新型fgfr3融合體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題是闡明作為癌的新致病基因的多核苷酸，由此，提供該多核苷酸或其編碼的多肽的檢測(cè)方法、其檢測(cè)用試劑盒、探針組、以及引物組。另外，還提供癌治療用醫(yī)藥組合物。在所述檢測(cè)方法中，檢測(cè)FGFR3基因的一部分和TACC3基因的一部分的融合基因、或者其編碼的融合蛋白。所述引物組、探針組或檢測(cè)用試劑盒含有根據(jù)編碼FGFR3的部分設(shè)計(jì)的正義引物、探針組、根據(jù)編碼TACC3的部分設(shè)計(jì)的反義引物和探針組。由于所述多肽的抑制劑顯示出抗腫瘤效果，因此，提供所述融合基因陽(yáng)性或該多肽陽(yáng)性的癌的治療用醫(yī)藥組合物。
【專利說(shuō)明】新型FGFR3融合體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及含有FGFR3激酶區(qū)域的新型融合基因或由各融合基因所編碼的融合 蛋白的檢測(cè)方法。另外，涉及含有抑制該融合蛋白的物質(zhì)的、用于治療該融合基因陽(yáng)性或該 融合蛋白陽(yáng)性的癌的醫(yī)藥組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 3(FibroblastGrowthFactorReceptor3 ;FGFR3)基 因存在于第4號(hào)染色體短臂，并且編碼的蛋白質(zhì)為受體型酪氨酸激酶，在中央部具有細(xì)胞 膜貫通區(qū)域，并且在其駿基末端側(cè)具有酪氨酸激酶區(qū)域、在氨基末端側(cè)具有細(xì)胞外區(qū)域。根 據(jù)氨基末端側(cè)的剪接的不同，已知有FGFR3b及FGFR3C該樣的異構(gòu)體，F(xiàn)GFR3bWFGF-I及 FGF-9 為配體，F(xiàn)GFR3CWFGF-l、-2、-4、-8、-9、-17、-18、-23 為配體形成二聚物，由此，將 自己的酪氨酸磯酸化而活化（非專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)2)。
[0003] 已知的是，在多發(fā)性骨肉瘤中，F(xiàn)GFR3基因通過(guò)染色體間轉(zhuǎn)座而與I巧基因融合， 由于該轉(zhuǎn)座所形成的蛋白質(zhì)的異常而引起細(xì)胞的異常增殖，從而成為軟骨發(fā)育不全癥的致 病基因（非專利文獻(xiàn)3)。另外，在末梢性T細(xì)胞惡性淋己瘤中，已知通過(guò)染色體間轉(zhuǎn)座， FGFR3基因和ETV6基因融合（非專利文獻(xiàn)4)。另外，在膀脫癌等中，已知FGFR3基因的活 化點(diǎn)突變，并且已知若將該些活化點(diǎn)突變基因?qū)氲叫∈笳＜?xì)胞NIH3T3細(xì)胞中，則其轉(zhuǎn) 化為癌細(xì)胞樣，但是已知的是野生型的FGFR3單獨(dú)不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化（非專利文獻(xiàn)5)。
[0004]轉(zhuǎn)化酸性卷曲螺旋含蛋白 3 (transforming,acidiccoiled-coilcontaining protein3 ;TACC3)基因與FGFR3基因一樣存在于第4號(hào)染色體短臂，由16個(gè)外顯子構(gòu)成。 已知的是，所編碼的蛋白質(zhì)作為肌動(dòng)蛋白與有絲分裂紡鍵體的穩(wěn)定化有關(guān)（非專利文獻(xiàn) 6)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006] 非專利文獻(xiàn)
[0007]非專利文獻(xiàn)1 細(xì)胞因子&生長(zhǎng)因子綜述（切tokine&GrowthFactorReview)， (英國(guó)）、2005 年、16 卷、p.139-149"
[0008] 非專利文獻(xiàn)2 生物化學(xué)雜志炬iochemicaljournal)，（（英國(guó)），2011年、437 卷、P.199-213) '，
[0009]非專利文獻(xiàn) 3 血液炬Iood)、（（美國(guó)）、2002 年、100 卷、P. 1579-1583)"
[0010] 非專利文獻(xiàn)4 癌癥研究（CancerReserch)、（（美國(guó)）、2001年、61卷、 P.8371-8374)，，
[0011]非專利文獻(xiàn) 5 癌基因（Oncogene)、（（英國(guó)）、2009 年、28 卷、P. 4306-4316)"
[0012] 非專利文獻(xiàn)6 細(xì)胞生物學(xué)趨勢(shì)（TrendsinCellBiology)、。英國(guó)）、2008年、 18 卷、P.379-388)"


【發(fā)明內(nèi)容】

[001引發(fā)明要解決的課題
[0014] 本發(fā)明的課題在于闡明作為癌的新致病基因的多核巧酸，由此提供該多核巧酸或 其編碼的多膚的檢測(cè)方法、及其檢測(cè)用試劑盒、引物組及探針組。另外，本發(fā)明的課題在于， 對(duì)表達(dá)該些融合蛋白的癌癥患者提供抑制本發(fā)明的多膚的藥物。
[001引解決問(wèn)題的手段
[0016] 本發(fā)明對(duì)由肺癌癥患者及膀脫癌癥患者檢體所得到的激酶FGFR3的一部分與 TACC3基因的一部分融合而成的新型融合基因進(jìn)行分離鑒定（實(shí)施例1、2、3及23)，發(fā)現(xiàn)該 些融合基因存在于肺癌癥患者檢體及膀脫癌癥患者檢體中（實(shí)施例4、5、6、20及23)，另外， 為了表達(dá)該些融合基因而制作了逆轉(zhuǎn)錄酶病毒（實(shí)施例7、10及24)，發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞具有腫 瘤形成能力，因此該融合基因是癌癥的致病基因（實(shí)施例8、11及25)。構(gòu)建了一種檢測(cè)方 法（實(shí)施例4、5、6、19、20、27及28)，其中，從源自人膀脫癌癥患者的細(xì)胞株或肺癌癥患者檢 體及膀脫癌癥患者檢體檢測(cè)該新型融合基因W及由該新型融合基因所編碼的融合蛋白。另 夕F，發(fā)現(xiàn)具有由該融合基因所編碼的融合蛋白的抑制作用的藥物抑制了感染細(xì)胞的腫瘤形 成能力，因此，對(duì)于表達(dá)該融合蛋白或?qū)ζ渚幋a的融合基因的癌癥患者而言（即，F(xiàn)GFR3基 因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌癥患者），該融合 蛋白的抑制劑是有效的（實(shí)施例9、12、13、14、16、22及30)。
[0017] 迄今為止，認(rèn)為野生型的FGFR3單獨(dú)不會(huì)轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，但是令人非常梅訝的是， 即便是野生型，通過(guò)與TACC3融合，也轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。另外，令人驚訝的是，確認(rèn)到該FGFR3 和TACC3的融合蛋白在FGFR3激酶的駿基末端側(cè)融合，形成了與迄今已知的在氨基末端的 融合激酶不同的結(jié)構(gòu)。
[0018] 本發(fā)明人根據(jù)該些見(jiàn)解構(gòu)建了該些融合基因的檢測(cè)法，提供了用于該方法的試劑 盒、引物組及探針組，并通過(guò)檢測(cè)該些融合基因或其所編碼的融合蛋白，可W篩選成為通過(guò) 融合蛋白抑制劑的藥物治療對(duì)象的癌癥患者。此外，還發(fā)現(xiàn)該融合蛋白抑制劑（特別是化 合物A?E、Dovitinib、AZD4547、BGJ398 或LY2874455)抑制FGFR3 和TACC3 的融合蛋白 的活性，并且對(duì)表達(dá)FGFR3和TACC3的融合蛋白的（即，F(xiàn)GFR3基因和TACC3基因的融合基 因陽(yáng)性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的）癌（例如肺癌或膀脫癌）等有效。
[0019]目P，本發(fā)明涉及W下內(nèi)容。
[0020] [1]-種纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3 (FGFR3)基因和轉(zhuǎn)化酸性卷曲螺旋含蛋白 3 (TACC3)基因的融合基因或FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，包括檢測(cè) 從受試者得到的試樣中的、編碼下述多膚的多核巧酸或該多膚的存在的步驟：
[0021] 所示多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461? 982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28 的氨基酸編號(hào)461?1040所示氨基酸序列的同源性為90 %W上的氨基酸序列，并且具有腫 瘤形成能力。
[002引凹根據(jù)山所述的方法，其中，所述多膚是含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461? 947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨 基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列，并且具有 腫瘤形成能力的多膚；或者是含有在序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸 編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入I?10 個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚。
