專利名稱：對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異的人t細(xì)胞克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)自身免疫性疾病的診斷、預(yù)防和/或治療有益的物質(zhì)，具體而言，本發(fā)明涉及與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的滑膜細(xì)胞所表達(dá)的、由特定的HLA-DR所呈遞的抗原進(jìn)行特異反應(yīng)的T細(xì)胞克隆。
背景技術(shù)：
本來免疫系統(tǒng)的應(yīng)答是機(jī)體為了破壞、清除從外部侵入的異物而產(chǎn)生的應(yīng)答，通常是對(duì)非己分子(抗原)特異的，但是，由于某種原因，機(jī)體識(shí)別自身分子和非己分子的功能發(fā)生障礙(自身免疫耐受異常)就會(huì)發(fā)生全身性紅斑狼瘡、硬皮病、多發(fā)性硬化癥(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(以下簡(jiǎn)稱RA)等各種自身免疫性疾病。中年以后的女性易發(fā)RA，主要癥狀有關(guān)節(jié)腫脹和變形、疼痛及運(yùn)動(dòng)功能障礙，病理組織學(xué)上可看到覆于關(guān)節(jié)腔(關(guān)節(jié)囊)內(nèi)側(cè)的滑膜組織有異常增生。此外，在增生組織中有大量免疫細(xì)胞(嗜中性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)存在，可觀察到產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞的漿性細(xì)胞和輔助型T細(xì)胞聚集。到目前為止已明了免疫學(xué)上與作為疾病敏感性基因的HLA-DRB1等位基因相關(guān)。閉經(jīng)前后的女性易發(fā)。此外，病理形態(tài)學(xué)上可見到病變部位(關(guān)節(jié)滑膜組織)有CD4陽性、CD45RO陽性的記憶性T細(xì)胞浸潤，這表明對(duì)某種特定抗原有記憶的輔助型T細(xì)胞與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。
目前RA治療的中心是非類固醇類抗炎癥劑、免疫調(diào)節(jié)劑和類固醇，但這些藥物有各種副作用(胃腸障礙、腎功能障礙等)。免疫調(diào)節(jié)劑則有起效慢、連續(xù)施用出現(xiàn)無效性等問題。近年開始使用更能有效控制炎癥的免疫抑制劑，但由于存在骨髓抑制等嚴(yán)重的副作用，所以迫切期望能開發(fā)出對(duì)病變部位特異的治療手段。
作為對(duì)自身免疫性疾病特異的治療手段，如可按照MS中提出的，從機(jī)體中去除對(duì)特定的自身抗原產(chǎn)生反應(yīng)性的T細(xì)胞這一病因(例如使用T細(xì)胞疫苗)及對(duì)該抗原自身免疫耐受的由誘導(dǎo)等。為了將上述方法適用于RA、有必要鑒定RA相關(guān)自身抗原和對(duì)該抗原特異的T細(xì)胞，得到RA相關(guān)T細(xì)胞克隆。如果能得到這樣的克隆，就能對(duì)與RA發(fā)病相關(guān)的T細(xì)胞受體(以下稱作TCR)和編碼它的基因進(jìn)行分析能分離、鑒定該TCR所特異識(shí)別的抗原，進(jìn)一步就有可能闡明T細(xì)胞活化的結(jié)制構(gòu)及RA發(fā)病時(shí)的結(jié)構(gòu)，最終就有可能開發(fā)出RA的治療、診斷和預(yù)防方法。
但是由于沒有RA相關(guān)的有效的動(dòng)物模型，所以還未得到明確識(shí)別RA相關(guān)自身抗原的T細(xì)胞克隆，與RA發(fā)病相關(guān)抗原的鑒定也未進(jìn)行，所以浸潤C(jī)D4陽性記憶型T細(xì)胞與滑膜細(xì)胞與RA發(fā)病的關(guān)系也未明確。一般情況下，與特定抗原有反應(yīng)性的輔助型T細(xì)胞克隆可這樣建立如在IL-2存在下持續(xù)給予抗原刺激，得到特別識(shí)別該抗原的T細(xì)胞株，在從這些細(xì)胞株用有限稀釋法建立。但是由于未規(guī)定其抗原特異性(未給予特定的抗原刺激)，所以長(zhǎng)期維持這些T細(xì)胞克隆非常困難。所以象RA這樣未鑒定出與疾病相關(guān)的自身抗原的自身免疫性疾病，就不能按照上述方法建立RA特異的T細(xì)胞克隆。
發(fā)明的公開本發(fā)明人們以提供與RA發(fā)病相關(guān)的、有增殖可能的T細(xì)胞克隆為目的進(jìn)行了深入研究，建立了特異性識(shí)別RA患者滑膜細(xì)胞來源的抗原的T細(xì)胞克隆，闡明了其特性。
也就是說本發(fā)明所提供的T細(xì)胞克隆以HLA-DR限制性識(shí)別類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞所表達(dá)的抗原。
本發(fā)明的T細(xì)胞克隆所識(shí)別RA相關(guān)抗原是以在特定的基因型HLA-DR上呈遞為條件進(jìn)行特異性識(shí)別，增殖的。
本發(fā)明的T細(xì)胞克隆包括識(shí)別HLA-DR4或HLA-DR9上所呈遞的RA相關(guān)抗原的HLA-DR4或HLA-DR9限制性克隆。
此外分析本發(fā)明T細(xì)胞克隆的TCR區(qū)域的結(jié)果表明，TCR Vα鏈的CDR3區(qū)域有精氨酸，TCRβ鏈?zhǔn)荲β6家族成員，或者TCRβ鏈包含Vβ12。
作為一種狀態(tài)，本發(fā)明的T細(xì)胞克隆為CD4陽性且CD45RO陽性，在HLA-DR4或HLA-DR9的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細(xì)胞存在下進(jìn)行增殖。
本說明書中涉及T細(xì)胞克隆“有反應(yīng)性”的時(shí)候是指某一T細(xì)胞克隆，體內(nèi)和體外，在一定條件下能進(jìn)行抗原特異性增殖。
“自身RA滑膜細(xì)胞”是指與特定的T細(xì)胞克隆相關(guān)過，與該克隆的供給源(RA患者的滑膜組織)相同的滑膜細(xì)胞?！胺亲陨淼腞A滑膜細(xì)胞”是指由與特定的T細(xì)胞克隆的供給源不同的供給源而來的滑膜細(xì)胞。即?；ぜ?xì)胞“自身”或“非自身”的區(qū)別只依賴于供給源，因而“非自身RA滑膜細(xì)胞”中不只是與特定T細(xì)胞克隆基因型不相同的細(xì)胞，也包含有相同HLA-DR的細(xì)胞。
