部分蒸發(fā)會(huì)產(chǎn)生如下效果第一種溶劑和溶于其中的單體首先被濃縮用于組合合成，然后從液態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)轉(zhuǎn)變回固態(tài)或凝膠態(tài)聚集態(tài)，而不會(huì)使單體由于擴(kuò)散從最初的涂布位置移開太遠(yuǎn)。支持物最好保持在比盛有該溶劑混合物的保存容器的溫度低10℃以上的條件下。幾乎不揮發(fā)的溶劑部分可以在該混合物被涂布于精確位置之前完全或部分涂布于支持物。所用的溶劑對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)呈惰性。
然后，在特定位置涂布的單體被由固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿缟纤龅囊簯B(tài)聚集態(tài)，優(yōu)選的是凝膠狀態(tài)，藉此，局部特異性確定的偶聯(lián)反應(yīng)開始進(jìn)行。
通過這種方法，一個(gè)在組合合成方法的輔助下產(chǎn)生的更為緊密的分子排列得以在支持物上實(shí)現(xiàn)，從而產(chǎn)生了與現(xiàn)有技術(shù)相比，高度復(fù)雜的、相對(duì)無(wú)假象的分子庫(kù)。
本發(fā)明包括將單體涂布于精確位置所需要的設(shè)備，該單體是用于支持物結(jié)合的分子庫(kù)的組合合成，特別是肽或寡核苷酸率。涂布單體的各個(gè)層的偶聯(lián)按如上所述之方法完成。
該單體被聯(lián)結(jié)于如下所述的顆粒。
該顆粒的定址精確轉(zhuǎn)印到支持物上是通過一臺(tái)基本上基于市售激光打印機(jī)或激光復(fù)印機(jī)，特別是彩色激光打印機(jī)或彩色激光復(fù)印機(jī)的設(shè)備(圖13和14)完成的。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)印顆粒的激光，特別是在使用激光復(fù)印機(jī)的情況下，可以被一維或二維的微激光陣列所替代。
如下的改變使該設(shè)備和市售激光打印機(jī)或激光復(fù)印機(jī)相區(qū)別1.含有所述單體的顆粒，而不是普通的調(diào)色劑顆粒，按下面的所述被使用。
2.不僅僅是一層單體顆粒被涂布，而是幾層含有該單體的顆粒層被層疊打印。
3.在每一種情況下，在涂布所述的幾個(gè)顆粒層之間，所述的單體被偶聯(lián)到支持物上，未偶聯(lián)的單體被從支持物上除去，以及臨時(shí)性保護(hù)基團(tuán)被從支持物偶聯(lián)的單體上分離掉。
4.在涂布最后一層單體之前，支持物相對(duì)于負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)印顆粒的激光保持一種精確的空間關(guān)系，其中只要該空間關(guān)系是可重復(fù)的就可以了。通過這種方法，層間和層內(nèi)各種單體顆?？梢灾丿B或并列被置于精確位置上。該空間關(guān)系可以通過反饋裝置(圖14)和/或支承輥或轉(zhuǎn)印單位和激光離子化輥(von dem Laser ionisierbaren Walze)之間的精確機(jī)械偶聯(lián)(圖13)而產(chǎn)生。這兩種方法也可以自然的結(jié)合起來(lái)使用。
例如，一個(gè)位置標(biāo)記網(wǎng)格(Rastster)(圖14，38)可以被設(shè)置于支持物或支承輥(35)，然后用掃描器(圖14，37)讀取再和存貯的網(wǎng)格(圖14，39)進(jìn)行對(duì)比。打印機(jī)內(nèi)存中像素對(duì)于測(cè)量到的偏差值的電偏移(圖14，40)是上述反饋機(jī)制的組成部分。
本發(fā)明包括根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的材料。這些材料包括可以通過所述的設(shè)備被涂布于支持物精確位置上的單體調(diào)色劑顆粒，該設(shè)備是基于主要市售的激光打印機(jī)或激光復(fù)印機(jī)的。這些單體調(diào)色劑顆粒與市售調(diào)色劑顆粒具有以下不同1.單體調(diào)色劑顆粒含有合適的用于組合合成單體或其衍生物，更為特別的也包括預(yù)激活單體，而不含有發(fā)色團(tuán)。
2.不含有或除了含有可熔性塑料組份(例如聚苯乙烯)外，單體調(diào)色劑顆粒含有對(duì)單體及支持物的偶聯(lián)反應(yīng)為惰性的溶劑(例如，二甲基甲酰胺)，其在室溫下處于固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“室溫”描述了一個(gè)介于-10℃到80℃的溫度范圍，優(yōu)選的介于0℃到40℃。
該單體調(diào)色劑顆粒的其它特征是3.其大小介于直徑0.2μm到200μm，優(yōu)選的介于直徑2μm到40μm之間。
4.該單體調(diào)色劑顆粒在室溫下呈現(xiàn)固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“室溫”描述了一個(gè)介于-10℃到80℃的溫度范圍，優(yōu)選的介于0℃到40℃。
5.該單體調(diào)色劑顆粒的另一個(gè)特征是它們含有磁性組分或與含有磁性組分的顆粒結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的其它材料包括單體調(diào)色劑流體，該流體通過使用主要市售噴墨打印機(jī)或彩色噴墨打印機(jī)可以被涂布于支持物的精確位置上。
這些單體調(diào)色劑流體與市售調(diào)色劑流體相比具有以下區(qū)別1.這些單體調(diào)色劑流體含有適用于組合合成的單體或其衍生物，更為特別的也包括預(yù)激活單體，而不是發(fā)色團(tuán)。
2.除了含有第一種在室溫下是流體的溶劑組分(例如，異丙醇、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷)外，該單體調(diào)色劑流體至少含有一個(gè)第二種對(duì)單體與支持物的偶聯(lián)反應(yīng)為惰性的溶劑(例如，二甲基甲酰胺)，其在室溫下處于固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“室溫”描述了一個(gè)介于-10℃到80℃的溫度范圍，優(yōu)選的介于0℃到40℃。因此該第二種溶劑在室溫條件下是溶解于第一種溶劑中的。
第一種溶劑的一個(gè)特征是其熔點(diǎn)和汽化點(diǎn)與第二種流體的相應(yīng)熔點(diǎn)和汽化點(diǎn)相比到要比后者低超過40℃，優(yōu)選的是超過70℃。
第一種溶劑的一個(gè)特征是在低于-80℃條件下，優(yōu)選的是低于-20℃條件下，該流體變成固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)，而且其具有一個(gè)大于40℃，優(yōu)選的大于70℃的汽化點(diǎn)。
第二種溶劑的一個(gè)特征是在低于-5℃條件下，優(yōu)選的是低于20℃條件下，該流體呈現(xiàn)固態(tài)聚集態(tài)狀態(tài)，而且其具有一個(gè)大于200℃，優(yōu)選的大于250℃的汽化點(diǎn)。
至少上述兩種溶劑和溶解在其中的單體組成的混合物的一個(gè)特征是在低于-20℃條件下，優(yōu)選的低于0℃條件下，該混合物呈現(xiàn)固態(tài)或凝膠態(tài)聚集態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的其它材料包括用該方法、材料或設(shè)備產(chǎn)生的分子庫(kù)，特別是肽分子庫(kù)或寡肽分子庫(kù)。這些分子庫(kù)的特征是1.它們是通過有限數(shù)量的單體的組合合成而產(chǎn)生的，
2.它們以二維陣列的形式存在于合適的衍生載體上，藉此，分子庫(kù)的各個(gè)單獨(dú)組份可以被定址精確的排列。載體的衍生按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)完成。
作為分子的支持物，特別是生物分子的支持物，更為特別的是在上述方法之一中使用的支持物，可以使用根據(jù)本發(fā)明的裝有積分位置標(biāo)記的細(xì)孔網(wǎng)柵(engmaschiges Netz von integriertenPositionsmarkierung)的支持物，使得通過傳統(tǒng)機(jī)械方法涂布到支持物的一個(gè)待測(cè)區(qū)域的位置可以用檢測(cè)器監(jiān)控。優(yōu)選的位置標(biāo)記的構(gòu)建應(yīng)該使得其能夠被光電子掃描系統(tǒng)所檢測(cè)。