[0023] [3]根據(jù)[1]所述的方法，其中，所述多膚是含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、 序列號(hào)26或序列號(hào)28所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤 形成能力的多膚。
[0024] [4]根據(jù)[1]所述的方法，其中，所述多膚是含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序 列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚；或者是含有在序列 號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入 1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚。
[002引 閒根據(jù)山所述的方法，其中，所述多膚為由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列 號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0026] [6] -種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的檢測(cè)用試劑盒，其含有W能夠特異 性地?cái)U(kuò)增編碼下述多膚的多核巧酸的方式設(shè)計(jì)的正義引物及反義引物：
[0027] 所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461? 982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28 的氨基酸編號(hào)461?1040所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫 瘤形成能力。
[002引 [7]根據(jù)[6]所述的試劑盒，其中，所述多膚是含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461? 947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力的多膚；或者，所述多膚是含有在序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461? 947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨 基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚。
[0029][引根據(jù)[6]所述的試劑盒，其中，所述多膚是含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào) 6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫 瘤形成能力的多膚。
[0030] [9]根據(jù)[6]所述的試劑盒，其中，所述多膚是含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、 序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚；或者，所述多膚 是含有在序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚。
[003。 [10]根據(jù)腳所述的試劑盒，其中，所述多膚為由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序 列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[003引山]一種用于檢測(cè)FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物組，其選自由下述a)?e)構(gòu)成的組：
[0033] a)引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸 雜交的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、W及由在嚴(yán)格條件下與該多核巧酸的互補(bǔ)鏈雜交的核 酸分子所構(gòu)成的正義引物；
[0034]b)引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸 雜交的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、W及由在嚴(yán)格條件下與該多核巧酸的互補(bǔ)鏈雜交的核 酸分子所構(gòu)成的正義引物；W及
[0035] C)引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸 雜交的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、W及由在嚴(yán)格條件下與該多核巧酸的互補(bǔ)鏈雜交的核 酸分子所構(gòu)成的正義引物；
[0036] d)引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)25所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧 酸雜交的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、W及由在嚴(yán)格條件下與該多核巧酸的互補(bǔ)鏈雜交的 核酸分子所構(gòu)成的正義引物；
[0037]e)引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)27所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧 酸雜交的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、W及由在嚴(yán)格條件下與該多核巧酸的互補(bǔ)鏈雜交的 核酸分子所構(gòu)成的正義引物。
[003引[12]-種正義引物及反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)1的堿基編號(hào) 1?2280中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)1的堿 基編號(hào)2281?2856中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成。
[0039] [13] -種正義引物及反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)3的堿基編號(hào) 1?2280中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)3的堿 基編號(hào)2281?2961中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成。
[0040] [14] -種正義引物及反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)5的堿基編號(hào) 1?2368中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)5的堿 基編號(hào)2369?3003中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成。
[0041] [15] -種正義引物及反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)25的堿基編號(hào) 1?2242中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)25的 堿基編號(hào)2243?3144中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成。 [004引[16] -種正義引物及反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)27的堿基編號(hào) 1?2233中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)27的 堿基編號(hào)2234?3135中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成。 [004引 [17] -種用于檢測(cè)FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的探針組，選自由下述 a)?C)構(gòu)成的組：
[0044]a)探針組，其包括由含有與序列號(hào)1的堿基編號(hào)1?2280中任意的連續(xù)的至少 16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組（優(yōu)選包括20種探針組）、W 及由含有與序列號(hào)1的堿基編號(hào)2281?2856中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核 巧酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組（優(yōu)選包括20種探針組）；
[0045]b)探針組，其包括由含有與序列號(hào)3的堿基編號(hào)1?2280中任意的連續(xù)的至少 16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組（優(yōu)選包括20種探針組）、W 及由含有與序列號(hào)3的堿基編號(hào)2281?2961中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核 巧酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組（優(yōu)選包括20種探針組）；