另外，T細(xì)胞克隆的“自身反應(yīng)性”是指某一T細(xì)胞克隆，在自身RA滑膜細(xì)胞的存在下顯示增殖活性。但是如說明書中所表明的，本發(fā)明的“自身反應(yīng)性”T細(xì)胞克隆不只對(duì)自身RA滑膜細(xì)胞對(duì)HLA-DR基因型相同的非自身滑膜細(xì)胞也具有反應(yīng)性，因此，“自身反應(yīng)性”從廣義上講也是指T細(xì)胞克隆在HLA-DR基因型相同的非自身RA滑膜細(xì)胞存在下顯示增殖活性。
“HLA-DR限制性”是指某一T細(xì)胞克隆識(shí)別的RA相關(guān)抗原，不管它是來源于自身或非自身的RA滑膜，只要它以特定的HLA-DR呈遞，該細(xì)胞克隆就能識(shí)別它、并顯示增殖活性。
因此，本發(fā)明的HLA-DR限制性T細(xì)胞克隆，只在某一RA相關(guān)抗原以特定的HLA-DR方式呈遞的時(shí)候才增殖，在不同基因型(異種的allogeneic)的HLA-DR呈遞的時(shí)候不能增殖。
“RA相關(guān)抗原”是指考慮為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病因的自身抗原，典型地是指與特定HLA分子結(jié)合的、由T細(xì)胞識(shí)別的抗原肽片段，或者包含它的抗原。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是獲得自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的工程的流程圖。
圖2表示用抗HLA-DR單克隆抗體(mAb)或抗原TCRαβmAb來阻斷HLA-DR限制性T細(xì)胞克隆對(duì)自身滑膜細(xì)胞的反應(yīng)性。
圖3表示HLA-DR限制性T細(xì)胞克隆與RA滑膜細(xì)胞來源的可溶性抗原。健康人及非RA患者的滑膜細(xì)胞來源的可溶性抗原的反應(yīng)性。這里N-1及N-3表示來源于健康人，OA-1表示來源于變形性關(guān)節(jié)病患者。
圖4a是HLA-DR限制性T細(xì)胞克隆(39SM1B5、39SF2A5)。由RA滑膜細(xì)胞獲得的可溶性抗原的層析圖，各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白(BSA(牛血清白蛋白)、OVA(卵白蛋白)、CA(碳酸酐酶)、STI(大豆胰蛋白酶抑制劑)和ALA(牛乳α-乳球蛋白)的洗脫位置圖。()內(nèi)的數(shù)字為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量。圖4b是HLA-DR限制性T細(xì)胞克隆對(duì)RA滑膜細(xì)胞來源的可溶性抗原的層析級(jí)份(圖4a)的反應(yīng)性?？煽吹接蟹磻?yīng)性的級(jí)份抗原(HPLC級(jí)份31和38)的分子量，可根據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫位置而求出的測(cè)量線計(jì)算為50kDa和25kDa。
實(shí)施本發(fā)明的最佳狀態(tài)以下就本發(fā)明的T細(xì)胞克隆的建立方法和其特性進(jìn)行一般地說明。本發(fā)明并不限于特定的HLA-DR限制性的T細(xì)胞克隆，包含按照本發(fā)明說明書中的方法所得到的各種HLA-DR限制性的RA特異的T細(xì)胞克隆。
原則上，制備本發(fā)明的RA滑膜細(xì)胞中表達(dá)的抗原特異的人T細(xì)胞克隆，包括以下工程。(1)從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織或滑液而來的T細(xì)胞克隆在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)來建立；(2)篩選對(duì)同一患者的自身滑膜細(xì)胞有反應(yīng)性的T細(xì)胞克隆；(3)篩選對(duì)具有與該自身滑膜細(xì)胞不同HLA-DR的其它類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者來源的滑膜細(xì)胞不具反應(yīng)性的T細(xì)胞克?。缓?或(4)表達(dá)與該自身滑膜細(xì)胞相同HLA-DR的、(1)中患者的滑膜細(xì)胞由來的不表達(dá)RA相關(guān)抗原的細(xì)胞，篩選與該細(xì)胞不進(jìn)行反應(yīng)的T細(xì)胞克隆。
首先從RA患者獲取滑膜組織和滑液，用含有膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNase的消化液進(jìn)行消化，得到1次培養(yǎng)的單核細(xì)胞，用有限稀釋法篩選T細(xì)胞克隆，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。建立T細(xì)胞克隆時(shí)可根據(jù)要求改變?cè)摷夹g(shù)領(lǐng)域中常用的培養(yǎng)基，但優(yōu)選本發(fā)明人所開發(fā)的培養(yǎng)基(含IL-2、人末梢血單核細(xì)胞PHA刺激培養(yǎng)上清及胎牛血清的培養(yǎng)基)。尤為優(yōu)選的培養(yǎng)基為AIM-V培養(yǎng)基(GIBCO BRL,#87-0112)400ml中補(bǔ)充了RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL,#22400)50-100ml，人T-STIM30-60ml(10 BRMP/ml；BRMP,BiologicalResponse Modifier Program Jurkat IL-2 reference reagent)、重組人IL-2 250-750U/ml，胎牛血清(預(yù)先56℃處理30分鐘進(jìn)行滅活)50-100ml及抗生素(例如青霉素約100U和約100μm/ml鏈霉素)的培養(yǎng)基。以后稱為MIX-H培養(yǎng)基。這里的人T-STIM是在植物血凝集素的刺激下人末梢血單核細(xì)胞的培養(yǎng)上清(Human T-STIMwith PHA,Becton Dickinson,#40045)。
