藥用融合體和綴合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥用融合體和綴合物，特別涉及具有改良的血清半衰期的藥用融合體。這些融合體和綴合物包含多肽、免疫球蛋白(抗體)單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和GLP和/或Exendin分子。本發(fā)明另外涉及包含這樣的藥用融合體和綴合物的應(yīng)用、制劑、組合物和裝置。
【專利說(shuō)明】藥用融合體和綴合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年3月24日的中國(guó)專利申請(qǐng)201080023261.5“藥用融合體和綴合物”的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及具有改良的血清半衰期的藥用融合體和綴合物。這些融合體和綴合物包含免疫球蛋白(抗體)單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和GLP和/或Exendin分子。本發(fā)明另外涉及包含這樣的藥用融合體和綴合物的應(yīng)用、制劑、組合物和裝置。
【背景技術(shù)】
[0003]許多藥物具有能用于治療和/或診斷目的的活性，但由于給藥時(shí)，它們迅速地從機(jī)體清除，因此具有有限的價(jià)值。例如，許多具有治療用途活性的多肽通過(guò)腎臟迅速地從循環(huán)中清除。因此，為了獲得想要的治療效果，必須施用大劑量。需要具有改良的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的改良的治療劑和診斷劑。
[0004]一類這樣的在體內(nèi)或體循環(huán)中具有短半衰期的藥物是腸降血糖素激素諸如胰高血糖素-樣肽I或肽YY以及Exendin,例如Exendin-4。
[0005]胰高血糖素-樣肽(GLP)-1是腸降血糖素激素，具有有效的葡萄糖-依賴性的促胰島素和胰高血糖素抑制(glucagonostatic)作用、對(duì)胰腺β細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用和對(duì)胃腸分泌和運(yùn)動(dòng)的抑制作用，這些結(jié)合起來(lái)來(lái)降低血漿葡萄糖和減小血糖波動(dòng)幅度。此外，通過(guò)其提高飽腹感的能力，GLP-1會(huì)降低攝食量，因此限制體重增加，甚至可以引起體重減輕?？傊?，這些作用會(huì)賦予GLP-1獨(dú)特的特征，被認(rèn)為用作抗糖尿病劑是相當(dāng)理想的，特別是由于其抗高血糖作用的葡萄糖依賴性會(huì)使嚴(yán)重低血糖的任何風(fēng)險(xiǎn)最小化。然而，它的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效動(dòng)力學(xué)特征使得天然GLP-1在治療上是無(wú)用的。因此，盡管連續(xù)給藥時(shí)GLP-1最有效，但是單次皮下注射具有短期效果。GLP-1對(duì)體內(nèi)酶降解是高度敏感的，二肽基肽酶IV(DPP-1V)的裂解可能是最相關(guān)的，因?yàn)檫@快速發(fā)生，并產(chǎn)生非促胰島素的代謝物。因此，基于對(duì)影響其代謝穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)/藥效動(dòng)力學(xué)特征的因素的理解，利用GLP-1的治療潛能的策略已經(jīng)成為熱切研究的焦點(diǎn)。
[0006]已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的工作，嘗試以使其降解減緩?fù)瑫r(shí)仍然保持生物活性的方式抑制肽酶或修飾GLP-1。W005/027978公開(kāi)了具有延長(zhǎng)作用特征的GLP-1衍生物。W002/46227公開(kāi)了異種融合蛋白，其包括與GLP-1或類似物融合的多肽(例如，白蛋白)(這些類似物的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)弓I用并入本文，作為可用于本發(fā)明中的GLP-1類似物的實(shí)例)。W005/003296、W003/06007UW003/059934公開(kāi)了氨基融合蛋白，其中GLP-1已經(jīng)與白蛋白融合，以嘗試增加激素的半衰期。
[0007]然而，盡管這些努力，還是沒(méi)有產(chǎn)生長(zhǎng)效活性的GLP-1。
[0008]因此，特別是在糖尿病和肥胖癥的領(lǐng)域中，存在對(duì)改良的GLP-1肽或其它藥劑(諸如Exendin-4或PYY)的極大需要，它們同樣具有促胰島素效果，特別適于糖尿病和肥胖癥的治療。因此，需要修飾GLP-UExendin-4和其它促胰島素肽，以提供更長(zhǎng)的體內(nèi)作用持續(xù)時(shí)間，同時(shí)維持它們的低毒性和治療優(yōu)勢(shì)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明提供了一種組合物，其是融合體或綴合物，且其包含下述物質(zhì)或由其組成:
(a)促胰島素藥劑或分子，或腸降血糖素藥物或分子，其可以是例如Exendin-4、PYY(例如3-26 PYY)或GLP-1 (例如GLP-1 (7-37) A8G突變體)，其作為與(b)的融合體或綴合物存在；(b)特異性地結(jié)合血清白蛋白(AlbudAbs TM)的dAb，其選自:(i)D0M 7h_14結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (DOM 7h-14 的氨基酸序列如圖 1(h):SEQ ID NO 8 所示)，(ii)DOM 7h_14_10 結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (DOM 7h-14-10的氨基酸序列如圖1(O):SEQ ID NO 26所示)，或與DOM7h-14-10 dAb的序列具有最多4個(gè)氨基酸差異的dAb ;和(iii)DOM 7h_ll_15 dAb (DOM7h-ll-15 的氨基酸序列如圖 l(p):SEQ ID NO 27 所示)，或(iv)DOM 7h_14_10 R108C 結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (DOM 7h-14-10的氨基酸序列如圖1 (r)所示)。
[0010]氨基酸連接物或化學(xué)連接物也可以任選地存在，其連接促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如 Exendin-4 和 / 或 GLP-1 或 PYY)和 dAb (例如 D0M7h_14 dAb,DOM 7h_14_10dAb,DOM 7h-ll-15 dAb)。所述連接物可以是例如螺旋連接物，例如圖1 (k):SEQ ID NO 11所示的序列的螺旋連接物，或它可以是gly-ser連接物，例如具有在圖1(1):SEQ ID NO 12中所示的氨基酸序列。
[0011]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合體(或綴合物)可以另外包含分子，例如其它肽或多肽。
[0012]促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如Exendin和/或GLP-1)可以作為與dAb的N-端或C-端的融合體(或綴合物)而存在。
[0013]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種多肽，所述多肽包含選自下述的融合體分子或由其組成:
[0014](a)2xGLP-l(7-37)A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DATO114，氨基酸序列如圖1 (a):SEQID NO I所示)
[0015](b)Exendin4(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0115，氨基酸序列如圖1(b):SEQ ID NO 2 所示)，
[0016](c)Exendin4-D0M7h-14 dAb 融合體(DAT0116，氨基酸序列如圖1 (c):SEQ ID NO3所示)。
[0017](d)Exendin4、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb融合體(DAT0117，氨基酸序列如圖1(d):SEQ ID NO 4 所示)。
[0018](e) GLP-1 (7-37) A8G(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0118，氨基酸序列如圖 1(e):SEQ ID NO 5 所示)，
[0019](f) GLP-1 (7-37) A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0119，氨基酸序列如圖1 (f):SEQID NO 6 所示)，
[0020](g) GLP-1 (7-37) A8G、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0120，氨基酸序列如圖 1(g):SEQ ID NO 7 所示)，
[0021](h)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h-14_10 融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖l(m):SEQ ID NO 24 所示)，
[0022](i)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_ll_15 融合體(DMS7143，氨基酸序列如圖l(n):SEQ ID NO 25 所示)。
[0023]本發(fā)明也提供了綴合物分子，其包含上述那些(即具有SEQ ID NO 1-7和SEQ IDNO 24-25所示的氨基酸序列的那些)的氨基酸序列或由其組成。
[0024]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種多肽，其包含綴合物分子或由其組成，所述綴合物分子是:
[0025]經(jīng)由賴氨酸(導(dǎo)入在PYY的10位)和4個(gè)重復(fù)PEG連接物綴合到C-端酰胺化的PYY3-36上的DOM 7h_14_10 (R108C) AlbudAb。該肽綴合物的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)如圖14所
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[0026]本發(fā)明也提供了一種多肽，其包含下述氨基酸序列或由其組成:EXendin4、(G4S)3、連接物D0M7h-14-10融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖l(m):SEQ ID NO 24所示)，或與DMS7139的氨基酸序列具有最多4個(gè)氨基酸變化的融合體或綴合物分子，所述氨基酸序列如圖l(m)所示。
[0027]DOM 7h_14是結(jié)合血清白蛋白的人免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或dAb (Vk)，且它的氨基酸序列如圖1(h):SEQ ID NO 8所示。DOM 7h_14 dAb的CDR區(qū)在圖1(h):SEQ IDNO 8所示的氨基酸序列中標(biāo)有下劃線。
[0028]DOM 7h-14_10是結(jié)合血清白蛋白的人免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或dAb，且它的氨基酸序列如圖 1(0):SEQ ID NO 26 所示。DOM 7h_14_10 dAb 的 CDR 區(qū)在圖1 (o):SEQ IDNO 26所示的氨基酸序列中標(biāo)有下劃線。
[0029]DOM 7h-ll_15是結(jié)合血清白蛋白的人免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或dAb，且它的氨基酸序列如圖1(P):SEQ ID NO 27 所示。DOM 7h_ll_15 dAb 的 CDR 區(qū)在圖1 (p):SEQ IDNO 27所示的氨基酸序列中標(biāo)有下劃線。
