Glp-1與人血清白蛋白重組蛋白的設(shè)計(jì)及穩(wěn)定表達(dá)cho細(xì)胞株的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一類(lèi)新穎的胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類(lèi)似物與人血清白蛋白重組蛋白及其制備的方法。該新穎重組蛋白組成框架為：T-S-X-G-G-H，T代表的蛋白序列為生物親和標(biāo)簽；S代表的蛋白序列為蛋白酶酶切位點(diǎn)；X代表一個(gè)氨基酸；G代表GLP-1類(lèi)似物蛋白；H代表人血清白蛋白。該設(shè)計(jì)通過(guò)生物制備后經(jīng)酶切獲得N端均一的GLP-1類(lèi)似物樣品，提高生物樣品的均一性和活性。并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)這類(lèi)重組蛋白的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）穩(wěn)定表達(dá)株。本發(fā)明制備的新穎重組蛋白具有更高的生物學(xué)活性和更優(yōu)的體內(nèi)外穩(wěn)定性。這類(lèi)重組蛋白可用于治療2型糖尿病及通過(guò)降低血漿葡萄糖而受益的其它疾病。可用于誘導(dǎo)細(xì)胞分化為β胰腺細(xì)胞的1型糖尿病的治療。同時(shí)也可用于刺激神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生飽腹感和抑制胃蠕動(dòng)而受益的其他疾病。
【專(zhuān)利說(shuō)明】GLP-1與人血清白蛋白重組蛋白的設(shè)計(jì)及穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞株的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明利用基因工程手段，設(shè)計(jì)新穎的GLP-1與HSA的類(lèi)似物。新穎的重組蛋白利用新型構(gòu)建的高效表達(dá)質(zhì)粒PMH3，并在中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞(CHO)中表達(dá)。獲得了高活性和高表達(dá)的細(xì)胞株(CH0/pMH3/TSXGGH)。獲得的菌株產(chǎn)率高達(dá)9.45 μ g*d^l06cellso發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)量高，純化工藝方便，純化所獲得的產(chǎn)品符合原料藥的要求。該藥物用于糖尿病和相關(guān)疾病的治療。

【背景技術(shù)】
[0002]2型糖尿病，又被稱(chēng)之為非胰島素依賴(lài)糖尿病，緣于β細(xì)胞功能低下，胰島素相對(duì)缺乏和胰島素抵抗。近年來(lái)，2型糖尿病的患病率逐漸增加，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，至2030年，全球?qū)⒂?億2型糖尿病患者。GLP-1藥物能刺激β細(xì)胞的分化和增值，并且促進(jìn)β細(xì)胞的分泌胰島素的能力，而成為治療2型糖尿病的關(guān)鍵藥物。
[0003]GLP-1類(lèi)似物成藥的藥物有Glaxo Smith Kline公司生產(chǎn)的阿必魯泰(Albugon)和Eli Iily公司生產(chǎn)的艾塞那肽(exendin-4)。國(guó)內(nèi)的長(zhǎng)效GLP-1類(lèi)似物還沒(méi)有任何一個(gè)藥物通過(guò)CFDA的批準(zhǔn)上市。國(guó)外批準(zhǔn)上市的藥物有Glaxo Smith Kline公司生產(chǎn)的阿必魯泰(Albugon)和Eli Iily公司生產(chǎn)的艾塞那肽(exendin-4),但他們?cè)趹?yīng)用當(dāng)中都有很明顯的缺陷。阿必魯泰因是與脂肪酸融合而變成長(zhǎng)效藥物因其制備方法而導(dǎo)致藥物的單位活性損失100倍以上，而藥物的半衰期卻只有4-6 h左右，單位服用劑量大而使得患者的副作用增強(qiáng)。艾塞那肽是單一的蛋白藥物，生物制備方法使得產(chǎn)品質(zhì)量很好控制，但其藥物的半衰期只有2 h而患者每天要注射兩次，增加了患者的痛苦和副作用。