[0046] C)探針組，其包括由含有與序列號(hào)5的堿基編號(hào)1?2368中任意的連續(xù)的至少 16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組（優(yōu)選包括20種探針組）、W 及由含有與序列號(hào)5的堿基編號(hào)2369?3003中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核 巧酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組（優(yōu)選包括20種探針組）。
[0047] [18]根據(jù)山?閒中任一項(xiàng)所述的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的檢 測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)多核巧酸的存在的步驟包括：使用從受試者得到的試樣W及 [17]所述的探針組進(jìn)行原位雜交的步驟；將雜交的信號(hào)放大的步驟；W及檢測(cè)所述信號(hào)重 疊的步驟。
[004引 [19] 一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的檢測(cè)用試劑盒，其含有用于檢測(cè) FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的[17]所述的探針組W及將雜交后的信號(hào)放大的試 劑。
[0049] 巧0]根據(jù)[1]?[5]中任一項(xiàng)所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)方法，其 特征在于，所述檢測(cè)多膚的存在的步驟包括；i)使識(shí)別源自該多膚的FGFR3基因的部分的 抗體（一次抗體）及識(shí)別源自該多膚的TACC3基因的部分的抗體（一次抗體）與從受試者 得到的試樣接觸的步驟；ii)添加與該一次抗體分別結(jié)合的、并且連結(jié)有寡核巧酸的各二 次抗體的步驟；iii)添加連接溶液從而進(jìn)行連接反應(yīng)的步驟，其中該連接溶液含有與該二 次抗體所連結(jié)的該寡核巧酸部分互補(bǔ)的二種寡核巧酸、W及在它們接近時(shí)能夠使其連接從 而在該二次抗體間形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的連接酶；iv)沿所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使核酸伸長(zhǎng)的步驟； V)使能夠與伸長(zhǎng)的核酸雜交的經(jīng)標(biāo)記的寡核巧酸探針雜交的步驟；W及Vi)檢測(cè)該標(biāo)記信 號(hào)的步驟。
[0050]KU-種FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)用試劑盒，其用于山?閒中任一 項(xiàng)所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)方法中，并且含有；識(shí)別源自所述融合多膚的 FGFR3基因的部分的抗體（一次抗體）及識(shí)別源自所述融合多膚的TACC3基因的部分的抗 體（一次抗體）、與該一次抗體分別結(jié)合并且連結(jié)有寡核巧酸的二次抗體、與連結(jié)于該二次 抗體的該寡核巧酸部分互補(bǔ)的二種寡核巧酸、在它們接近時(shí)能夠使其連接從而在該二次抗 體間形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的連接酶、W及經(jīng)標(biāo)記的寡核巧酸探針。
[0051] 巧2] -種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或FGFR3和TACC3的融合蛋白 陽(yáng)性的癌的治療用醫(yī)藥組合物，其含有抑制下述多膚的物質(zhì)：
[0052] 所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461? 982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序 列、并且具有腫瘤形成能力。
[005引 巧引根據(jù)巧引所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多膚是含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào) 461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的 氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚；或者是含有在序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461? 947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的氨基酸 序列中缺失、取代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能 力的多膚。
[0054] 巧4]根據(jù)巧2]所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多膚為由序列號(hào)2的氨基酸編號(hào) 461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的 氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0055] 巧引根據(jù)巧2]所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多膚為含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4或 序列號(hào)6所示氨基酸序列的同源性為90 %W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多 膚。
[005引巧6]根據(jù)巧引所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多膚是含有序列號(hào)2、序列號(hào)4或序 列號(hào)6所示氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚；或者是含有在序列號(hào)2、序列號(hào)4 或序列號(hào)6所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力的多膚。
[0057]巧7]根據(jù)巧引所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多膚為由序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列 號(hào)6所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[005引 巧8]根據(jù)巧引?巧7]中任一項(xiàng)所述的癌治療用醫(yī)藥組合物，其中，所述的抑制多 膚的物質(zhì)為Dovitinib、AZD4547、BGJ398 或LY2874455。
[005引 巧9]根據(jù)巧引?巧7]中任一項(xiàng)所述的癌治療用醫(yī)藥組合物，其中，所述癌為肺癌 或膀脫癌。
[0060] 巧0]抑制下述多膚的物質(zhì)用于制造FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或 FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌的治療用醫(yī)藥組合物的應(yīng)用：
[0061] 所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461? 982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。
[0062] 巧1]抑制下述多膚的物質(zhì)用于治療FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或 FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌的應(yīng)用：
[0063] 所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461? 982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。
[0064] 巧2]抑制下述多膚的物質(zhì)，其用于治療FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性 或FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌：
[0065] 所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461? 982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。
[0066] 巧3] -種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或FGFR3和TACC3的融合蛋白 陽(yáng)性的癌的治療方法，包括向?qū)ο蠼o予有效量的抑制下述多膚的物質(zhì)：