就這樣建立每個(gè)RA患者的T細(xì)胞克隆，從其中的CD4陽性和CD45RO陽性克隆中，按照?qǐng)D1所示的方法得到自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆。后面的實(shí)施例中，從2名患者(RA39和RA40)中共得到8個(gè)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆。作為開發(fā)物質(zhì)的RA患者由來的滑膜細(xì)胞的一個(gè)細(xì)胞株RA39-sy(HLA-DRB1*0405/0901)，根據(jù)與專利程序相關(guān)的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了國際保藏，以保藏號(hào)FERM BP-5681存放于茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)的通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所(保藏日平成7年10月3日)。
制備本發(fā)明的T細(xì)胞克隆時(shí)也可應(yīng)用滑膜組織或滑液以外組織而來的T細(xì)胞。即，向認(rèn)為能有抗原特異性增殖(或無自動(dòng)增殖)的T細(xì)胞中加入有抗原呈遞作用的細(xì)胞及滑膜細(xì)胞的可溶性物質(zhì)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基)中37℃培養(yǎng)10～20天，來建立T細(xì)胞株。然后應(yīng)用從滑膜組織分離自身反應(yīng)性克隆時(shí)所述的工程處理所得的T細(xì)胞株，分離目的性自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆。
所謂“抗原呈遞細(xì)胞”可以例舉為巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等，二能抗原特異性增殖(或無自動(dòng)增殖)T細(xì)胞、可例舉人末梢血中的T細(xì)胞、組織中浸潤的T細(xì)胞。
T細(xì)胞克隆反應(yīng)性(抗原特異的增殖活性)的評(píng)價(jià)，可用通常的3H-胸腺嘧啶核苷摻入法(CPM)，也可用下面的各種方法。
1．DNA聚合酶等與核酸合成相關(guān)的酶活性的測(cè)定2．溴化乙錠與DNA所形成的復(fù)合體的測(cè)定3．培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量的測(cè)定4．形態(tài)學(xué)觀察(活細(xì)胞數(shù)的測(cè)定)如圖l所示，首先在自身RA滑膜細(xì)胞存在的條件下培養(yǎng)建立的T細(xì)胞克隆，篩選具有反應(yīng)性的克隆，之后篩選與HLA-DR不相同的RA滑膜細(xì)胞不具反應(yīng)性的克隆。此時(shí)，用γ-干擾素刺激滑膜細(xì)胞，使HLA-DR大量表達(dá)。
然后篩選對(duì)轉(zhuǎn)入了HLA-DRB1的小鼠纖維母細(xì)胞(HLA-DR轉(zhuǎn)化體)無反應(yīng)性的克隆。通過這一步驟可除去對(duì)無抗原呈遞的HLA-DR具有反應(yīng)性的克隆，可得到識(shí)別抗原呈遞的H-LA-DR。具有自身反應(yīng)性的克隆。
本發(fā)明克隆的特征可列舉以下幾點(diǎn)。1)不僅對(duì)自身RA滑膜細(xì)胞對(duì)非自己RA滑膜細(xì)胞呈HLA-DR限制性反應(yīng)、增殖，但對(duì)有與自身相同HLA-DR健康人末梢血的抗原呈遞細(xì)胞(PB-APC)無反應(yīng)(參照后面表1)。2)對(duì)自身末梢血中的抗原呈遞細(xì)胞(PB APC)無反應(yīng)。
1)和2)中的結(jié)果表明本發(fā)明的T細(xì)胞克隆識(shí)別HLA-DR限制性抗原，該抗原具有滑膜細(xì)胞特異性。3)對(duì)多個(gè)RA患者由來的滑膜細(xì)胞有反應(yīng)(參照表1)。4)自身反應(yīng)性可被抗HLA-DR及抗TCRαβ抗體(均為小鼠IgG)完全阻斷，而無關(guān)的小鼠IgG無影響(參照表2)。5)TCR的氨基酸序列分析結(jié)果表明，有TCRα鏈的CDR3區(qū)中含精氨酸的克隆，其中均使用TCR Vβ6，以及，其它的克隆α鏈無特征，均使用TCR Vβ12(參照表2)。6)在末梢血由來的抗原呈遞細(xì)胞的存在下，與RA滑膜細(xì)胞抽提出的可溶性抗原進(jìn)行反應(yīng)，但與非RA滑膜細(xì)胞抽提出的可溶性抗原無反應(yīng)(參照表3)。
3)～6)中的結(jié)果為本發(fā)明的T細(xì)胞克隆能識(shí)別各種共同的或類似的抗原，且該抗原具有RA特異性，并且表明多個(gè)患者間可能存在共同的、普遍的RA相關(guān)抗原。
如上所述，本發(fā)明的自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆是以HLA-DR限制性識(shí)別RA相關(guān)抗原的人T細(xì)胞克隆，它對(duì)于闡明RA的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)治療、正確的診斷及預(yù)防方法有很大益處。例如，應(yīng)用本發(fā)明的T細(xì)胞克隆，可根據(jù)對(duì)RA可疑患者滑膜組織中獲得的滑膜細(xì)胞的反應(yīng)性檢測(cè)出RA相關(guān)抗原。因此應(yīng)用本發(fā)明或本發(fā)明的T細(xì)胞克隆，以其反應(yīng)性為指標(biāo)可提供檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原的方法，并可提供如此檢測(cè)出的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)抗原?？乖乃y(cè)方法是從可疑為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的被檢者滑膜細(xì)胞入手，將其可溶化，將上述本發(fā)明的人T細(xì)胞克隆和被檢者由來的有抗原呈遞作用的細(xì)胞與所得的可溶化物進(jìn)行反應(yīng)，通過測(cè)定該克隆的反應(yīng)性來檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)抗原。