[0004]現(xiàn)在研究報(bào)道的人血清白蛋白與GLP-1類(lèi)似物重組蛋白在酵母中表達(dá)，未考慮N末端一致性而提高藥物高活性的問(wèn)題。生物模擬計(jì)算和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示N末端的是GLP-1藥物的活性區(qū)域，為保證N末端的一致性，本發(fā)明在新穎重組蛋白的N末端前添加Hi s-tag標(biāo)簽，并在Hi s-tag標(biāo)簽后加入蛋白酶位點(diǎn)(腸激酶DDDDK )。表達(dá)的重組蛋白6*His-DDDDK-X-GGH,純化后經(jīng)腸激酶酶切獲得重組蛋白(fus1n protein)。獲得的重組蛋白的N末端一致，且活性高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種重組蛋白并在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary,CH0)中制備方法，保證了 N末端的一致性并且獲得了高活性的藥物蛋白。主要包含的
【發(fā)明內(nèi)容】
包括以下幾點(diǎn)。
[0006](I)新穎GLP-1類(lèi)似物的重組蛋白設(shè)計(jì)。GLP-1 (A2G) - GLP-1 (A2G) -HSA蛋白分別簡(jiǎn)與為GGH,設(shè)計(jì)XGGH蛋白(X代表Iv氣基Ife或無(wú))。為表達(dá)N端一致性的目標(biāo)蛋白，在蛋白的N端添加His-tag等生物標(biāo)簽(簡(jiǎn)稱(chēng)T)，并在生物標(biāo)簽后加入腸激酶DDDDK等蛋白酶酶切位點(diǎn)(簡(jiǎn)稱(chēng)S)。通過(guò)基因工程手段獲得TSXGGH的基因片段。附圖中SEQ ID NO:1GLP-1 (A2G)- GLP-1 (A2G)-HSA基因序列，SEQ ID NO: 2 GLP-1 (A2G)- GLP-1 (A2G)-HSA蛋白序列。其它GLP-1類(lèi)似物序列以此類(lèi)推。
[0007](2)高效表達(dá)質(zhì)粒(pMH3/TSXGGH)的構(gòu)建。利用自行構(gòu)建的高啟動(dòng)活性，高GC序列和poly A序列的質(zhì)粒PMH3 (國(guó)際專(zhuān)利號(hào):W0/2008/091276)。表達(dá)的重組蛋白為T(mén) (親和標(biāo)簽)-S (蛋白酶位點(diǎn))-X-GLP-lm-GLP-lm-HSA，將表達(dá)的重組蛋白簡(jiǎn)稱(chēng)TSXGGH。經(jīng)&oR I和I酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并與ρΜΗ3載體連接。構(gòu)建表達(dá)細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pMH3/TSXGGH。
[0008](3)穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞株的篩選。所用的CHO細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)基(D001)和懸浮培養(yǎng)基(B001)均為優(yōu)化后的培養(yǎng)基。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)無(wú)內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒后，經(jīng)電轉(zhuǎn)和梯度壓力篩選獲得表達(dá)菌株。重復(fù)低密度鋪板和表型篩選四個(gè)循環(huán)后獲得穩(wěn)定且高表達(dá)的細(xì)胞株。穩(wěn)定細(xì)胞株可以連續(xù)培養(yǎng)20代以上，表達(dá)量無(wú)明顯變化。
[0009](4)穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞株的懸浮馴化與發(fā)酵。篩選的8株穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，在BOOl中連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)2個(gè)月，使得CHO細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。按照1:3比例放大培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，最后在10 L生物反應(yīng)器中發(fā)酵培養(yǎng)連續(xù)發(fā)酵12 do蛋白產(chǎn)率達(dá)4.58-9.43 μ g*d_1*106cellso