[0067] 所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461? 982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。
[0068] 另外，本發(fā)明涉及
[0069] -種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的存 在的檢測(cè)方法，其特征在于，包括下述步驟：
[0070] 檢測(cè)從受試者得到的試樣中的編碼下述（1)?（3)中記載的多膚的多核巧酸的存 在的步驟，
[0071](1)所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的 氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；
[0072](2)所述多膚含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨 基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者所述多膚含有在序列號(hào)2的氨 基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列 號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列 號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或序列號(hào)28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者
[0073] (3)所述多膚由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列構(gòu)成。
[0074] 另外，本發(fā)明涉及
[00巧]一種本段落中記載的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌 或膀脫癌）的存在的檢測(cè)方法，其特征在于，該多核巧酸的存在的檢測(cè)步驟包括：使用從受 試者得到的試樣及[17]所述的標(biāo)記探針組進(jìn)行原位雜交的步驟；W及檢測(cè)所述標(biāo)記的信 號(hào)重疊的步驟。
[007引另外，本發(fā)明涉及
[0077] 一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的診 斷方法，其特征在于，包括下述步驟：
[007引檢測(cè)從受試者得到的試樣中的編碼下述（1)?（3)中記載的多膚的多核巧酸的存 在的步驟，
[0079](1)所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的 氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；
[0080](2)所述多膚含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨 基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者所述多膚含有在序列號(hào)2的氨 基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列 號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列 號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或序列號(hào)28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者
[0081] (3)所述多膚由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列構(gòu)成。
[0082] 另外，本發(fā)明涉及
[0083]-種本段落中記載的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌 或膀脫癌）的診斷方法，其特征在于，該多核巧酸的存在的檢測(cè)步驟包括：使用從受試者得 到的試樣及[17]中記載的標(biāo)記探針組進(jìn)行原位雜交的步驟；W及檢測(cè)所述標(biāo)記的信號(hào)重 疊的步驟。
[0084] 另外，作為其他方案，本發(fā)明涉及一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的 癌（特別是肺癌或膀脫癌）的治療方法，包括對(duì)通過(guò)上述2個(gè)方案的診斷方法診斷為FGFR3 基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的患者給予本發(fā)明的抑制 多膚的物質(zhì)（在一種方案中為化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398或化合物 LY287445 巧。
[0085] 另外，本發(fā)明涉及
[0086] -種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的存 在的檢測(cè)方法，其特征在于，包含下述步驟：
[0087] (1)W從受試者得到的試樣作為模板，使用上述山]?[16]中任一項(xiàng)所述的引物 組進(jìn)行PCR的步驟；W及
[008引 （2)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的存在的步驟。
[008引另外，本發(fā)明涉及
[0090] 一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的診 斷方法，其特征在于，包含下述步驟：
[0091] (1)W從受試者得到的試樣作為模板，使用上述山]?[16]中任一項(xiàng)所述的引物 組進(jìn)行PCR的步驟；W及
[0092] (2)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的存在的步驟。
[0093] 另外，作為其他方案，本發(fā)明涉及一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性 的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的治療方法，包括對(duì)通過(guò)上述診斷方法診斷為FGFR3基因 和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的患者給予抑制本發(fā)明的多 膚的物質(zhì)（在一種方案中為化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398或化合物 LY287445 巧。
[0094] 另外，本發(fā)明涉及
[0095] 一種檢測(cè)染色體的重排（genomicrearrangement,基因重排）的方法，包含下述 步驟：
[0096] 檢測(cè)從受試者得到的試樣中的編碼下述（1)?（3)中記載的多膚的多核巧酸的存 在的步驟，
[0097](1)所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的 氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能 力；
[0098](2)所述多膚含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨 基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者所述多膚含有在序列號(hào)2的氨 基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列 號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列 號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或序列號(hào)28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入I?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者
[0099] (3)所述多膚由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列構(gòu)成。
[0100] 此外，本發(fā)明還涉及
[010。 一種檢測(cè)染色體的重排（genomicrearrangement,基因重排）的方法，其特征在 于，包含下述步驟：
[0102] (1)使用i)從受試者得到的試樣、ii)含有編碼FGFR3基因的5'側(cè)基因組區(qū)域的 英光標(biāo)記探針（第一探針）、W及iii)含有編碼TACC3基因的3'基因組區(qū)域的英光標(biāo)記探 針（第二探針）（此處，第一探針和第二探針的英光不同）進(jìn)行原位雜交的步驟；W及
[0103] (2)檢測(cè)所述標(biāo)記的信號(hào)重疊的步驟。
[0104] 另外，本發(fā)明涉及
[0105] 一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的存 在的檢測(cè)方法，其特征在于，包含下述步驟：
[0106] (1)使用i)從受試者得到的試樣、ii)含有編碼FGFR3基因的5'側(cè)基因組區(qū)域的 英光標(biāo)記探針（第一探針）、W及iii)含有編碼TACC3基因的3'基因組區(qū)域的英光標(biāo)記探 針（第二探針）（在此，第一探針和第二探針的英光不同）進(jìn)行原位雜交的步驟；W及
[0107] (2)檢測(cè)所述標(biāo)記的信號(hào)重疊的步驟。
