淀粉樣蛋白tdp-43及其用途
【專利摘要】本發(fā)明證明了TDP-43多肽和其他淀粉樣蛋白的結(jié)構(gòu)相似性。通過檢測橫跨先前定義的淀粉樣蛋白的片段，發(fā)現(xiàn)了形成淀粉樣纖維的最小核心區(qū)域，這與FTLD-TDP 腦組織中檢測到的TDP-43纖維是相似的。A315E突變型淀粉樣蛋白TDP-43多肽可以雜交其他TDP-43多肽和淀粉樣β多肽。淀粉樣蛋白TDP-43多肽的結(jié)構(gòu)為反向平行β構(gòu)象，它能誘導(dǎo)TDP-43從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)重新分配。TDP-43多肽可以被軸突取代，誘導(dǎo)軸突毒性和神經(jīng)元死亡。淀粉樣蛋白TDP-43多肽中一個(gè)氨基酸的改變會打亂其纖維結(jié)構(gòu)也會減少神經(jīng)毒性，支持了淀粉樣蛋白的生成對于TDP-43神經(jīng)毒性的重要性。
【專利說明】淀粉樣蛋白TDP-43及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種淀粉樣蛋白TDP-43及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002]經(jīng)過不懈的努力之后，人們清楚了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，包括癡呆(如AD和FTLD)、運(yùn)動神經(jīng)元疾病、帕金森和海綿狀腦病。這些神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)共同的機(jī)制是受影響的神經(jīng)元中這些疾病相關(guān)蛋白的聚合和錯折疊，例如，AD中的β淀粉樣蛋白，PD中的α突觸核蛋白，海綿狀腦病中的朊蛋白和最近的TDP-43蛋白樣疾病中的TDP-43。這些蛋白質(zhì)的共有的一種生化特征是有形成淀粉樣纖維的傾向。然而，對于TDP-43淀粉樣蛋白生成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和其神經(jīng)毒性作用的仍有待闡明。
[0003]TDP-43 (transactive response DNA-binding protein of 43 ku)是一種組織中分布廣泛、功能多樣的核蛋白，是一個(gè)多功能的DNA和RNA結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮功能。在肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)和額顳葉變性(FTLD)病人脊髓或大腦受損區(qū)域的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中，能檢測到泛素化的蛋白質(zhì)包涵體，TDP-43是其特征性成分。在家族性或散發(fā)性ALS病例中，已鑒定出30多個(gè)TDP-43的突變，它們多集中于該蛋白C端的甘氨酸富集區(qū)。ALS相關(guān)的突變集群在羧基末端TDP-43甘氨酸富集的區(qū)域，雖然在TDP-43的RNA結(jié)合域的RNA識別序列已被充分表征，其突變富集的疾病相關(guān)的羧基末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)仍然不明確。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種淀粉樣蛋白TDP-43及其用途，其能用于篩選阻斷TDP-43聚集的化合物，從而治療與TDP-43的蛋白通路相關(guān)的老年癡呆癥和運(yùn)動神經(jīng)元疾病。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種淀粉樣蛋白TDP-43，所述淀粉樣蛋白TDP-43采用反向平行β構(gòu)象。
[0006]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述淀粉樣蛋白TDP-43形成纖維的最小核心區(qū)域?yàn)閃t-TDP-43肽、A315T突變型TDP-43肽或A315E突變型TDP-43肽。
[0007]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述Wt-TDP-43肽的氨基酸序列為MGGGMNFGAFSIN，所述A315T突變型TDP-43肽的氨基酸序列為MGGGMNFGTFSIN，所述A315E突變型TDP-43肽的氨基酸序列為MGGGMNFGEFSIN。
[0008]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述淀粉樣蛋白TDP-43能自交或雜交誘導(dǎo)淀粉樣纖維的形成。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述A315E突變型TDP-43肽能雜交A β 1-40肽。
[0010]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述淀粉樣蛋白TDP-43能誘導(dǎo)TDP-43從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的重新分配，導(dǎo)致細(xì)胞核TDP-43減少和細(xì)胞質(zhì)TDP-43增加。
[0011]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述淀粉樣蛋白TDP-43通過誘導(dǎo)軸突損傷和神經(jīng)元死亡增強(qiáng)神經(jīng)毒性，能用于開發(fā)TDP-43蛋白病的生物標(biāo)記物。
[0012]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述淀粉樣蛋白TDP-43用于篩選阻斷TDP-43聚集的化合物或修飾基因，從而治療與TDP-43的蛋白通路相關(guān)的老年癡呆癥和運(yùn)動神經(jīng)元疾病。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的淀粉樣蛋白TDP-43及其用途，其能用于篩選阻斷TDP-43聚集的化合物，從而治療與TDP-43的蛋白通路相關(guān)的老年癡呆癥和運(yùn)動神經(jīng)元疾病，TDP-43肽的水平傳播和它的神經(jīng)毒性可促使我們開發(fā)靈敏的方法，用于檢測TDP-43蛋白病患者的腦脊髓液或血漿中諸如TDP-43這樣的基因產(chǎn)物，同時(shí)有助于開發(fā)TDP-43蛋白病例的生物標(biāo)記物。還能搜尋化學(xué)化合物或修飾基因，如可以抑制淀粉樣TDP-43種類形成，或者抑制淀粉樣蛋白原纖維形成/接種或阻斷神經(jīng)毒性TDP-43肽的吸收或選擇性地促進(jìn)神經(jīng)毒性TDP-43基因產(chǎn)物清除，為TDP-43蛋白病患者提供治療學(xué)的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是在TDP-43的C-末端甘氨酸富集的區(qū)域之內(nèi)，不同TDP-43多肽的位置和序列的圖表解釋，顯示了我們先前定義的TDP-43的淀粉樣蛋白區(qū)域aa286331的序列和ALS-相關(guān)的突變型。疾病相關(guān)的突變型影響的氨基酸殘基有加亮。相同的或相似的殘基有標(biāo)注，分別把朊病毒蛋白的殘基60120對應(yīng)到TDP-43(aa286331)。但是應(yīng)當(dāng)指出的是，磷酸化的A315T肽T6是合成的，但不進(jìn)一步推行，因?yàn)樗囊慌鸵慌憩F(xiàn)型不太一致，可能是由于不完全的/異構(gòu)磷酸化。T6肽，因此不包括在隨后的實(shí)驗(yàn)中。