[0030]本文使用的“融合體”表示這樣的融合蛋白:其包含結(jié)合血清白蛋白的D0M7h_14dAb或D0M7h-14-10 dAb或DOM 7h_ll_15 dAb作為第一部分，且包含促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物作為第二部分。結(jié)合血清白蛋白的dAb和所述藥物或藥劑作為單個(gè)連續(xù)多肽鏈的離散部件(部分)存在。第一(dAb)和第二(腸降血糖素藥物或促胰島素藥劑)部分可以通過(guò)肽鍵直接互相鍵合，或通過(guò)合適的氨基酸或肽或多肽連接物相連。在適當(dāng)時(shí)，可以存在其它部分，例如肽或多肽(例如第三、第四)和/或連接物序列。第一部分可以是在相對(duì)于第二部分的N-端位置、C-端位置或內(nèi)部。在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白含有一個(gè)或超過(guò)一個(gè)(例如一個(gè)至約20個(gè))dAb部分。
[0031]本文使用的“綴合物”表示這樣的組合物:其包含結(jié)合血清白蛋白的dAb，促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如GLP-1、Exendin-4、PYY例如PYY 3-36)與所述dAb共價(jià)地或非共價(jià)地鍵合。促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物可以直接地或通過(guò)合適的連接物部分(例如PEG連接物部分)間接地共價(jià)鍵合dAb。所述藥物或藥劑可以鍵合在dAb的任意合適的位置(諸如氨基-端、羧基-端)，或通過(guò)合適的氨基酸側(cè)鏈(例如，賴氨酸的ε氨基，或半胱氨酸的硫醇基)進(jìn)行鍵合?；蛘撸鏊幬锘蛩巹┛梢灾苯拥?例如，靜電相互作用、疏水相互作用)或間接地(例如，通過(guò)互補(bǔ)的結(jié)合配偶體(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共價(jià)結(jié)合，其中一個(gè)配偶體共價(jià)地鍵合藥物或藥劑，且互補(bǔ)的結(jié)合配偶體共價(jià)地鍵合dAb)非共價(jià)地鍵合dAb。
[0032]本發(fā)明另外提供了本發(fā)明任一種綴合物或融合體(例如DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120、DMS 7139 或 DMS 7143 或 DMS 7143)的(基本上)純的單體。在一個(gè)實(shí)施方案中，它是至少98、99、99.5%純的或100%純的單體。
[0033]本發(fā)明也提供了編碼本文所述的融合體的核酸，例如編碼DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120、DMS 7139 或 DMS 7143 的核酸，例如其中所述核酸序列如圖2(SEQ ID NO 13-32)所示。也提供了包含這些核酸的宿主細(xì)胞。
[0034]本發(fā)明也提供了編碼dAb的氨基酸，所述dAb結(jié)合選自下述的血清白蛋白(AlbudAbs TM):D0M7h_14(SEQ ID NO 8)、D0M7h-14_10(SEQ ID NO 26)、D0M7h_ll_15(SEQID NO 27)和 DOM 7h-14_10R108C(SEQ ID NO 42)。
[0035]本發(fā)明也提供了編碼dAb的核酸，所述dAb結(jié)合選自下述的血清白蛋白:D0M7h-14(SEQ ID NO 23)、D0M7h-14_10 (SEQ ID NO 31)、D0M7h_ll_15 (SEQ ID NO 32)和DOM 7h-14-10R108C(SEQ ID NO 44)。
[0036]本發(fā)明另外提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的融合體的方法，所述方法包括:在適合表達(dá)所述重組核酸的條件下，維持宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼本發(fā)明的融合體的重組核酸和/或構(gòu)建體，由此生產(chǎn)融合體。
[0037]本發(fā)明也提供了組合物(例如，藥物組合物)，其包含本發(fā)明的融合體或綴合物。
[0038]本發(fā)明也提供了一種治療個(gè)體的方法，所述個(gè)體具有疾病或障礙，諸如本文所述的那些，例如代謝病諸如高血糖癥、受損的葡萄糖耐受性、β細(xì)胞缺乏、糖尿病(例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖癥或特征在于進(jìn)食過(guò)量的疾病，例如，所述方法可以用于抑制食欲，例如在帕-魏二氏綜合征中，且所述方法包括:給所述個(gè)體施用治療有效量的本發(fā)明的融合體或綴合物。
[0039]其它代謝障礙包括、但不限于:胰島素抗性、胰島素缺乏、超高胰島素血癥、高血糖癥、血脂異常、高脂血癥、高酮血癥、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、腎衰竭、神經(jīng)病(例如，自主神經(jīng)病、副交感神經(jīng)神經(jīng)病和多神經(jīng)病)、視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、代謝障礙(例如，胰島素和/或葡萄糖代謝障礙)、內(nèi)分泌障礙、肥胖癥、體重減輕、肝障礙(例如，肝病、肝硬化和與肝移植有關(guān)的障礙)和與這些疾病或障礙有關(guān)的病癥。
[0040]另外，使用本發(fā)明的化合物可以預(yù)防或治療的與糖尿病有關(guān)的病癥包括、但不限于:高血糖癥、肥胖癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、單神經(jīng)病、多神經(jīng)病、動(dòng)脈粥樣硬化、潰瘍、心臟病、中風(fēng)、貧血、壞疽(例如，腳和手的壞疽)、陽(yáng)痿、感染、白內(nèi)障、腎功能減退、自主神經(jīng)系統(tǒng)功能失常、受損的白細(xì)胞功能、腕管綜合征、Dupuytren攣縮和糖尿病酮癥酸中毒。
[0041]本發(fā)明也提供了用于治療或預(yù)防與高血糖有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括:給患者或受試者施用至少一劑量的本發(fā)明的綴合物或融合體和/或藥物組合物。
[0042]本發(fā)明另外涉及:使用本發(fā)明的綴合物或融合體，調(diào)節(jié)患者中的胰島素響應(yīng)性的方法，以及增加細(xì)胞的葡萄糖攝取的方法，和調(diào)節(jié)細(xì)胞的胰島素敏感性的方法。也提供了刺激胰島素合成和釋放的方法，增強(qiáng)脂肪、肌肉或肝組織對(duì)胰島素?cái)z取的敏感性的方法，刺激葡萄糖攝取的方法，減慢消化過(guò)程的方法，或阻斷患者中胰高血糖素的分泌的方法，所述方法包括:給所述患者施用本發(fā)明的融合體或綴合物，例如施用至少一劑量的本發(fā)明的藥用綴合物或融合體和/或藥物組合物。
[0043]本發(fā)明的融合體或綴合物和/或藥物組合物可以單獨(dú)施用，或與其它分子或部分例如多肽、治療蛋白和/或分子(例如，胰島素和/或其它蛋白(包括抗體)、肽或小分子，它們調(diào)節(jié)患者中的胰島素敏感性、體重、心臟病、高血壓、神經(jīng)病、細(xì)胞代謝和/或葡萄糖、胰島素或其它激素水平)組合施用。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物或融合體與胰島素(或胰島素衍生物、類似物、融合蛋白或促分泌劑)組合施用。
[0044]本發(fā)明也提供了本發(fā)明的綴合物或融合體用于生產(chǎn)藥劑的應(yīng)用，所述藥劑用于治療疾病或障礙，諸如上述那些中的任一種，例如代謝障礙諸如高血糖癥、糖尿病(I型糖尿病或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖癥。
[0045]本發(fā)明也涉及本文所述的融合體或綴合物用于治療、診斷或預(yù)防的應(yīng)用。
[0046]本發(fā)明的融合體或綴合物(例如融合體的dAb組分)可以進(jìn)一步格式化(formatted)成具有更大的流體動(dòng)力學(xué)尺寸，以進(jìn)一步延長(zhǎng)半衰期，例如，通過(guò)連接PEG基團(tuán)、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或至少其轉(zhuǎn)鐵蛋白-結(jié)合部分、抗體Fe區(qū)域，或通過(guò)綴合抗體結(jié)構(gòu)域。例如，結(jié)合血清白蛋白的dAb可以格式化成抗體的更大抗原結(jié)合片段(例如，格式化成 Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。
[0047]在本公開(kāi)內(nèi)容描述的本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，作為在本發(fā)明的融合體中使用“dAb”的替代，預(yù)見(jiàn)到，技術(shù)人員可以使用這樣的結(jié)構(gòu)域，其包含dAb的⑶R，例如結(jié)合血清白蛋白的DOM 7h-14、D0M 7h_14_10或DOM 7h_ll_15的CDR(例如，移植到合適的蛋白支架或骨架上的⑶R，例如affibody、SpA支架、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域)。本公開(kāi)內(nèi)容作為整體應(yīng)當(dāng)相應(yīng)地解釋，以提供這樣的替代dAb的結(jié)構(gòu)域的公開(kāi)。
[0048]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的融合體或綴合物，其包含促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物和雙-特異性配體或多-特異性配體，所述配體包括根據(jù)本發(fā)明的第一 dAb (其結(jié)合血清白蛋白例如DOM 7h-14、DOM 7h_14_10或DOM 7h_ll_15)和第二dAb (其具有與第一 dAb相同或不同的結(jié)合特異性)和任選地在多-特異性配體的情況下的其它dAb。第二 dAb(或其它dAb)可以任選地結(jié)合不同的靶物，例如FgFr Ic或CD5靶物。
[0049]因而，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于通過(guò)腸胃外給藥來(lái)遞送的本發(fā)明的融合體或綴合物，所述腸胃外給藥例如通過(guò)皮下注射、肌肉內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射、吸入、鼻遞送、透粘膜遞送、經(jīng)口遞送、遞送至患者的胃腸道、直腸遞送或眼遞送。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的融合體或綴合物在藥劑生產(chǎn)中的應(yīng)用，所述藥劑用于下述遞送:皮下注射、吸入、靜脈內(nèi)遞送、鼻遞送、透粘膜遞送、經(jīng)口遞送、遞送至患者的胃腸道、直腸遞送或眼遞送。
[0050]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)皮下注射、肺遞送、靜脈內(nèi)遞送、鼻遞送、透粘膜遞送、經(jīng)口遞送、遞送至患者的胃腸道、直腸遞送或眼遞送來(lái)遞送給患者的方法，其中所述方法包括:給患者施用藥學(xué)有效量的本發(fā)明的融合體或綴合物。
[0051]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了口服的、可注射的、可吸入的、可霧化的或眼的制劑，其包含本發(fā)明的融合體或綴合物。所述制劑可以是片劑、丸劑、膠囊、液體或糖漿劑。在一個(gè)方面，所述組合物可以口服給藥，例如作為飲料，例如作為用于治療肥胖的體重減輕飲料來(lái)銷售。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于直腸遞送給患者的制劑，所述制劑可以提供為例如栓劑。
[0052]例如，可以如在WO 03/002136(通過(guò)引用并入本文)中所述，制備用于GLP-1化合物的腸胃外給藥的組合物。
[0053]例如，可以如在歐洲專利號(hào)272097 (授權(quán)給Novo Nordisk A/S)或在WO93/18785(都通過(guò)引用并入本文)中所述，制備用于某些肽的鼻給藥的組合物。
[0054]術(shù)語(yǔ)“受試者”或“個(gè)體”在本文中被定義為包括動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，包括但不限于，靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如人)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它?？啤⒀蚩?、馬科、犬科、貓科、哨齒動(dòng)物科或鼠科物種。