[010引另外，本發(fā)明涉及
[0109] 一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的診 斷方法，其特征在于，包含下述步驟：
[0110] (1)使用i)從受試者得到的試樣、ii)含有編碼FGFR3基因的5'側(cè)基因組區(qū)域的 英光標(biāo)記探針（第一探針）、W及iii)含有編碼TACC3基因的3'基因組區(qū)域的英光標(biāo)記探 針（第二探針）（在此，第一探針和第二探針的英光不同）進(jìn)行原位雜交的步驟；W及
[0111] (2)檢測(cè)所述標(biāo)記的信號(hào)重疊的步驟。
[0112] 另外，作為其他方案，本發(fā)明涉及一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性 的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的治療方法，包括對(duì)于通過(guò)上述診斷方法診斷為FGFR3基因 和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的患者給予抑制本發(fā)明的多 膚的物質(zhì)（在一種方案中為化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、或化合物 LY287445 巧。
[011引另外，本發(fā)明涉及
[0114] 下述（1)?（3)中記載的多膚（W下也稱為"本發(fā)明的多膚"）或編碼該多膚的多 核巧酸（W下也稱為"本發(fā)明的多核巧酸"）：
[0115](1)所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的 氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；
[0116](2)所述多膚含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨 基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者所述多膚含有在序列號(hào)2的氨 基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列 號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列 號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或序列號(hào)28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者
[0117] (3)所述多膚由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列構(gòu)成。
[0118] 另外，本發(fā)明涉及一種FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，包含 檢測(cè)從受試者得到的試樣中的下述（1)?（3)中記載的多膚的存在的步驟：
[0119](1)所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的 氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能 力；
[0120](2)所述多膚含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨 基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者所述多膚含有在序列號(hào)2的氨 基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列 號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列 號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或序列號(hào)28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者
[0121] (3)所述多膚由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列構(gòu)成。
[0122] 另外，本發(fā)明涉及
[0123] 一種FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的存在的檢測(cè) 方法，其特征在于，包含下述步驟：
[0124] 檢測(cè)從受試者得到的試樣中的下述（1)?（3)中記載的多膚的存在的步驟，
[0125](1)所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的 氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能 力；
[0126](2)所述多膚含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨 基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者所述多膚含有在序列號(hào)2的氨 基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列 號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列 號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或序列號(hào)28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者
[0127] (3)所述多膚由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列構(gòu)成的多膚。
[012引另外，本發(fā)明涉及
[0129] 一種FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的診斷方法， 其特征在于，包含下述步驟：
[0130] 檢測(cè)從受試者得到的試樣中的下述（1)?（3)中記載的多膚的存在的步驟，
[0131](1)所述多膚含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的 氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能 力；
[0132] (2)所述多膚含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨 基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列 號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或 序列號(hào)28)所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者所述多膚含有在序列號(hào)2的氨 基酸編號(hào)461?947 (或序列號(hào)2)、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 (或序列號(hào)4)、序列 號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996 (或序列號(hào)6)、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 (或序列 號(hào)26)或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040 (或序列號(hào)28)所示的氨基酸序列中缺失、取 代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力；或者
[0133] (3)所述多膚由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列構(gòu)成。
[0134] 另外，作為其他方案，本發(fā)明涉及一種FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性的 癌（特別是肺癌或膀脫癌）的治療方法，包括對(duì)通過(guò)上述診斷方法診斷為FGFR3和TACC3 的融合蛋白陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的患者給予抑制上述（1)?（3)中記載的多 膚的物質(zhì)（在一種方案中為化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398、或化合物 LY287445 巧。
[01巧]Science. 2012S巧 7 ;337化099) :1231-5.化油 2012化 1 26.中報(bào)道了 存在顯 示出癌化能力的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因、FGFR抑制劑PD173074、AZD4547、 BGJ398抑制FGFR3-TACC3融合基因表達(dá)細(xì)胞的增殖、并且給出了FGFR3-TACC3融合基因表 達(dá)可能有助于FGFR抑制治療有用的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組的鑒定的啟示，但是其為本申請(qǐng) 最先的 優(yōu)先權(quán)日:（2012年3月8日）之后的文獻(xiàn)。在該文獻(xiàn)中記載了使融合點(diǎn)與本發(fā)明的 FGFR3-TACC3_vl及FGFR3-TACC3_v2相同的基因片斷的序列，但是其全長(zhǎng)并未明確，并且其 根本沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、及FGFR3-TACC3_v化或其檢測(cè) 方法、引物組、探針組、檢測(cè)試劑盒，也沒(méi)有給出啟示。另外，也沒(méi)有關(guān)于肺癌及膀脫癌的記 載和啟示。