因而本發(fā)明建立全新的診斷可行性，特別是提高了發(fā)現(xiàn)診斷性標(biāo)記物和療法的機(jī)會(huì)。例如，如果將一個(gè)完全的6基體肽分子庫(kù)被用于和相當(dāng)大量的病人血清接觸，而且，例如，利用染色反應(yīng)方法進(jìn)行檢測(cè)以確定對(duì)于哪種肽分子血清組分會(huì)發(fā)生沉淀，從而可以獲得疾病和被染色肽分子之間的相關(guān)性。這是因?yàn)槊總€(gè)人在其血清中都具有一個(gè)極度復(fù)雜的個(gè)體抗體反應(yīng)性模式，該模式特別的反應(yīng)了其免疫系統(tǒng)和急性、慢性或隱蔽性疾病或已經(jīng)克服的疾病之間的沖突。很大比例的抗體反應(yīng)性可以通過對(duì)五肽或六肽的特異性結(jié)合而確定，藉此，通過對(duì)與完全五肽或六肽分子庫(kù)的結(jié)合反應(yīng)性進(jìn)行分析，前述的個(gè)體抗體反應(yīng)性模式可以作為尚未了解的復(fù)雜性進(jìn)行確定。
所稱的完全肽分子庫(kù)在圖15中進(jìn)行了解釋。該完全肽分子庫(kù)的陣列中每一個(gè)定址精確的點(diǎn)代表了一種肽分子混合物，其確定序列僅在以N表示的位點(diǎn)處有一不同。使用這種肽分子混合物的原因是在一個(gè)抗體-肽抗原反應(yīng)中，被識(shí)別的肽抗原需要一定的體積才能被抗體特異性識(shí)別。不過，既然在科技發(fā)展的現(xiàn)階段還不可能產(chǎn)生一個(gè)具有2010個(gè)成員的完全的十肽分子庫(kù)，所以才使用該混合物。
該陣列的一個(gè)方便的用途在圖16(也見例(1.))中進(jìn)行了圖示說(shuō)明。一個(gè)高度復(fù)雜的肽陣列用對(duì)照血清和病人血清得到的差異性染色情況一方面產(chǎn)生可以被兩種血清識(shí)別的反應(yīng)配偶體(以及肽序列)(圖16，42)，另一方面產(chǎn)生被病人血清特異性識(shí)別的肽分子(圖16，43)。這使得鑒定病人特異性著色模式成為可能。在所給的例子中(圖16及例1)，與引起胃潰瘍的幽門螺桿菌表達(dá)的基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的肽被鑒定出來(lái)。這說(shuō)明該疾病和肽分子模式之間可以在上述陣列輔助下建立相關(guān)性。
除了確定的單克隆抗體的表位，該完全肽分子庫(kù)也適合于通過血清特征和被診斷疾病的相關(guān)性來(lái)追蹤診斷性標(biāo)記，例如，自身免疫性疾病或過敏癥(例如，風(fēng)濕病、花粉病、哮喘、食物過敏癥、紅斑狼瘡、青少年性糖尿病等)、傳染性疾病(例如，流感、流感樣感染、AIDS、肝炎、麻疹、流行性腮腺炎、腦膜炎、胃潰瘍、瘧疾、南美洲錐蟲病等)、癌癥(例如肺癌、肝癌、腸癌、腎癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、淋巴癌等)、和迄今未知或病因可疑的特殊性疾病(如，心臟病、中風(fēng)、帕金森氏病、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、克羅恩病、克-雅病等)。
另外，本方法并不局限于單一疾病，非常多的疾病可以并行診斷，或者目前尚未知道的病因的疾病可以利用被鑒定的肽進(jìn)行追蹤。
該陣列也適合用于尋找相互作用配偶體，例如，在這種情況下該完全分子庫(kù)染色可以用于人類或病毒基因產(chǎn)物的相互作用配偶體。例如，用純化的病毒粒子進(jìn)行染色，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合基序可以被快速的鑒定出來(lái)，而且通過將相應(yīng)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類肽序列進(jìn)行比較，可以鑒定出病毒進(jìn)入人類細(xì)胞的入口位點(diǎn)。
更長(zhǎng)的結(jié)合基序，特別是那些經(jīng)常發(fā)生的具有螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合基序，可以通過特定的分子庫(kù)被查明，在該分子庫(kù)中并不是每個(gè)氨基酸都是隨機(jī)的，而是只有位于來(lái)源于該結(jié)構(gòu)特定位置的氨基酸是隨機(jī)的。通過這種方法，新的診斷性標(biāo)記物和目前未知的相關(guān)性可以在疾病和特定抗體反應(yīng)性之間被找到，包括例如，用于腫瘤疾病、心血管疾病如心肌梗塞的標(biāo)記物，用于多發(fā)性硬化癥和帕金森氏病的標(biāo)記物，用于所有類型的自身免疫性疾病和過敏癥的標(biāo)記物和用于所有類型的傳染性疾病的標(biāo)記物。
獲得的標(biāo)記物的特征可以一方面通過與特定臨床癥狀的相關(guān)性進(jìn)行診斷性預(yù)測(cè)。但最新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記物也可以被單獨(dú)涂布到支持物上以進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
同樣的也適用于稱為單基因產(chǎn)物陣列的涂布。人類具有平均編碼約500種氨基酸的約100,000個(gè)基因。在幾年內(nèi)這些基因中超過90％都會(huì)被人們所了解。如果每一個(gè)基因產(chǎn)物被平均100個(gè)重疊15肽分子所覆蓋，而其中每一個(gè)肽分子彼此之間被替換掉5個(gè)氨基酸，那么就需要約1千萬(wàn)種不同的肽分子以覆蓋人類所有的基因產(chǎn)物。這樣的陣列在圖17中進(jìn)行了圖示。
中等目標(biāo)也可以采用每個(gè)肽覆蓋人類基因產(chǎn)物的一部分的表達(dá)陣列的形式，例如，“致癌基因陣列”、“免疫基因陣列”等。
如上面對(duì)完全肽文庫(kù)所描述的，這些陣列特別適合用于分析自身免疫疾病病人的血清抗體特征(見上)。預(yù)期可以得到特別清晰的信號(hào)，因?yàn)檫@里使用了個(gè)體確定性和相對(duì)較長(zhǎng)的肽的陣列。
這些陣列也特別適合用于分析病因不明病人的血清。這些陣列可以，例如，回答關(guān)于多發(fā)性硬化癥或帕金森氏病或不同癌癥是否具有自身免疫成分的問題。的，這些陣列特別適合作為這些疾病的診斷工具。
如上面所描述的，該陣列也可以用于尋找相互作用配偶體，從而，例如，有助于回答關(guān)于哪種人類基因產(chǎn)物是特定病毒的入口位點(diǎn)的問題。
類似的，也進(jìn)行了疾病和與其它分子文庫(kù)例如D-肽文庫(kù)或寡糖文庫(kù)的結(jié)合模式相關(guān)性的嘗試。該方法不局限于人類疾病，也適合于檢查法醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)問題以及分析從植物提取液到微生物提取液的其它流體。
在另外一個(gè)用途中，感興趣的潛在治療性分子，例如，不能被人消化性酶類所降解的D-肽類被排列在支持物上，然后與醫(yī)學(xué)相關(guān)分子，特別是病原體特異性蛋白或其混合物相接觸。這樣就允許對(duì)這些醫(yī)學(xué)相關(guān)分子對(duì)應(yīng)的結(jié)合配偶體進(jìn)行特異性而且快速的搜尋。類似的，也可以用于尋找酶配基、酶底物類似物酶式抑制因子。
最后，與醫(yī)學(xué)相關(guān)分子的結(jié)合也可以用，例如，生物素?；驘晒鈽?biāo)記的方法進(jìn)行檢測(cè)，從而使得與病原體至少部分結(jié)合的D-肽類或aptamer可以被鑒定。然后這些D-肽類或aptamers可以被一個(gè)接一個(gè)的測(cè)試以確定它們是否抑制該病原體。例如，如果病原體的一種酶類(例如，HIV蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)以適當(dāng)?shù)牧看嬖?，這種酶就可以被熒光標(biāo)記(直接標(biāo)記或在抗體輔助下標(biāo)記，或被一個(gè)可用單抗染色的小肽標(biāo)記物的重組表達(dá)所標(biāo)記)。從而就可以確定它結(jié)合了哪種D-肽類。然后由酶活性引起的其它染色反應(yīng)被進(jìn)行。例如，HIV蛋白酶的切割作用可以沉淀一種可被檢測(cè)的熒光多肽。因此我們獲得了不僅結(jié)合酶而且同時(shí)抑制該酶的D-肽類。
這樣陣列的方便用途在圖18中進(jìn)行了圖示。這使得酶類可以通過兩種方法檢測(cè)。