[0055]本發(fā)明也提供了一種試劑盒，其用于將根據(jù)本發(fā)明的組合物(例如，本發(fā)明的綴合物或融合體)施用給受試者(例如，患者)，所述試劑盒包含組合物(例如，本發(fā)明的綴合物或融合體)、藥物遞送裝置和任選的使用說(shuō)明書(shū)。所述組合物(例如，綴合物或融合體)可以提供為制劑，諸如冷凍干燥的制劑。在某些實(shí)施方案中，所述藥物遞送裝置選自:注射器、吸入器、鼻內(nèi)或眼給藥裝置(例如，mister、眼或鼻滴管)和無(wú)針注射裝置。
[0056]本發(fā)明的組合物(例如綴合物或融合體)可以低壓凍干進(jìn)行儲(chǔ)存，并在使用前在合適的載體中重構(gòu)。可以使用任意合適的低壓凍干方法(例如，噴霧干燥、餅干燥)和/或重構(gòu)技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，冷凍干燥和重構(gòu)可以導(dǎo)致不同程度的抗體活性損失，且可能必須調(diào)節(jié)使用水平來(lái)補(bǔ)償。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含本文所述的低壓凍干的(冷凍干燥的)組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)。優(yōu)選地，低壓凍干的(冷凍干燥的)組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)在再水合時(shí)，其活性損失不超過(guò)約20%、或不超過(guò)約25%、或不超過(guò)約30%、或不超過(guò)約35%、或不超過(guò)約40%、或不超過(guò)約45%、或不超過(guò)約50% (例如,對(duì)血清白蛋白的結(jié)合活性)。
[0057]活性是在低壓凍干之前產(chǎn)生組合物效果所需要的組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)的量。例如，獲得并維持希望的血清濃度希望的時(shí)間段所需要的綴合物或融合體的量?？梢栽诘蛪簝龈芍笆褂萌我夂线m的方法測(cè)定組合物(例如，藥用綴合物、藥用融合體)的活性，并可以在再水合之后使用相同方法測(cè)定活性，以測(cè)定損失的活性的量。
[0058]本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的融合體或綴合物的持續(xù)釋放制劑，這樣的持續(xù)釋放制劑可以包含與下述物質(zhì)相組合的本發(fā)明的融合體或綴合物:例如玻璃酸、微球或脂質(zhì)體和其它藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。這樣的持續(xù)釋放制劑可以是例如栓劑形式。
[0059]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的融合體或綴合物和藥學(xué)上或生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0060]本發(fā)明也提供了修飾的前導(dǎo)序列，其可以在它的C端末端處具有氨基酸序列AMA或AWA，其中所述前導(dǎo)序列不是野生型序列。所述修飾的前導(dǎo)序列可以是OmpA-AMA或-AWA ；或 OmpT-AMA 或-AWA ;或 GAS-AMA 或-AWA。
[0061]所述修飾的前導(dǎo)序列可以用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)異源多肽。所述異源多肽可以包含促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物或由其組成。所述異源多肽可以包含結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)或由其組成，所述結(jié)構(gòu)域抗體例如結(jié)合血清白蛋白的dAb。
[0062]由所述修飾的前導(dǎo)序列表達(dá)的異源多肽可以是包含下述物質(zhì)或由其組成的融合體或綴合物:(a)促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物，其作為與(b)的融合體或綴合物存在；
(b)dAb，例如結(jié)合血清白蛋白的dAb，例如選自下述的dAb:結(jié)合血清白蛋白且具有圖1(h)(SEQ ID NO 8)所示的氨基酸序列的DOM 7h_14 Vk結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)，具有圖1 (o) (SEQ IDNO 26)所示的氨基酸序列的DOM 7h-14-10 dAb，和具有圖1 (p) (SEQ ID NO 27)所示的氨基酸序列的DOM 7h_ll_15 dAb。
[0063]所述修飾的前導(dǎo)序列也可以用于表達(dá)這樣的異源多肽，其包含選自下述的融合體或由其組成:
[0064](a)2xGLP-l(7-37)A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DATO114，氨基酸序列如圖1 (a):SEQID NO I所示)
[0065](b)Exendin4(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0115，氨基酸序列如圖1(b):SEQ ID NO 2 所示)，
[0066](c)Exendin4-D0M7h-14 dAb 融合體(DAT0116，氨基酸序列如圖1 (c):SEQ ID NO3所示)。
[0067](d)Exendin4、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb融合體(DAT0117，氨基酸序列如圖1(d):SEQ ID NO 4 所示)。
[0068](e) GLP-1 (7-37) A8G(G4S 連接物)3 D0M7h_14 dAb 融合體(DATO118，氨基酸序列如圖 1(e):SEQ ID NO 5 所示)，
[0069](f) GLP-1 (7-37) A8G D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0119，氨基酸序列如圖1 (f):SEQID NO 6 所示)，
[0070](g) GLP-1 (7-37) A8G、螺旋連接物、D0M7h_14 dAb 融合體(DAT0120，氨基酸序列如圖 1(g):SEQ ID NO 7 所示)，
[0071](h)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h-14_10 融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖l(m):SEQ ID NO 24 所示)，
[0072](i)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_ll_15 融合體(DMS7143，氨基酸序列如圖l(n):SEQ ID NO 25 所示)。
[0073]要由所述修飾的前導(dǎo)序列表達(dá)的異源多肽也可以包含具有上述那些(即具有SEQID NO 1-7和SEQ ID NO 24-25所示的氨基酸序列的那些)的氨基酸序列的綴合物分子或由其組成。
[0074]要由所述修飾的前導(dǎo)序列表達(dá)的異源多肽也可以包含下述氨基酸序列或由其組成:Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_14_10 融合體(DMS7139，氨基酸序列如圖1 (m) =SEQID NO 24所示)，或與DMS7139的氨基酸序列具有最多4個(gè)氨基酸變化的融合體或綴合物分子，所述氨基酸序列如圖1 (m)所示。
[0075]用于表達(dá)的宿主細(xì)胞可以是微生物宿主細(xì)胞、原核宿主細(xì)胞、革蘭氏陰性細(xì)菌宿主細(xì)胞或大腸桿菌宿主細(xì)胞。
[0076]也提供了一種生產(chǎn)下述物質(zhì)的混合物的方法:(?)促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物；和(ii)在促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的N-端減去2個(gè)氨基酸的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物；所述方法包括下述步驟:使用前導(dǎo)序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)(i)，所述前導(dǎo)序列會(huì)導(dǎo)致在促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的I位之前裂解和3位之前裂解。促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物可以是例如與本文定義的結(jié)合血清白蛋白的dAb的融合體或綴合物的形式。本發(fā)明也提供了通過(guò)上述方法得到的或可得到的混合物。
[0077]所述前導(dǎo)序列可以是ompA、ompT、GAS或任一種上述修飾的序列。所述方法可以包括下述步驟:通過(guò)異源表達(dá)，在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)混合物。所述宿主細(xì)胞可以是微生物宿主細(xì)胞、原核宿主細(xì)胞、革蘭氏陰性細(xì)菌宿主細(xì)胞或大腸桿菌宿主細(xì)胞。
[0078]促胰島素藥劑和腸降血糖素藥物(諸如GLP-1)具有多種治療效果，它們可以由GLP-1R(諸如刺激胰腺的葡萄糖依賴性的胰島素分泌的那些)介導(dǎo)。還已經(jīng)提出，存在一類可以由DPPIV裂解產(chǎn)物GLP-19-36酰胺(或GLP-19-37)介導(dǎo)的作用。GLP-19-37不具有刺激胰腺的葡萄糖敏感的胰島素分泌的活性，但是已經(jīng)提出它具有其它生物學(xué)效應(yīng)，可能是通過(guò)非-GLP-1R驅(qū)動(dòng)的機(jī)理。由于迄今為止GLP-1類分子的大多數(shù)臨床應(yīng)用已經(jīng)靶向糖尿病(通過(guò)胰腺GLP-1R)，已經(jīng)將對(duì)DPPIV的穩(wěn)定性工程化進(jìn)肽中，這如下實(shí)現(xiàn):通過(guò)使用非人GLP-1類似物諸如Exendin-4，或突變GLP-1中的氨基酸8或9，諸如用于Albiglutide (Syncria)中，或通過(guò)在肽的氨基末端處的化學(xué)修飾或合成修飾。另一個(gè)方案是，使用小分子DPPIV抑制劑諸如維格列汀(Galvus)和西他列汀(Januvia)，完全阻斷DPPIV活性，這會(huì)延長(zhǎng)任何內(nèi)源分泌的GLP-1的半衰期。這兩種方案均會(huì)有效地降低DPPIV代謝物GLP-19-36酰胺或GLP-19-37的水平。
[0079]然而，已經(jīng)提出，DPPIV代謝物GLP-19-36酰胺或GLP-19-37具有希望的生物學(xué)效應(yīng)。幾項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，GLP-17-36酰胺的DPPIV裂解產(chǎn)物(即GLP-19-36酰胺，其在GLP-17-36分泌后快速地形成，且在正常條件下比GLP-17-37更豐富)可能具有生物學(xué)效應(yīng)。已經(jīng)為該機(jī)理提出了幾種不同的作用途徑，如下所列:
[0080]GLP-1 (9-37)是 GLP-1R 的拮抗劑二參見(jiàn)例如:Eur J Pharmacol.1996Dec 30;318(2-3):429-35。
[0081]胰高血糖素-樣肽-1-(9-36)酰胺是胰高血糖素-樣肽-1-(7-36)酰胺在體內(nèi)施用給狗以后的主要代謝物，且它作為拮抗劑作用于胰腺受體(Knudsen LB7Pridal L.J B1lChem.1997 Aug 22 ；272 (34) =21201-6)，也是胰腺胰高血糖素-樣肽_1受體的高效價(jià)拮抗劑(Montrose-Rafizadeh C, Yang H, Rodgers BD, Beday A, Pritchette LA, Eng J.J B1lChem.1997Aug 22 ；272(34):21201-6)。
[0082]GLP-1 (9-37)通過(guò)不同機(jī)理向GLP-1 (7_37)發(fā)出信號(hào)，通過(guò)非胰島素依賴性的機(jī)理:(Am J Phys1l Endocrinol Metab.2002 Apr ；282 (4):Ε873_9.)