[0015]圖2是在不同時(shí)間點(diǎn)定時(shí)拍攝的相應(yīng)的TDP-43肽AFM圖像。在0.5h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，A315T組只檢測到少數(shù)原纖維(在圓圈示出)，而在A315E多肽中檢測到許多顆粒狀聚集物。在Ih這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，A315E多肽樣本中檢測到許多短纖維。在3h至8h，A315E多肽形成豐富的原纖維，而Wt和A315T多肽形成較少但是較粗較長的纖維。
[0016]圖3是不同的放大倍數(shù)下不同的TDP-43多樣肽的EM圖像。該Wt和A315T肽形成的主要為直纖維，而A315E肽形成的原纖維表現(xiàn)出彎曲的螺旋特征，兩個(gè)彎曲之間的平均距離為?287.3 nm之間(范圍88.3-642.3 nm，箭頭標(biāo)記了兩個(gè)彎曲)。不同組纖維的平均直徑(nm):Wt，9.3 (范圍:4.1-21.1) ;A315T，10.1 (范圍:3.5-21.6)和 A315E，10.9 (范圍:4.9-17.3)。將G314V突變型引入Wt或者A314E突變型肽來消除原纖維形成這些肽。比例尺:200 nm。
[0017]圖4是之前已經(jīng)描述了來源于FTLD-TDP患者和對照組已經(jīng)驗(yàn)證的死亡的大腦樣本，并使用特異性抗TDP-43抗體和第二抗體兔免疫金膠體(10 nm)進(jìn)行免疫染色。三個(gè)FTLD-TDP案例檢查均顯示TDP-43免疫反應(yīng)性的纖維樣結(jié)構(gòu)，而在6個(gè)對照大腦樣本中沒有檢測到這種纖維。在這些FTLD-TDP病例中檢測出的原纖維樣結(jié)構(gòu)類似于由圖3所示的TDP-43肽所形成的原纖維。
[0018]圖5是TDP-43的合成肽在62.5、125和250 μ M的不同濃度孵育，而淀粉樣蛋白原纖維形成用熒光增強(qiáng)后的ThT結(jié)合檢測。
[0019]圖6是不同TDP-43肽用一系列預(yù)先形成的種子在PBS緩沖液(pH為7.4)中以62.5 μΜ的濃度孵育，種子通過Wt、A315T和A315E預(yù)先形成?！唉帧眱H表示預(yù)形成種子的ThT熒光強(qiáng)度。但是應(yīng)當(dāng)注意的是，只有Α315Ε肽種子能夠誘導(dǎo)Τ8肽原纖維的形成，縮短Wt肽纖維形成的停滯期。
[0020]圖7是通過ThT結(jié)合檢查不同濃度(62.5μΜ和125μΜ)的兩個(gè)β淀粉樣蛋白衍生肽，A β 9-14和A β 1-40，添加Α315Ε突變型TDP-43肽種子促進(jìn)了 A β的1_40肽淀粉樣纖維的形成。
[0021]圖8是Wt、A315T、A315E和T8-TDP-43肽的CD光譜和這張插圖里放大的A315E肽的光譜。A315E肽在193nm的清晰正峰表明了 β片層結(jié)構(gòu)的存在。
[0022]圖9是TDP-43肽的FTIR光譜。粗虛線是原始曲線，細(xì)實(shí)線是對應(yīng)的峰分化曲線。分化的峰的峰值已經(jīng)顯示出來了。
[0023]圖10是A315E-TDP-43 (Μ307-Ν319)核心肽序列是根據(jù)全長TDP-43上標(biāo)記的頂部相對應(yīng)的氨基酸殘基(參見序列ID:ΝΜ_007375 ;ΝΡ_031401)。為方便標(biāo)記，在圖11和12中的氨基酸殘基編號對應(yīng)于氨基酸末端肽的位置。該2-D1H-NOESY譜選定區(qū)域表示肽的疏水性殘基之間形成的NOE交叉峰。值得注意的是，檢測到了數(shù)套Μ311和1318之間、Μ311和F313之間、F316和1318之間的ΝΟΕ，表明該殘基M311，F(xiàn)313，F(xiàn)316和1318有可能形成一種疏水族。
[0024]圖11在DQF-COSY譜的區(qū)域表示G314的耦合常數(shù)。幾組G314殘基的COSY峰組用圓圈圈起來，耦合常數(shù)顯示在相應(yīng)圓圈的上面或下面。
[0025]圖12是分子間相互作用模型中10個(gè)疊加的A315E突變型TDP-43核心肽NMR衍生結(jié)構(gòu)支柱的立體視圖。這兩條肽鏈中，A鏈和B鏈的是以頭對尾的反平行方式組合，標(biāo)注了氨基酸殘基數(shù)和多肽N和C末端的標(biāo)簽。
[0026]圖13是分子間相互作用模型中A315E-TDP-43淀粉樣蛋白核心肽一個(gè)具有代表型的NMR結(jié)構(gòu)的帶狀圖。
[0027]圖 14 是 HEK293 細(xì)胞用對照(Ctr)、Wt、A315T、A315E 或 A315E / G314V (A315E /GV)突變體TDP-43肽(50μΜ)處理24h，然后固定進(jìn)行免疫染色，用抗TDP-43抗體檢測內(nèi)源性蛋白。細(xì)胞核(Nu)用Hoechst染料染色。A315Et突變型TDP-43肽誘導(dǎo)TDP-43免疫著色信號從細(xì)胞核顯著的再分配，而A315E/ G314V突變型肽不能誘導(dǎo)TDP-43再分配。顯示了共焦圖象的Z-stack預(yù)測。三角箭頭標(biāo)記減少的細(xì)胞核和增加的細(xì)胞質(zhì)TDP-43染色信號，而箭頭標(biāo)記的細(xì)胞幾乎沒有可檢測到的細(xì)胞核TDP-43信號。
[0028]圖15是生化分離實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核TDP-43水平，細(xì)胞質(zhì)部分(泳道1-5)和細(xì)胞核部分(泳道6-10)用不同的TDP-43肽的HEK293細(xì)胞處理后的24小時(shí)[Ctr:泳道1，6 ;Wt:泳道 2，7 ;A315T:泳道 3，8 ;A315E:泳道 4，9 和 A315E/ G314V (A315E/ GV):泳道5，10]。用RhoA和PCNA來分別監(jiān)控這些部分里面的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白。
[0029]圖16是WB信號的定量，與圖14的泳道一致:P <0.001;**:P〈0.01* P〈0.05;統(tǒng)計(jì)分析方式中單因素方差分析)。對照泳道的信號是標(biāo)準(zhǔn)化的。圖17是皮層神經(jīng)元(div3)免疫熒光染色圖像48h緊接著用對照或不同TDP-43肽處理的圖像。
[0030]圖18是神經(jīng)細(xì)胞百分比的定量顯示肽處理后TDP-43陰性細(xì)胞核24h和48h的比例。肽處理后24h，只有A315E突變型肽TDP-43核染色減少，而其它TDP-43肽與對照組相比沒有顯示顯著的效果。肽處理48h，淀粉樣肽(Wt、A315T和A315E)誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元中TDP-43再分配。箭頭標(biāo)示出TDP-43再分配的神經(jīng)細(xì)胞。每組有100個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行評分。數(shù)據(jù)表示來源于三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。:P〈0.001:P〈0.01* P〈0.05 ；多重檢測的單因素方差分析)。
[0031]圖19是在光感受器中Wt或者A315T突變型人TDP-43的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因果蠅進(jìn)行性視網(wǎng)膜變性。用GMR-gal4驅(qū)動來表達(dá)對照載體或Wt或A315T突變型TDP-43 ；fft和A315T突變型TDP-43蛋白在光感受器細(xì)胞的表達(dá)是同等水平的。但是應(yīng)當(dāng)指出的是由于技術(shù)上的困難我們無法獲得的轉(zhuǎn)基因果蠅表達(dá)A315E突變TDP-43蛋白。與我們之前的研宄一樣，視網(wǎng)膜變性的表現(xiàn)型評分在孵化后的第I天、第3和第6天來檢測果蠅的眼睛。簡言之，視網(wǎng)膜變性被分為1-4級如圖B1-B4所示(與A中所示的對照組果蠅正常眼相比)。