[0136]另外，HumMolGenet. 2012.Nov2UHumMolGenet. 2013Febl5 ;22 (4) :795-803)中報(bào)道了具有癌化能力的FGFR3和TACC3的融合基因（本發(fā)明的FGFR3-TACC3_vl)在膀脫 癌中存在，但是該文獻(xiàn)為公開(kāi)了本發(fā)明的FGFR3-TACC3_vl的本申請(qǐng)最先的 優(yōu)先權(quán)日:（2012 年3月8日）及本申請(qǐng)第二 優(yōu)先權(quán)日:（2012年9月5日）之后的文獻(xiàn)。在該文獻(xiàn)中，根本 沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的FGFR3-TACC3_v2、FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_v5a、及FGFR3-TACC3_ V化或其檢測(cè)方法、引物組、探針組、檢測(cè)試劑盒，也沒(méi)有給出啟示。另外，也沒(méi)有關(guān)于肺癌的 記載和啟示。
[0137]此外，JClinInvest. 2013February1 ;123(2) ;855_865,中報(bào)道了在膠質(zhì)母細(xì) 胞瘤中存在幾個(gè)具有癌化能力的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，但是該文獻(xiàn)為在公 開(kāi)了本發(fā)明的FGFR3-TACC3_vl及FGFR3-TACC3_v2的本申請(qǐng)最先的 優(yōu)先權(quán)日:（2012年3月 8日）、本申請(qǐng)第二 優(yōu)先權(quán)日:（2012年9月5日）及本申請(qǐng)第H 優(yōu)先權(quán)日:（2012年12月21 日）之后出版的文獻(xiàn)。在該文獻(xiàn)中，根本沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的FGFR3-TACC3_v3、FGFR3-TACC3_ v5a、及FGFR3-TACC3_v^或其檢測(cè)方法、引物組、探針組、檢測(cè)試劑盒，也沒(méi)有給出啟示。另 夕F，也沒(méi)有關(guān)于肺癌及膀脫癌的記載和啟示。
[013引發(fā)明效果
[0139] 本發(fā)明的檢測(cè)方法可用作檢測(cè)FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或FGFR3 和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的方法。另外，本發(fā)明的檢測(cè)方法 可用作檢測(cè)染色體重排的方法。另外，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，可鑒別是否為利用抑制本發(fā) 明的多膚的物質(zhì)的治療的適用對(duì)象。本發(fā)明的檢測(cè)用試劑盒、引物組及探針組可用于本發(fā) 明的檢測(cè)方法。另外，抑制本發(fā)明的多膚的物質(zhì)可用作FGFR3基因和TACC3基因的融合基 因陽(yáng)性或FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的治療用醫(yī)藥組合 物。

【具體實(shí)施方式】
[0140] <本發(fā)明的檢測(cè)方法〉
[0141] 本發(fā)明的檢測(cè)方法為檢測(cè)融合基因或融合蛋白的方法，該方法包含檢測(cè)從受試者 得到的試樣中的特定的多核巧酸或多膚的存在的步驟。作為從受試者得到的試樣，使用來(lái) 自受試者的采集物（從活體分離的試樣），具體而言，使用所采集的任意的組織、體液（優(yōu)選 血液）、肺泡或支氣管清洗液、活檢試樣、尿中癌細(xì)胞、姨試樣，優(yōu)選使用受試者的肺患部或 膀脫患部的活檢試樣或姨試樣?？蒞從試樣中提取基因組DNA來(lái)使用，另外，可W使用其轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物（將基因組轉(zhuǎn)錄及翻譯，結(jié)果產(chǎn)生的產(chǎn)物；例如mRNA、cDNA、蛋白質(zhì)）。特別優(yōu)選制備 并使用mRNA或cDNA。另外，可W使用對(duì)試樣進(jìn)行福爾馬林固定并包埋于石蠟中而穩(wěn)定化的 標(biāo)本（FFP巧。也可W使用將FFPE薄切片后的FFPE切片。如果使用FFPE切片，則可W直接 檢測(cè)其中存在的多核巧酸或多膚。
[0142] 在融合基因的檢測(cè)方法中的"檢測(cè)多核巧酸的存在的步驟"中，作為其檢測(cè)對(duì)象的 多核巧酸（W下稱為"檢測(cè)對(duì)象多核巧酸"）為"FGFR3基因和TACC3基因的融合基因"，其 為含有FGFR3基因的一部分和TACC3基因的一部分的基因。
[0143] 作為"FGFR3基因和TACC3基因的融合基因"，可列舉該樣的融合基因；其具有 編碼作為FGFR3的功能域之一的激酶區(qū)域的序列和編碼作為T(mén)ACC3的功能域之一的螺旋 卷曲區(qū)域的序列。作為引起癌癥的融合基因，已知有PTC-RET(Clin.CancerRes. 2009; 7119-7123)、KIF5B-ALK(Clin.CancerRes. 2009 ;3143-3149)、KIF5B-RET(Nature medicine2012;Feb12;Epub址eadofprint、P'JatMed. 2012Feb12:18(3) :375-7)、EML4-ALK(化化re2007 :561-566)等，該些融合基因?yàn)樵?'末端側(cè)具有螺旋卷曲區(qū)域的蛋 白質(zhì)的基因與在3'末端側(cè)缺損配體結(jié)合部位的激酶基因結(jié)合而成的融合基因，并且已知 的是如果強(qiáng)制地在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)，則引起轉(zhuǎn)化。例如，對(duì)于使不具有配體結(jié)合部位的 KI巧B-RET融合基因表達(dá)了的3T3細(xì)胞而言，引起第905位的酪氨酸自我磯酸化從而被活 化，其中該第905位的酪氨酸對(duì)配體非依賴性地RET激酶活化是重要的。已知該自我磯酸 化被作為RET抑制劑的Vandetanib抑制，引起細(xì)胞死亡（化1：11'6medicine2012;Feb12; 化ub址eadofprint、化tMed. 2012Feb12;18(3) ;375-7)。另外已知的是，對(duì)于使同樣 不具有配體結(jié)合部位的EML4-ALK融合基因內(nèi)源性地表達(dá)的細(xì)胞株而言，也會(huì)引起對(duì)于ALK 的激酶活性重要的第1604位的磯酸化，并且通過(guò)對(duì)ALK具有抑制活性的TAE684來(lái)抑制磯 酸化，從而抑制增殖（Clin.CancerRes. 2008:4275-4283)。此外，還教導(dǎo)了作為ALK激酶 抑制劑的化izotinib對(duì)于表達(dá)了EML4-ALK融合基因的肺癌患者是有效的治療藥值rug Des.Devel.Ther. 2011 ;471-485)。作為該些融合基因所編碼的融合蛋白的活化機(jī)制，教導(dǎo) 了通過(guò)經(jīng)由螺旋卷曲區(qū)域的均二聚化作用，引起融合的激酶區(qū)域的配體非依賴性地恒定的 活化。此外，還教導(dǎo)了通過(guò)使用融合的激酶的抑制劑，可由此抑制融合蛋白的功能。因此， 關(guān)于FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，也將FGFR3的激酶區(qū)域和TACC3的螺旋卷曲區(qū) 域推測(cè)為引起癌化的重要的區(qū)域。因此，作為上述"檢測(cè)對(duì)象多核巧酸"，例如可列舉具有該 樣的序列的多核巧酸：該序列編碼FGFR3基因和TACC3基因的融合基因當(dāng)中對(duì)應(yīng)于FGFR3 的激酶區(qū)域和TACC3的螺旋卷曲區(qū)域的序列，即編碼下述（1)?（3)中記載的多膚的多核 巧酸。在某種方案中，即使通過(guò)檢測(cè)該些區(qū)域內(nèi)的一部分，也可W對(duì)檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的存 在進(jìn)行檢測(cè)。
[0144] (1)含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、 序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨 基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤 形成能力的多膚[W下也稱為"同源多膚"];
[0145] (2)含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、 序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨 基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚；或者含有在序列 號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào) 461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所 示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有 腫瘤形成能力的多膚[W下也稱為"功能性等效變體多膚"];或者