[0083]GLP-1-(9-36)酰胺會(huì)降低麻醉的豬的血糖，這是通過(guò)不涉及胰島素分泌的機(jī)理(Deacon CF, Plamboeck A MdIer S, Holst JJ.),
[0084]或通過(guò)在肥胖個(gè)體中起增加胰島素敏感性的作用:(Obesity (Silver Spring)。2008 Jul ；16(7):1501-9.Epub 2008 Apr 17。
[0085]GLP-1 (9-36)酰胺(即GLP-1 (7-36)酰胺的裂解產(chǎn)物)是一種糖調(diào)節(jié)肽(Elahi D，Egan JM, Shannon RP, Meneilly GS, Khatri A, Habener JF, Andersen DK)。
[0086]尚未證實(shí)Exendin的減去2個(gè)氨基酸形式的這種活性，因?yàn)檫@不是作為DPPIV裂解的結(jié)果而形成，但是對(duì)于Exendin-4的減去2個(gè)氨基酸形式的情況，這也可能的。還已經(jīng)證實(shí)，在心臟作用和其它作用方面，Exendin-4通過(guò)依賴于和獨(dú)立于GLP-1R的途徑起作用(Circulat1n.2008 ;117:2340-2350:Card1protective and Vasodilatory Act1nsof Glucagon-Like Peptide I Receptor Are Mediated Through Both Glucagon-LikePeptide I Receptor-Dependent and-1ndependent Pathways Kiwon Ban, MSc ；M.HosseinNoyan-Ashraf, PhD ；Judith Hoefer, MD ；Steffen-Sebastian Bolz, MD, PhD ；DanielJ.Drucker, MD ；Mansoor Husain, MD)。這會(huì)增加下述可能性，即實(shí)際上可能存在全長(zhǎng)和減去2個(gè)氨基酸形式的Exendin的類似的且平行的活性。
[0087]至少2個(gè)工藝途徑可用于生產(chǎn)促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物和減去2個(gè)氨基酸形式的混合物。
[0088]例如，可以分別生產(chǎn)全長(zhǎng)GLP-17-36酰胺(以希望的半衰期延長(zhǎng)形式諸如AlbudAb)和GLP-19-36酰胺(或希望的融合蛋白)。然后混合它們，得到具有希望比例的GLP-17-36和GLP-19-36分子的產(chǎn)物?？梢允褂?個(gè)平行的GMP工藝來(lái)生產(chǎn)藥物混合物。
[0089]一種替代方法是，選擇這樣的分泌信號(hào):負(fù)責(zé)去除信號(hào)序列的信號(hào)肽酶對(duì)其不具有單個(gè)裂解位點(diǎn)，而是具有2個(gè)裂解位點(diǎn)。使用的分泌信號(hào)可以以確定的比例切割它們。因而，依賴于選擇的分泌信號(hào)，生成的比例可以是:
[0090]100% I位之前裂解，得到GLP-17_36(或其它促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物全長(zhǎng)分子)；或100 % 3位之前裂解，得到GLP-19-36 (或其它促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物減去2個(gè)氨基酸序列)；或每種全長(zhǎng)或減2形式在O至100之間的任意百分比。例如，所述比例可以是:
[0091 ] 90 %全長(zhǎng):10 %減去2個(gè)氨基酸；
[0092]80 %全長(zhǎng):20 %減去2個(gè)氨基酸；
[0093]75%全長(zhǎng):25%減去2個(gè)氨基酸；
[0094]50 %全長(zhǎng):50 %減去2個(gè)氨基酸；
[0095]25%全長(zhǎng):75%減去2個(gè)氨基酸；
[0096]20%全長(zhǎng):80%減去2個(gè)氨基酸；或
[0097]10%全長(zhǎng):90%減去2個(gè)氨基酸。
[0098]選擇適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列來(lái)產(chǎn)生希望的比例，將允許從一個(gè)單獨(dú)的宿主細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。在GMP工藝方面，這是一個(gè)關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)。這允許開(kāi)發(fā)兩種物質(zhì)的潛在治療效果，同時(shí)保留對(duì)內(nèi)源酶的穩(wěn)定性。
[0099]還用氨基端二肽酶處理整個(gè)范圍的其它內(nèi)源肽和類似物，產(chǎn)生最初的全長(zhǎng)分子和/或二肽酶敏感的物質(zhì)。因而，該方案可以用于生產(chǎn)任意肽和蛋白，其中單個(gè)生產(chǎn)運(yùn)行可以產(chǎn)生長(zhǎng)度相差幾個(gè)氨基酸的2種物質(zhì)的確定的混合物，其中相差的氨基酸包含信號(hào)肽酶的識(shí)別位點(diǎn)的一部分?？赡茉诓溉閯?dòng)物、真核或原核宿主細(xì)胞中(例如在大腸桿菌中)利用該方法。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
:
[0100]圖1:是下述氨基酸序列的圖解:(a) DATOl 14 (SEQ ID NO I), (b) DATOl 15 (SEQ IDNO 2)， (c)DATOI16(SEQ ID NO 3)， (d)DATOl17(SEQ ID NO 4)， (e)DATOl18(SEQ ID NO 5)，(f)DATO119(SEQ ID NO 6)，(g)DATO120(SEQ ID NO 7)，(h)DOM 7h_14(SEQ ID NO 8) (dAb)(CDR 標(biāo)有下劃線)，(i) GLP-17-37 A (8) G (SEQ ID NO 9)，(j) Exendin-4 (SEQ ID NO 10)，(k)螺旋連接物(SEQ ID NO 11)，(l)Gly-ser 連接物(SEQ ID NO 12)，(m)DMS 7139 (SEQID NO 24，(n)DMS 7143 (SEQ ID NO 25)，(o)DOM 7h_14_10(SEQ ID NO 26) (dAb) (CDR 標(biāo)有下劃線)，(P)DOM 7h-l 1-15 (SEQ ID NO 27) (dAb) (CDR 標(biāo)有下劃線)，(q) OmpT AWA 信號(hào)肽(前導(dǎo)序列)(SEQ ID NO 28)，(r) D0M7h-14-10R108C (SEQ ID NO 42)，(s)PYY 3-36 (具有在10位的賴氨酸)(SEQ ID NO 43)。
[0101]圖2:是下述核酸序列的圖解:(a)DAT0114(哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)(SEQ ID NO 13)，
(b)DAT0115(哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)(SEQ ID NO 14)，(c)DAT0115 (為大腸桿菌構(gòu)建體優(yōu)化)(SEQID NO 15)，(d) DATOl 16(哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)(SEQ ID NO 16)，(e)DAT0116 (為大腸桿菌構(gòu)建體優(yōu)化)(SEQ ID NO 17)，(f) DATOl 17 (哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)(SEQ ID NO 18)，(g) DATOl 17 (為大腸桿菌構(gòu)建體優(yōu)化)(SEQ ID NO 19)，(h) DATOl 18 (哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)(SEQ ID NO 20)，(i) DATOl 19 (哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)(SEQ ID NO 21)，(j)DAT0120 (哺乳動(dòng)物構(gòu)建體)(SEQ ID NO22)，(k)Dom7h-14(SEQ ID NO 23)，(I)DMS 7139 (SEQ ID NO 29，(m)DMS 7143 (SEQ ID NO30)， (n)Dom7h-14-10(SEQ ID NO 31)(dAb)， (o)DOM7h_l1-15(SEQ ID NO 32)(dAb)， (p)OmpAWA 信號(hào)肽(SEQ ID NO 33)，(q) DOM 7h_14_10 R108C(dAb) (SEQ ID NO 44)，(r)食蟹猴的cDNA (SEQ ID NO 45)，(s)寡核苷酸 I (SEQ ID NO 47)，(t)寡核苷酸 2 (SEQ ID NO 48)，(u)用于在大腸桿菌中表達(dá)的DMS 7139的核酸序列(SEQ ID NO 50)。
[0102]圖3:(a)顯示了通過(guò)施用DAT0115造成的肥胖癥小鼠模型的劑量依賴性的體重減輕，(b)顯示了通過(guò)施用DAT0115造成的肥胖癥小鼠模型的每日攝食量。
[0103]圖4:顯示了 DATOl 15的DSC:實(shí)線-DATOl 15跡線，虛線-擬合非_2_態(tài)模型。
[0104]圖5:顯示了溶菌酶的DSC:實(shí)線-溶菌酶跡線，虛線-擬合非-2-態(tài)模型(跡線疊力口，所以不可看到虛跡線)。
[0105]圖 6:顯示了 DATOl 15 的 SEC MALLS。
[0106]圖7:顯示了 DATOl 17 的 SEC MALLS。
[0107]圖 8:顯示了 DATO120 的 SEC MALLS。
[0108]圖9:顯示了前導(dǎo)序列的氨基酸序列:(a) ompA(大腸桿菌來(lái)源的)(SEQ ID NO34)，(b) ompA-AMA (人工序歹丨J) (SEQ ID NO 35)，(c) ompA-AWA (人工序歹丨J) (SEQ ID NO 36)，
(d)ompT (大腸桿菌來(lái)源的)(SEQ ID NO 37)，(e) ompT-AMA (人工序列)(SEQ ID NO 38)，(f) GAS (釀酒酵母來(lái)源的)(SEQ ID NO 39)，(g) GAS-AMA (人工序列)(SEQ ID NO 40)，(h)GAS-AWA(人工序列)(SEQ ID NO 41)，(i)Pel B(胡蘿卜軟腐歐文氏菌)(SEQ ID NO 46)，(j)Mal E (人工序列)(SEQ ID NO 49)。
[0109]圖10:顯示了通過(guò)質(zhì)譜法分析的純化的DMS7139。
[0110]圖11:顯示了血糖降低的統(tǒng)計(jì)顯著性的圖解，包括DAT0115和對(duì)照之間、DMS7139和對(duì)照之間、以及DMS7139和DAT0115之間的對(duì)比，(a)顯示了研究設(shè)計(jì)，(b)葡萄糖AUC的圖解表示。沒(méi)有覆蓋水平線的置信區(qū)間是顯著的。
[0111]圖12:表明，與D0M7h-14對(duì)照相比，重復(fù)劑量的DMS7139顯示出劑量-依賴性的HbAlc降低。
[0112]圖13:表明，在肥胖癥D1小鼠模型中，與D0M7h-14對(duì)照相比，DAT0115和DMS7139顯示出攝食量和體重的劑量-依賴性減少。在圖中，meg =微克。
[0113]圖14:顯示了一種肽綴合物，它是:通過(guò)賴氨酸(導(dǎo)入在PYY的10位)和4個(gè)重復(fù)PEG連接物綴合到C-端酰胺化的PYY3-36上的D0M7h_14_10 (R108C) AlbudAbs。線代表連接物，其共價(jià)地連接至D0M7h-14-10 (R108C) AlbudAb的游離C端半胱氨酸和在PYY序列的10位處的賴氨酸。該肽綴合物的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)如下。
[0114]圖15:表明，與媒介物對(duì)照相比，DMS7605表現(xiàn)出劑量依賴性的體重減輕。
【具體實(shí)施方式】
[0115]在本說(shuō)明書(shū)中已經(jīng)參照實(shí)施方案描述了本發(fā)明，描述方式使得本說(shuō)明書(shū)能夠既清楚又簡(jiǎn)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的情況下，可以對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行各種組合或分開(kāi)。
[0116]除非另有說(shuō)明，否則本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué))普通技術(shù)人員公知的相同含義。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于分子、遺傳和生化方法(一般參見(jiàn)Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular B1logy (1999)第 4 版，Johnffiley&Sons, Inc.,所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文)和化學(xué)方法。
[0117]本文使用的術(shù)語(yǔ)“促胰島素藥劑”是指，能夠刺激激素胰島素、或引起激素胰島素的刺激、合成或表達(dá)或活性的化合物。促胰島素藥劑的已知實(shí)例包括、但不限于:例如葡萄糖、GIP、GLP> Exendin (例如 Exendin-4 和 Exendin-3)、PYY 和 0XM。