[0032]圖20是對果蠅視網(wǎng)膜損傷不同水平的百分比進(jìn)行定量，A315T突變型TDP-43的表達(dá)比Wt-TDP-43導(dǎo)致更嚴(yán)重視網(wǎng)膜變性。
[0033]圖21是果蠅蕈形體(MBs)中Wt或者A315T突變型TDP-43的表達(dá)引起軸突變性。共聚焦顯微鏡圖像顯示，從第5天轉(zhuǎn)基因果蠅的蕈形體。對照蒼蠅(0K107 GaWUAS-mGFP/UAS-RFP)表現(xiàn)正常MB葉的結(jié)構(gòu)。箭頭:α / α ’葉；三角箭頭:β / β ’葉；星:γ葉。0K107-Gal4/UAS-mGFP/UAS-Wt-hTDP43-RFP 果蠅在第 I 天開始丟失 MB 葉。到第 5 天，MB的大小可檢測到顯著軸索損傷和減少。這樣的軸索損傷和MB葉損失在A315T突變型果蠅表達(dá)中更加明顯(0K107-Gal4/UAS-mGFP/UAS-A315T-hTDP43-RFP)。細(xì)箭頭標(biāo)記異常軸突靜脈曲張與mGFP的信號分布不均。比例尺為50 μ mD
[0034]圖22是皮層神經(jīng)元末端標(biāo)記法(TUNEL)染色結(jié)果顯示了 Wt、A315T和A315E突變型多肽的神經(jīng)毒性。TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞的百分比顯示凋亡的細(xì)胞核的定量在B中顯示。神經(jīng)細(xì)胞在蓋玻片上培養(yǎng)，染色和定量如前面所描述的。對照組中健康的神經(jīng)元顯示在面板A的子面板A1-A4中。箭頭標(biāo)記TUNEL陽性的伴有核濃縮的凋亡神經(jīng)細(xì)胞，而三角箭頭標(biāo)出那些破碎的細(xì)胞核。CH，微流體中神經(jīng)元培養(yǎng)表明，TDP-43肽運(yùn)用于軸突部分足以引起軸突毒性和神經(jīng)元死亡。這些數(shù)據(jù)代表了 3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每組定量的神經(jīng)細(xì)胞>200 (***:P〈0.0001;#:P〈0.001，多重測試試驗(yàn)單因素方差分析)。
[0035]圖23是帶有不同的隔室微流體和軸突隔室中多肽應(yīng)用的示意圖。右側(cè)的熒光顯微圖像顯示出微槽的軸突下面的經(jīng)Hoechst染色檢測到細(xì)胞體隔室的細(xì)胞核使用抗Tujl抗體免疫染色。細(xì)胞體室(單元)和軸突隔室(Axon)與近端(Prox.)和遠(yuǎn)端(Dist.)的軸突微槽一起舉例說明。
[0036]圖24是72h后軸突隔室中熒光標(biāo)記多肽的應(yīng)用(FITC對照肽、Cy2Wt、Cy3A315E和TDP-43肽)，樣品用小鼠單克隆抗Tujl抗體固定和染色，二抗為抗小鼠Cy5成對的第二抗體。使用我們開發(fā)的算法計(jì)算軸突的連續(xù)性指標(biāo)，結(jié)果顯示，TDP-43肽引起顯著軸索損傷，A315E突變型組更為嚴(yán)重。
[0037]圖25是以下應(yīng)用的未標(biāo)記的肽在軸突隔室中的應(yīng)用[對照肽(Ctr)、Wt、或A315E、A315E/G314V突變型TDP-43肽]，樣品用抗Tujl進(jìn)行免疫染色，用Hoechst進(jìn)行復(fù)染來揭示細(xì)胞核形態(tài)。箭頭標(biāo)記濃縮的凋亡的細(xì)胞核，而三角箭頭標(biāo)記形態(tài)正常的細(xì)胞核。對軸突的連續(xù)性指標(biāo)和凋亡細(xì)胞核進(jìn)行定量，結(jié)果顯示A315E突變型肽要比Wt肽引起更嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，G314V突變型消除由A315E TDP-43肽引起的軸突毒性和細(xì)胞核損傷。這些數(shù)據(jù)代表軸突在>60微槽定量的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0038]下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0039]實(shí)施例一:
TDP-43的羧基域的最小的淀粉樣核心的識別和特征
最近的研宄表明，TDP-43羧基末端區(qū)域的合成肽對應(yīng)的Q286Q331段形成淀粉樣纖維導(dǎo)致神經(jīng)毒性。為了獲得TDP-43淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)的深入理解和檢查其神經(jīng)毒性的分子基礎(chǔ)，使用短TDP-43肽橫跨這個(gè)淀粉樣蛋白區(qū)域來明確滿足原纖維形成的最小核心區(qū)域。在動物模型中，ALS-相關(guān)聯(lián)的突變型A315T，比野生型(Wt)TDP43，出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)毒性和神經(jīng)退行性疾病的關(guān)聯(lián)性更大。包涵體檢測到的TDP-43往往是過度磷酸化的，已經(jīng)在ALS患者鑒定出了 A315T /A315E突變型。由于這些原因，我們也合成包含A315T和A315E突變型的TDP-43多肽，具體請參閱圖1。
[0040]首先，利用原子力顯微鏡(AFM)檢測這些多肽的纖維形成。然后多肽孵育延長兩周，TDP-43 衍生的多肽 Tl (aa320-331)、T2 (aa286_299)和 T3 (aa300_306)均未能形成任何纖維狀聚合物，與對照TO多肽包含的氨基酸286-298相反順序相似。與此相反，在接下來的 8 小時(shí)孵育后，T4 (Wt，aa307-319)、T5 (A315T 突變，aa307_319)和 T7 (A315E 突變，aa307-319)多肽形成輪廓分明的纖維。請參閱圖2，在早期0.5小時(shí)的快速孵育時(shí)，在A315E突變型中可以檢測到均勻分布的小聚集體，而在Wt、A315T突變型和縮短了的T8(aa310-319)多肽中有很少或沒有聚合物。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在A315T樣品中只能檢測到細(xì)的原纖維。Wt和A315E突變的聚合物TDP-43多肽的形成是從最初的幾個(gè)小聚合，到短原纖維，再到最終的纖維。該A315T多肽顯示出纖維形成較快的初始階段，即少數(shù)細(xì)纖維需要
0.5h或者較長的纖維需要lh。在Ih的時(shí)候，Wt和A315E多肽形成短但更大量的纖維。到3h的時(shí)候，Wt和A315E突變型多肽形成粗而長的纖維，而A315E多肽形成較高的密度均勻的粗纖維。到了 8h，A315E多肽的聚合物表現(xiàn)為致密的纖維幾乎覆蓋了整個(gè)表面。與此相反，T8多肽8h孵育后，形成顆粒和片狀結(jié)構(gòu)。
我們用電子顯微鏡(EM)進(jìn)行研宄這些TDP-43肽的形成的纖維。Wt多肽形成的纖維束的厚度和長度是多樣的。A315T多肽往往聚集成整齊的纖維堆疊，鑒于A315E多肽在厚度和長度是均勻分布的。在更高的放大倍率下，A315E纖維呈現(xiàn)出彎曲的螺旋形特點(diǎn)，兩個(gè)彎曲之間的平均距離大約為287.3 nm (從88.3 nm到642.3 nm)。分子動力學(xué)模擬預(yù)測，A315E多肽有更大的可能性形成β片層結(jié)構(gòu)，位置314 (G314)的甘氨酸殘基對β結(jié)構(gòu)非常重要。與預(yù)測的一致，把G314殘基改變?yōu)槔i氨酸破壞了 A315E-TDP-43多肽纖維的形成，如EM或原子力顯微鏡所示，具體請參閱圖3。
[0041]實(shí)施例二:
FTLD-TDP大腦樣本中TDP-43免疫反應(yīng)性纖維的檢測為了檢測TDP-43在體外是否形成纖維狀聚合物，我們使用免疫電子顯微鏡(IEM)來檢測病理確診為FTLD-TDP患者的大腦組織。如圖3和4所示，IEM使用特定的抗TDP-43抗體和第二抗體與膠體金顆粒成對的顯示檢測的3個(gè)FTLD-TDP大腦內(nèi)的免疫反應(yīng)性纖維，然而對照大腦沒有顯示出這樣的纖維結(jié)構(gòu)。在FTLD-TDP腦組織中檢測到的TDP-43免疫反應(yīng)性纖維和在體外TDP-43肽形成的淀粉樣纖維表現(xiàn)出類似的絲狀結(jié)構(gòu)。雖然這篇文章是在準(zhǔn)備中，簡單的EM研宄已經(jīng)發(fā)表，指出在ALS-TDP患者的一小團(tuán)體的脊髓中檢測到絲狀TDP-43陽性結(jié)構(gòu)，但是在他們的研宄中，沒有在FTLD-TDP大腦樣本中檢測到這樣的結(jié)構(gòu)。由Robinson等人檢測出的絲狀結(jié)構(gòu)在形態(tài)上與我們的FTLD-TDP腦樣品中檢測到的TDP-43免疫反應(yīng)性纖維相似。
[0042]實(shí)施例三:
TDP-43淀粉樣蛋白多肽可以自交或者雜交誘導(dǎo)淀粉樣纖維的形成硫磺素-T (ThT)是一種可以顯示淀粉樣纖維的熒光染料。我們采用隨時(shí)間變化的ThT結(jié)合試驗(yàn)，來表示TDP-43纖維形成的動力學(xué)特性。請參閱圖5，與AFM和EM的結(jié)果一致，無論是Tl-、T2-或者T3-TDP-43肽均未顯示出可檢測到的ThT結(jié)合，然而Wt_、A315T-和A315E-肽，但不包括T8，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加表現(xiàn)出增強(qiáng)的ThT結(jié)合。Wt-TDP-43肽僅在濃度范圍檢驗(yàn)的約2.5h的最后一個(gè)相位開始形成ThT-陽性纖維，然而A315T-或者A315E-突變肽幾乎在ThT結(jié)合反應(yīng)啟動后立即形成了 ThT反應(yīng)的纖維。在較低的肽濃度(62.5 μ M和125μM，如圖5所示上部和中間)，Wt-肽的ThT熒光強(qiáng)度比A315T-和A315E-肽的低，然而增加肽濃度到250 μ M (如圖5所示下面)顯著增強(qiáng)Wt-肽的ThT結(jié)合(比Α315Τ-和Α315Ε-肽更高)。對于Α315Τ-和Α315Ε-肽，增加肽濃度也會提高了 ThT熒光強(qiáng)度。
[0043]為了研宄不同的TDP-43肽(Wt_、A315T-或者A315E-突變型)能否誘導(dǎo)纖維形成的種子，我們測試了一種肽的先前形成的纖維狀種子是否能夠誘導(dǎo)其他的TDP-43的肽纖維的形成。由于A315T-或者A315E-肽纖維的形成沒有停滯期，所以很難看到ThT的結(jié)合的不接種和接種動力學(xué)之間的差異。請參閱圖5和6，對于Wt-TDP-43肽，與無任何接種的反應(yīng)相比，自交和雜交縮短了纖維形成的停滯期。A315E-突變肽接種縮短了 Wt-肽纖維形成的停滯期。只有A315E-肽，而沒有Wt-和A315T肽，可以雜交促進(jìn)縮短了的T8-肽中淀粉樣纖維的形成(圖6中、上部和中間)。這些結(jié)果表明，該A315E-突變型TDP-43的肽能夠雜交，促進(jìn)TDP-43肽的淀粉樣蛋白原纖維的形成，否則本身不形成原纖維。當(dāng)A315E突變中315位點(diǎn)的中性丙氨酸被改變?yōu)楣劝彼釙r(shí)，雜交接種活性很高，這表明磷酸化的殘基315T或由一種酸性殘基替代可以增加TDP-43促進(jìn)TDP-43衍生物補(bǔ)充到TDP-43聚合物里面的能力。
[0044]請參閱圖7，最近的研宄已經(jīng)揭示阿爾茨海默氏病和TDP-43蛋白病理之間顯著的臨床和病理重疊。為了檢測TDP-43肽對淀粉樣β肽纖維形成的影響，我們使用A β 9-14，它是一種來源于淀粉樣β蛋白的多肽并且在ThT雜交試驗(yàn)中不能夠形成原纖維和40-merΑβ 1-40肽。該Αβ 1-40肽在相對高濃度形成的淀粉樣蛋白原纖維。在62.5 μΜ的濃度，在Αβ 9-14經(jīng)過40h孵育后，沒有檢測到淀粉樣纖維，Αβ 1-40肽與TDP-43肽相比，淀粉樣纖維的形成非常慢。增加Α315Ε-突變型TDP-43肽的接種，可以加速纖維的形成和增強(qiáng)A β 1-40肽在62.5 μ M和125 μ M的濃度的ThT結(jié)合，表明Α315Ε-突變型TDP-43的肽是能夠雜交Αβ 1-40肽。這一觀察表明，TDP-43的淀粉樣纖維的形成可能在AD患者的淀粉樣β病理學(xué)起作用。
[0045]實(shí)施例四:
⑶和FTIR分析支持了淀粉樣蛋白TDP-43肽采用β -構(gòu)象
請參閱圖8和9，用CD光譜進(jìn)行分析這些TDP-43肽。Α315Ε-肽在193nm表現(xiàn)出明顯的正峰值，這表明存在結(jié)構(gòu)；而Wt-TDP肽在這一區(qū)域出現(xiàn)更廣闊的峰值，這表明α-螺旋和片層的混合。值得注意的是，在Α315Ε-肽的遠(yuǎn)程的-UV⑶輪廓與主要由β-片層結(jié)構(gòu)組成的胰凝乳蛋白酶是相似的。與此相一致，通過Yong’ s算法，在片層含量預(yù)測中，Wt-和Α315Ε-肽比其他TDP-43肽排名高，而Α315Τ肽排名最高。我們接下來用FTIR光譜來進(jìn)一步研宄這些TDP-43肽。對于Wt-和Α315Τ-肽，發(fā)現(xiàn)在1677 cnT1有一個(gè)主要的波段和1626CHT1有一個(gè)較小的峰，而A315E-和T8肽的主要波段轉(zhuǎn)移到1626CHT1。我們已經(jīng)確定，1677CHT1峰是由于酰胺鍵I的振動，而16260^1峰表明β-片層結(jié)構(gòu)的存在。有趣的是，在Α315Ε肽的剖面檢測到了 1626CHT1處一個(gè)主要的峰連同1696、1672和1525cm_l的3個(gè)較小的峰，這表明存在反平行β -片層結(jié)構(gòu)的。⑶和FTIR數(shù)據(jù)都支持TDP-43肽β -結(jié)構(gòu)的存在。
[0046]實(shí)施例五:
A315突變型TDP-43肽的NMR結(jié)構(gòu)
請參閱圖10，接下來，我們使用核能譜核磁共振(NMR)光譜，來檢查這些在不斷變化中的TDP-43 (Μ307-Ν319)核心肽。盡管做了大量的努力，無論是野生型或Α315Τ-突變型TDP-43肽的核磁共振的分析，并沒有得到足夠的信息來解決它們的結(jié)構(gòu)。另一方面，不斷變化中的Α315Ε-突變型TDP-43核心肽的分析，提供了詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息，除了 N末端MGGG區(qū)域。除了連續(xù)的NOE效應(yīng)，還檢測到M311和1318之間一系列遠(yuǎn)程的NOE，這表明該肽在擴(kuò)展構(gòu)造時(shí)可以采用分子內(nèi)的折疊結(jié)構(gòu)或形成分子間的相互作用。Μ311到F313和F316到1318之間分別也觀察到幾組Ν0Ε。因此，該殘基M311、F313、F316和1318有可能互相鑲嵌以形成疏水簇。請參閱圖11、12和13，然后用雙量子過濾相關(guān)光譜(DQF-C0SY)，測量耦合常數(shù)和區(qū)分分子內(nèi)和分子間的相互作用之間的差異。如果該肽通過分子內(nèi)折回結(jié)構(gòu)，殘基F313、G314、E315和F316就會形成β -轉(zhuǎn)角，G314的一個(gè)耦合常數(shù)會小于6Hz。然而，測量的G314的酰胺和α質(zhì)子間親合常數(shù)分別為12.6 Hz和11.4 Ηζ，這表明是延長的結(jié)構(gòu)，而不是分子內(nèi)折回構(gòu)象。因此，從分子間的相互作用獲得相應(yīng)的遠(yuǎn)程N(yùn)OE是可以估算的。在這個(gè)模型中，兩分子的TDP-43-(M307-N319)肽以反平行的方式(即，頭-尾包裝)與四個(gè)相互填充的疏水性殘基(M311、F313、F316、1318 )在鏈之間以分子間的方式包裹。這ALS的相關(guān)的突變型(A315E)TDP-43肽的核磁共振結(jié)構(gòu)，提供了 TDP-43和以前的具有特色的經(jīng)典的淀粉樣肽之間的相似性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[0047]實(shí)施例六:
淀粉樣蛋白TDP-43肽誘導(dǎo)TDP-43蛋白重新分配到細(xì)胞質(zhì)
TDP-43蛋白質(zhì)病的一個(gè)顯著的病理特點(diǎn)是受影響組織中細(xì)胞核TDP-43的清除。由于淀粉樣TDP-43肽是能夠作為纖維形成的種子，并可以被神經(jīng)細(xì)胞占據(jù)引起神經(jīng)毒性，我們測試了這些TDP-43肽是否可能影響內(nèi)源性TDP-43蛋白的亞細(xì)胞分布。請參閱圖14、15和16，不同TDP-43肽處理的HEK293細(xì)胞免疫染色結(jié)果顯示，Wt-TDP-43肽導(dǎo)致細(xì)胞核中TDP-43適度減少，而A315T-突變型，尤其是A315E-突變型TDP-43肽誘發(fā)更為顯著的細(xì)胞核TDP-43重新分配到細(xì)胞質(zhì)。在用A315T或者A315E突變型TDP-43肽處理約24小時(shí)后的細(xì)胞中，TDP-43重新分配到細(xì)胞質(zhì)是明顯的。同樣的用免疫染色，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核分離后的蛋白質(zhì)裂解液WB印跡表明，用Wt或者A315T或者A315E突變型TDP-43肽處理會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞核TDP-43下降。A315E-突變型TDP-43肽的G314V變異體不能誘導(dǎo)TDP-43重新分配，表明TDP-43肽的纖維形成的與其誘導(dǎo)TDP-43再分配的能力相關(guān)。我們進(jìn)一步研宄這些TDP-43肽在人工培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中是否有類似的效果，具體參閱圖17和18。向培養(yǎng)基中添加A315E突變型TDP-43肽的24h后，在約40%的神經(jīng)細(xì)胞中檢測到了 TDP-43再分配到細(xì)胞質(zhì)，然而Wt和A315T突變型TDP-43肽與對照組相比較，僅顯示輕微的效果。48h后，包括Wt、A315T和A315E突變型的所有的淀粉樣蛋白TDP-43肽，神經(jīng)細(xì)胞的比例顯著增加，并呈現(xiàn)出細(xì)胞核TDP-43染色減少，細(xì)胞質(zhì)TDP-43信號增加，A315E突變型表現(xiàn)出更顯著的效果。
[0048]實(shí)施例七:
A315T-和A315E-突變型淀粉樣蛋白TDP-43誘導(dǎo)軸突損傷和神經(jīng)元死亡顯示增強(qiáng)了神經(jīng)毒性
請參閱圖19、20和21，為了模擬TDP-43蛋白質(zhì)病理，我們做了轉(zhuǎn)基因果蠅表達(dá)Wt和A315T突變型TDP-43蛋白。當(dāng)定位到光感受器時(shí)，Wt-TDP-43的表達(dá)導(dǎo)致進(jìn)行性視網(wǎng)膜變性，A315T突變型TDP-43導(dǎo)致了更快的進(jìn)程和更嚴(yán)重的視網(wǎng)膜損害。當(dāng)在蕈狀體(MB)表達(dá)神經(jīng)元時(shí)，該A315T突變型TDP-43誘導(dǎo)比Wt-TDP-43出現(xiàn)更嚴(yán)重的軸突損傷，但是Wt和A315T突變型果蠅的TDP-43蛋白表達(dá)水平是相等的。值得注意的是，在這三個(gè)MB的任何一個(gè)腦葉中均可以檢測到軸突損傷；然而，損害不是對稱的和均勻的，往往影響一個(gè)腦葉比其他幾個(gè)要嚴(yán)重。這表明，軸突損傷會以“分組”的方式發(fā)生，類似于在ALS患者的運(yùn)動神經(jīng)元中檢測到的。這也表明，神經(jīng)毒性TDP-43衍生物可能在非細(xì)胞自主的向其他鄰近細(xì)胞蔓延過程中起作用，這與之前的研宄中提出的是一致的。為了驗(yàn)證這一想法，我們在體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元時(shí)增加了 TDP-43肽，質(zhì)疑細(xì)胞外傳遞的TDP-43衍生物是否會引起神經(jīng)毒性。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶用dUTP原位末端標(biāo)記法，來評價(jià)培養(yǎng)的對照、Wt、A315T和A315E突變型TDP-43肽中神經(jīng)元死亡。將13-mer核心淀粉樣TDP-43肽加入到培養(yǎng)基中可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，A315T和A315E突變型TDP-43肽顯示出比Wt-TDP-43肽更大的神經(jīng)毒性，具體參閱圖22。
[0049]請參閱圖23、24和25，為了測試軸突是否占據(jù)了 TDP-43肽造成神經(jīng)毒性，我們利用我們的修改軸突微流體進(jìn)行細(xì)胞元培養(yǎng)。在這些微流體中，流體壓力保持在檢測不到熒光肽進(jìn)入細(xì)胞體隔室的強(qiáng)度，甚至在軸突隔室和中央流道中加入熒光標(biāo)記的肽的72h后。到這個(gè)時(shí)候，與對照相比，Wt或者A315E突變肽處理的組檢測到顯著軸索損傷，并且A315E突變型肽會引發(fā)更嚴(yán)重的軸突毒性。這些軸索損傷不是由熒光部分引起的，因?yàn)榉菬晒釺DP-43肽也會引起相似的軸突損傷。此外，我們發(fā)現(xiàn)TDP-43應(yīng)用于軸突隔室會導(dǎo)致細(xì)胞核死亡，這表明細(xì)胞外TDP-43肽不僅會引起軸索損傷，而且神經(jīng)元死亡。重要的是，非淀粉樣蛋白G314V突變體同時(shí)失去了軸突毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。這樣的微流體模型中的神經(jīng)元培養(yǎng)適合空間性被控制的和暫時(shí)性解決的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以讓我們演示淀粉樣核心TDP-43肽的胞外應(yīng)用足以引起軸突損傷和神經(jīng)元死亡。
[0050]β-構(gòu)造對于許多蛋白質(zhì)的生物活性非常重要，對許多人類疾病很關(guān)鍵。不溶性或聚合蛋白質(zhì)的形成往往使可溶性的轉(zhuǎn)換和正確折疊的多肽進(jìn)入錯誤折疊的蛋白包括β-結(jié)構(gòu)。雖然疾病相關(guān)的“錯誤折疊的蛋白”的全長蛋白的晶體結(jié)構(gòu)尚未明確，有意義的結(jié)構(gòu)的見解來自于這些蛋白的衍生物和片段的詳細(xì)研宄。例如，通過NMR或X線晶體學(xué)研宄的幾個(gè)淀粉樣蛋白的片段:人tau蛋白的VQIVYK，酵母朊病毒Sup35的GNNQQNY，乙型淀粉樣卵白的MVGGVV/ GGVVIA，人朊病毒蛋白的SNQNNF。這些成淀粉樣肽中的一個(gè)重要的共同結(jié)構(gòu)特征是β -片層結(jié)構(gòu)，它會形成主干堆疊和側(cè)鏈氫鍵結(jié)合。側(cè)鏈從兩個(gè)β -片層突起形成一個(gè)堅(jiān)固的自我補(bǔ)充立體拉鏈。GNNQQNY、SNQNNF和GGVVIA形成平行結(jié)構(gòu)，而MVGGVV形成反平行結(jié)構(gòu)。NMR和高分辨率的AFM也被廣泛地用來分析淀粉樣蛋白的結(jié)構(gòu)。β淀粉樣纖維由雜交β片層同步的二聚體單位堆疊組成。與已知淀粉樣蛋白相比，該TDP-43淀粉樣區(qū)域與朊病毒和淀粉樣β肽很相似的，但是在一級序列和三維結(jié)構(gòu)中有其獨(dú)特的性能。