[0146] (3)由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列構(gòu) 成的多膚。
[0147] 作為優(yōu)選的上述檢測(cè)對(duì)象多核巧酸，可列舉編碼下述（1)?（3)中記載的多膚的 多核巧酸。
[014引 （1)含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序 列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚；
[0149] (2)含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列， 并且具有腫瘤形成能力的多膚；或者含有在序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列 號(hào)28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并 且具有腫瘤形成能力的多膚；或者
[0150] (3)由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列構(gòu) 成的多膚。
[0151] 作為更優(yōu)選的上述檢測(cè)對(duì)象多核巧酸，可列舉由序列號(hào)1、序列號(hào)3、序列號(hào)5、序 列號(hào)25或序列號(hào)27所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸。
[0152] 由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸為由從FGFR3基因突變3佑enBank 注冊(cè)編號(hào)；NM_〇〇1163213. 1)的堿基編號(hào)257(與外顯子2的第一個(gè)甲硫氨酸對(duì)應(yīng)）到 2536(與外顯子18的3'末端對(duì)應(yīng)））和從TACC3基因（GenBank注冊(cè)編號(hào)；NM_006342. 1) 的堿基編號(hào)2050(與外顯子11的5'末端對(duì)應(yīng)）到2625(與外顯子16的終止密碼子對(duì)應(yīng)） 為止的堿基序列所構(gòu)成的多核巧酸。序列號(hào)1所示的堿基序列中，堿基編號(hào)1?2280的序 列源自FGFR3基因，堿基編號(hào)2281?2856的序列源自TACC3基因。將該融合多核巧酸稱為 FGFR3-TACC3_vl。序列號(hào)1的堿基編號(hào)1?2856為融合蛋白的開(kāi)放閱讀框（ORF)，該ORF 所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)2。
[0153] 由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸為由從FGFR3基因突變3佑enBank注 冊(cè)編號(hào)；NM_001163213. 1)的堿基編號(hào)257 (與外顯子2的第一甲硫氨酸對(duì)應(yīng)）到2536(與 外顯子18的3'末端對(duì)應(yīng)）和從TACC3基因佑enBank注冊(cè)編號(hào)；NM_006342. 1)的堿基編 號(hào)1945 (與外顯子10的5'末端對(duì)應(yīng)）到2625 (與外顯子16的終止密碼子對(duì)應(yīng)）為止的 堿基序列所構(gòu)成的多核巧酸。在序列號(hào)3所示的堿基序列中，堿基編號(hào)1?2280的序列 源自FGFR3基因，堿基編號(hào)2281?2961的序列源自TACC3基因。將該融合多核巧酸稱為 FGFR3-TACC3_v2。序列號(hào)3的堿基編號(hào)1?2961為融合蛋白的0RF，將該ORF所編碼的氨 基酸序列不于序列號(hào)4。
[0154] 由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸為由從FGFR3基因突變3佑enBank注 冊(cè)編號(hào)；NM_001163213. 1)的堿基編號(hào)257 (與外顯子2的第一甲硫氨酸對(duì)應(yīng)）到2624(與 外顯子19的中部對(duì)應(yīng)）和夾住TACC3基因佑enBank注冊(cè)編號(hào)；NM_006342. 1)的內(nèi)含子59 堿基并且從堿基編號(hào)2050 (與外顯子11的5'末端）到2625 (與外顯子16的終止密碼子對(duì) 應(yīng)）為止的堿基序列所構(gòu)成的多核巧酸。序列號(hào)5所示的堿基序列中，堿基編號(hào)1?2368 的序列源自FGFR3基因，堿基編號(hào)2369?2427的序列源自TACC3的基因組序列，堿基編號(hào) 2428?3003的序列源自TACC3基因。將該融合多核巧酸稱為FGFR3-TACC3_v3。序列號(hào)5 的堿基編號(hào)1?3003為融合蛋白的0RF，將該ORF所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)6。
[0155] 由序列號(hào)25所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸為由從FGFR3基因突變3佑enBank 注冊(cè)編號(hào)；NM_〇〇l163213. 1)的堿基編號(hào)257到2498(但是，第1980位不是C而是G)和從 TACC3基因佑enBank注冊(cè)編號(hào)；NM_006342. 1)的堿基編號(hào)1771到2672為止的堿基序列所 構(gòu)成的多核巧酸。序列號(hào)25所示的堿基序列中，堿基編號(hào)1?2242的序列源自FGFR3基 因，堿基編號(hào)2243?3144的序列源自TACC3基因。將該融合多核巧酸稱為FGFR3-TACC3_ v5a。序列號(hào)25的堿基編號(hào)1?3144為融合蛋白質(zhì)的0RF，將該ORF所編碼的氨基酸序列 示于序列號(hào)26。
[0156] 由序列號(hào)27所示的堿基序列構(gòu)成的多核巧酸為由從FGFR3基因突變3佑enBank 注冊(cè)編號(hào)；NM_〇〇1163213. I)的堿基編號(hào)257到2498和從TACC3基因佑enBank注冊(cè)編號(hào)：NM_006342. 1)的堿基編號(hào)1771到2672為止的堿基序列所構(gòu)成的多核巧酸。但是，一部分中 存在多核巧酸的缺失和插入。缺失的部分相當(dāng)于FGFR3基因（NM_001163213. 1)的第690位 到第701位（外顯子4的3'側(cè)的序列）。插入的部分相當(dāng)于FGFR3基因（NM_001163213. 1) 的第1528位和第1529位之間（外顯子10和外顯子11之間），插入有CAG該樣的序列。序 列號(hào)27所不的堿基序列中，堿基編號(hào)1?2233的序列源自FGFR3基因，堿基編號(hào)2234? 3135的序列源自TACC3基因。將該融合多核巧酸稱為FGFR3-TACC3_v^。序列號(hào)28的堿 基編號(hào)1?3135為融合蛋白的ORF，將該ORF所編碼的氨基酸序列示于序列號(hào)28。
[0157]將FGFR3-TACC3-V1、FGFR3-TACC3-V2、FGFR3-TACC3-V3、FGFR3-TACC3_v5a、 FGFR3-TACC3_v^統(tǒng)稱為FGFR3-TACC3融合多核巧酸。
[0158]作為其他方案中的所述檢測(cè)對(duì)象多核巧酸，可列舉：與序列號(hào)1的堿基編號(hào) 1381?2841對(duì)應(yīng)的FGFR3-TACC3_vl的部分序列、與序列號(hào)3的堿基編號(hào)1381?2946對(duì)應(yīng) 的FGFR3-TACC3_v2的部分序列、與序列號(hào)5的堿基編號(hào)1381?2988對(duì)應(yīng)的FGFR3-TACC3_ v3等。
[0159] 作為優(yōu)選的"同源多膚"，可列舉；"含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26 或序列號(hào)28所示的氨基酸序列的同源性為90%W上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能 力的多膚"，更優(yōu)選含有該同源性為95%W上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%W上的氨基酸序列的多 膚。
[0160] 作為優(yōu)選的"功能性等效變體多膚"，優(yōu)選"含有在序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序 列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或插入1?10個(gè)、優(yōu)選1?數(shù)個(gè)、 進(jìn)一步優(yōu)選1?7個(gè)、最優(yōu)選1?5個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力 的多膚"，特別優(yōu)選"含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基 酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚"。
[0161] 另夕F，本說(shuō)明書(shū)中的上述"同源性"是指：通過(guò)肥邸LEprogram(JMolBiol1970; 48:443-453)檢索，采用通過(guò)默認(rèn)值而準(zhǔn)備的參數(shù)所得到的值Identity。上述參數(shù)如下所 述。
[0162]Gappenalty= 10
[0163]Extendpenalty= 0. 5
[0164]Matrix=EMDSUM62