[0010](5)藥物蛋白純化與活性檢測(cè)。先通過(guò)Blue親和柱調(diào)取含HSA的蛋白并除去大部分的雜蛋白。稀釋溶液至電導(dǎo)與Ni離子柱等親和柱上樣液相同后，再通過(guò)Ni離子等親和柱調(diào)取N端含His-tag的蛋白。經(jīng)脫鹽柱置換緩沖液，獲得的蛋白通過(guò)腸激酶剪等蛋白酶酶切后終獲得N端均一的目標(biāo)蛋白。藥物蛋白經(jīng)體內(nèi)外活性檢測(cè)，均顯示有很好的藥效。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1:細(xì)胞株表達(dá)蛋白的Dot blot篩選圖；挑選的單克隆細(xì)胞經(jīng)Dot blot挑選高表達(dá)的克隆。
[0012]圖2:細(xì)胞株表達(dá)蛋白的Western blot篩選圖；挑選的8株高表達(dá)細(xì)胞株的GLP-1單抗的Western blot圖，泳道I為陽(yáng)性對(duì)品GGH。
[0013]圖3:細(xì)胞株表達(dá)蛋白的Western blot篩選圖；挑選的8株高表達(dá)細(xì)胞株的HSA單抗的Western blot圖，泳道I為陽(yáng)性對(duì)品GGH。
[0014]圖4:CH0細(xì)胞株的10 L發(fā)酵罐過(guò)程監(jiān)測(cè)。
[0015]圖5:CH0細(xì)胞株表達(dá)藥物蛋白的體外活性實(shí)驗(yàn)；在構(gòu)建好的CH0/GLP-1R/CRE-fLUC細(xì)胞模型檢測(cè)。
[0016]圖6:CH0細(xì)胞株表達(dá)藥物蛋白的體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)；給藥量為3 mg/kg。
[0017]

【具體實(shí)施方式】
[0018]具體實(shí)施方法是本發(fā)明的制備途徑之一，本發(fā)明還可以通過(guò)其他途徑實(shí)施和應(yīng)用，本發(fā)明可以在沒(méi)有違背本發(fā)明的精神下進(jìn)行修飾和改善。
[0019]具體實(shí)施方法1: GLP-1重組蛋白在CHO中的穩(wěn)定株克隆和制備實(shí)驗(yàn)材料中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO-S);遺傳霉素G418 (sigma)；自己構(gòu)建的表達(dá)載體pMH3 ；自己配置的培養(yǎng)基，貼壁培養(yǎng)基(D001)，懸浮培養(yǎng)基(B001)，流加培養(yǎng)基(F001);所用其它試劑皆為分析純?cè)噭?br> [0020]實(shí)驗(yàn)儀器
電轉(zhuǎn)儀；細(xì)胞培養(yǎng)箱；細(xì)胞搖床；10 L生物反應(yīng)器；常規(guī)的一次性耗材。
[0021]實(shí)驗(yàn)步驟
(I)質(zhì)粒提取
溶液配制:溶液 1:50mM 葡萄糖；25mM Tris_cl(pH 8.0) ；10mM EDTA (pH 8.0)，配好后滅菌放在 4°C。溶液 II:0.2 mol/L NaoH ；1% (m/L)的 SDS,現(xiàn)用現(xiàn)配。0.4 mol/L NaoH 與2% (m/L)的 SDS 等體積混勻。溶液 III (100 mL):5mol/L KAc 60 mL ;冰醋酸 11.5 ml ;水28.5 mL。
[0022]操作步驟。培養(yǎng)12-16 h的新鮮菌液6-8 mL, 12000 rpm lmin，吸掉管底殘留培養(yǎng)基。溶液I 300 μ L，用移液器吹打使菌體充分重懸。溶液II 300 μ L，小心翻轉(zhuǎn)EP管，待液體變清澈后，靜置I min。溶液III 300 μ L，小心的混勻，有大量的白色絮狀析出(液體是透明的)。12000 rpm離心15 min,移上清至一新EP管中，再重復(fù)一遍。加異丙醇至1.5mL, -20°C, 1min0 12000 rpm離心25 min。在管里加ImL的75%乙醇漂洗沉淀,倒掉乙醇，晾干。加入超純水溶解，加入適量RNA酶，37°C I h。按體積比1:1加入苯酚，劇烈混勻，靜置2 min。12000 rpm離心10 min,小心吸取上清至一新EP管。按體積比1:1加入氯仿，劇烈混勻，靜置2 min。12000 rpm離心10 min，小心吸取上清至一新EP管。在上清中加入 75 μ L3M 的 NaAc,加異丙醇至 1.5 mL, -20°C , 1min0 12000 rpm 離心 25 min,倒掉上清，加入ImL的75%乙醇漂洗。12000 rpm離心2 min，倒掉乙醇，晾干。溶于適量的超純水中(100 μ L 左右)。