[0051]在這項(xiàng)研宄中，我們通過原子力顯微鏡、ΕΜ、⑶、紅外光譜和核磁共振檢測TDP-43核心淀粉樣肽的分子量和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。野生型TDP-43肽可形成淀粉樣纖維。此外，ALS突變型、Α315Τ和Α315Ε，以加速的比率形成纖維。對于許多其他的淀粉樣肽，淀粉樣纖維的形成顯示一個(gè)有滯后期的S形運(yùn)動模式。在我們的案例中，僅Wt-TDP-43肽表現(xiàn)出纖維形成的典型時(shí)間進(jìn)程，而A315T和A315E突變型肽在反應(yīng)開始后不久形成ThT陽性纖維。與Wt-TDP-43肽相比這種A315T或者A315E突變型增強(qiáng)的淀粉樣蛋白原纖維的形成與它們增加的神經(jīng)毒性是一致的。許多淀粉樣蛋白可以在纖維形成中自我接種，如重組人突觸核蛋白，小鼠朊病毒或合成淀粉樣β肽1-40和1-42。某些淀粉樣蛋白肽可以雜交接種異源肽的原纖維形成。例如，α-突觸核蛋白可以雜交接種合成淀粉樣β肽1-40和1-42中纖維的形成。我們的實(shí)驗(yàn)表明，Α315Ε突變型肽可以雜交其他TDP-43肽淀粉樣纖維的形成，包括Wt和縮短的Wt肽(Τ8)。提出了在Α315Τ/ E突變型ALS患者，增強(qiáng)了的突變型TDP-43蛋白或A到E突變型磷酸化作用可以加速Wt-TDP-43蛋白淀粉樣蛋白原纖維的形成，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和神經(jīng)毒性增加的可能性。我們的數(shù)據(jù)可以提供一個(gè)機(jī)制來解釋相對早期發(fā)病，ALS患者病情增加的嚴(yán)重程度和加速的疾病進(jìn)展。此外，我們觀察到在纖維形成過程中A315E突變型TDP-43肽能夠雜交淀粉樣β 1_40，這表明了 TDP-43蛋白病和阿爾茨海默病的神經(jīng)病理學(xué)和臨床的重疊。
[0052]利用核磁共振，我們證明了 Α315Ε突變型TDP-43肽以反平行的方式形成延長的β結(jié)構(gòu)。雖然野生型TDP-43的NMR分析無法解析其結(jié)構(gòu)，這可能是由于Wt-TDP-43肽支持向后折疊構(gòu)象，由分子動力學(xué)模擬和掃描隧道顯微鏡(STM)研宄的支持。該A315E突變型TDP-43肽的反平行的β-結(jié)構(gòu)類似于八類空間拉鏈的第5-8個(gè)，這些片層中的β結(jié)構(gòu)是以反平行的方式存在。雖然TDP-43淀粉樣蛋白纖維的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征需要進(jìn)一步調(diào)查，我們的工作提供了 TDP-43的核心淀粉樣區(qū)分子結(jié)構(gòu)的有趣見解。我們的數(shù)據(jù)表明，至少某些ALS相關(guān)的突變可以改變TDP-43的構(gòu)象，致使突變體型更容易自交形成纖維，從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性的增強(qiáng)。我們這里介紹的工作幫助我們理解TDP-43神經(jīng)毒性和TDP-43淀粉樣纖維形成原子水平的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。基于TDP-43相鄰區(qū)域的NMR分析我們報(bào)道了 α_螺旋結(jié)構(gòu)；并提出α -螺旋到β -片層轉(zhuǎn)化完全基于細(xì)菌表達(dá)TDP-43片段的聚合和CD光譜的變化。然而，沒有確切的證據(jù)證明構(gòu)象，沒有提供數(shù)據(jù)支持其提出的“α-螺旋到片層轉(zhuǎn)變”的功能意義。
[0053]最近的一項(xiàng)研究揭不出，在多系統(tǒng)的蛋白病和ALS患者的基因編碼的另外兩個(gè)RNA結(jié)合蛋白突變型:hnRNPA I和A2。對于hnRNPA I和hnRNPA2，突變的六肽(SYNVFG和NYNVFG)是高度淀粉樣蛋白。我們確定了 TDP-43的13mer突變肽(MGGGMNFGEFSIN)，與hnRNPA I/ A2六聚體有序列相似性，特別是在NFGEFS的區(qū)域。TDP-43肽兩個(gè)F殘基與hnRNPAl/ A 2六聚體序列中的兩個(gè)芳香族殘基(Y和F)在淀粉樣蛋白生成時(shí)可能有某一重要的結(jié)構(gòu)特征。這個(gè)概念需要在后期的調(diào)查來進(jìn)行試驗(yàn)。
[0054]由hnRNPAl (D262V或D262N)和hnRNPA2 (D290V)突變六肽形成的纖維，不僅能接種他們自己組裝，還能用他們各自的野生型來雜交進(jìn)行纖維化。然而，hnRNPAl纖維無法雜交hnRNPA2的裝配，或反之亦然；也沒有hnRNPAl/ A2雜交TDP-43。這證實(shí)了 hnRNPAl/ A2肽雜交相對特異性。類似hnRNPAl和hnRNPA2的突變的六肽，TDP-43的A315E突變型肽可以雜交短的野生型TDP-43肽。同時(shí)A315E突變型TDP-43肽還能夠增強(qiáng)淀粉樣蛋白β 1_40肽的淀粉纖維的形成。
[0055]以前的研宄顯示TDP-43的RRM結(jié)構(gòu)域的有趣的結(jié)構(gòu)特征。據(jù)報(bào)道，TDP-43通過氨基酸1183區(qū)域和RRM2域形成二聚體。在RRM2-DNA絡(luò)合物的晶體結(jié)構(gòu)中觀察到了 RRM2二聚體接口，這表明核苷酸結(jié)合需要二聚體的形成。TDP-43的這種自交聯(lián)性質(zhì)可能導(dǎo)致其聚合物和內(nèi)含物的形成。值得注意的是，帶有RRMIC/ S突變的(一個(gè)ALS突變)全長的TDP-43的內(nèi)含物的形成需要C-末端區(qū)域，增加了 TDP-43蛋白質(zhì)病發(fā)病機(jī)理中TDP-43聚合物中的甘氨酸富集的羧基區(qū)域的重要作用。
[0056]之前，我們先前的研宄展示TDP-43到朊病毒蛋白的生化和序列相似性，TDP-43蛋白質(zhì)病已被認(rèn)為是一組硫磺素-S-陰性疾病，與經(jīng)典的淀粉樣疾病不同。我們的數(shù)據(jù)提示TDP-43蛋白病例中硫磺素-S著色的重新評價(jià)，使得我們發(fā)現(xiàn)，在調(diào)查的FTLD-TDP的大部分病例，但不包括FTLD-FUS和ALS-SODl病例，TDP-43陽性包含物是硫磺素-S-陽性。我們這里的工作，用綜合的辦法，現(xiàn)在已經(jīng)揭示了 TDP-43和經(jīng)典的淀粉樣蛋白之間相似性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。重要的是，我們的數(shù)據(jù)表明，淀粉樣蛋白纖維形成與TDP-43的神經(jīng)毒性作用相關(guān)聯(lián)，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)的神經(jīng)元中單個(gè)G314V變化，可同時(shí)消除淀粉樣蛋白原纖維的形成和神經(jīng)毒性。
[0057]TDP-43的亞細(xì)胞定位對于其生物學(xué)功能和致病作用是至關(guān)重要。不同的基因突變和細(xì)胞應(yīng)激可影響TDP-43細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)比率的平衡，擾亂TDP-43的主要的細(xì)胞核定位。事實(shí)上，TDP-43蛋白質(zhì)病的顯著的神經(jīng)毒性病理學(xué)特征之一 TDP-43細(xì)胞核的清除，已經(jīng)顯示作為TDP-43蛋白質(zhì)疾病的發(fā)病機(jī)制的早期事件。TDP-43的異常裂解或截?cái)?，促進(jìn)TDP-43細(xì)胞質(zhì)聚集和毒性。我們以前的工作表明，TDP-43的細(xì)胞質(zhì)定位與它的神經(jīng)毒性相關(guān)聯(lián)。最近的一項(xiàng)研宄表明，果蠅TDP-43同系物(TBPH)的肌肉特異性的超表達(dá)導(dǎo)致了 TBPH細(xì)胞核清除和蛋白聚合。我們的數(shù)據(jù)表明，存在于細(xì)胞外隔室中的人TDP-43衍生物，可以被神經(jīng)元占據(jù)，誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞核TDP-43到重新分配到細(xì)胞質(zhì)。這具有很多含義。