1.結(jié)合該酶(圖18，44)但不阻斷其活性的肽類的鑒定和，2.結(jié)合該酶同時(shí)阻斷其活性的肽類的差異性鑒定。后者的D-肽類分子組件尤其適合用作潛在療法的組成部件。
在下一個(gè)步驟中，具有抑制效應(yīng)的結(jié)合組件可以通過其它的單體或彼此結(jié)合而被延長(zhǎng)，然后再進(jìn)行對(duì)抑制作用的其它檢測(cè)。
為了確定分子被添加到哪一個(gè)結(jié)合在支持物上分子上，在支持物與血清或DNA接觸之前或之后，可以將血清或DNA和一種可以與該血清或DNA反應(yīng)，特別是可以形成偶聯(lián)鍵，的物質(zhì)相接觸。更為合適的，在與血清或DNA接觸前，和血清或DNA反應(yīng)的物質(zhì)先用一種可以被激發(fā)光的物質(zhì)，特別是一種可以被激光激發(fā)發(fā)射熒光的物質(zhì)對(duì)其進(jìn)行染色。這樣的染料在市場(chǎng)上可以買到，例如，名稱為“Cy3”、“Cy5”、“FITC”或“TRITC”的染料，目前整個(gè)系列的這種抗體的結(jié)合物已經(jīng)可以方便的得到(例如，結(jié)合Cy5羊抗人抗體)。
如果待測(cè)血清和一種對(duì)IgE特異性的檢測(cè)試劑相接觸，那么很有可能可以確定病人體內(nèi)存在的過敏性反應(yīng)，因?yàn)镮gE在體內(nèi)負(fù)責(zé)如哮喘或花粉熱之類的過敏反應(yīng)。非過敏患者的血清內(nèi)幾乎沒有IgE，而過敏患者的血清內(nèi)則有不同數(shù)量的IgE，數(shù)量的差異可以揭示不同的變態(tài)反應(yīng)原。最后，本發(fā)明使得尋找來(lái)源于高度復(fù)雜分子庫(kù)的一個(gè)目標(biāo)分子的特定結(jié)合配偶體成為可能，而且通過同步的鑒定許多(具有不同結(jié)合能力)的結(jié)合配偶體使得，尋找負(fù)責(zé)將配基結(jié)合到目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)參數(shù)成為可能。用這種方法，指導(dǎo)結(jié)構(gòu)的路徑就被大大簡(jiǎn)化了。例如，用上述方法獲得的信號(hào)模式可以被自動(dòng)的與所用文庫(kù)中已鑒定配基的結(jié)構(gòu)參數(shù)或結(jié)構(gòu)模型相關(guān)聯(lián)。
上述方便的涂布絕不僅限于肽陣列或?qū)ρ宓臋z查。此外，在總是可以方便的檢測(cè)大量的用于結(jié)合的結(jié)合配偶體的情況下，還會(huì)有豐富的其它可能的涂布。這特別適用于兩個(gè)分子庫(kù)的組合，其中一個(gè)分子庫(kù)代表該陣列，而血清只是第二個(gè)文庫(kù)可用的許多對(duì)象之一例子。結(jié)合配偶體基于其在陣列中的位置在該陣列中被鑒定，而其他方便的檢測(cè)方法，例如質(zhì)譜可以被用于鑒定第二個(gè)結(jié)合配偶體。
隨后，與根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施以及根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的使用相關(guān)的一些例子參考附圖進(jìn)行了描述。
附圖如下所述圖1組合合成I. 適合于組合合成的物質(zhì)(2)被涂布于支持物(1)II. 各種不同的物質(zhì)(2)被偶聯(lián)到(11)支持物(1)III.未發(fā)生偶聯(lián)的物質(zhì)(2)被洗去IV. 保護(hù)基(14)被分離V. 更多物質(zhì)(2)被涂布于支持物(1)，開始下一個(gè)循環(huán)。
圖2共聚焦激光顯微鏡作為陣列的讀出器原則如果陣列用共聚焦顯微鏡進(jìn)行評(píng)估，那么所有三個(gè)維度空間都必須被搜索直到所需信號(hào)可以被唯一確定為止。與此相比，例如，一個(gè)掃描器，要快得多1.它不只有一個(gè)可用激光，而是與一個(gè)一維發(fā)光二極管陣列并行使用。
2.既然發(fā)光二極管的光幾乎平行透射支持物，那么用掃描器時(shí)第三個(gè)維度上的搜索就不再必要了。
圖3用于組合合成的平版印刷方法。
在傳統(tǒng)的平版印刷合成方法中，通過光能(圖3，I.)作用或光能敏感保護(hù)基團(tuán)斷裂(圖3.II.)作用，使活化的單體可以接近合成位點(diǎn)，藉此，可能進(jìn)行位點(diǎn)可確定的鏈增長(zhǎng)反應(yīng)。這兩種方法的的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們都具有高分辨率。而它們的一個(gè)缺點(diǎn)是整個(gè)合成循環(huán)是在犧牲質(zhì)量的代價(jià)下對(duì)每種單體一輪一輪的進(jìn)行。
Ia.經(jīng)過光能(16)作用后，一個(gè)光敏保護(hù)層被定址精確地(18)上被除去。
Ib.用這種方法，用于組合合成的單體(2)可以被被定址精確地(18)偶聯(lián)(11)到支持物(1)。
IIa.經(jīng)過光能(16)作用后，光敏保護(hù)基團(tuán)(16)被被定址精確地(18)分離下來(lái)。
IIb.用這種方法，用于組合合成的單體(2)可以被定址精確地(18)偶聯(lián)(11)到支持物(1)。
圖4用于合成的平版印刷方法的缺點(diǎn)在所有的印刷方法中，整層的不同單體(2)通常都被涂布于支持物(1)上，它們都是在下一層單體被印上之前通過一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)完成的。在圖3所示的用于合成的平版印刷方法中，每一種單體(2)都必須被分別按順序涂布、偶聯(lián)(11)以及洗去過量單體。這意味著對(duì)于相同的寡聚物陣列的合成，平版印刷合成方法必須比打印過程多進(jìn)行Nx個(gè)偶聯(lián)循環(huán)。數(shù)字N在這里代表不同的單體(2)數(shù)量，即，對(duì)于寡肽陣列合成，平版印刷合成法與打印方法相比需要多20x個(gè)偶聯(lián)循環(huán)。
圖5用于組合合成的打印方法(Druckverfahren)Ia.含有適合于組合合成的物質(zhì)(2)的調(diào)色劑顆粒或轉(zhuǎn)印單元(19)被定址精確地(18)涂布于合適的衍生載體(1)的上。
Ib.然后，用于組合合成的單體(2)被從調(diào)色劑顆?；蜣D(zhuǎn)印單元(19)中釋放出來(lái)，接著定址精確地(18)偶聯(lián)(11)到支持物(1)上。
IIa.含有適合于組合合成的物質(zhì)(2)的流體被定址精確地(18)涂布于合適的衍生載體(1)上。
IIb.然后，用于組合合成的單體(2)被尋址精確地(18)偶聯(lián)到支持物(1)上。
IIa和IIb描述了標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的用于組合合成的打印方法。Ia和Ib描述了本發(fā)明的新的方法。它結(jié)合了打印方法和平版印刷方法的優(yōu)勢(shì)。這里，如在平版印刷方法中一樣，激光的高分辨率也被用來(lái)獲得密集的分子庫(kù)。另一方面，如同在其他的打印方法中，整層的不同單體可以被并行的涂布到支持物上。
圖6單體定點(diǎn)的缺點(diǎn)當(dāng)紙用染料打印時(shí)，被打印的發(fā)色團(tuán)必須盡可能少的擴(kuò)散，因?yàn)檫@會(huì)干擾被打印圖片的鮮明度。這可以通過使所涂布的發(fā)色團(tuán)非?？焖俚墓潭ㄓ诖蛴↑c(diǎn)上來(lái)實(shí)現(xiàn)，快速固定是在調(diào)色劑流體中使用高揮發(fā)性組分的結(jié)果。此外，所用的發(fā)色團(tuán)相對(duì)較大，也相當(dāng)程度上限制了其擴(kuò)散速率。另外，使用了特殊的具有高吸收性的高度光滑的紙張。
然而，所涂布的單體(用于組合合成)會(huì)發(fā)生很大程度的擴(kuò)散，因?yàn)橛糜诤铣傻娜軇┚哂蟹浅５偷膿]發(fā)性而且需要較多時(shí)間偶聯(lián)反應(yīng)配偶體。所用的單體相對(duì)也較小，這也會(huì)大大提高其擴(kuò)散速率。特殊紙張一般不適合用作分子庫(kù)的支持物。
圖7普通調(diào)色劑(46、47、48)和“氨基酸調(diào)色劑”(46、49、2、50)的顆粒圖示比較-室溫下普通調(diào)色劑中的固體聚苯乙烯小球(47)的對(duì)應(yīng)物在這種情況下是熔點(diǎn)約為71℃的二苯基甲酰胺(50)。
-兩種情況下的磁性組分(46)由磁性顆粒控制。
-氨基酸調(diào)色劑含有活化的氨基酸(49、2)而不是發(fā)色團(tuán)，該活化氨基酸在N-末端有保護(hù)基。