[0023](2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染
準(zhǔn)備高濃度無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒，收集CHO細(xì)胞。配置電轉(zhuǎn)反應(yīng)體系:200 yL細(xì)胞懸液+20μ g質(zhì)粒+10 μ g鮭魚(yú)精DNA (提高轉(zhuǎn)染效率)，混勻后加入2 mm電極杯中。將電極杯冰浴I min,250V, 12 mS電擊一次，冰浴I min。兩個(gè)dish中各加入10 mL的培養(yǎng)基(D001含10%FBS)，將電極杯中的懸液均分至兩個(gè)dish中。
[0024](3)克隆篩選
待dish細(xì)胞生長(zhǎng)兩天貼壁后，換液(D001+6%FBS)加壓，加G418濃度為1.2-1.8mg/mL。有大量死細(xì)胞直接換液不加壓，待克隆長(zhǎng)出。細(xì)胞單克隆長(zhǎng)至合適大小，準(zhǔn)備挑克隆。將克隆挑至96孔板中。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待克隆長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)80%孔底，通過(guò)Dot blot (附圖1)和WB (附圖2、圖3)檢測(cè)表達(dá)情況。挑選陽(yáng)性克隆繼續(xù)放大貼壁培養(yǎng)，繼續(xù)講陽(yáng)性克隆消化后放置在dish中加壓培養(yǎng)，待長(zhǎng)出克隆可見(jiàn)后據(jù)需挑至96孔板中通過(guò)Dot blot和WB檢測(cè)表達(dá)情況。
[0025](4)細(xì)胞懸浮馴化
選擇8個(gè)陽(yáng)性克隆，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度至90%左右時(shí)，將兩瓶T75細(xì)胞消化，合并轉(zhuǎn)移至40mL搖瓶中，加入30mL懸浮培養(yǎng)液B001懸浮馴化。連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月，挑選最終適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株作為工程菌株。
[0026](5) Dot blot 檢測(cè)
收集樣本，一般為細(xì)胞培養(yǎng)液上清；點(diǎn)膜，使用NC膜或PVDF膜(需泡甲醇)，按照樣品順序點(diǎn)膜，5uL/點(diǎn)，設(shè)置陰性對(duì)照(空培養(yǎng)液、空細(xì)胞培養(yǎng)液)和陽(yáng)性對(duì)照(稀釋梯度)，并用圓珠筆做好標(biāo)記；將膜置37°C烘干，約10-15min ;封閉，用TBST配制5%脫脂奶粉，室溫?fù)u床封閉Ih ；TBST洗滌1-2次;一抗(TBST配制)孵育Ih ；TBST洗滌三次，每次1min ;二抗(TBST配制)孵育Ih ;TBST洗滌三次，每次1min ；ECL顯影。
[0027](6) Western blot 檢測(cè)
收集樣本，一般為細(xì)胞培養(yǎng)液上清。樣品處理，加入相應(yīng)量的Loading buffer，煮沸5min ；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜，電泳完后，將膠小心剝下，與濾紙、纖維墊、硝酸纖維膜按正確順序裝好，_20°C浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液40 min ;裝好轉(zhuǎn)移電泳盒，放入轉(zhuǎn)子、冰盒，接好電源，在磁力攪拌器上50-100V恒壓轉(zhuǎn)移Ih ;轉(zhuǎn)移完成后拆去轉(zhuǎn)移裝置，揭下膜，標(biāo)記好正反面(膜與膠貼著的一面為正面)，放入麗春紅染液染色5-10 min，取出，去離子水洗去浮色，觀察轉(zhuǎn)移效果，麗春紅染色可做可不做；加入封閉液，4 °C過(guò)夜，或室溫Ih ;TBST洗膜1-2次；用TBST稀釋一抗，置于水平搖床上室溫孵育I h ；TBST洗滌三次，每次1min ;用TBST稀釋二抗，置于水平搖床上室溫孵育I h ；TBST洗滌三次，每次1minECL顯色。
[0028](7)穩(wěn)定細(xì)胞株的10 L生物反應(yīng)器發(fā)酵表達(dá)
裝液量為6 L，準(zhǔn)備I L種子液，密度為4.0 X 16個(gè)/mL。轉(zhuǎn)速為110 rpm, pH控制為