[0118]本文使用的術(shù)語(yǔ)“腸降血糖素”是指一類胃腸激素，其在葡萄糖水平正常時(shí)或特別是升高時(shí)，會(huì)引起釋放的胰島素的量增加。作為實(shí)例，它們包括GLP-1、GIP、0XM、PYY(例如PYY 3-36)、VIP 和 PP (胰腺多肽)。
[0119]本文關(guān)于多肽所用的術(shù)語(yǔ)“類似物”是指修飾的肽，其中肽的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被其它氨基酸殘基置換，和/或其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)從肽刪除，和/或其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)從肽刪除，和/或其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)添加至肽。這樣的氨基酸殘基的添加或刪除可以發(fā)生在肽的N-端和/或肽的C-端，或它們可以在肽內(nèi)部。使用簡(jiǎn)單的系統(tǒng)來(lái)描述GLP-1的類似物:例如GLP-1 A8G(7-37個(gè)氨基酸)指定GLP-1類似物，其中在8位的天然存在的丙氨酸已經(jīng)被甘氨酸殘基置換。使用根據(jù)IUPAC-1UB命名法所用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫(xiě)，描繪肽類似物及其衍生物的通式。
[0120]當(dāng)提及多肽使用時(shí)，本文使用的“片段”是具有這樣氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與整個(gè)天然存在的多肽的一部分，但是并非其所有氨基酸序列相同。片段可以是“獨(dú)立的”，或被包含在更大多肽內(nèi)，它們作為單個(gè)更大多肽中的單個(gè)連續(xù)區(qū)域，形成所述更大多肽的一部分或區(qū)域。作為實(shí)例，天然存在的GLP-1的片段包括天然存在的氨基酸1-36的氨基酸7-36。此外，多肽的片段也可以是天然存在的部分序列的變體。例如，包含天然存在的GLP-1的氨基酸7-30的GLP-1片段也可以是在它的部分序列內(nèi)具有氨基酸置換的變體。
[0121]本發(fā)明的合適的促胰島素藥劑的實(shí)例包括:GLP_1、GLP-1衍生物、GLP-1類似物、或GLP-1類似物的衍生物。另外，它們包括Exendin-4、Exendin-4類似物和Exendin-4衍生物或片段和Exendin-3、Exendin-3衍生物和Exendin-3類似物。
[0122]本文使用的術(shù)語(yǔ)“GLP-1” 是指 GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36)、GLP-1 (7-35)、GLP-1 (7-38)、GLP-1 (7-39)、GLP-1 (7-40)、GLP-1 (7-41) ,GLP-1 類似物、GLP-1 肽、GLP-1 衍生物、或GLP-1類似物的突變體或片段或衍生物。這樣的肽、突變體、類似物和衍生物是促胰島素藥劑。
[0123]例如GLP-1可以是具有圖1⑴:SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列的GLP-1 (7-37)A8G突變體。
[0124]在國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?0/11296 (The General Hospital Corporat1n)中描述了其它GLP-1類似物，該專利申請(qǐng)涉及包含GLP-1 (7-36)和其功能衍生物的肽片段，所述肽片段的促胰島素活性超過(guò)GLP-1 (1-36)或GLP-1 (1-37)的促胰島素活性，還涉及它們作為促胰島素藥劑的應(yīng)用(通過(guò)引用并入本文，特別作為用于本發(fā)明中的藥物的實(shí)例)。
[0125]國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 91/11457 (Buckley等人)公開(kāi)了有活性的GLP-1肽7-34、7-35,7-36和7-37的類似物，它們也可以用作根據(jù)本發(fā)明的GLP-1藥物。
[0126]本文使用的術(shù)語(yǔ)“Exendin-4 妝”是指 Exendin-4 (1-39)、Exendin-4 類似物、Exendin-4肽的片段、Exendin-4衍生物、或Exendin-4類似物的衍生物。這樣的肽、片段、類似物和衍生物是促胰島素藥劑。Exendin-4(1-39)的氨基酸序列如圖1 (j):SEQ ID NO10所示。
[0127]在PCT 專利公開(kāi) WO 99/25728 (Beeley 等人)、TO 99/25727 Beeley 等人)、WO98/05351 (Young 等人)、WO 99/40788 (Young 等人)、WO 99/07404 (Beeley 等人)和 WO99/43708 (Knudsen等人)(都通過(guò)引用并入本文，特別作為用于本發(fā)明中的藥物的實(shí)例)中，描述了可用于本發(fā)明中的其它Exendin-類似物。
[0128]本文使用的“肽”表示通過(guò)肽鍵連接到一起的約2至約50個(gè)氨基酸。
[0129]本文使用的“多肽”表示通過(guò)肽鍵連接到一起的至少約50個(gè)氨基酸。多肽通常包含三級(jí)結(jié)構(gòu)，并折疊成功能結(jié)構(gòu)域。
[0130]本文使用的“展示系統(tǒng)”表示這樣的系統(tǒng)，其中對(duì)于基于希望的特性(諸如物理的、化學(xué)的或功能的特性)的選擇，可以得到多肽或肽的集合。所述展示系統(tǒng)可以是多肽或肽(例如，在溶液中，固定化在合適的支持物上)的合適集合。所述展示系統(tǒng)也可以是采用細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如，在例如轉(zhuǎn)化的、感染的、轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中表達(dá)核酸文庫(kù)，和在細(xì)胞表面上展示編碼的多肽)或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(例如，乳液區(qū)室化和展示)的系統(tǒng)。示例性的展示系統(tǒng)將核酸的編碼功能與所述核酸編碼的多肽或肽的物理的、化學(xué)的和/或功能的特性相關(guān)聯(lián)。當(dāng)采用這樣的展示系統(tǒng)時(shí)，可以選擇具有希望的物理的、化學(xué)的和/或功能的特性的多肽或肽，并可以容易地分離或回收編碼選擇的多肽或肽的核酸。許多將核酸的編碼功能與多肽或肽的物理的、化學(xué)的和/或功能的特性相關(guān)聯(lián)的展示系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，例如，曬菌體展示(曬菌體展示，例如曬粒展示)、核糖體展示、乳液區(qū)室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、細(xì)菌展示、在質(zhì)粒上展示、共價(jià)展示等(參見(jiàn)，例如，EP 0436597 (Dyax)，美國(guó)專利號(hào)6，172，197 (McCafferty等人)，美國(guó)專利號(hào)6，489，103 (Griffiths 等人))。
[0131]本文使用的“有功能的”描述了具有生物活性(諸如特異性的結(jié)合活性)的多肽或肽。例如，術(shù)語(yǔ)“有功能的多肽”包括通過(guò)它的抗原-結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合靶抗原的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0132]本文使用的“靶配體”表示被多肽或肽特異性地或選擇性地結(jié)合的配體。例如，當(dāng)多肽是抗體或其抗原結(jié)合片段時(shí)，靶配體可以是任意希望的抗原或表位。與靶抗原的結(jié)合依賴于有功能的多肽或肽。
[0133]本文使用的“抗體”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab，)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構(gòu)象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙特異抗體)，無(wú)論是源自天然地產(chǎn)生抗體的任何物種，還是通過(guò)重組DNA技術(shù)制備；無(wú)論分離自下列哪種樣品:血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌。
[0134]本文使用的“抗體形式”表示任意合適的多肽結(jié)構(gòu)，其中可以摻入一個(gè)或更多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域，從而賦予該結(jié)構(gòu)對(duì)抗原的結(jié)合特異性。多種合適的抗體形式是本領(lǐng)域已知的，例如，嵌合的抗體、人源化的抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性的抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同源二聚體和異源二聚體、任意前述物質(zhì)的抗原-結(jié)合片段(例如，F(xiàn)v片段(例如，單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、單個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如，dAb、Vi^VmnV1J和任意前述物質(zhì)的修飾形式(例如,通過(guò)共價(jià)連接聚乙二醇或其它合適的聚合物或人源化的Vhh進(jìn)行修飾)。
[0135]短語(yǔ)“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”表示獨(dú)立于其它V區(qū)或結(jié)構(gòu)域而特異性地結(jié)合抗原或表位的抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH、VHH, Vl)。免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域可以以含有其它可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域的形式(例如，同源多聚體或異源多聚體)存在，其中其它區(qū)域或結(jié)構(gòu)域不是單個(gè)免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合所必需的(即其中免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域與抗原的結(jié)合獨(dú)立于另外的可變結(jié)構(gòu)域)。“結(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”與本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”同義。“單個(gè)免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域”與本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”同義?！皢蝹€(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域”與本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域”同義。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但是也包括來(lái)自其它物種的單個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域，諸如嚙齒動(dòng)物(例如，如在WO 00/29004中所公開(kāi)的，其內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)、鉸口鯊和駱駝科(Camelid)VHHdAb。駱駝科Vhh是這樣的免疫球蛋白單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域多肽:其源自包括駱駝、美洲駝羊、羊駝、單峰駱駝和原駝在內(nèi)的物種，且生產(chǎn)天然地缺少輕鏈的重鏈抗體。所述Vhh可以是人源化的。
[0136]“結(jié)構(gòu)域”是折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，它具有獨(dú)立于蛋白的其余部分的三級(jí)結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的離散的功能性質(zhì)，并且在許多情況下可以添加、去除或轉(zhuǎn)移給其它蛋白，而不喪失該蛋白和/或該結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能?！皢蝹€(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域”是折疊的多肽結(jié)構(gòu)域，其包含抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列。因此，它包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié)構(gòu)域(例如，其中一個(gè)或更多個(gè)環(huán)已經(jīng)被不是抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列所置換)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及至少保留全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。