以按本發(fā)明方法檢測(cè)出的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原為例，應(yīng)用PBS以流速0.5ml/分作流動(dòng)相，通過TSK膠、G300SW柱的HPLC測(cè)定出分子量為25kDa或50kDa的抗原。這樣所得的抗原對(duì)開發(fā)病灶特異性RA治療方法、闡明發(fā)病機(jī)制、或RA的治療、診斷等有益。
此外，由于本發(fā)明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)抗原特異的T細(xì)胞克隆的TCR的部分序列已經(jīng)明確，應(yīng)用該序列就能得到全TCR分子或與識(shí)別RA相關(guān)抗原相關(guān)的部分肽以及編碼該肽片段的DNA或DNA片段，將之轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用DNA重組技術(shù)就能得到研究中必要量的、具有TCR活性的分子。這樣所得的TCR分子對(duì)于闡明RA特異的RA相關(guān)抗原-HLA-DR復(fù)合體的構(gòu)造、進(jìn)一步表明RA相關(guān)抗原的情況有益。
臨床上應(yīng)用RA相關(guān)抗原可由誘導(dǎo)患者的耐受(自身免疫耐受)，從而抑制或消除癥狀。再者，可按MS所述，將自身的T細(xì)胞克隆或TCR與適當(dāng)?shù)墓绖┮黄鹗┡c患者，就能選擇性去除引起炎癥的T細(xì)胞克隆。另外，應(yīng)用與TCR相拮抗的與抗原-HLA-DR復(fù)合體相結(jié)合的物質(zhì)可阻斷T細(xì)胞對(duì)滑膜細(xì)胞所呈遞的抗原的識(shí)別，從而可以抑制癥狀的發(fā)生、或者得到與T0細(xì)胞克隆的TCR相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體，將該單克隆抗體，施與RA患者，這樣可通過體內(nèi)去除誘發(fā)RA的T細(xì)胞而進(jìn)行治療。
另外通過檢測(cè)與RA相關(guān)抗原進(jìn)行反應(yīng)的T細(xì)胞而進(jìn)行RA的診斷。還可應(yīng)用ELISA檢測(cè)有無RA相關(guān)抗原反應(yīng)性抗體而進(jìn)行RA的診斷。
另一方面，本說明書中所公開的滑膜細(xì)胞不僅對(duì)研究HLA-DR4/9限制性自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆所識(shí)別的RA相關(guān)抗原有利，而且可用于同一HLA-DR限制性T細(xì)胞相關(guān)RA的篩選。
由此本發(fā)明首次提供了對(duì)多個(gè)患者的RA相關(guān)抗原特異的T細(xì)胞克隆，這將有利于RA發(fā)病機(jī)制的闡明以及治療、預(yù)防、診斷方法的開發(fā)。
以下列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不僅限于此。實(shí)施例1當(dāng)RA患者的滑膜病變部位建立T細(xì)胞克隆(1)材料1)滑膜組織及滑液的制備類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的診斷按照1987年的ACR標(biāo)準(zhǔn)(F.C.Arnett等，Arthritis Rheum.,31；315(1988))，從診斷為2～4級(jí)，2～4期的RA患者(RA39)的病變部位，無菌條件下獲取滑膜組織及滑液?；そM織在生理鹽水或培養(yǎng)基中于4℃存放于試管中。滑液于4℃存放于試管中。以下的操作原則上在無菌條件下進(jìn)行。2)消化液的制備在補(bǔ)充了高濃度葡萄糖(4500ml/L)的DMEM(Duibecco’sModified Eagle Medium)(GIBCO BRL,#12430-021或其它等價(jià)物)500ml中，常溫下溶解膠原酶(Ⅳ型，Sigma ChemicalCo.)0.5mg、透明質(zhì)酸酶(Sigma)0.5mg及DN ase(Ⅰ型，Sigma)5μg制備消化液。將該溶液10ml移入附有聚丙烯蓋的試管中(CorningCostar Co.#430766或其等價(jià)物，-15℃保存于冰箱中。3)MIX-H培養(yǎng)基的制備向AIM-V培養(yǎng)基(GIBCO BRL,#87-0112)400ml中補(bǔ)充RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL,#22400)60ml，人T-STIM40ml(10BRMP/ml；BRMP,Biological Response ModifierProgram Jurkat IL-2reference reagent)、重組人IL-2(鹽野義制藥公司)500U/ml，胎牛血清(預(yù)先56℃30分鐘滅活)50ml及抗生素(青霉素100U和約100μg/ml鏈霉素；GIBCO BRL#15140-015或其等價(jià)物)，制備MIX-H培養(yǎng)基。人T-STIM是在植物血凝集素的刺激下人末梢血單核細(xì)胞的培養(yǎng)上清(Human T-STIM with PHA,Becton Dickinson,#40045)。(2)滑膜組織的消化于37℃溫浴中解東消化液。從保存滑膜組織的試管中除去生理鹽水，將大約5g的組織放于塑料平皿上，用剪刀切碎。將剪碎的組織移入付有螺絲帽的試管中，加入冷卻的、不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(組織的5-10倍量)，1000rpm。4℃離心5分鐘。棄上清，向試管中加入解凍了的消化液(10-20ml)，將含有組織的試管置入37℃溫浴中，振蕩培養(yǎng)2～3小時(shí)。
接著向試管中加入RPMI 1640培養(yǎng)基(2-3倍量)，靜置，未消化的組織存于沉淀中，回收細(xì)胞懸浮液。如此重復(fù)2次。合并回收的細(xì)胞懸浮液，1000rpm、4℃離心5分鐘。