圖8激光打印機(jī)的運(yùn)行方式由含有磁性組分的聚苯乙烯小珠組成的調(diào)色劑顆粒(19)由于磁性組分的作用而附著到磁力輥(21)上。在那里它們被帶上靜電荷，然后作為帶電的結(jié)果跳躍到一個(gè)激光可記錄的滾筒(22)的定址精確區(qū)域上。這些區(qū)域是通過激光而確定的，激光通過開關(guān)的打開和關(guān)閉而記錄下特定區(qū)域。作為電荷吸引力的結(jié)果，調(diào)色劑顆粒(19)從磁力輥(21)跳躍到被激光所記錄的滾筒(25)特定區(qū)域上。從這里調(diào)色劑顆粒再次跳躍到支持物(24)(例如，紙或復(fù)印膜)上并且被一個(gè)加熱壓光輥(25)所熔化或在用氨基酸調(diào)色劑顆粒的情況下，吸收的物質(zhì)被活動(dòng)化(26)。
圖9彩色激光打印機(jī)的運(yùn)行方式與黑白打印機(jī)(圖8)類似，對(duì)于彩色激光打印機(jī)調(diào)色劑顆粒也是由聚苯乙烯和磁性組分所組成。它們由于磁性組分的作用而附著到一個(gè)磁力輥(21)上。在那里它們被帶上靜電荷，作為帶電的結(jié)果跳躍到一個(gè)激光可記錄的滾筒(22)的定址精確區(qū)域上。這些區(qū)域是通過激光而確定的，激光通過開關(guān)的打開和關(guān)閉而記錄下特定區(qū)域。作為電荷吸引力的結(jié)果，調(diào)色劑顆粒(19)從磁力輥(21)跳躍到被激光所記錄的滾筒(25)特定區(qū)域上。從這里調(diào)色劑顆粒在跳躍到支持物(24)(例如，紙或復(fù)印膜)上并且被一個(gè)加熱壓光輥(25)所熔化或在氨基酸調(diào)色劑顆粒的情況下，吸收的物質(zhì)被活動(dòng)化(26)。
與黑白激光打印機(jī)不同(圖8)，彩色激光打印機(jī)必須不僅打印一種調(diào)色劑(20)顆粒，而且是以精確的彼此緊挨的方式打印4種不同的彩色調(diào)色劑(31、32、33、34)顆粒(20)。
解決此問題的方法之一在圖9中進(jìn)行了圖示
-所用的激光可記錄滾筒(22)比黑白激光打印機(jī)所用的(圖8)要大得多-按這種方式激光可以在滾筒上記錄一整張紙的內(nèi)容-激光用第一種顏色在激光可記錄滾筒(22)上進(jìn)行記錄-磁力輥(21)將第一種顏色的調(diào)色劑(21、31)轉(zhuǎn)印到可記錄滾筒(22)上-在那里調(diào)色劑顆粒(21、31)跳躍到已記錄的可記錄滾筒(22)上-可記錄滾筒(22)以機(jī)械方式非常緊密的和同樣大的第二個(gè)滾筒(35)結(jié)合在一起-在這個(gè)滾筒(35)上支持物(1)被涂布并固定-兩個(gè)滾筒(22和35)以相反方向轉(zhuǎn)動(dòng)-從而使第一種調(diào)色劑(27)被轉(zhuǎn)印到固定于滾筒(35)的支持物(1)上-激光用第二種顏色在可記錄滾筒(22)上進(jìn)行記錄-然后另外交變的磁力輥(21、32、33、34)移向可記錄滾筒(22)-從而將其它的顏色(28、29、30)轉(zhuǎn)印到可記錄滾筒(22)上-在那里其它的顏色(28、29、30)被轉(zhuǎn)印到支持物(1)上-只有到整個(gè)打印過程完成后，支持物才會(huì)被釋放一個(gè)被稱為轉(zhuǎn)印單元的裝置可以被用來(lái)代替支承輥(35)，該轉(zhuǎn)印單元以反饋機(jī)制不斷的相對(duì)于可記錄滾筒而進(jìn)行調(diào)整。
圖10市售激光打印機(jī)具有600dpi的分辨率，即，被該裝置打印的每個(gè)點(diǎn)具有約40μm的直徑。
圖11一個(gè)可買到的具有600dpi分辨率打印機(jī)的打印圖像用一個(gè)可買到的具有600dpi分辨率的掃描儀進(jìn)行掃描。這里被掃描的激光打印圖像的掃描結(jié)果有代表性的顯示了在更高放大率下也沒有錯(cuò)置的點(diǎn)。
圖12組合肽文庫(kù)的復(fù)雜性。
圖13用于組合合成的裝置。
不像圖9中所描述的彩色激光打印機(jī)，在這個(gè)裝置中熱輥筒(25)被一個(gè)可以將氣態(tài)或液態(tài)的偶聯(lián)反應(yīng)物或清洗溶液帶到旋轉(zhuǎn)支承輥(35)，并使之接觸的設(shè)備(36)所代替。氣態(tài)物質(zhì)(也包括熱空氣)在一個(gè)寬噴嘴的輔助下進(jìn)行供給，而流體與固定于支承輥(35)上的分子庫(kù)的支持物(1)相接觸則是通過，例如使用無(wú)極皮帶進(jìn)行(36)。一行紅外光源(36)也可以被用來(lái)激活物質(zhì)(2)。具有四種不同顏色調(diào)色劑(31，32，33，34)的交變磁力輥(Wechselmagnetwalze)(21)被替換為具有20種不同氨基酸調(diào)色劑(2，19)的交變磁力輥。
圖14用于組合合成的具有內(nèi)置反饋機(jī)制的裝置掃描單元(37)掃描涂布于支持物(1)或支承輥(35)的模式(38)，然后將其和以前保存的相同的模式(39)進(jìn)行比較。如果與預(yù)期值產(chǎn)生了偏差，則加載到打印機(jī)內(nèi)存中的圖像，將電偏移該偏差(40)。通過這種方法轉(zhuǎn)印單元(19)或其中含有的物質(zhì)(2)可以被可重復(fù)地定址準(zhǔn)確地并列或重疊印刷。
圖15完全的肽分子庫(kù)所示的十聚體混合物的陣列可以在上述的方法的輔助下合成到支持物上。以N表示的所有可能的氨基酸組合都被該陣列所覆蓋。
圖16疾病與肽分子模式的相關(guān)性用對(duì)照血清和病人血清對(duì)高度復(fù)雜的肽陣列的差異性染色一方面產(chǎn)生可以被兩種血清(42)識(shí)別的肽(和肽序列)，另一方面產(chǎn)生被病人血清(43)特異性識(shí)別的肽。這使得鑒定病人特異性染色模式成為可能。在所給的例子中，與表達(dá)的幽門螺旋桿菌基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的肽被鑒定出來(lái)(43)，該細(xì)菌會(huì)引起胃潰瘍。
本方法并不局限于單一疾病，可以用于同時(shí)診斷幾種疾病，或者利用被鑒定的肽分子對(duì)目前未知的病因進(jìn)行的追蹤。
圖17基因產(chǎn)物陣列，單基因產(chǎn)物陣列約100,000個(gè)人類基因(即，基因組)中每個(gè)基因編碼了平均略少于500個(gè)氨基酸。幾年內(nèi)這些基因中的大部分將被了解。每一種相應(yīng)的基因產(chǎn)物可以被平均100個(gè)重疊的15基體的多肽分子所代表，這些多肽之間相互被有5個(gè)氨基酸的偏差。因而總體上需要約1千萬(wàn)種不同的多肽分子以覆蓋全部100,000種人類的基因產(chǎn)物(即其proteom)。
圖18搜索酶抑制因子兩種不同的檢測(cè)酶的方法可以被使用a.鑒定和酶(44)結(jié)合但不阻斷其活性的多肽。
b.差異性鑒定與酶結(jié)合同時(shí)阻斷其酶活的多肽(45)。后者D-多肽的組件適合作為潛在治療方法的組成部件。
圖19普通商業(yè)性調(diào)色劑和各種“氨基酸調(diào)色劑”打印質(zhì)量的比較各種調(diào)色劑被加載到調(diào)色劑盒中，然后用激光打印機(jī)在普通紙上打印。氨基酸調(diào)色劑用其中含有的磁性顆粒進(jìn)行著色。
圖20賴氨酸和其后的天冬氨酸被成功的均勻偶聯(lián)到衍生紙的游離氨基基團(tuán)上。然后兩種不同肽分子以棋盤方式被合成于衍生紙的支持物上。用這種方法產(chǎn)生了與圖20所示的氨基酸1到10對(duì)應(yīng)的氨基酸調(diào)色劑。在圖20中標(biāo)記的氨基酸1到5被以常規(guī)的橢圓型模式11進(jìn)行打印，而標(biāo)記的氨基酸6到9則以第二種常規(guī)的矩形模式12被打印。兩種模式以棋盤方式互相結(jié)合。在最后一個(gè)步驟中，N-末端氨基酸天冬氨酸均勻的與支持物再次偶聯(lián)，然后分離保護(hù)基。
在(A)中所示的多肽合成位點(diǎn)與(B)中可見的灰色橢圓或矩形對(duì)應(yīng)。條形紙用奶粉在PBS溶液中進(jìn)行封閉，然后和抗-FLAG M1抗體或抗生物素抗體一起溫育。結(jié)合的第一種抗體用過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體(底物13)或堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體(底物14)進(jìn)行檢測(cè)。
圖21將具有DMTr保護(hù)基的核苷在5`羥基末端偶聯(lián)到固定于固體底物的NH2基團(tuán)上。
圖22在寡聚物合成中常用的保護(hù)基(用于堿基和磷酸基團(tuán))。
圖23未反應(yīng)5`羥基末端的“加蓋”。
圖24三價(jià)磷酸基團(tuán)的氧化。