[0058]首先，我們的數(shù)據(jù)支持非細(xì)胞自主的機(jī)制，即通過受損的或者死亡的神經(jīng)細(xì)胞或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TDP-43蛋白產(chǎn)物可以被臨近的神經(jīng)元或者軸突占據(jù)引起TDP-43蛋白病例橫向的傳播。這與我們的轉(zhuǎn)基因果蠅神經(jīng)/神經(jīng)軸突損傷出現(xiàn)在“分組的”的模型中相一致，類似于在ALS患者檢測到的運(yùn)動神經(jīng)元損傷。第二，我們觀察到淀粉樣TDP-43肽能夠誘導(dǎo)細(xì)胞核TDP-43重新分配到細(xì)胞質(zhì)中，這把之前提出的TDP-43蛋白病理發(fā)病機(jī)制中的兩個(gè)假設(shè)聯(lián)系起來:細(xì)胞核TDP-43的功能丟失與細(xì)胞質(zhì)TDP-43聚合體/包涵體的毒性的增加。第三，TDP-43肽的水平傳播和它的神經(jīng)毒性可促使我們開發(fā)靈敏的方法，用于檢測TDP-43蛋白病患者的腦脊髓液或血漿中諸如TDP-43這樣的基因產(chǎn)物。這或許有助于開發(fā)TDP-43蛋白病例的生物標(biāo)記物。最后，搜尋化學(xué)化合物或修飾基因，如可以抑制淀粉樣TDP-43種類形成，或者抑制淀粉樣蛋白原纖維形成/接種或阻斷神經(jīng)毒性TDP-43肽的吸收或選擇性地促進(jìn)神經(jīng)毒性TDP-43基因產(chǎn)物清除，可以為TDP-43蛋白病患者提供治療學(xué)的意義。
[0059]以下是上述實(shí)施例采用的材料和方法
除去經(jīng)鑒定的TDP-43-蛋白病患者死后的大腦樣本和對照項(xiàng)目來源于西北大學(xué)的認(rèn)知神經(jīng)學(xué)與阿爾茨海默氏病中心(CNADC)符合公共機(jī)構(gòu)和美國國立衛(wèi)生研宄所指南。所有涉及動物的組織樣品的實(shí)驗(yàn)的實(shí)施均遵循公共機(jī)構(gòu)和美國國立衛(wèi)生研宄所指南。
[0060](I)多肽合成和樣品制備
該 TDP-43 合成肽[Tl (P320Q331):PAMMAAAQAALQ; T2 (Q286L299):QGGFGNSRGGGAGL;T3 (G200N306):GNNQGSN; T4 (M307N319fft):MGGGMNFGAFSIN; T5 (M307N319A315T):MGGGMNFGTFSIN; T7 (M307N319A315E):MGGGMNFGEFSIN; T8 (M310N319):GMNFGAFSIN]，Wt/G314V (M307N319:MGGGMNFVAFSIN)，A315E/ G314V (M307N319:MGGGMNFVEFSIN)，或?qū)φ盏?3mer肽TO:LGAGGGRSNGFGG (含有的氨基酸286-298反向序列)和淀粉樣蛋白肽9_14和1-40，均購自于上?？茖W(xué)肽生物科技有限公司或ProteinTech Group (芝加哥，美國)。這些序列來源于人TDP-43蛋白的相應(yīng)的氨基酸殘基286-331。這些肽使用HPLC來純化兩次，純度〉99%。首先用1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP，Sigma-Aldrich)長期的溶解這些肽，然后將溶液轉(zhuǎn)移到無菌微量離心管中。所有的肽都以20mg/mL的濃度在HFIP中溶解作為原液。所有傅里葉變換紅外光譜、圓二色光譜、原子力顯微鏡(AFM)實(shí)驗(yàn)的樣品，均從原液稀釋至指定的濃度。
[0061](二)FarUV圓二色(⑶)光譜測量
該TDP-43肽的原液(20毫克/毫升在HFIP)用20mM PBS緩沖液(pH為7.4)稀釋至0.2毫克/毫升。圓二色性試驗(yàn)是用含有0.1 cm規(guī)格的石英電池在J810的⑶光譜儀(Jasco, Japan)在室溫下進(jìn)行。
[0062](三)傅里葉變換紅外(FTIR)光譜的測量
紅外光譜被記錄在4 CM分辨率的珀金埃爾默紅外光譜儀。FTIR光譜學(xué)的測量是使用BaF2窗口的傳輸模式進(jìn)行的。該溶液滴到的BaF2表面后在風(fēng)干之前先進(jìn)行FTIR測量。
[0063](四)AFM測量
用 PBS (pH 為 7.4)準(zhǔn)備濃度為 62.5 μΜ 的 Wt、A315T、A315E，Wt / G314V、A315E/G314V和T8的水溶液。在37°C下振蕩孵育0、0.5、1、3、5和8小時(shí)的30 μ L的肽溶液投放在新鮮剝離云母表面。吸附10分鐘后，經(jīng)過AFM觀察，過多的溶液已經(jīng)離開云母表面了。輕敲模式用Dimens1n 3100 AFM (Bruker, USA)輕敲模式AFM研宄在外界條件進(jìn)行研宄。在所有的AFM成像中使用商用娃尖為2.0 N/m的標(biāo)稱彈簧常數(shù)和442.5 kHz共振頻率。
[0064](五)硫磺素T結(jié)合，自交和雜交試驗(yàn)
TDP-43的合成肽在DMSO中以12.5 mM的濃度溶解，然后以不同濃度(分別為62.5、125和250 μ M)稀釋到PBS緩沖液(pH為7.4)中，在13.3 krpm離心10分鐘，以除去所有不可溶的物質(zhì)。淀粉樣纖維的形成是通過硫黃素T (ThT的，Sigma-Aldrich公司)結(jié)合后的熒光增強(qiáng)而檢測到的。纖維形成反應(yīng)，在圓底黑色的96孔板設(shè)立了三個(gè)重復(fù)。每個(gè)孔中有一個(gè)I /8寸玻璃球(飛世爾科技)和150 μ I的肽在補(bǔ)充有200 μΜ的ThT的PBS緩沖液中。板用Greiner EASY seal密封，并在37°C振蕩培養(yǎng)，除I分鐘，每次10分鐘按要求進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。用Var1skan閃存盤讀寫器(Thermo Scientific)在440nm (激發(fā))/480 nm (發(fā)射)監(jiān)控ThT熒光變化。自交和雜交試驗(yàn):不同的肽，在250 μ M的濃度下，在37°C，帶有I/8寸玻璃球孵育，在PBS緩沖液(pH為7.4)中連續(xù)地?fù)u動中24小時(shí)，纖維的形成時(shí)間完全是由ThT和EM確定的。成熟的纖維然后用超聲波儀持續(xù)處理I分鐘(5s工作和5s間歇)，用最大振幅的10%，來產(chǎn)生自交的種子。對應(yīng)TDP-43合成肽(62.5μΜ)用少量的[5% (W/ W)]準(zhǔn)備好的種子在PBS緩沖液中(pH為7.4)置于冰上孵育。淀粉樣纖維形成通過在37°C搖動和它的如上所述的ThT結(jié)合動力學(xué)的監(jiān)測而啟動。
[0065](六)樣本準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)測定
所用的所有肽的序列通過質(zhì)譜分析證實(shí)。TDP-43合成肽(M307-N319)(?2毫克)野生型或A315E突變型首先溶解于5 μ I DMS0-d6，然后在PBS (pH6.5-6.8)中稀釋至終濃度為
2.5mM，13.3 krpm離心10分鐘，以除去所有不溶性物質(zhì)。在25°C，通過配備了三重共振冷探頭的安捷倫科技公司600MHz的DD2光譜儀獲得所有的NMR波譜。用總相關(guān)譜(TOCSY)和核極化效應(yīng)光譜(NOESY)收集連續(xù)的主干和側(cè)鏈共振作用的光譜，而雙量子濾波相關(guān)光譜(DQF-COSY)用于測量的耦合常數(shù)。近似質(zhì)子內(nèi)的距離限制均來自2D1H-N0ESY光譜(300ms混合時(shí)間)。這些光譜用項(xiàng)目NMR Pipe處理，用Sparky分析(http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/)。用項(xiàng)目CNS計(jì)算結(jié)構(gòu)。共有200結(jié)構(gòu)進(jìn)行了計(jì)算，最后選出來最低的總能量和最小的實(shí)驗(yàn)性的違規(guī)的20個(gè)結(jié)構(gòu)代表多肽結(jié)構(gòu)。用軟件MoIMoI和PyMol (http://WWW.pymol.0rg/)顯示和分析結(jié)構(gòu)的總效果。