7.2，培養(yǎng)溫度為37°C。通過(guò)調(diào)節(jié)氧氣和二氧化碳的通氣量保證溶氧控制在3(Γ60%之間。待細(xì)胞密度長(zhǎng)為9.0 X 16個(gè)/mL后，降低溫度流加R)01繼續(xù)培養(yǎng)10 d(圖4)。結(jié)果顯示，在發(fā)酵罐中前三天細(xì)胞密度每天翻倍增長(zhǎng)，第三天細(xì)胞密度高達(dá)8.78*106 cell/mL。第三天后降溫細(xì)胞密度變化不大，細(xì)胞開(kāi)始大量生產(chǎn)目的蛋白，發(fā)酵后期細(xì)胞死亡率增加，蛋白積累量減少，最終的蛋白濃度可達(dá)到487 mg/Lo
[0029](8)重組蛋白的純化
發(fā)酵液8000 rpm、10 min離心獲得上清液,用0.45 μπι的膜過(guò)濾除菌。用截留分子量10 kDa的超濾儀超濾濃縮5?12倍。第一步選用Blue Sepharose, 0.1 mol/L NaCl (pH
6.0?9.0)平衡，用濃縮液上樣，淋洗平衡。2 mol/L NaCl (pH 6.0?9.0)為B液，以100%B液梯度洗脫。第二部稀釋收集的洗脫液，經(jīng)過(guò)Ni Sepharose親和層析,收集100 mmol/L咪唑的洗脫液。最后一步經(jīng)G25 Sepharose離子層析置換緩沖液。置換后的純化蛋白經(jīng)腸激酶剪切后，再經(jīng)過(guò)Ni Sepharose親和層析流穿液即為最終制備的樣品。
[0030]整個(gè)純化工藝步驟銜接較好，上一步層析的洗脫液只需要稍微的調(diào)節(jié)便可作為下一步的層析上樣液。減少中間處理步驟，便于工業(yè)化操作和減少中間操作帶來(lái)的污染。
[0031 ] (9)重組蛋白的活性檢測(cè)
體外細(xì)胞模型活性檢測(cè):脂質(zhì)體順轉(zhuǎn)=Optiwcly 100 μ L中加入1.5 μ g/mL GLP-1R質(zhì)粒和0.5yg/mL CRE/Luc置15min，加至HEK293細(xì)胞中，培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞鋪于96孔板中(80*104個(gè)/mL)，過(guò)夜培養(yǎng)至90%-95%匯合度即可，每孔100 μ L。將培養(yǎng)基吸走，加入DMEM和藥物的刺激液各100 μ L，孵育4h。吸走培養(yǎng)基，每孔加50 μ L裂解液，于水平搖床震蕩30min。吸取30 μ L裂解液與配制好的15 μ L檢測(cè)液混合，加入96孔板，搖床震蕩15min，檢測(cè)0D.。結(jié)果顯示CHO表達(dá)的藥物蛋白可以刺激胞內(nèi)的cAMP含量提升并刺激熒光蛋白(Luc)的提高，結(jié)果見(jiàn)附圖5。
[0032]體內(nèi)活性檢測(cè):取體重22-25 g雄性KM小鼠50只，隨機(jī)分為:正常組，Exendin-4組(0.125mg/Kg) ,GGH高劑量組(6.0 mg/kg)和低劑量組(3 mg/kg)。小鼠禁食(不禁水)過(guò)夜后，各組灌胃給藥，正常組給生理鹽水。3各組小鼠灌胃給予1.5 g/kg葡萄糖溶液后立刻尾靜脈注射Exendin-4和不同劑量的GGH。注射后20、40、60 min、80 min、10min的血糖值。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的血糖水平長(zhǎng)時(shí)間的得到控制，結(jié)果見(jiàn)附圖6。
[0033] SEQ ID NO:1
ICACCACCACC ATCACCATGA TGACGATGAC AAGCACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT
61GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCMGCTGCT AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT
121AGACACGGTG AAGGTACTTT CACTTCTGAT GTTTCTTCTT ACTTGGAAGG TCAAGCTGCT
181AAGGAGTTCA TTGCTTGGTT GGTTAAGGGT AGAGATGCAC ACAAGAGTGA GGTTGCTCAT
241CGATTTAAAG ATTTGGGAGA AGAAAATTTC AMGCCTTGG TGTTGATTGC CTTTGCTCAG
301TATCTTCAGC AGTGTCCATT TGAAGATCAT GTAAAATTAG TGAATGAAGT AACTGAATTT