對(duì)消化的細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過苔盼蘭排除試驗(yàn)計(jì)算單個(gè)細(xì)胞的存活率。(3)單核細(xì)胞的原代培養(yǎng)和滑膜細(xì)胞的分離將所得細(xì)胞的一部分懸浮于MIX-H培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物中含有滑膜細(xì)胞和組織中浸潤的單核細(xì)胞兩種。在這種條件下培養(yǎng)2-3周并傳代，單核細(xì)胞可活化增殖，而在培養(yǎng)物中幾乎看不到滑膜細(xì)胞。
另一方面，清膜細(xì)胞在含有10％胎牛血清和抗生素的DMEM中培養(yǎng)可增殖。即，將上面(2)中所得細(xì)胞的一部分，以MIX-H培養(yǎng)基中相同的濃度在加入了10％胎牛血清和抗生素的、補(bǔ)充了高濃度葡萄糖(4500mg/L)的DMEM中培養(yǎng)。培養(yǎng)在37℃、5％CO2存在的條件下進(jìn)行，分離滑膜細(xì)胞。由來于RA39的表達(dá)HLA-DR4和HLA-DR9的滑膜細(xì)胞株RA39-Sy(HLA-DRBl*0405/0901)存放于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所，保藏為FERM BP-5681(保藏平成7年10月3日)。(4)來源于滑液的單核細(xì)胞的原代培養(yǎng)用移液管將滑液約10ml移到新的帶螺絲帽試管中，2500-3000rpm,4℃離心10分鐘試管底部能觀察到細(xì)胞團(tuán)。吸取無細(xì)胞滑液，必要時(shí)將液體保存于-15℃。將離心所得細(xì)胞懸浮于MIX-H培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。在該條件下培養(yǎng)2-3周并進(jìn)行傳代，單核細(xì)胞能活性增殖。(5)從單核細(xì)胞而來的T細(xì)胞的克隆化可以看到上面(3)和(4)中增殖的、由滑膜組織和滑液而來的單核細(xì)胞株分別以活化細(xì)胞的大集落存在。若觀察到大量的死亡細(xì)胞(＞50％)或幾乎沒有集落，可每3-5天，半量交換培養(yǎng)液(MIX-H)，有必要反復(fù)觀察集落，以得到適當(dāng)?shù)膯魏思?xì)胞株。
從肝素處理過的末梢血中制備異種的(allogeneic)末梢血單核細(xì)胞(PBMC)，在25μg/ml絲裂霉素C存在下、37℃于RPMI 1640(不含血清)中培養(yǎng)1小時(shí)。用這些PBMC作支持細(xì)胞。在MIX-H培養(yǎng)基中將支持細(xì)胞調(diào)配成3×105/ml，以5×104細(xì)胞/100μl孔分配到96孔圓底板中。
在不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中洗滌上述增殖了的細(xì)胞株，用苔盼蘭染色計(jì)數(shù)。在MIX-H培養(yǎng)基中調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×103/10ml、5×103/10ml及1×104/10ml，與支持細(xì)胞一起以10、50或100個(gè)/100μl/孔的比率分配到板的各孔中。
接著，在37℃、5％CO2的條件下將板培養(yǎng)2-4周。從克隆化開始每1周后檢查平板?？寺』_始1周后可識(shí)別陽性孔(細(xì)胞增加了的孔)，但陽性孔的數(shù)目及陽性孔的出現(xiàn)時(shí)間隨細(xì)胞株而有所差異。每1周間將半量MIX-H培養(yǎng)基與新鮮培養(yǎng)基交換。
將增加了的細(xì)胞移到48孔板培養(yǎng)，使之增殖，從自身RA滑膜組織及滑液分別建立T細(xì)胞克隆59個(gè)和53個(gè)。其中CD4陽性且CD45RO陽性克隆是108個(gè)。剩余的4個(gè)克隆為CD8陽性。(6)篩選自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆按照?qǐng)D1中的工程，從上述(5)中得到的CD4陽性且CD45RO陽性T細(xì)胞克隆中篩選對(duì)(3)中分離出的RA滑膜細(xì)胞特異的克隆。
T細(xì)胞克隆對(duì)自已或非自身RA滑膜細(xì)胞的反應(yīng)性是在添加了10％胎牛血清和抗生素后的RPMI1640培養(yǎng)基中、37℃培養(yǎng)72-96小時(shí)后，以3H胸腺嘧啶核苷的摻入值(CPM)作為增殖活性的拮抗來進(jìn)行測(cè)定的。1)以上述方法檢測(cè)與自身RA滑膜細(xì)胞(HLA-DRB1*0405/0901)的反應(yīng)性，共獲得17個(gè)陽性克隆。2)檢測(cè)與基因型不同的異型(allogeneic)非自身滑膜細(xì)胞(HLA-DRB1*0802/0802)的反應(yīng)性，得到8個(gè)陰性克隆。3)獲得與表達(dá)自身HLA-DR的小鼠轉(zhuǎn)化體(HLA-DRB1*0405/0901)無反應(yīng)性的T細(xì)胞克隆。結(jié)果去除無抗原呈遞時(shí)對(duì)HLA-DR有反應(yīng)性的克隆，得到6個(gè)只對(duì)呈遞RA抗原的特定HLA-DR進(jìn)行特異反應(yīng)、HLA-DR限制性克隆。
同樣從其它患者RA40的滑膜組織和滑液入手，分別獲得1個(gè)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆?；颊逺A40的HLA-DR等位基因?yàn)镈RB1*0901/1502。
如此，最終從本發(fā)明的8個(gè)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆入手。
為了說明本發(fā)明自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的反應(yīng)性、TCR構(gòu)造、RA滑膜細(xì)胞、RA抗原識(shí)別等特性進(jìn)行了下面實(shí)施例中的系列實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果中凡表示T細(xì)胞克隆反應(yīng)性(增殖活性)的時(shí)候，若無特殊說明，均與實(shí)施例1中同樣的3H胸腺嘧啶核苷摻入值(CPM)進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)例1(1)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的HLA-DR限制性通過測(cè)定實(shí)施例1中所得8個(gè)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆(39SM1B5,39SMID4、39SM3C4,39SF1A2,39SF1D1,39SF2A5,40SM1A1,44SM2A7)對(duì)呈遞RA抗原的自身和非自身滑膜細(xì)胞的反應(yīng)性，以及對(duì)不呈遞RA抗原的抗原呈遞細(xì)胞的反應(yīng)性，來探對(duì)其HLA-DR限制性。作為不呈遞RA抗原的抗原呈遞細(xì)胞可應(yīng)用RA患者或者健康人末梢血中的抗原呈遞細(xì)胞(PB-APC)。