圖25根據(jù)權(quán)利要求1的方法的圖示說(shuō)明。
a)彩色激光打印機(jī)到寡聚體合成機(jī)的轉(zhuǎn)變(圖13)將市售彩色激光打印機(jī)的程序控制在如下方面進(jìn)行修改-偶聯(lián)到支承輥(或轉(zhuǎn)印滾筒)的支持物(特別是用于肽分子合成或寡肽分子合成的主要由聚苯乙烯組成的衍生拷貝膜或用于肽分子合成或寡肽分子合成的衍生紙)保持固定于支承輥(或轉(zhuǎn)印滾筒)的狀態(tài)，直到外部信號(hào)終止其對(duì)支承輥的固定狀態(tài)。
-用24個(gè)不同的附有調(diào)色劑容器的交變磁力輥代替4個(gè)不同的附有調(diào)色劑容器的交變磁力輥，在可記錄滾筒附近起控制作用。
可選的，轉(zhuǎn)印單元也可以順次用于6臺(tái)改裝的彩色激光打印機(jī)中，其每一個(gè)含有4個(gè)不同的調(diào)色劑容器。因此，一層中總共24種不同的調(diào)色劑顆粒被涂布于轉(zhuǎn)印單元。根據(jù)設(shè)備的不同，在事先測(cè)量激光定位，在打印過程中予以考慮。
另外，一臺(tái)由如下部分組成的外部設(shè)備被構(gòu)建-一個(gè)加熱單元，特別是使用紅外光能或熱空氣鼓風(fēng)機(jī)(heiβluftfon)進(jìn)行加熱-一個(gè)旋轉(zhuǎn)滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時(shí)間程控的方式被轉(zhuǎn)印到固定于支承輥或轉(zhuǎn)印單元上的支持物上-一個(gè)旋轉(zhuǎn)滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時(shí)間程控的方式被從固定于支承輥的支持物上導(dǎo)出b)另一臺(tái)彩色激光打印機(jī)到寡聚體合成機(jī)的轉(zhuǎn)變(圖14)支持物被固定于可買到的彩色激光打印機(jī)轉(zhuǎn)印滾筒的無(wú)極皮帶上。在支持物上，特別是在轉(zhuǎn)印單元上，裝有可以被光電掃描儀單元所識(shí)別的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)允許轉(zhuǎn)印單元的位置以及固定于其上的支持物的位置相對(duì)于負(fù)責(zé)以反饋機(jī)制轉(zhuǎn)印調(diào)色劑顆粒的激光的位置進(jìn)行調(diào)整。
另外，一臺(tái)由以下部分組成的外部設(shè)備被構(gòu)建-一個(gè)加熱單元，特別是使用紅外光能或熱空氣鼓風(fēng)機(jī)進(jìn)行加熱-一個(gè)槽，利用它各種不同的流體能夠以時(shí)間程控的方式被轉(zhuǎn)印到固定于轉(zhuǎn)印單元的支持物上-一個(gè)旋轉(zhuǎn)滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時(shí)間程控的方式被從固定于支承輥的支持物上導(dǎo)出。
所述的具有固定于其上的支持物的轉(zhuǎn)印單元可以在每偶聯(lián)循環(huán)之間被從所述的其它彩色激光打印機(jī)中移去，然后裝入到所述的其它外部設(shè)備中。在各種不同的流體被導(dǎo)入和導(dǎo)出后，使用光電掃描儀單元，將轉(zhuǎn)印單元相對(duì)于轉(zhuǎn)印調(diào)色劑顆粒的激光的位置進(jìn)行精確重調(diào)。
c)氨基酸調(diào)色劑的制備用保護(hù)基，特別是fMoc保護(hù)基保護(hù)的各種氨基酸，特別是其相應(yīng)的酸酐和磁性顆粒一起在75℃條件下被溶解于二苯基甲酰胺中，驟然冷凍然后充分磨碎，以產(chǎn)生盡可能均一的顆粒，該顆粒直徑約1-200μm，特別是5-40μm。這些顆粒被裝填到調(diào)色劑盒中然后打印到紙上。圖19比較了普通調(diào)色劑和各種氨基酸調(diào)色劑的打印質(zhì)量。
d)亞磷酰胺調(diào)色劑顆粒的制備不同的具有保護(hù)基的亞磷酰胺和磁性顆粒一起在25℃條件下被溶解于二苯基甲酰胺/乙腈中，驟然冷凍然后將可溶性組分在低溫下升華。將得到的產(chǎn)物進(jìn)行充分研磨以產(chǎn)生盡可能均一的顆粒，該顆粒直徑約為1-200μm，特別是2-40μm。這些顆粒被裝填到調(diào)色劑盒中然后打印到紙上。
e)用激光打印機(jī)合成多肽陣列在例(c)中描述的氨基酸(也見于圖19)被用于合成以棋盤方式相互嚙合的兩種肽模式(Peptidmustern)。首先將紙按照標(biāo)準(zhǔn)方法用游離氨基基團(tuán)進(jìn)行衍生。然后將另外兩種氨基酸按照標(biāo)準(zhǔn)方法均一的結(jié)合到紙上。使用例(c)中描述的分別的氨基酸調(diào)色劑，一個(gè)棋盤模式的橢圓和更換調(diào)色劑盒后一個(gè)互相嚙合模式的矩形被打印到衍生紙上?？偣?層氨基酸被打印，每一層打印后都接著進(jìn)行包含于氨基酸調(diào)色劑中的具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)以及N-末端保護(hù)基團(tuán)的去除。在另一個(gè)步驟中，最后一個(gè)N-末端氨基酸按照標(biāo)準(zhǔn)方法被均一的偶聯(lián)，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行位于多肽鏈側(cè)鏈上的保護(hù)基的去除。在該方法中，兩種以棋盤方式互相嚙合的多肽(N-末端)-DYKDDDDK-(支持物)和(N-末端)-DDEETTDK-(支持物)被合成。
f)按照標(biāo)準(zhǔn)方法用激光打印機(jī)合成的多肽模式的檢測(cè)例(e)中所描述的偶聯(lián)有兩種棋盤嚙合多肽模式的衍生紙被切成小片，然后，首先用合適的水相溶液，例如2％的奶粉PBS溶液對(duì)非特異性偶聯(lián)進(jìn)行封閉。將兩種不同的單克隆抗體(來(lái)源于鼠)也用同樣的緩沖液稀釋。然后，將不同的紙片用兩種單抗中的一種通過輕微振蕩60分鐘進(jìn)行著色，然后洗滌三次。偶聯(lián)到酶上的羊抗鼠抗體被稀釋于2％奶粉PBS溶液中；將支持物用得到的溶液通過輕微振蕩60分鐘弄濕，然后洗滌三次。圖20顯示了用不同的酶底物對(duì)紙片的染色結(jié)果單克隆鼠抗體FLAG M1(Sigma)特異性識(shí)別用激光打印機(jī)產(chǎn)生的矩形棋盤多肽模式的多肽(N-末端)-DYKDDDDK-(支持物)。
g)利用改裝的彩色激光打印機(jī)合成完全5肽分子庫(kù)將一個(gè)合適的平面支持物按照標(biāo)準(zhǔn)方法用游離氨基酸基團(tuán)進(jìn)行衍生。紙或基本上由聚苯乙烯組成的拷貝膜特別適合于此方法。利用為專家所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)水條件下fMoc多肽合成方法，一個(gè)合適的間隔子，特別是2-3個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的間隔子，首先被合成于支持物的游離氨基基團(tuán)上。隨意的2或3個(gè)其它的被偶聯(lián)的氨基酸層，優(yōu)選的是19或20種不同氨基酸(即，任選地不含半胱氨酸)混合物，可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法被加到該間隔子上。然后，衍生的支持物被固定到例(a)或例(b)中所描述的經(jīng)過改進(jìn)的彩色激光打印機(jī)的支承輥或轉(zhuǎn)印單元上。
在例(a)或(b)中所描述的經(jīng)過改進(jìn)的彩色激光打印機(jī)的調(diào)色劑容器含有如例(5)所述的各種氨基酸調(diào)色劑。
然后打印過程被起始，使得特別是19或20種氨基酸調(diào)色劑基本上按照普通彩色激光打印機(jī)的運(yùn)行原理被并列打印到精確位置上。從而使支持物被分為19或20個(gè)分離的、定址準(zhǔn)確的區(qū)域。接著被打印于精確位置的活化氨基酸，特別是氨基酸酸酐的偶聯(lián)反應(yīng)在約65℃條件下進(jìn)行5-30分鐘。在該過程中具有牢固固定于其上的衍生支持物的支承輥(或轉(zhuǎn)印滾筒)在一行紅外燈照射下勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，這些紅外燈在例(a)或例(b)中被描述為加熱單元。
然后，在例(a)或例(b)中描述的未轉(zhuǎn)化的氨基酸調(diào)色劑被洗掉，fMoc保護(hù)基團(tuán)被按照標(biāo)準(zhǔn)方法分離去掉，再次洗滌后，用例(a)或例(b)中描述的加熱單元將支持物烘干。在這段時(shí)間中支持物保持牢固固定于支承輥(或轉(zhuǎn)印滾筒)的狀態(tài)，該滾筒在整段時(shí)間內(nèi)都在勻速轉(zhuǎn)動(dòng)。