[0137]術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)”表示異源多肽或核酸的混合物。文庫(kù)由成員組成，每個(gè)成員都具有單個(gè)多肽或核酸序列。就這一方面而言，“文庫(kù)”和“集合”同義。文庫(kù)成員之間的序列差異會(huì)造成文庫(kù)中存在的多樣性。文庫(kù)可以是多肽或核酸的簡(jiǎn)單混合物的形式，或者可以是用核酸文庫(kù)轉(zhuǎn)化的生物體或細(xì)胞的形式，例如細(xì)菌、病毒、動(dòng)物或植物細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)單個(gè)的生物體或細(xì)胞僅含有一個(gè)或有限數(shù)目的文庫(kù)成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，將核酸摻入到表達(dá)載體中，以表達(dá)該核酸所編碼的多肽。因此，在一個(gè)方面，文庫(kù)可以是宿主生物體群體的形式，每個(gè)生物體含有一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)載體拷貝，所述載體含有核酸形式的文庫(kù)的單個(gè)成員，該成員可以被表達(dá)而產(chǎn)生其相應(yīng)的多肽成員。因此,宿主生物體群體具有編碼多種多肽的集合的潛力。
[0138]本文使用的術(shù)語(yǔ)“劑量”表示施用給受試者的融合體或綴合物的量，所述施用是一次性全部施用(單位劑量)，或在確定的時(shí)間段內(nèi)的2次或更多次施用。例如，劑量可以表示在I天(24小時(shí))(日劑量)、2天、I周、2周、3周或I個(gè)月或更多個(gè)月的過(guò)程中施用給受試者的融合體或綴合物的量(例如通過(guò)單次施用，或通過(guò)2次或更多次施用)。給藥之間的間隔可以是任何希望的時(shí)間量。
[0139]短語(yǔ)“半衰期”表示融合體或綴合物的血清或血漿濃度在體內(nèi)降低50 %所需要的時(shí)間，例如因?yàn)樘烊粰C(jī)制所致降解和/或清除或隔離。本發(fā)明的融合體或綴合物在體內(nèi)是穩(wěn)定的，其半衰期因結(jié)合抵抗降解和/或清除或隔離的血清白蛋白分子(例如人血清白蛋白(HSA))而延長(zhǎng)。這些血清白蛋白分子是天然存在的蛋白，它們本身在體內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)。如果分子的功能活性在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間比對(duì)延長(zhǎng)半衰期的分子不具有特異性的類似分子更長(zhǎng)的話，則該分子的半衰期延長(zhǎng)。例如，將本發(fā)明的包含對(duì)人血清白蛋白(HSA)特異性的dAb和腸降血糖素藥物或促胰島素藥劑(諸如GLP-1或Exendin)的融合體或綴合物與相同配體(其中不存在對(duì)HSA的特異性，即不結(jié)合HSA，但是結(jié)合另一種分子。例如，它可以結(jié)合細(xì)胞上第三靶物)相比較。通常，半衰期延長(zhǎng)10%、20%、30%、40%、50%或以上。2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x、100x、200x、300x或以上的半衰期延長(zhǎng)范圍是可能的。或者，或另外，最高達(dá) 30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x、200x、300x、400x 的半衰期延長(zhǎng)范圍也是可能的。
[0140]本文使用的“流體動(dòng)力學(xué)尺寸”表示，基于分子在水溶液中的擴(kuò)散，分子(例如，蛋白分子、配體)的表觀尺寸?？梢蕴幚淼鞍自谌芤褐械臄U(kuò)散或運(yùn)動(dòng)，以衍生出蛋白的表觀尺寸，其中所述尺寸由蛋白顆粒的“Stokes半徑”或“流體動(dòng)力學(xué)半徑”給出。蛋白的“流體動(dòng)力學(xué)尺寸”取決于質(zhì)量和形狀(構(gòu)象)，所以具有相同分子量的兩種蛋白可能具有不同的流體動(dòng)力學(xué)尺寸(基于蛋白的總構(gòu)象)。
[0141]如下進(jìn)行兩個(gè)序列之間的“同源性”或“同一性”或“相似性”(這些術(shù)語(yǔ)在本文可互換使用)的計(jì)算。為了最佳比較目的，比對(duì)序列(例如對(duì)于最佳比對(duì)，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)中引入缺口，為了比較目的，非同源序列可以忽略不計(jì))。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了比較目的所比對(duì)的參照序列的長(zhǎng)度是參照序列長(zhǎng)度的至少30 %、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、80 %、90 %、100 %。然后，比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械哪硞€(gè)位置被與第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，那么分子在該位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。兩個(gè)序列之間的同一性百分比隨考慮缺口數(shù)和各缺口長(zhǎng)度后的序列共享的相同位置數(shù)而變化，需要引入這些缺口以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。使用采用默認(rèn)參數(shù)的算法BLAST 2 Sequences (Tatusova, Τ.Α.等人，F(xiàn)EMS Microb1l Lett, 174:187-188 (1999)，可以準(zhǔn)備和測(cè)定氨基酸和核苷酸序列比對(duì)以及如本文定義的同源性、相似性或同一性。
[0142]核酸、宿主細(xì)胞:
[0143]本發(fā)明涉及分離的和/或重組的核酸，它們編碼本文所述的本發(fā)明的融合體，例如由SEQ ID NO 13-23編碼的那些。
[0144]在本文中稱作“分離的”核酸是，已經(jīng)與在它的原始環(huán)境中(例如，在細(xì)胞中，或在核酸的混合物諸如文庫(kù)中)的其它物質(zhì)(例如，其它核酸，諸如基因組DNA、cDNA和/或RNA)分離的核酸。分離的核酸可以分離為載體(例如，質(zhì)粒)的一部分。
[0145]在本文中稱作“重組的”核酸是，已經(jīng)通過(guò)重組DNA方法生產(chǎn)的核酸，所述重組DNA方法包括依賴于人工重組的方法，諸如克隆進(jìn)載體或染色體中(其中使用例如限制性酶、同源重組、病毒等)，以及使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備的核酸。
[0146]本發(fā)明也涉及重組宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物或微生物，其包含(一種或更多種)重組核酸或表達(dá)構(gòu)建體，它們包含編碼本文所述的本發(fā)明的融合體的核酸。還提供了制備本文所述的本發(fā)明的融合體的方法，所述方法包括:在適合表達(dá)融合體多肽的條件下，維持本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物或微生物。如果需要，所述方法可以另外包括分離或回收融合體的步驟。
[0147]例如，使用任意適合選定的宿主細(xì)胞的方法(例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染)，可以將編碼本發(fā)明的融合體多肽的核酸分子(即，一個(gè)或更多個(gè)核酸分子)或包含這樣的核酸分子的表達(dá)構(gòu)建體(即，一個(gè)或更多個(gè)構(gòu)建體)導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，使得所述核酸分子可操作地連接至一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制元件(例如，在載體中，在通過(guò)細(xì)胞中的過(guò)程建立的構(gòu)建體中，整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中)，以制備重組宿主細(xì)胞。可以在適合表達(dá)的條件下(例如，在有誘導(dǎo)物存在下，在合適的動(dòng)物中，在補(bǔ)充了適當(dāng)?shù)柠}、生長(zhǎng)因子、抗生素、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑等的合適的培養(yǎng)基中)，維持得到的重組宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)編碼的肽或多肽。如果需要，可以分離或回收編碼的肽或多肽(例如，從動(dòng)物、宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基、乳汁)。該方法包括在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見(jiàn)，例加，WO 92/03918,GenPharm Internat1nal)。
[0148]也可以在合適的體外表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)本文所述的本發(fā)明的融合體多肽，例如通過(guò)化學(xué)合成，或通過(guò)任意其它合適的方法。
[0149]如本文所述和例證的，本發(fā)明的融合體或綴合物通常會(huì)以高親和力結(jié)合血清白蛋白。
[0150]例如，本發(fā)明的融合體或綴合物可以以約5微摩爾至約10pM (例如約I微摩爾至約 ΙΟΟρΜ，例如約 5-50nm，例如約 10_30nm，例如約 20_30nm)的親和力(KD ；KD = Koff (kd)/Kon(ka)[通過(guò)表面等離子體共振測(cè)定])結(jié)合人血清白蛋白。
[0151]可以在大腸桿菌中或在畢赤酵母物種(例如，巴氏畢赤酵母)中表達(dá)本發(fā)明的融合體或綴合物，也可以在任意酵母或真菌細(xì)胞中表達(dá)它們。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在大腸桿菌中或在畢赤酵母物種(例如，巴氏畢赤酵母)中或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(例如CHO或HEK 293細(xì)胞)中表達(dá)時(shí)，以至少約0.5mg/L的量分泌融合體。盡管當(dāng)在大腸桿菌中或在畢赤酵母物種中或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，本文所述的融合體或綴合物可以是可分泌的，但是可以使用任意合適的方法來(lái)生產(chǎn)它們，所述方法例如合成化學(xué)方法或不采用大腸桿菌或畢赤酵母物種的生物生產(chǎn)方法。
[0152]在某些實(shí)施方案中，當(dāng)施用有效量時(shí)，本發(fā)明的融合體和綴合物在動(dòng)物模型中是有效的，所述動(dòng)物模型例如在WO 2006/059106(例如在公開(kāi)的WO 2006/059106的第104-105頁(yè))中描述的那些，或在本文的實(shí)施例中描述的那些。一般而言，有效量是約0.0001mg/kg 至約 10mg/kg(例如，約 0.001mg/kg 至約 10mg/kg,例如約 0.001mg/kg 至約lmg/kg,例如約0.01mg/kg至約lmg/kg,例如約0.01mg/kg至約0.lmg/kg)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)所述疾病模型能夠預(yù)測(cè)在人類中的治療效能。
[0153]通常，本發(fā)明的融合體和綴合物以純化形式與藥理上或生理學(xué)上合適的載體一起使用。通常，這些載體可以包括水性溶液或醇/水溶液、乳劑或混懸劑，任一種包括鹽水和/或緩沖介質(zhì)。胃腸外媒介物可以包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉以及乳酸化的林格液。如果需要在混懸劑中維持多肽復(fù)合物的話，則可以從增稠劑中選出合適的生理上可接受的輔料，這些增稠劑例如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。
[0154]靜脈內(nèi)的媒介物包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和電解質(zhì)補(bǔ)充劑，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 16 版)。各種合適的制劑都可米用，包括延長(zhǎng)釋放制劑。
[0155]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑可以為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何途徑。對(duì)于治療，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將本發(fā)明的藥用融合體或綴合物施用給任何患者。