將T細(xì)胞克隆與自身或非自身RA滑膜細(xì)胞或與該RA患者或健康人(HD)由來的PB-APC(末梢血抗原呈遞細(xì)胞)一起，在添加了10％胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中、37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，檢測(cè)增殖活性。結(jié)果如下文表1所示。
表1 RA關(guān)節(jié)病變部位由來的CD4+CD8-T細(xì)胞克隆在滑膜細(xì)胞識(shí)別中的HLA-DR4或HLA-DR9限制性

注·HLA-DR的兩個(gè)或單個(gè)相同或二者均不同的RA滑膜細(xì)胞的HLA-DR等位基因(基因型)如下。RA36,DRB1*0101/0405；RA38,DRB1*0101/0901；RA45,DRB1*0802/0802；RA49,DRB1*0101/0405。
是3次培養(yǎng)所得結(jié)果的平均值cpm±SD。NT表示未做試驗(yàn)，一表示不能適用。從表1可看出以下幾點(diǎn)1)從RA39來的克隆對(duì)有HLA-DR4和DR9的自身滑膜細(xì)胞顯示增殖活性，對(duì)HLA-DR基因型共同的非自身RA滑膜細(xì)胞也具有反應(yīng)性。2)39SM1B5、39SM3C4和39SM1D1對(duì)具有HLA-DR9的滑膜細(xì)胞有反應(yīng)，39SM1D4、39SF1A2和39SF2A5對(duì)具有HLA-DR4的滑膜細(xì)胞有反應(yīng)，由此可知，該反應(yīng)由與自身同一HLA-DR中任一方的HLA-DR限制性引起。3)從具有HLA-DR9和HLA-DR15的RA40SM1和RA40SM2獲得具有HLA-DR9限制性增殖活性的克隆。4)對(duì)RA滑膜細(xì)胞具有反應(yīng)性的T細(xì)胞克隆對(duì)自身的和具有與自身同一HLA-DR的PB-APC(末梢血抗原呈遞細(xì)胞)無反應(yīng)性。
以上結(jié)果表明本發(fā)明的T細(xì)胞克隆從HLA-DR限制性識(shí)別RA滑膜組織中特異存在的抗原。另外，由于一個(gè)克隆可與多個(gè)RA滑膜細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，所以可以推測(cè)各個(gè)RA滑膜細(xì)胞上的HLA-DR呈遞的抗原肽是相類似的或是相同的。首次得到這樣表明RA相關(guān)抗原是單一物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。(2)T細(xì)胞克隆識(shí)別RA滑膜細(xì)胞時(shí)HLA-DR和TCRαβ分子的關(guān)系。
自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆與經(jīng)HLA-DRmAb(單克隆抗體)處理過的自身滑膜、或者自身滑膜細(xì)胞與經(jīng)抗TCRαβmAb(單克隆抗體)處理過的T細(xì)胞克隆一起，在上述(1)的條件下，培養(yǎng)基中存在抗體的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。作為對(duì)照，用無關(guān)的小鼠IgG處理滑膜細(xì)胞，與T細(xì)胞克隆一起進(jìn)行培養(yǎng)，檢查T細(xì)胞克隆的增殖活性(自身反應(yīng)性)。其結(jié)果如圖2所示。圖中是用3回培養(yǎng)的平均值cpm±SD來表示結(jié)果。#表示未進(jìn)行試驗(yàn)。從圖2可知以下幾點(diǎn)1)抗HLA-DR及抗TCRαβ抗體可完全阻斷T細(xì)胞克隆的自身反應(yīng)性。2)無關(guān)的小鼠IgG對(duì)反應(yīng)性無影響。且用無關(guān)小鼠IgG處理T細(xì)胞克隆時(shí)結(jié)果不變(數(shù)據(jù)未列出)。
以上結(jié)果表明非特異性粘附分子等的刺激自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆不增殖，通過TCR可特異性識(shí)別滑膜細(xì)胞的HLA-DR上呈遞的抗原，由此而增殖。(3)TCR結(jié)構(gòu)的分析分析與自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆識(shí)別RA滑膜細(xì)胞相關(guān)的受體結(jié)構(gòu)。用銜接子連接PCR法(Y.Tsuruta，等，免疫方法學(xué)雜志161,7；1993)和鏈終止法測(cè)定TCR V、D及J區(qū)的核苷酸序列，根據(jù)它來確定氨基酸序列。用Koop等的方法(B.F Koop等，基因?qū)W19,487；1994；N.Kimura等，歐洲免疫學(xué)雜志，17,375；1987,B.Togonaga等，美國國家科學(xué)院院刊。82,8624；1985,S.Roman-Roman等，歐洲免疫學(xué)雜志，21,935；1991,M.Yassai等，人類免疫學(xué)，34,279,1992)來命名TCR的V及J區(qū)。結(jié)果如下面表2所示。表2自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的TCR氨基酸序列的比較TCRα鏈

TCRβ鏈

注A·丙氨酸3C半胱氨酸；D天冬氨酸；E谷氨酸；F苯丙氨酸；G氨基醋酸；H組氨酸；I異亮氨酸；K賴氨酸；L亮氨酸；M甲硫氨酸；N天門冬酰胺；P脯氨酸；Q谷氨酰胺；R精氨酸；S絲氨酸；T蘇氨酸；V秸氨酸；Y酩氨酸。N端是這樣一區(qū)域，可通過末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶將核苷酸插入到TCR的V-D或D-J間(β鏈)、或V-J間(α鏈)。