然后打印過程被再次起始，使得19或20種不同的氨基酸調(diào)色劑也再次以并列或重疊方式被打印到精確位置上。這次支持物被優(yōu)選的分為192或202個(gè)定址精確的區(qū)域。如剛才所述的，活化的氨基酸被偶聯(lián)到支持物上，未轉(zhuǎn)化的氨基酸調(diào)色劑被洗去，以及fMoc保護(hù)基團(tuán)被去除。
再進(jìn)行3次類似的打印過程，從而將支持物優(yōu)選的分為195或205個(gè)定址精確的區(qū)域。任意的2或3層被偶聯(lián)的氨基酸，優(yōu)選的是19或20種不同氨基酸(即，半胱氨酸可以任選省略)混合物，可以被加到游離的氨基末端。
最后，所有的保護(hù)基，包括那些側(cè)鏈上的保護(hù)基被用10％硅烷三氟乙酸溶液分離除去，支持物用DMF和甲醇進(jìn)行洗滌和干燥，使得具有，例如，205＝3,200,000個(gè)不同區(qū)域的支持物產(chǎn)生于最后的作用中，其中每一個(gè)不同的區(qū)域代表了所有可能天然存在的C-末端偶聯(lián)的五肽之一。
h)利用改進(jìn)的彩色激光打印機(jī)在支持物上合成完全的12聚體的寡聚核苷酸庫(kù)如例(d)中所描述的，產(chǎn)生4種不同的亞磷酰胺調(diào)色劑顆粒，優(yōu)選的含有用于寡聚核苷酸合成的4種不同的活化單體。這些調(diào)色劑被加載到調(diào)色劑容器中，然后被用一臺(tái)改進(jìn)的彩色激光打印機(jī)打印到如例(a)或例(b)中所描述的載體上。
如例5中對(duì)完全5肽分子庫(kù)合成進(jìn)行的描述，一種按照標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)的具有游離氨基基團(tuán)(或羥基基團(tuán))的合適的支持物被使用。如果沒有作為第一步反應(yīng)的結(jié)果而存在，一種合適的接頭在被專家所熟悉的無(wú)水條件下按照標(biāo)準(zhǔn)合成方法被合成到游離氨基基團(tuán)(或羥基基團(tuán))上，它可以再次將游離氨基基團(tuán)(或羥基基團(tuán))固定于支持物上，不過這次這些基團(tuán)距離平面約有22個(gè)原子遠(yuǎn)。
如例5中對(duì)完全5肽分子庫(kù)合成進(jìn)行的描述，位于四種不同的亞磷酰胺調(diào)色劑顆粒中的單體在被四唑活化后通過加熱單元的作用被活動(dòng)化。然后它們偶聯(lián)到支持物2-10分鐘。
在標(biāo)準(zhǔn)條件下的用于寡聚核苷酸合成的活化亞磷酰胺(具有保護(hù)基)偶聯(lián)到固體支持物上，保護(hù)基的去除和洗滌步驟為專家所熟悉。
如例(g)中所描述的，未轉(zhuǎn)化的亞磷酰胺調(diào)色劑按照例(a)或(b)中的描述被洗去，DMTr保護(hù)基按照標(biāo)準(zhǔn)方法從亞磷酰胺的5`末端被分離掉，再次洗滌，然后如例(a)或(b)中的描述用加熱單元干燥支持物。在這段時(shí)間里，支持物保持牢固固定于支承輥的狀態(tài)。
所用的保護(hù)基的例子有-用于亞磷酰胺5`末端保護(hù)的4`，4`-二甲氧三苯甲游基氯(DMTr)(圖21)-用于腺嘌呤和胞嘧啶堿基保護(hù)的苯甲?；?圖22)-用于鳥嘌呤堿基保護(hù)的異丁酰基(圖22)-用于磷酸基團(tuán)保護(hù)的加氧基或β氰乙基(圖22)在單體被偶聯(lián)到支持物以后，在每一步驟中保留下來(lái)的所有游離5`羥基被“加蓋”使得它們不能夠參與以后的反應(yīng)(圖23)。三價(jià)磷酸基團(tuán)被氧化的最后步驟結(jié)束了合成循環(huán)(圖24)。
在DMTr保護(hù)基從亞磷酰胺的5`末端被分離后，支持物在下個(gè)步驟中如例(g)中所描述的被再次打印，使得支持物這次被分為42個(gè)獨(dú)立的區(qū)域。16種可能的二聚體核苷酸存在于每一個(gè)這樣的獨(dú)立區(qū)域中，這些核苷酸通過間隔子以3`末端偶聯(lián)到支持物上，其5`末端具有一個(gè)游離的羥基基團(tuán)。
該過程總共被重復(fù)10x次，每次都使用，例如，全部四種活化的亞磷酰胺，使得上述的16個(gè)獨(dú)立的區(qū)域被分為總共412個(gè)定址精確的區(qū)域，在每個(gè)合成步驟中，按如上所述對(duì)保留的游離5`羥基末端“加帽”后，進(jìn)行三價(jià)磷酸基團(tuán)的氧化以及用TCA去除DMTr保護(hù)基。
上面描述的合成方法與專家所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)寡聚核苷酸合成方法一致。不象所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)合成方法，寡聚核苷酸被固定在固體支持物上，使得在最后保護(hù)基被全部分離后，它們不會(huì)被從支持物上被分離掉，而是保持偶聯(lián)于支持物的狀態(tài)。
最后，所有保護(hù)基被用二氯甲烷和三氯乙酸分離掉，支持物用乙腈洗滌過后進(jìn)行干燥，從而在最后的作用中具有412＝16,777,216種不同區(qū)域的支持物被產(chǎn)生出來(lái)，每一個(gè)區(qū)域代表了所有的通過3`末端偶聯(lián)的12基體寡聚核苷酸之一。
i)用噴墨打印機(jī)合成肽陣列各種不同的具有保護(hù)基團(tuán)，特別是具有fMoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，及相應(yīng)的酸酐和異丙醇或NMP和二苯基甲酰胺一起進(jìn)行溶解。該流體被倒入多色調(diào)色劑盒內(nèi)，放入一臺(tái)基本上可買到的彩色噴墨打印機(jī)內(nèi)，然后按照例(g)中描述的方法打印到紙上。
所述的噴墨打印機(jī)事先被按照例(a)或例(b)中描述的彩色激光打印機(jī)類似的方法進(jìn)行改進(jìn)，使得支持物在重復(fù)的打印循環(huán)中相對(duì)與打印頭(Druckkopf)保持固定，藉此，優(yōu)選的使用一個(gè)旋轉(zhuǎn)的支承輥。如例(a)或例(b)中所描述的，一臺(tái)外部設(shè)備被構(gòu)建并由以下部分組成-一個(gè)加熱單元，特別是使用紅外光能或熱空氣鼓風(fēng)機(jī)進(jìn)行加熱-一個(gè)旋轉(zhuǎn)滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時(shí)間程控的方式被轉(zhuǎn)印到固定于支承輥的支持物上-一個(gè)旋轉(zhuǎn)滾筒，利用它各種不同的流體能夠以時(shí)間程控的方式被從固定于支承輥的支持物上導(dǎo)出將一個(gè)合適的平面支持物按照標(biāo)準(zhǔn)方法用游離氨基基團(tuán)進(jìn)行衍生。紙或基本上由聚苯乙烯組成的拷貝膜特別適合于此方法。利用為專家所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)水條件下的fMoc多肽合成方法，一個(gè)合適的間隔子，特別是2-3個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的間隔子，首先被合成于支持物的自由氨基基團(tuán)上。任意的2或3個(gè)其它的被偶聯(lián)的氨基酸層，優(yōu)選的是19或20種不同氨基酸(即，可以任意的省略半胱氨酸)混合物，可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法加到該間隔子上。
然后支持物可以任意的被二氯甲烷和二苯基甲酰胺的混合物所浸泡。二氯甲烷在轉(zhuǎn)印過程中被蒸發(fā)，藉此，衍生紙被固定于支持物上，該支持物可以相對(duì)于上述改進(jìn)的彩色噴墨打印機(jī)的打印單元而被移動(dòng)。
然后打印過程被起始，使得特別是19或20種不同的氨基酸調(diào)色劑基本上按照普通噴墨打印機(jī)的操作原理被并行地定址精確地打印。這樣，該支持物被劃分為19或20個(gè)相互獨(dú)立的，定址精確的區(qū)域。接著被打印于精確位置的活化氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)在約65℃條件下進(jìn)行5-30分鐘。在該過程中具有牢固固定于其上的衍生支持物的支承輥在一行紅外燈照射下勻速轉(zhuǎn)動(dòng)，這些紅外燈在例(a)或例(b)中被描述為加熱單元。