[0066](七)基本的神經(jīng)元培養(yǎng)，微流體，多肽處理和免疫熒光染色
蓋玻片上皮層神經(jīng)元培養(yǎng)物。簡要地，在處理之前在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中將合成TDP-43肽稀釋到200μΜ，在室溫下孵育8h。將多肽加入到已在體外培養(yǎng)6天(Div 6)的E18大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中至終濃度為20 μ M。在48小時(shí)，有一半培養(yǎng)基，含有20 μ M肽的新鮮制備的培養(yǎng)基進(jìn)行了交換。在肽處理過后細(xì)胞固定96小時(shí)，并用抗Tujl，TUNEL法和赫斯特染料著色。
[0067]軸突微流控的制備。簡言之，在HBSS緩沖液(Gibco公司)中從E18大鼠胚胎中分離皮質(zhì)神經(jīng)元，接下來在木瓜蛋白酶(Sigma)中分解，37°C，15min。約5X 14細(xì)胞接種到的組裝在多聚賴氨酸(PDL，Sigma)覆蓋的蓋玻片微流體中的細(xì)胞室中。神經(jīng)元培養(yǎng)物在37°C下，5% 0)2中，在添加了 2% B-27 (Gibco公司)的神經(jīng)元培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。在多肽處理之前，神經(jīng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)7天。在二甲基亞砜(DMSO)中準(zhǔn)備對照或者對應(yīng)的TDP-43肽5mM的原液，加入到神經(jīng)元的培養(yǎng)物之前用培養(yǎng)基稀釋到20μΜ。用工作濃度的多肽溶液漂洗的中央流動室和軸突室一次，將50μ?相應(yīng)肽溶液加入到中央流動腔最頂部的源泉，100 μ L加到軸突的源泉。在細(xì)胞體隔添加充分的培養(yǎng)基到來維持在整個(gè)處理進(jìn)程中抵抗多肽擴(kuò)散作用的正液壓。在顯微鏡檢查固定之前先用TDP-43多肽孵育神經(jīng)元軸突72h。使用我們開發(fā)的AxonQuant算法定量軸突的連續(xù)性。為了檢測TDP-43的分布，HEK293或原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分別在肽處理后不同的時(shí)間點(diǎn)固定，用特定抗TDP-43抗體與相應(yīng)的Cy3標(biāo)記的第二抗體免疫染色。皮層神經(jīng)元使用抗Tujl抗體免疫染色來揭示軸突形態(tài)學(xué)，用抗體TDP-43免疫染色來檢測TDP-43的分布。通過免疫染色，免疫Tujl陽性神經(jīng)元顯示了 TDP-43細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分布。
[0068](A)免疫 EM
如之前描述的，除去經(jīng)鑒定的TDP-43-蛋白病患者死后的大腦樣本和對照項(xiàng)目來源于西北大學(xué)的CNADC。腦組織在2%多聚甲醛和0.2%戊二醛固定和嵌入12%的明膠中。該明膠嵌入塊準(zhǔn)備和保存均在4°C，2.3 M蔗糖的條件下。在-120°C用干的金剛石刀切超薄切片(70nm)。下面的塊，切片用多克隆的抗TDP-43抗體(蛋白技術(shù)組；1:100)和抗兔IgG抗體偶聯(lián)至1nm膠體金顆粒進(jìn)行免疫染色。所有EM圖像使用Tecnai Spirit (120kV)電子顯微鏡獲得的。
[0069]TDP-43蛋白病是臨床中與遺傳有關(guān)的異質(zhì)性疾病，這個(gè)蛋白以前被認(rèn)為與經(jīng)典的淀粉樣疾病不同。這里，我們提供證據(jù)證明TDP-43多肽和其他淀粉樣蛋白的結(jié)構(gòu)相似性。原子力顯微鏡和電子顯微鏡檢測橫跨先前定義的淀粉樣蛋白多的多肽碎片，顯示了最小核心區(qū)，這個(gè)區(qū)域形成與FTLD-TDP腦組織中檢測到的TDP-43纖維一樣的淀粉樣纖維。一個(gè)ALS-突變型A315E淀粉樣蛋白TDP-43多肽可以雜交其他TDP-43多肽和淀粉樣β多肽。NMR中的NOEs和DQF-COSY對A315Ε突變型TDP-43多肽的分析表明，它采用了反向平行β構(gòu)象。當(dāng)加入到細(xì)胞培養(yǎng)，這個(gè)淀粉樣蛋白TDP-43多肽誘導(dǎo)TDP-43從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)重新分配。神經(jīng)元的培養(yǎng)用微流體區(qū)分證明TDP-43多肽可以被軸突取代，誘導(dǎo)軸突毒性和神經(jīng)元死亡，因此，概括TDP-43蛋白質(zhì)病的神經(jīng)病理學(xué)的關(guān)鍵特征。重要的是，淀粉樣蛋白TDP-43多肽中一個(gè)氨基酸的改變打亂了纖維結(jié)構(gòu)也會減少神經(jīng)毒性，支持了淀粉樣蛋白生成對于TDP-43神經(jīng)毒性的重要性。
[0070]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述淀粉樣蛋白TDP-43采用反向平行β構(gòu)象。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述淀粉樣蛋白TDP-43形成纖維的最小核心區(qū)域?yàn)閃t-TDP-43肽、A315T突變型TDP-43肽或A315E突變型TDP-43肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述Wt-TDP-43肽的氨基酸序列為MGGGMNFGAFSIN，所述A315T突變型TDP-43肽的氨基酸序列為MGGGMNFGTFSIN，所述A315E突變型TDP-43肽的氨基酸序列為MGGGMNFGEFSIN。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述淀粉樣蛋白TDP-43能自交或雜交誘導(dǎo)淀粉樣纖維的形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述A315E突變型TDP-43肽能雜交Αβ 1-40肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述淀粉樣蛋白TDP-43能誘導(dǎo)TDP-43從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的重新分配，導(dǎo)致細(xì)胞核TDP-43減少和細(xì)胞質(zhì)TDP-43增加。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述淀粉樣蛋白TDP-43通過誘導(dǎo)軸突損傷和神經(jīng)元死亡增強(qiáng)神經(jīng)毒性，能用于開發(fā)TDP-43蛋白病的生物標(biāo)記物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淀粉樣蛋白TDP-43，其特征在于，所述淀粉樣蛋白TDP-43用于篩選阻斷TDP-43聚集的化合物或修飾基因，從而治療與TDP-43的蛋白通路相關(guān)的老年癡呆癥和運(yùn)動神經(jīng)元疾病。
【文檔編號】C07K14/47GK104497121SQ201410437461
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】吳瑛, 朱笠 申請人:蘇州順升橋生物科技有限公司