從表2可得出以下結(jié)論。1)8個(gè)克隆中有5個(gè)克隆的TCRα鏈的CDR3區(qū)(ComplementarityDetermining Region 3指含有V-D-J或V-JN區(qū)的抗原結(jié)合部位)有精氨酸，它們均使用TCRVβ6。2)剩余的3個(gè)克隆α鏈無特征，均使用TCRVβ12。
上述結(jié)果表明TCR形成多樣性。能對(duì)各種抗原應(yīng)答的α鏈CDR3區(qū)有精氨酸的T細(xì)胞偏存于滑膜細(xì)胞，以及，這樣的T細(xì)胞TCRβ鏈的使用方式有規(guī)律性。并且與該TCR有親和性的RA相關(guān)抗原肽的構(gòu)造也有相同結(jié)構(gòu)特征，這表明本發(fā)明的T細(xì)胞克隆對(duì)闡明其結(jié)構(gòu)特征有益。(4)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆與可溶性RA抗原的反應(yīng)性原則上按照Meltezer等的方法(M.S Meltaer等，國家癌癥研究所雜志(J.Nat.Cancer Inst.47,7033 1971)用氯化鈉高脹液處理RA40滑膜細(xì)胞來制備可溶性RA抗原，具體的步驟如下。將0.005M磷酸鈉緩沖液(pH3.4)中配制的3M KCl溶液3ml加入到5×107～1×108滑膜細(xì)胞的細(xì)胞板中。4℃抽提抗原16小時(shí)，之后，將上清在去離子水中透析2次(4℃、1小時(shí))。過濾抽提物，4℃保存。
再將所得可溶性抗原與自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆一起，在從HLA-DR9健康人得到的末梢血抗原呈遞細(xì)胞(PB-APC；DRB1*0901)的存在下、或非存在下培養(yǎng)72小時(shí)，以3H-TdR(3H-胸腺嘧啶核苷)的摻入值為基準(zhǔn)檢查T細(xì)胞克隆的增殖活性，評(píng)價(jià)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆對(duì)HLA-DR所呈遞的可溶性抗原有無特異性反應(yīng)。結(jié)果如表3所示。表3自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆對(duì)HLA-DR限制性可溶性RA抗原的識(shí)別

注NA不適用。
Ag可溶性抗原。從表3可知1)RA滑膜細(xì)胞HLA-DR9限制性的克隆(39SM3C4、40SM1A1及44SM2A7)在HL-DR9陽性的PB-APC存在下識(shí)別可溶性抗原、起進(jìn)行增殖，但在HLA-DR9陽性PB-APC不存在的情況下不增殖。2)RA滑膜細(xì)胞HLA-DR4限制性克隆(39SM1D4及39SF1A2)即使在HLA-DR9陽性PB-APC存在下也不識(shí)別可溶性抗原。同樣，用從RA滑膜細(xì)胞抽提出的可溶性抗原和HLA-DR4陽性PB-APC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這些抗原與PB-APC共同存在的時(shí)候HLA-DR4限制性T細(xì)胞克隆增殖。(5)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的RA滑膜細(xì)胞特異性用與上面(9)相同的方法從健康人的滑膜細(xì)胞抽提抗原，在HLA-DR9陽性PB-APC的存在下或不存在下與上面同樣的方法進(jìn)行培養(yǎng)，檢查HLA-DR9限制性自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆(39SM1B5、39SM3C4、39SF1D1、40SM1A1)的增殖活性。結(jié)果如圖3所示。如圖中所示，T細(xì)胞克隆與來源于RA滑膜細(xì)胞的可溶性抗原反應(yīng)，但與來源于非RA患者(健康人(N-1和N-3)及變形性關(guān)節(jié)病患者(0A-1))滑膜細(xì)胞的可溶性抗原無反應(yīng)。這表明本發(fā)明的自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆所識(shí)別的抗原有特異存在于RA滑膜細(xì)胞的可能性。(6)可溶性RA抗原的鑒定在不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中透析上述(4)中制備的抽提物(4℃1小時(shí))通過凝膠滲透HPLC進(jìn)行分級(jí)分離。進(jìn)行后者的時(shí)候，用PBS作流動(dòng)相，以0.5ml/分的流速，TSK凝膠、G3000SW柱(7.5×600mm,10μm,Tosoh Co.,Tokyo)對(duì)從RA滑膜抽提出的可溶性抗原(1mg/ml)進(jìn)行適用于地凝膠滲透HPLC的分級(jí)分離。將各級(jí)份過濾，用與實(shí)驗(yàn)例1中(1)相同的方法試驗(yàn)自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆對(duì)所得可溶性抗原的層析流分的反應(yīng)性(增殖應(yīng)答)。即，將各流分與RA滑膜細(xì)胞HLA-DR限制性的T細(xì)胞克隆(39SM1B5、39SM1D4、39SM3C4、39SF1A2、39SF2A5、或40SM1A1)及DR一致的PB-APC(未梢血抗原呈遞細(xì)胞)一起在添加了10％胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中37℃、5％CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)增殖活性，然后求出有增殖活性的流分中所含抗原的分子量。代表性結(jié)果如圖4所示。從圖4b可知。HLA-DR9限制性T細(xì)胞克隆39SM1B5及DR-4限制性T細(xì)胞克隆39SF2A5，分別識(shí)別HPLC流分31和38的可溶性抗原，并增殖。用BSA(牛血清白蛋白)、OVA(卵白蛋白)、CA(碳酸酐酶)、STI(大豆胰蛋白抑制劑)、ALA(牛乳α-乳球蛋白)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作的測(cè)量線求出這些流分中所含可溶性抗原的分子量分別為50kDa和25kDa(圖4a)。