然后，未轉(zhuǎn)化的氨基酸調(diào)色劑在上述滾筒的輔助下被洗掉，fMoc保護(hù)基團(tuán)被按照標(biāo)準(zhǔn)方法分離去掉，用上述的加熱單元將支持物烘干。在這段時(shí)間中支持物保持牢固固定于支承輥的狀態(tài)，該輥在整段時(shí)間內(nèi)都在勻速轉(zhuǎn)動(dòng)。
然后打印過程被再次起始，使得19或20種不同的氨基酸調(diào)色劑再次以并列或?qū)盈B的方式被打印到精確位置上。通過這種方法使得這次支持物被優(yōu)選的分為192或202個(gè)定址精確的區(qū)域。如剛才所述的，活化的氨基酸被偶聯(lián)到支持物上，未轉(zhuǎn)化的氨基酸調(diào)色劑被洗去，以及fMoc保護(hù)基團(tuán)被去除。
再進(jìn)行3次類似的打印過程，從而將支持物優(yōu)選的分為195或205個(gè)定址精確的區(qū)域。任意的2或3層其它偶聯(lián)的氨基酸，優(yōu)選的是19或20種不同氨基酸(即，半胱氨酸可以隨意省略)混合物，可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法被加到該陣列的游離的氨基末端。
最后，所有的保護(hù)基，包括那些側(cè)鏈上的保護(hù)基被用10％硅烷三氟乙酸溶液分離除去，支持物用DMF和甲醇進(jìn)行洗滌和干燥，使得具有，例如，205＝3,200,000個(gè)不同區(qū)域的支持物產(chǎn)生于最后的作用中，其中每一個(gè)不同的區(qū)域代表了所有可能天然存在的C-末端偶聯(lián)的五肽之一。
j)用具有固定于其上的肽分子庫(kù)的支持物檢測(cè)血清在例(g)中描述的完全肽分子庫(kù)被用病人血清進(jìn)行著色，其中非特異性偶聯(lián)反應(yīng)首先用合適的水相溶劑，例如2％的奶粉PBS溶液進(jìn)行封閉，然后將血清用相同的緩沖液稀釋。接著將支持物用血清通過輕微搖動(dòng)60分鐘弄濕，然后洗滌3次。
來(lái)源于血清的結(jié)合的人類抗體被通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè)。羊抗人抗體或抗體結(jié)合蛋白，如蛋白質(zhì)G或蛋白質(zhì)A被用于此目的。這些檢測(cè)試劑被偶聯(lián)到諸如過氧化物酶或磷酸酶的酶類或染料或如Cy5或碘131的放射活性物質(zhì)上。
檢測(cè)試劑被稀釋于2％的奶粉PBS溶液中，支持物用該溶液通過輕微搖動(dòng)60分鐘弄濕，然后洗滌3次。酶的作用可以產(chǎn)生一種有色的沉淀物，它可以通過可買到的掃描儀被讀出。對(duì)結(jié)合放射活性或熒光的定址精確檢測(cè)通過市售磷成像儀(phosphoimager)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
信號(hào)被分為總共10種不同的信號(hào)階段，每階段都分派給肽陣列的不同的5肽。
k)用具有固定于其上的肽分子庫(kù)的支持物鑒定血清中疾病特異性的反應(yīng)活性例(g)中描述的五肽分子庫(kù)被用如例(j)中描述的來(lái)源于50個(gè)胃潰瘍病人的血清進(jìn)行染色。這里幾個(gè)病人的血清可以被混合在一起使用或者每一份血清染色一個(gè)陣列。然后陣列中每一種肽分子的來(lái)源于幾個(gè)染色反應(yīng)的平均信號(hào)強(qiáng)度被確定。
然后用50份對(duì)照血清再進(jìn)行相同的步驟。這里每一種肽分子的來(lái)源于幾個(gè)染色反應(yīng)的平均信號(hào)強(qiáng)度也同樣被確定。
通過比較得到的平均值可以鑒定出一些與相應(yīng)的對(duì)照血清相比，被病人血清顯著染色的肽分子。結(jié)果在圖16中進(jìn)行了圖示。利用這些肽分子序列進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索在這些肽分子和胃幽門螺旋桿菌的基因產(chǎn)物之間建立了相關(guān)性。
l)用固定于支持物上的12基體寡聚核苷酸分子庫(kù)檢測(cè)病人DNA在例(h)中描述的具有固定于其上的完全寡聚核苷酸分子庫(kù)的支持物被用病人DNA進(jìn)行染色。采用了專家所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)方法。非特異性的偶聯(lián)用，例如，來(lái)源于鯡魚精子的DNA進(jìn)行飽和。
一份腫瘤組織樣品和一份健康組織樣品被同時(shí)從病人體內(nèi)取出，其中含有的基因組DNA在腫瘤特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物(對(duì)例如p53、p16、ras、c-myc、n-myc基因具有特異性)中的一對(duì)或幾對(duì)的幫助下進(jìn)行擴(kuò)增。腫瘤樣品用例如fluorescein-12-dUTP進(jìn)行標(biāo)記，而普通樣品用例如四甲基-若丹明-5-dUTP進(jìn)行標(biāo)記。樣品被混合在一起然后在支持物上進(jìn)行雜交。
結(jié)合熒光活性(或放射活性)的定址精確檢測(cè)是通過使用如例(j)中描述的可買到的磷成像儀而實(shí)現(xiàn)的。這里綠色熒光對(duì)紅色熒光的比值，即或產(chǎn)生的混合顏色作為例子被確定。每一種信號(hào)被分派給陣列中的不同12基體寡聚核苷酸。
這樣，對(duì)腫瘤疾病的預(yù)后非常重要的基因點(diǎn)突變就可以被診斷出來(lái)。與市售其他系統(tǒng)相比，多個(gè)基因可以用完全12基體寡聚核苷酸庫(kù)同時(shí)進(jìn)行分析。
在一種可選的方法中，取自病人的DNA被用作稱為Alu引物擴(kuò)增的模板，該引物可以和基因組中頻繁出現(xiàn)的Alu重復(fù)序列的邊緣發(fā)生雜交并且擴(kuò)增兩個(gè)Alu重復(fù)序列之間的非重復(fù)DNA。腫瘤樣品再次用例如fluorescein-12-dUTP進(jìn)行標(biāo)記，而四甲基-若丹明-5-dUTP則被普通樣品吸收。樣品被如上混合在一起然后在支持物上進(jìn)行雜交。
熒光信號(hào)按如上所述的方法讀出。在這種方法中，基因組的很大一部分都被掃描用于尋找普通組織和腫瘤組織之間的差異，因此新的腫瘤演進(jìn)產(chǎn)生重要的信息的診斷性標(biāo)記物可以被發(fā)現(xiàn)。
術(shù)語(yǔ)列表1支持物2物質(zhì)3基質(zhì)4第一種溶劑5轉(zhuǎn)印單元6朝支持物(1)方向的移動(dòng)7固態(tài)或凝膠態(tài)聚集態(tài)8改進(jìn)的物理環(huán)境9活動(dòng)化的物質(zhì)10朝支持物平面(1)方向的移動(dòng)11共價(jià)偶聯(lián)于支持物(1)的物質(zhì)(2)12第二種溶劑13液態(tài)14保護(hù)基15被光分解的保護(hù)基16電磁波，光17光敏保護(hù)層18在支持物(1)或陣列上的定址精確的區(qū)域19調(diào)色劑顆粒，轉(zhuǎn)印單元20調(diào)色劑存貯器21磁力輥22激光可記錄的滾筒23帶電的調(diào)色劑顆粒跳躍到可記錄滾筒(22)上24載體(1)上的調(diào)色劑顆粒25加熱壓光輥26熔化的或活動(dòng)化的調(diào)色劑顆粒27打印于紙上的第一種顏色28打印于紙上的第二種顏色29打印于紙上的第三種顏色30打印于紙上的第四種顏色31含有第一種顏色的調(diào)色劑顆粒(19)的調(diào)色劑存貯器
32含有第二種顏色的調(diào)色劑顆粒(19)的調(diào)色劑存貯器33含有第三種顏色的調(diào)色劑顆粒(19)的調(diào)色劑存貯器34含有第四種顏色的調(diào)色劑顆粒(19)的調(diào)色劑存貯器35彩色激光打印機(jī)的支承輥或轉(zhuǎn)印單元36偶聯(lián)反應(yīng)物、洗滌溶液或氣態(tài)物質(zhì)的供給37掃描單元38涂布于支持物(1)的模式39用掃描單元測(cè)量得到的模式和相同的以前保存的模式的比較40打印機(jī)內(nèi)存中的圖像電偏移預(yù)期值的偏差41未使用的42被病人血清和對(duì)照血清所識(shí)別的肽分子43被病人血清特異性識(shí)別的肽分子44可結(jié)合酶的陣列中的D-肽類45結(jié)合酶并同時(shí)使酶失活的陣列中的D-肽類46磁性組分47可熔性塑料組分48發(fā)色團(tuán)49用于組合合成物質(zhì)(2)的單體50以固態(tài)聚集態(tài)存在的溶劑
權(quán)利要求