361GCAAAAACAT GTGTTGCTGA TGAGTCAGCT GAAAATTGTG ACAMTCACT TCATACCCTT
421TTTGGAGACA AATTATGCAC AGTTGCAACT CTTCGTGAM CCTATGGTGA AATGGCTGAC
481TGCTGTGCAA AACMGAACC TGAGAGAMT GAATGCTTCT TGCAACACAA AGATGACAAC
541CCAAACCTCC CCCGATTGGT GAGACCAGAG GTTGATGTGA TGTGCACTGC TTTTCATGAC
601AATGMGAGA CATTTTTGM AAAATACTTA TATGAAATTG CCAGAAGACA TCCTTACTTT
661TATGCCCCGG AACTCCTTTT CTTTGCTMA AGGTATMAG CTGCTTTTAC AGAATGTTGC
721CAAGCTGCTG ATAAAGCTGC CTGCCTGTTG CCAAAGCTCG ATGAACTTCG GGATGAAGGG
781AAGGCTTCGT CTGCCMACA GAGACTCAAG TGTGCCAGTC TCCMAAATT TGGAGAAAGA
841GCTTTCAAAG CATGGGCAGT AGCTCGCCTG AGCCAGAGAT TTCCCMAGC TGAGTTTGCA
901GMGTTTCCA AGTTAGTGAC AGATCTTACC AAAGTCCACA CGGAATGCTG CCATGGAGAT
961CTGCTTGAAT GTGCTGATGA CAGGGCGGAC CTTGCCAAGT ATATCTGTGA AAATCAAGAT
1021TCGATCTCCA GTAAACTGAA GGAATGCTGT GAMAACCTC TGTTGGAMA ATCCCACTGC
1081ATTGCCGAAG TGGMAATGA TGAGATGCCT GCTGACTTGC CTTCATTAGC TGCTGATTTT
1141GTTGAAAGTA AGGATGTTTG CMAAACTAT GCTGAGGCAA AGGATGTCTT CCTG GGCATG
1201TTTTTGTATG AATATGCAAG AAGGCATCCT GATTACTCTG TCGTGCTGCT GCTGAGACTT
1261GCCMGACAT ATGAAACCAC TCTAGAGMG TGCTGTGCCG CTGCAGATCC TCATGMTGC
1321TATGCCAMG TGTTCGATGA ATTTAAACCT CTTGTGGAAG AGCCTCAGAA TTTAATCAAA
1381CMAATTGTG AGCTTTTTGA GCAGCTTGGA GAGTACAAAT TCCAGAATGC GCTATTAGTT
1441CGTTACACCA AGAAAGTACC CCAAGTGTCA ACTCCAACTC TTGTAGAGGT CTCAAGAMC
1501CTAGGAAAAG TGGG CAGCAA ATGTTGTAAA CATCCTGAAG CAAAMGAAT GCCCTGTGCA
1561GAAGACTATC TATCCGTGGT CCTGMCCAG TTATGTGTGT TGCATGAGM AACGCCAGTA
1621AGTGACAGAG TCACCAAATG CTGCACAGM TCCTTGGTGA ACAGGCGACC ATGCTTTTCA
1681GCTCTGGAAG TCGATGAAAC ATACGTTCCC AMGAGTTTA ATGCTGMAC ATTCACCTTC
1741CATGCAGATA TATGCACACT TTCTGAGAAG GAGAGACAAA TCAAGMACA AACTGCACTT
1801GTTGAGCTCG TGAAACACAA GCCCAAGGCA ACAAMGAGC AACTGAMGC TGTTATGGAT
1861GATTTCGCAG CTTTTGTAGA GMGTGCTGC AAGGCTGACG ATAAGGAGAC CTGCTTTGCC
1921GAGGAGGGTA AAAAACTTGT TGCTGCAAGT CAAGCTGCCT TAGGCTTATA A SEQ ID NO:2
IHisHisHisHisHisHisAspAspAspAspLysHisGlyGluGlyThrPheThrSerAsp
21ValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIIeAlaTrpLeuValLysGly41ArgHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAla
61LysGluPhelleAlaTrpLeuValLysGlyArgAspAlaHisLysSerGluValAlaHis
81ArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeuIIeAlaPheAlaGln
101TyrLeuGlnGlnCysProPheGluAspHisValLysLeuValAsnGluValThrGluPhe
121AlaLysThrCysValAlaAspGluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeu
141PheGlyAspLysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMETAlaAsp
161CysCysAlaLysGlnGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGlnHisLysAspAspAsn
181ProAsnLeuProArgLeuValArgProGluValAspValMETCysThrAlaPheHisAsp
201AsnGluGluThrPheLeuLysLysTyrLeuTyrGluIIeAlaArgArgHisProTyrPhe
221TyrAlaProGluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCysCys
241GlnAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGluLeuArgAspGluGly
261LysAlaSerSerAlaLysGlnArgLeuLysCysAlaSerLeuGlnLysPheGlyGluArg
281AlaPheLysAlaTrpAlaValAlaArgLeuSerGlnArgPheProLysAlaGluPheAla
301GluValSerLysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGlyAsp
321LeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrIIeCysGluAsnGlnAsp
341SerlleSerSerLysLeuLysGluCysCysGluLysProLeuLeuGluLysSerHisCys
361IleAlaGluValGluAsnAspGluMETProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPhe
381ValGluSerLysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAspValPheLeuGlyMET
401PheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAspTyrSerValValLeuLeuLeuArgLeu
421AlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCysCysAlaAlaAlaAspProHisGluCys
441TyrAlaLysValPheAspGluPheLysProLeuValGluGluProGlnAsnLeuIIeLys
461GlnAsnCysGluLeuPheGluGlnLeuGlyGluTyrLysPheGlnAsnAlaLeuLeuVal
481ArgTyrThrLysLysValProGlnValSerThrProThrLeuValGluValSerArgAsn
501LeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMETProCysAla
521GluAspTyrLeuSerValValLeuAsnGlnLeuCysValLeuHisGluLysThrProVal
541SerAspArgValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPheSer
561AlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPhe
581HisAlaAspIIeCysThrLeuSerGluLysGluArgGlnlIeLysLysGlnThrAlaLeu
601ValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThrLysGluGlnLeuLysAlaValMETAsp
621AspPheAlaAlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAla
641GluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGlnAlaAlaLeuGlyLeu
【權(quán)利要求】
1.一種類(lèi)似物蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)方法，其特征為:蛋白序列結(jié)構(gòu)為1-34-(-- ；其中I'代表的蛋白序列為生物親和標(biāo)簽；3代表的蛋白序列為蛋白酶酶切位點(diǎn)3代表一個(gè)氨基酸而代表61？-1類(lèi)似物蛋白出代表人血清白蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的設(shè)計(jì)方法，其特征為:1代表的蛋白序列為親和標(biāo)簽蛋白序列，優(yōu)先為??！18-1:叫、！！18-？1叫、'-1:叫、18？-1:叫、81:1-61)-1:88中的一種，但不僅局限于所列舉的未和蛋白標(biāo)簽。
3.如權(quán)利要求1所述的設(shè)計(jì)方法，其特征為:3代表的蛋白序列為蛋白酶酶切位點(diǎn)的蛋白序列，優(yōu)先為腸激酶酶切位點(diǎn)00001凝血酶酶切位點(diǎn)、凝血因子即12/0(?、煙草蝕紋病毒蛋白酶中的一種，但不僅局限于所列舉的蛋白酶酶切位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述的設(shè)計(jì)方法，其特征為4代表的氨基酸為以7、？1~0、紅8、％1、？116、丁印、161:、[78、八1已和I'口'中的一種；優(yōu)先選擇61丫、[78、八1已中的一種。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所設(shè)計(jì)的重組蛋白包含序列為以下的任何一種父-以迅和(--:1-8-66?是I'-3與以迅直接融合的蛋白，I'-為I'-3，X和(--按照權(quán)利1順序融合的蛋白，為X與(--直接融合的蛋白，(--為61？~1類(lèi)似物蛋白的二聯(lián)體與人血清白蛋白的融合蛋白。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所設(shè)計(jì)的重組蛋白在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(:?)中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選在(310-3細(xì)胞中懸浮培養(yǎng)表達(dá)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，由高效表達(dá)質(zhì)粒？腿3整合到(^0基因組中進(jìn)行表達(dá)。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征為:培養(yǎng)表達(dá)的培養(yǎng)基為優(yōu)化后高效表達(dá)的培養(yǎng)基，￠:?)細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)基為0001，懸浮培養(yǎng)基為8001，流加培養(yǎng)基為？001 ；按照1:3比例放大培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，最后在10 [生物反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)酵12山蛋白產(chǎn)率高達(dá)4.58-9.43 9 ^^10606118 ；發(fā)酵表達(dá)獲得的重組蛋白，先通過(guò)81116親和柱附層析，再經(jīng)脫鹽柱置換緩沖液，再通過(guò)腸激酶剪切后獲得~端均一的重組蛋白。
9.如權(quán)利8所述的方法，其特征在于:制備獲得的重組蛋白可用于2型糖尿病和通過(guò)降低血漿葡萄糖而受益的其它疾病的治療；可用于誘導(dǎo)細(xì)胞分化為13胰腺細(xì)胞的1型糖尿病的治療；可用于刺激神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生飽腹感和抑制胃蠕動(dòng)而受益的其他疾病。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104403005SQ201410699879
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】金堅(jiān), 錢(qián)凱, 龔笑海, 馬鑫, 朱瑞宇, 蔡燕飛, 陳蘊(yùn) 申請(qǐng)人:江南大學(xué), 無(wú)錫鑫連鑫生物醫(yī)藥科技有限公司