[0156]可通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行施用，包括胃腸外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服、透皮、通過(guò)肺途徑，或者在合適時(shí)用導(dǎo)管直接輸注。給藥的劑量和頻率取決于患者年齡、性別和狀況、同時(shí)施用的其它藥物、禁忌和臨床醫(yī)生要考慮的其它參數(shù)。按照指示，可以局部給藥或全身給藥。
[0157]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于遞送給肺的肺制劑，其包含:(a)本發(fā)明的綴合物或融合體，和(b)藥學(xué)上可接受的緩沖液，其中所述組合物包含液滴，且存在于組合物中的約40%或更多(例如50%或更多)的液滴具有在下述范圍內(nèi)的尺寸:小于約6微米，例如約I微米至約6微米,例如小于約5微米,例如約I至約5微米。這些組合物例如特別適合通過(guò)直接局部肺遞送來(lái)施用給受試者。這些組合物可以例如直接地施用給肺，例如通過(guò)吸入，例如通過(guò)使用噴霧器裝置。這些用于肺遞送的組合物可以包含生理上可接受的緩沖液，其具有約4至約8 (例如約7至約7.5)的pH范圍和這樣的粘度:其大致等于約2%至約10% PEG 1000在含有1.2% (w/v)蔗糖的50mM磷酸鹽緩沖液中的溶液的粘度。
[0158]本發(fā)明的融合體或綴合物可以低壓凍干進(jìn)行儲(chǔ)存，并在使用前在合適的載體中重構(gòu)。已經(jīng)證實(shí)，該技術(shù)對(duì)于常規(guī)免疫球蛋白是有效的，且可以采用本領(lǐng)域已知的冷凍干燥和重構(gòu)技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，冷凍干燥和重構(gòu)可以導(dǎo)致不同程度的抗體活性損失(例如對(duì)于常規(guī)免疫球蛋白，IgM抗體傾向于具有比IgG抗體更大的活性損失)，且可能必須向上調(diào)節(jié)使用水平來(lái)補(bǔ)償。
[0159]對(duì)于預(yù)防應(yīng)用而言，例如當(dāng)施用給具有前驅(qū)糖尿病或胰島素抗性的個(gè)體時(shí)，也可以以類似或稍低的劑量施用含有本發(fā)明的融合體或綴合物的組合物，以預(yù)防、抑制或延遲疾病發(fā)作(例如，維持緩解或靜止?fàn)顟B(tài)，或者預(yù)防急性期)。熟練的臨床醫(yī)生能夠確定合適的給藥間隔，以治療、抑制或預(yù)防疾病。當(dāng)施用本發(fā)明的融合體或綴合物來(lái)治療、抑制或預(yù)防疾病時(shí)，可以施用最多每天4次、每周兩次、每周一次、每?jī)芍芤淮?、每月一次或每?jī)稍乱淮?，劑量為例如約0.0001mg/kg至約10mg/kg (例如，約0.001mg/kg至約10mg/kg,例如約0.00 lmg/kg 至約 lmg/kg,例如約 0.0 lmg/kg 至約 lmg/kg,例如約 0.0 lmg/kg 至約 0.1mg/kg)。
[0160]用本文所述的組合物進(jìn)行的治療被視為“有效”的條件是:相對(duì)于治療前存在的所述癥狀，或者相對(duì)于未用所述組合物或其它合適對(duì)照治療的個(gè)體(人或模型動(dòng)物)中的所述癥狀，一種或更多種癥狀減輕(例如減輕至少10%或在臨床評(píng)價(jià)量表中至少一個(gè)點(diǎn))。盡管癥狀隨所針對(duì)的疾病或障礙的確切性質(zhì)而明顯不同，但是可以由一般熟練的臨床醫(yī)生或技術(shù)人員進(jìn)行測(cè)定。
[0161]類似地，如果相對(duì)于未經(jīng)所述組合物治療的類似個(gè)體(人或動(dòng)物模型)的所述癥狀，一種或更多種癥狀的發(fā)作或嚴(yán)重程度延遲、減少或消除，則用本文所述的組合物進(jìn)行的預(yù)防是“有效”的。
[0162]本發(fā)明的融合體和綴合物可以作為單獨(dú)施用的組合物來(lái)使用，或它們可以與其它治療劑或活性劑(例如其它多肽或肽或小分子)結(jié)合施用。這些其它的藥劑可以包括各種藥物，例如二甲雙胍、胰島素、格列酮類(例如羅格列酮)、免疫抑制劑、免疫刺激劑。
[0163]本發(fā)明的融合體和綴合物可以與一種或更多種額外的治療劑或活性劑一起施用和/或配制。當(dāng)本發(fā)明的融合體或綴合物與額外的治療劑一起施用時(shí)，可以在額外的藥劑之前、同時(shí)、一起或之后，施用所述融合體或綴合物。通常，以提供重疊的治療效果的方式，施用本發(fā)明的融合體或綴合物和額外的藥劑。
[0164]半衰期:
[0165]促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如GLP-1或Exendin配體)的增加的半衰期可用于體內(nèi)用途中。本發(fā)明如下解決了該問(wèn)題:通過(guò)提供促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物(例如GLP和Exendin)的增加的體內(nèi)半衰期,并從而提供這些分子的功能活性在體內(nèi)的更長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間。
[0166]如本文所述，與單獨(dú)的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，本發(fā)明的組合物(即包含本文所述的融合體或綴合物)可以具有顯著延長(zhǎng)的體內(nèi)血清或血漿半衰期和/或增加的AUC和/或增加的平均停留時(shí)間(MRT)。另外，在本發(fā)明的組合物(例如，綴合物或融合體)中，促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的活性通?；旧喜桓淖?。然而，與單獨(dú)的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，本發(fā)明組合物的活性的某些變化是可接受的，且通常會(huì)被本發(fā)明的綴合物或融合體的改良的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)補(bǔ)償。例如，本發(fā)明的藥用綴合物或融合體可以以比單獨(dú)的藥物更低的親和力結(jié)合藥物靶物，但是與單獨(dú)的藥物相比具有大致等效或更優(yōu)的效能，這是由于藥物組合物的改良的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(例如，延長(zhǎng)的體內(nèi)血清半衰期。更大的AUC)。另外，由于本發(fā)明的綴合物或融合體的增加的半衰期，它們可以以比單獨(dú)的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物更低的頻率施用，例如它們可以每月一次或每周一次地施用給患者，并且與施用單獨(dú)的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，它們也達(dá)到促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物在血液中的更恒定的水平，從而實(shí)現(xiàn)希望的治療效果或預(yù)防效果。
[0167]藥代動(dòng)力學(xué)分析方法和配體半衰期的測(cè)定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。細(xì)節(jié)可以參見(jiàn):Kenneth, A 等人:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook forPharmacists,和Peters等人，Pharmacokinetic analysis:A Practical Approach(1996)。也參見(jiàn):“Pharmacokinetics”，M Gibaldi&D Perron, Marcel Dekker 出版，2nd Rev.exedit1n (1982)，它描述了藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)諸如t α和半衰期和曲線下面積(AUC)。
[0168]從配體相對(duì)于時(shí)間的血漿或血清濃度曲線，可以確定半衰期(tl/2a和tl/2i3)和 AUC 和 MRT。可以使用 WinNonlin 分析包(可從 Pharsight Corp.，Mountain View,CA94040，USA得到)，例如，建立曲線的模型。在第一階段(α階段)，配體主要進(jìn)行在患者中的分布，具有一些消除。第二階段(β階段)是末期，這時(shí)配體已經(jīng)分布，且血清濃度隨著配體從患者清除而降低。ta半衰期是第一階段的半衰期，半衰期是第二階段的半衰期。另外，本領(lǐng)域眾所周知的無(wú)分區(qū)擬合模型也可以用于確定半衰期。
[0169]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的融合體或綴合物，其在例如人受試者中具有在下述范圍內(nèi)的消除半衰期:約12小時(shí)或更長(zhǎng)，例如約12小時(shí)至約21天，例如約24小時(shí)至約21天，例如約2-10天，例如約3-4天。
[0170]本發(fā)明的融合體或綴合物也可以進(jìn)一步格式化成具有更大的流體動(dòng)力學(xué)尺寸，例如，通過(guò)連接PEG基團(tuán)、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或至少其轉(zhuǎn)鐵蛋白-結(jié)合部分、抗體Fe區(qū)域,或通過(guò)綴合抗體結(jié)構(gòu)域。
[0171]使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，可以測(cè)定流體動(dòng)力學(xué)尺寸。例如，可以使用凝膠過(guò)濾色譜法來(lái)測(cè)定配體的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。適用于測(cè)定配體的流體動(dòng)力學(xué)尺寸的凝膠過(guò)濾基質(zhì)(諸如交聯(lián)的瓊脂糖基質(zhì))是眾所周知的，且可容易地得到。
[0172]本發(fā)明的組合物(即包含本文所述的融合體和綴合物的那些)會(huì)提供幾個(gè)另外的優(yōu)點(diǎn)。所述結(jié)構(gòu)域抗體組分是非常穩(wěn)定的，比抗體和抗體的其它抗原-結(jié)合片段更小，可以通過(guò)在大腸桿菌或酵母(例如，巴氏畢赤酵母)中表達(dá)來(lái)高產(chǎn)量地生產(chǎn)，且可以從人來(lái)源文庫(kù)或從任意希望的物種容易地選擇結(jié)合血清白蛋白的抗體的抗原-結(jié)合片段。因此，可以比通常在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)的治療劑(例如，人抗體、人源化的抗體或嵌合的抗體)更容易地生產(chǎn)本發(fā)明的包含結(jié)合血清白蛋白的dAb的組合物，且可以使用非免疫原性的dAb (例如，人dAb可以用于治療或診斷人的疾病)。
[0173]當(dāng)促胰島素藥劑或腸降血糖素是含有結(jié)合血清白蛋白的dAb的藥物組合物的一部分時(shí)，可以降低促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物的免疫原性。因此，本發(fā)明提供了一種融合體或綴合物組合物，其在含有結(jié)合血清白蛋白的dAb的藥物組合物的背景下，可以具有更低的免疫原性(例如相對(duì)于單獨(dú)的促胰島素藥劑或腸降血糖素)，或可以是基本上無(wú)免疫原性的。因而，這樣的組合物可以在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)施用給受試者，且具有最小的由受試者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗-藥物抗體而引起的效能損失。
[0174]另外，與單獨(dú)的促胰島素藥劑或腸降血糖素相比，本文所述的綴合物或融合體組合物可以具有增加的安全性特性和更少的副作用。例如，作為dAb的血清白蛋白-結(jié)合活性的結(jié)果，本發(fā)明的融合體和綴合物在血管循環(huán)中具有增加的停留時(shí)間。另外，本發(fā)明的融合體和綴合物在全身給藥(例如，血管內(nèi)給藥)后基本上不能穿過(guò)血腦屏障和積累在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。因此，與單獨(dú)的促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物相比，本發(fā)明的融合體或綴合物可以以更大的安全性和更小的副作用來(lái)施用。類似地，與單獨(dú)的藥物相比，所述融合體或綴合物可以具有減小的對(duì)特定器官(例如，腎臟或肝臟)的毒性。
[0175]實(shí)施例:
[0176]實(shí)施例1:GLP-1 (A8G)或 Exendin-4 和 D0M7h_14 AlbudAb 的遺傳融合體的表達(dá):
[0177]將Exendin-4或GLP-1 (7-37)(在8位的丙氨酸被甘氨酸替換([Gly8]GLP_l))作為與D0M7h-14(結(jié)合血清白蛋白的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (AlbudAb)，其具有下示的氨基酸序列)的融合體克隆進(jìn)PTT-5載體(可從加拿大的CNRC得到)中。在每種情況下，GLP-1或Exendin-4是在構(gòu)建體的5’末端處，dAb是在3’末端處?？傊苽淞?7個(gè)構(gòu)建體(DAT0114、DAT0115, DATOl 16, DAT0117、DATOl 18, DATOl 19, DAT0120)，它們具有圖1 (A-G)所示的氨基酸序列。沒(méi)有連接物，或具有g(shù)ly-ser連接物(G4S)或螺旋連接物(Arai, R.,H.Ueda,等人(2001).“Design of the linkers which effectively separate domainsof a bifunct1nal fus1n protein.，，Protein Eng 14(8):529-32.456)或由 GLP-1 或Exendin-4和dAb之間的第二個(gè)GLP-1部分組成的連接物。所述連接物被包括作為間隔物，以使GLP-1或Exendin-4在空間上與dAb分離，從而防止GLP-1或Exendin-4和GLP-1受體之間的結(jié)合的位阻。構(gòu)建體的序列如圖1(A-G)所示。