1.一種將物質(zhì)，更為特別的是用于分子庫(kù)的組合合成的單體涂布到支持物的方法，其特征在于-物質(zhì)(2)首先被包埋進(jìn)基質(zhì)(3)中，基質(zhì)(3)至少由一種溶劑(4)組成，該溶劑(4)在低于90℃的條件下，優(yōu)選的在低于50℃的條件下以固態(tài)聚集態(tài)形式(7)存在，-物質(zhì)(2)被包埋至至少由一種溶劑(4)組成的基質(zhì)(3)中形成以單元形式被移動(dòng)(6)的轉(zhuǎn)印單元(5)，-然后該轉(zhuǎn)印單元(5)在低于90℃條件下，優(yōu)選的低于50℃條件下，以固態(tài)聚集態(tài)(7)形式被涂布(6)于支持物(1)，或該轉(zhuǎn)印單元(5)被溶解于一個(gè)第二種溶劑組分(12)中，并且在該溫度條件下處于液態(tài)聚集態(tài)(13)被涂布(6)于支持物(1)，其中，在該第二種溶劑組分(12)全部或部分蒸發(fā)后，它們呈現(xiàn)出固態(tài)或凝膠態(tài)聚集態(tài)(7)，-該轉(zhuǎn)印單元(5)在涂布到支持物(1)后保持固態(tài)或凝膠態(tài)聚集態(tài)(7)，-位于支持物(1)上，溶解于所述的第一種溶劑的物質(zhì)(2)，接著通過改變物理環(huán)境(8)，更為具體的在所述的第一種溶劑(4)內(nèi)，被活動(dòng)化，-被活動(dòng)化的物質(zhì)(2，9)通過一個(gè)物理過程進(jìn)入支持物平面(10)附近，-被活動(dòng)化的物質(zhì)(2，9)共價(jià)偶聯(lián)到位于支持物(1)的分子上，或者進(jìn)入與這些分子的化學(xué)反應(yīng)或催化這些分子，-被活動(dòng)化并共價(jià)偶聯(lián)到支持物的物質(zhì)(11)是或產(chǎn)生許多不同的物質(zhì)(2)，-超過1層的該物質(zhì)(2)被反復(fù)的一個(gè)接一個(gè)的定址精確地涂布到支持物(1)上，在每一種情況下，隨后進(jìn)行物質(zhì)與支持物(11)的共價(jià)偶聯(lián)和洗去未偶聯(lián)的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于該物質(zhì)(2)在90℃條件下，優(yōu)選的在50℃條件下以顆粒形式呈現(xiàn)固定化狀態(tài)，其顆粒大小介于0.2μm和200μm之間，優(yōu)選的介于2μm和40μm之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于在單體與支持物(1)的偶聯(lián)反應(yīng)(10，11)開始之前，該支持物(1)保存在與所述的轉(zhuǎn)印單元(7，13)相比低至少10℃的條件下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3之一的方法，其特征在于物質(zhì)的定址精確轉(zhuǎn)印是在合適的經(jīng)過改進(jìn)的打印方法的輔助下，更為特別是在一臺(tái)激光打印機(jī)、一臺(tái)激光復(fù)印機(jī)或一臺(tái)噴墨打印機(jī)的幫助下發(fā)生的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4之一的方法，其特征在于物質(zhì)的定址精確轉(zhuǎn)印是在許多可有目的控制的光源的輔助下，更為特別的是在發(fā)光二極管或微激光陣列的輔助下發(fā)生的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5之一的方法，其特征在于被涂布到支持物的顆粒是被噴灑到支持物上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6之一的方法，其特征在于支持物上的顆粒是被冷卻并深度冷凍的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7之一的方法，其特征在于顆粒含有至少一種來(lái)源于下組的成分或結(jié)合于含有來(lái)源于下組的成分的顆粒磁性組分、二苯基甲酰胺、用于組合合成的單體、二體或三體的前體、更為具體的，D或L氨基酸、核苷或衍生的核苷或其鏡像異構(gòu)體或它們的衍生物的前體或者聚苯乙烯或纖維素，更為具體的是被偶聯(lián)到一層或多層單體上的聚苯乙烯或纖維素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8之一的方法，其特征在于在第一輪偶聯(lián)反應(yīng)循環(huán)后，保護(hù)基按照標(biāo)準(zhǔn)方法被去除，使得優(yōu)選的可與單體、二體或三體的前體偶聯(lián)的游離氨基基團(tuán)或羥基基團(tuán)出現(xiàn)。
10.將物質(zhì)特別是用于分子庫(kù)組合合成的單體涂布于支持物的方法，其特征在于電磁波、更為特別的是激光，被反復(fù)定址準(zhǔn)確地照射支持物的特定區(qū)域，使得支持物的特定區(qū)域被或?qū)⒈粠喜煌肿踊蜻@些分子上的不同的聚集體，不同分子或這些分子上的不同的聚集體和入射的電磁波相互作用，位于特定區(qū)域的不同分子或這些分子上的不同聚集體或其他分子和入射的電磁波相互作用，并且通過入射的電磁波和不同分子或這些分子上的不同聚集體或其他分子的相互作用，使得定址的物理或化學(xué)過程開始進(jìn)行。
11.用于將分子涂布到支持物的一個(gè)基本平面的表面上的設(shè)備，該設(shè)備包括用于可旋轉(zhuǎn)地固定支持物的裝置，使得可以圍繞基本垂直于支持物平面的軸進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，用于將不同流體涂布到支持物表面旋轉(zhuǎn)軸區(qū)域的裝置以及至少一臺(tái)可以相對(duì)于支持物表面進(jìn)行操作的激光發(fā)射器以用激光照射支持物的特定區(qū)域。
12.用于將分子涂布到支持物的一個(gè)基本平面的表面上的設(shè)備，該設(shè)備包括類似噴嘴的裝置，其用于將微量待固定的分子涂布于支持物上，用于使涂布分子的裝置和載體互對(duì)彼此操作的裝置，以及至少一臺(tái)激光發(fā)射器，其用于激光照射支持物的特定區(qū)域。
13.用于將分子涂布到支持物的一個(gè)基本平面的表面上的設(shè)備，包括一個(gè)用于含有待涂布分子的顆粒的容器，一臺(tái)激光發(fā)射器和將支持物和激光發(fā)射器相對(duì)彼此移動(dòng)的裝置。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的設(shè)備，其特征在于其特征在于該設(shè)備是一個(gè)改進(jìn)的主要市售激光打印機(jī)或激光復(fù)印機(jī)，其中的調(diào)色劑顆粒被含有待涂布分子的顆粒所替換。
全文摘要
本發(fā)明提供一種將物質(zhì),更為特別的是用于分子庫(kù)的組合合成的單體涂布到支持物的方法,物質(zhì)首先被包埋進(jìn)基質(zhì)中,基質(zhì)至少由一種溶劑組成,該溶劑在低于90℃的條件下,優(yōu)選的在低于50℃的條件下以固態(tài)聚集態(tài)形式存在,物質(zhì)被包埋至基質(zhì)形式的轉(zhuǎn)印單元中,然后該轉(zhuǎn)印單元在低于90℃條件下,優(yōu)選的低于50℃條件下,以固態(tài)聚集態(tài)形式被涂布于支持物,或該轉(zhuǎn)印單元被溶解于一個(gè)第二種溶劑組分中,并且在該溫度條件下,以液態(tài)聚集態(tài)被涂布支持物,其中,在該第二種溶劑組分全部或部分蒸發(fā)后,它們呈現(xiàn)出固態(tài)或凝膠狀態(tài)聚集態(tài),該轉(zhuǎn)印單元在涂布到支持物后保持固態(tài)或凝膠態(tài)聚集態(tài),位于支持物上的物質(zhì),接著通過改變物理環(huán)境被活動(dòng)化,通過一個(gè)物理過程進(jìn)入支持物平面附近,被活動(dòng)化的物質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)到分子上。多層該物質(zhì)被反復(fù)的一個(gè)接一個(gè)的定址精確地涂布到支持物上,該方法可通過基本具有激光打印機(jī)或激光復(fù)印機(jī)或噴墨打印機(jī)結(jié)構(gòu)的設(shè)備進(jìn)行。
文檔編號(hào)C07B61/00GK1357004SQ99816181
公開日2002年7月3日 申請(qǐng)日期1999年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月14日
發(fā)明者A·普斯特卡, F·布雷特林, K·－H·格羅斯, S·迪貝爾, R·薩夫里希 申請(qǐng)人:德國(guó)癌癥研究公共權(quán)益基金會(huì), 歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室