其它的HLA-DR限制性克隆(39SM3C4、39SF1A2、39SF2A5及40SM1A1)這對(duì)這些流分起反應(yīng)、增殖(數(shù)據(jù)未列出)。
權(quán)利要求
1．人T細(xì)胞克隆，它以HLA-DR限制性識(shí)別來源于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原。
2．權(quán)利要求1的人T細(xì)胞克隆，它與來源于該類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的末梢血抗原呈遞細(xì)胞單獨(dú)作用，無反應(yīng)。
3．權(quán)利要求1的人T細(xì)胞克隆，是HLA-DR4或HLA-DR9限制性的。
4．權(quán)利要求1的人T細(xì)胞克隆，其T細(xì)胞受體α鏈的CD3區(qū)域中有精氨酸。
5．權(quán)利要求1的人T細(xì)胞克隆，其T細(xì)胞受體的β鏈為Vβ6家族成員。
6．權(quán)利要求1的人T細(xì)胞克隆，其T細(xì)胞受體β鏈為Vβ12的家族成員。
7．權(quán)利要求1的人T細(xì)胞克隆，它在CD4陽性、有HLA-DR4或HLA-DR9的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者來源的滑膜細(xì)胞的存在下進(jìn)行增殖。
8．權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的人T細(xì)胞克隆的制備方法，包括有以下工程(1)建立來源于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織或滑液的T細(xì)胞克??；(2)篩選與該類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者來源的自身滑膜細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)的T細(xì)胞克隆；(3)篩選與含有與該自身滑膜細(xì)胞不同HLA-DR的、來源于其它類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細(xì)胞不進(jìn)行反應(yīng)的T細(xì)胞克??；和/或(4)篩選表達(dá)同該自身滑膜細(xì)胞相同的HLA-DR、而與不表達(dá)來源于該自身滑膜細(xì)胞的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原的細(xì)胞不進(jìn)行反應(yīng)的T細(xì)胞克隆。
9．自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的制備方法，其特征在于向只對(duì)抗原特異性增殖的T細(xì)胞中添加有抗原呈遞作用的細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的可溶性物質(zhì)，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)來建立T細(xì)胞株，然后按照權(quán)利要求8中的(3)和(4)項(xiàng)工程進(jìn)行。
10．以權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)中T細(xì)胞克隆的反應(yīng)性為指標(biāo)，檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原的方法。
11．權(quán)利要求10的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原的檢測(cè)方法，它包括從可能為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的被檢者滑膜細(xì)胞入手，將其可溶化，與權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)中的T細(xì)胞克隆和來源于被檢者的有抗原呈遞作用細(xì)胞的可溶性物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定該克隆的反應(yīng)性。
12與權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)中的人T細(xì)胞克隆具有反應(yīng)性的、來源于滑膜細(xì)胞的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原。
13．權(quán)利要求12的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原，用PBS作流動(dòng)相，以0.5ml/分的流速，通過TSK膠、G3000SW柱進(jìn)行的HPLC測(cè)定其分子量為25kDa或50kDa。
14．權(quán)利要求12中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗原的激動(dòng)劑或拮抗劑的篩選方法，它包括將預(yù)計(jì)含有該激動(dòng)劑或拮抗劑的樣品與特異性識(shí)別抗原的權(quán)利要求1中的T細(xì)胞克隆進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定該克隆的反應(yīng)性。
15．含有人白細(xì)胞介素2、人末梢血單核細(xì)胞PHA刺激培養(yǎng)上清和胎牛血清的培養(yǎng)基。
全文摘要
一種人T細(xì)胞克隆,它以HLA－DR限制性識(shí)別表達(dá)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者滑膜細(xì)胞的抗原,并對(duì)闡明RA的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)治療和預(yù)防方法極為有益。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1218506SQ9719462
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月13日
發(fā)明者前田朋子, 鈴木隆二, 鶴田裕次, 武本浩 申請(qǐng)人:鹽野義制藥株式會(huì)社