[0178]使用堿性裂解，在大腸桿菌中制備無(wú)內(nèi)毒素的DNA(使用無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒Giga試劑盒，可從Qiagen CA得到)，并用于轉(zhuǎn)染HEK293E細(xì)胞(可從加拿大的CNRC得到)。每個(gè)燒瓶使用 333ul 293fectin(Invotrogen)和 250ug DNA,以 1.75xl06 細(xì)胞/ml,轉(zhuǎn)染進(jìn)250ml/燒瓶的HEK293E細(xì)胞，并在30°C表達(dá)5天。通過(guò)離心，收獲上清液，并通過(guò)在蛋白L上的親和純化進(jìn)行純化。使蛋白分批結(jié)合樹(shù)脂(填充在柱上)，并用10柱體積的PBS洗滌。用50ml 0.1M甘氨酸pH2洗脫蛋白，并用Tris pH8中和。在SDS-PAGE凝膠上鑒別預(yù)期尺寸的蛋白，尺寸如下面的表I所示。
[0179]表1:DAT0114、DATOl 15、DATOl 16、DATOl 17、DATOl 18、DATOl 19、DAT0120 的分子量
[0180]
融合蛋白 j預(yù)期的分子量
DATOl1418256
DATOl1516896
DATOl1615950
DATOl1719798
DATOl1815936
DATOl1915318
DAT012018895
[0181]實(shí)施例2:證實(shí)GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs融合體會(huì)結(jié)合血清白蛋白:
[0182]通過(guò)表面等離子體共振(Biacore AB,可從GE Healthcare得到)，分析GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs融合體，以得到關(guān)于親和力的信息。使用被血清白蛋白包被的CM5Biacore芯片(羧甲基化的葡聚糖基質(zhì))，進(jìn)行分析。將每種要測(cè)試的血清白蛋白(人、大鼠和小鼠血清白蛋白)的約1000個(gè)共振單元(RU)在乙酸鹽緩沖液pH5.5中固定化。B1coreAB的流動(dòng)池I是未包被的、阻斷的陰性對(duì)照，流動(dòng)池2被人血清白蛋白(HSA)包被(815RU)，流動(dòng)池3被大鼠血清白蛋白(RSA)包被(826 RU)，流動(dòng)池4被小鼠血清白蛋白(MSA)包被(938 RU)。如上面的實(shí)施例所述，在哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)物中表達(dá)測(cè)試的每種融合體分子。
[0183]如下制備融合體分子的濃度范圍(在16ηΜ-2 μ M范圍內(nèi)):在BIACORE HBS-EP緩沖液(0.0lM HEPES, pH7.4,0.15M NaCl, 3mM EDTA，0.005% 表面活性劑 P20)中稀釋，并流過(guò)BIACORE芯片。
[0184]通過(guò)使結(jié)合速率(on-rate)和解離速率(off-rate)曲線擬合dAb在KD區(qū)域中的濃度所產(chǎn)生的跡線，從BIACORE跡線計(jì)算親和力(KD)。親和力(KD)總結(jié)在下面的表2中:
[0185]表2 =GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs對(duì)人、大鼠和小鼠血清白蛋白的結(jié)合
[0186]
GLP-1 (7-37)A8G，螺旋連 j 2xGLP-l (7-37) A8G
接物、DOM7h-14融合體DOM7h-14融合體
HSAIlOnM150nM
RSA800nM700nM
MSAIlOnM130nM
[0187]上面的結(jié)果證實(shí)，融合體分子保留結(jié)合所有類型的血清白蛋白的能力，這表明，它們可能具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。
[0188]實(shí)施例3 =GLP-1和Exendin-4 AlbudAbs融合體在GLP-1受體結(jié)合試驗(yàn)(GLP-1RBA)中是有活性的:
[0189]將融合體緩沖液更換進(jìn)10mM NaVl、20mM檸檬酸鹽pH 6.2中。同時(shí)，以2xl05細(xì)胞/mL，將CHO 6CRE GLPlR細(xì)胞(用6個(gè)驅(qū)動(dòng)螢光素酶報(bào)告基因的cAMP反應(yīng)元件以及用人GLP-1受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO Kl細(xì)胞(可從美國(guó)典型組織保藏中心ATCC得到))接種進(jìn)懸浮介質(zhì)中。維持懸浮培養(yǎng)24小時(shí)。然后在含有2mM L谷氨酰胺的15mM HEPES緩沖液(可從Sigma得到)中稀釋細(xì)胞(2.5x10s細(xì)胞/ml)，并分配進(jìn)含有1ul/孔的待測(cè)化合物的384-孔平板中。加入試驗(yàn)對(duì)照以后，將平板返回培養(yǎng)箱，在37°C和5% CO2溫育3h。溫育后，如試劑盒所述，將穩(wěn)定的glo螢光素酶底物(可從Promega得到)加入孔中，并用自粘合平板密封帶(Weber Marking Systems Inc.目錄號(hào)607780)密封平板。將平板放入讀數(shù)器(Viewlux，Perkin Elmer)中，并重新溫育5分鐘，然后讀出熒光和繪制結(jié)果。在有和沒(méi)有1uM白蛋白存在下，在濃度范圍內(nèi)測(cè)定化合物，在有和沒(méi)有白蛋白存在下擬合劑量響應(yīng)曲線。計(jì)算EC50，并總結(jié)在下面的表3中:
[0190]表3 =GLP-1 和 Exendin-4 AlbudAbs 融合體在 GLP-1 受體結(jié)合試驗(yàn)(GLP-1R BA)
中的活性
[0191]
【權(quán)利要求】
1.一種融合體或綴合物組合物，其包含下述物質(zhì)或由其組成:(a)促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物，其作為與(b)的融合體或綴合物存在；(b)結(jié)合血清白蛋白的dAb，其選自:(i)DOM 7h-14結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (DOM 7h_14的氨基酸序列如圖1 (h): SEQ ID NO 8所示)，(ii) DOM 7h-14-10結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (DOM 7h_14_10的氨基酸序列如圖1 (o): SEQID NO 26所示)，或與DOM 7h_14_10 dAb的序列具有最多4個(gè)氨基酸差異的dAb ;和(iii)DOM 7h-ll-15 dAb (DOM 7h_ll_15 的氨基酸序列如圖1 (p): SEQ ID NO 27所示)，或(iv)DOM 7h-14-10 R108C結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (DOM 7h_14_10的氨基酸序列如圖1 (r)所示)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合體或綴合物，其中所述藥物是EXendin-4、GLP-l分子或PYY分子、或它們的保留天然分子的結(jié)合活性的突變體或衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合體或綴合物，其中所述藥物選自:(a)GLP-1 (7-37)A8G突變體，其具有圖1 (i) (SEQ ID NO 9)所示的氨基酸序列，或(b) Exendin-4分子，其具有圖1 (j) (SEQ ID NO 10)所示的氨基酸序列，或(c) PYY3-36或具有在10位的賴氨酸，且具有圖1s所示的氨基酸序列的PYY 3-36。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的融合體或綴合物，其包含連接藥物和dAb的氨基酸連接物或化學(xué)連接物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合體或綴合物，其中所述氨基酸連接物是具有圖1(k)(SEQ ID NO 11)所示的氨基酸序列的螺旋連接物，或具有圖1 (I) (SEQ ID NO 12)所示的氨基酸序列的gly-ser連接物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的融合體，其中所述促胰島素藥劑或腸降血糖素藥物作為融合體的一部分存在于dAb的N-端或C-端。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合體或綴合物，其包含選自下述的氨基酸序列或由其組成 (a)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_14_10 融合體(DMS7139)
HG EC}T1:TSDL.SKQM E E E A V R L FiE WL KNCiG PSSGA PPPSGGCJGCiSGCi
GCiSGCSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVrrrCRASQWICjSQLSWYOOK
PGKAPKLLlMWRSSLQSGVPSRFSGSCiSCiTDFrLTiSSLQPEDFATYY
CAQCji^HPKTFGQGTKVIiIfCR
iSr.0 In NO 24)
(b)Exendin4、(G4S) 3、連接物 D0M7h_ll_15 融合體(DMS7143)
HGEGTn'SDLSKQMEEEAVRLFlEWLKMGGPSSGAPPPSGGGCjGSGG
GOSGCiGGSP1MTOSPSStSASVGDRVTITCRASRFlGTWlS WYQQK
PG KAPKLLIL A FSA LQSG V PSRFSGSGSCiTD FTLTISSLQPEDFATYYC
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<S1-:Q ID \Ol5) (c)肽綴合物，它是:經(jīng)由賴氨酸(導(dǎo)入在PYY的10位)和4個(gè)重復(fù)PEG連接物綴合到 C-端酰胺化的 PYY3-36 上的 DOM 7h_14_10 (R108C) AlbudAb,如圖 14 所示。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的融合體或綴合物，其中所述dAb進(jìn)一步格式化以增加它的流體動(dòng)力學(xué)尺寸，這是通過(guò)連接選自下述的分子到dAb上:PEG基團(tuán)、血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或至少其轉(zhuǎn)鐵蛋白-結(jié)合部分、抗體Fe區(qū)域，或通過(guò)綴合抗體結(jié)構(gòu)域。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的融合體或綴合物，其包含額外的dAb部分，所述dAb部分具有與DOM 7h-14-10或DOM 7h_ll_15 dAb相同或不同的結(jié)合特異性。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的融合體或綴合物，其在人類中具有12小時(shí)或更長(zhǎng)例如12-21天的消除半衰期。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的融合體或綴合物，其以在約5微摩爾至約I皮摩爾范圍內(nèi)的KD結(jié)合人血清白蛋白。
12.—種藥物組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的融合體或綴合物以及藥學(xué)上或生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
13.—種組合物，其包含:(a)根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的融合體或綴合物，和(b)另外的治療劑或活性劑，用于單獨(dú)地、先后地或同時(shí)地施用給受試者。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其用于治療或預(yù)防代謝疾病或障礙。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述疾病或障礙選自:高血糖癥、受損的葡萄糖耐受性、β細(xì)胞缺乏、糖尿病(I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)、肥胖癥或特征在于進(jìn)食過(guò)量的疾病。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK104127880SQ201410367609
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2009年3月27日
【發(fā)明者】C.赫林, L.J.霍爾特, L.S.耶斯珀斯, S.邁爾, M.普佩卡-斯維德 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司