[0165] 某種多膚"具有腫瘤形成能力"可通過(guò)后述實(shí)施例8中記載的方法來(lái)確認(rèn)。具體 而言，可列舉將該融合基因?qū)氲絅IH3T3細(xì)胞中，使用球形板確認(rèn)銷(xiāo)定非依賴性細(xì)胞增殖 作用的方法。另外，也可W是將導(dǎo)入有該融合基因的細(xì)胞接種于裸鼠的皮下之后，觀察一定 期間，確認(rèn)腫瘤形成的方法。
[0166] 作為本發(fā)明檢測(cè)方法中的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸，優(yōu)選編碼"含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、 序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多膚"的多 核巧酸，最優(yōu)選編碼"由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸 序列構(gòu)成的多膚"的多核巧酸。
[0167] 本發(fā)明的融合基因檢測(cè)方法中的"檢測(cè)多核巧酸的存在的步驟"該樣實(shí)施；檢測(cè)從 受試者得到的試樣的基因組中的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸（含有融合點(diǎn)的基因組序列）的存在， 制備從受試者得到的試樣中所提取的基因組DM的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（例如mRM或cDNA)并檢測(cè) 與檢測(cè)對(duì)象多核巧酸對(duì)應(yīng)的mRNA或CDNA的存在，或者通過(guò)原位雜交檢測(cè)根據(jù)需要進(jìn)行了 前處理的從受試者所得到的試樣中的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的存在。
[0168] 基因組DNA的提取可通過(guò)公知的方法來(lái)進(jìn)行，可使用市售的DNA提取試劑盒來(lái)簡(jiǎn) 便地進(jìn)行。
[0169] 檢測(cè)步驟可根據(jù)公知的基因分析法（例如，作為基因檢測(cè)法常用的PCR、 LCR(Ligasechainreaction,連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、SDA(Stranddisplacement amplification,鏈置換擴(kuò)增）、NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification,基于 核酸序列的擴(kuò)增）、ICAN(Isothermalandchimericprimer-initiatedampli円cationof nucleicacids,等溫的和嵌合引物起始的核酸擴(kuò)增）、LAMP法（Loop-mediatedisothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增）、TMA法（Gen-Probe'sTMAsystem)、原位雜交（ISH)法、 W及微陣列等公知的方法）來(lái)實(shí)施。例如，利用W與檢測(cè)對(duì)象多核巧酸雜交的核酸作為探 針的雜交技術(shù)、或者W與檢測(cè)對(duì)象多核巧酸雜交的DNA作為引物的基因擴(kuò)增技術(shù)等。
[0170] 具體而言，使用源自從受試者得到的試樣的核酸（例如mRNA等）進(jìn)行測(cè)定。mRNA 量的測(cè)定采用W能夠特異性地?cái)U(kuò)增檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的方式所設(shè)計(jì)的引物并利用基因擴(kuò) 增反應(yīng)方法來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的檢測(cè)方法中所使用的引物、或者檢測(cè)用試劑盒中所含的引物 只要能夠特異性地?cái)U(kuò)增檢測(cè)對(duì)象多核巧酸即可，沒(méi)有特別限定，可基于檢測(cè)對(duì)象多核巧酸 的堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增監(jiān)測(cè)法中的引物設(shè)計(jì)可利用引物設(shè)計(jì)軟件（例如Primer Express; 7才3 ^FW^，厶《公司）等。另外，如果PCR產(chǎn)物的尺寸變大，則擴(kuò)增 效率變差，因此，適當(dāng)?shù)卦O(shè)定正義引物和反義引物使得WmRNA或CDNA作為對(duì)象擴(kuò)增時(shí)的擴(kuò) 增產(chǎn)物的大小為化bW下。
[017。 更具體而言，從源自FGFR3基因的部分（例如上述融合多核巧酸（特別是cDNA) 的FGFR3基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì)正義引物（5'-引物），由源自TACC3基因的部分 (例如上述融合多核巧酸（特別是cDNA)的TACC3基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì)反義引物 (3'-引物）。或者，也可WW與含有該融合多核巧酸的融合點(diǎn)（后述）的區(qū)域?qū)?yīng)的方式 來(lái)設(shè)計(jì)正義引物或反義引物的一者。優(yōu)選使用本發(fā)明的檢測(cè)用試劑盒中所含的引物組，進(jìn) 一步優(yōu)選使用本發(fā)明的檢測(cè)用試劑盒中最優(yōu)選含有的引物組。在PCR擴(kuò)增監(jiān)測(cè)法中，也可 W通過(guò)慘混與各基因?qū)?yīng)的上述正義引物來(lái)設(shè)計(jì)多重PCR(MultiplexPCR)，所述多重PCR 利用一種反應(yīng)液來(lái)測(cè)定全部的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸?？赏ㄟ^(guò)適于各擴(kuò)增技術(shù)的方法來(lái)確認(rèn)目 標(biāo)基因（整體或其特異性部分）是否被擴(kuò)增。例如，在PCR法中，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，并通過(guò)漠化己錠染色等確認(rèn)是否得到了目標(biāo)尺寸的擴(kuò)增片斷。當(dāng)?shù)玫搅?目標(biāo)尺寸的擴(kuò)增片斷時(shí)，在從受試者得到的試樣中存在檢測(cè)對(duì)象多核巧酸。由此可檢測(cè)出 檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的存在。
[0172] 作為本發(fā)明的融合基因的檢測(cè)方法，除了通過(guò)基因擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)從受試者得到的 試樣中的特定多核巧酸的存在的步驟W外，優(yōu)選還包括檢測(cè)是否得到了目標(biāo)尺寸的擴(kuò)增片 斷的步驟。
[0173] 利用雜交技術(shù)的檢測(cè)采用（例如）northern雜交、斑點(diǎn)雜交法、DNA微陣列法、RNA 保護(hù)法等來(lái)進(jìn)行。作為用于雜交的探針，可W使用含有在嚴(yán)格條件下（優(yōu)選更嚴(yán)格條件下） 與檢測(cè)對(duì)象多核巧酸或其互補(bǔ)鏈雜交的連續(xù)的至少32個(gè)堿基的核酸分子，即由W融合點(diǎn) 為中也在其上游及下游的各16個(gè)堿基所構(gòu)成的序列（具體而言，為序列號(hào)I所示的堿基序 列的第2265位?第2296位（第2280位/第2281位）、或序列號(hào)3所示的堿基序列的第 2265位?第2296位（第2280位/第2281位）、序列號(hào)5所示的堿基序列的第2353位? 第2384位（第2368位/第2369位）、序列號(hào)25所示的堿基序列的第2227位?第2258 位（第2242位/第2243位）、或序列號(hào)27所示的堿基序列的第2218位?第2249位（第 2233位/第2234位）。需要說(shuō)明的是，括號(hào)內(nèi)的堿基編號(hào)表示融合點(diǎn)。）、或含有它們的互 補(bǔ)鏈的探針。
[0174] 需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中的融合點(diǎn)是指源自FGFR3基因的部分和源自TACC3基 因的部分融合的點(diǎn)。
[01巧]利用原位雜交技術(shù)的檢測(cè)可W根據(jù)公知的FI甜法（化Sionassay,融合方法）來(lái) 實(shí)施?；蛘呖赏ㄟ^(guò)顯色原位雜交（CISH)法和銀染原位雜交（SISH)法組合的融合檢測(cè)方法 來(lái)頭施。
[0176] 利用原位雜交技術(shù)的檢測(cè)可根據(jù)公知的RNAFI甜法（J.Mol.Diagn. 2012 ;22-29) 來(lái)實(shí)施。更具體而言，從源自FGFR3基因的部分（例如，上述融合多核巧酸（mRNA)的FGFR3 基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，從源自TACC3基因的部分（例如，上述融合多核巧 酸（mRNA)的TACC3基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì)其他檢測(cè)探針。與從受試者得到的試樣 進(jìn)行該探針的雜交。接下來(lái)，進(jìn)行使信號(hào)放大的試劑的雜交，從而將信號(hào)放大。檢測(cè)源自 FGFR3基因的部分的信號(hào)和源自TACC3基因的部分的信號(hào)的信號(hào)重疊。通過(guò)區(qū)別檢測(cè)上述 由源自FGFR3基因的部分所設(shè)計(jì)的探針和由源自TACC3基因的部分所設(shè)計(jì)的探針的英光試 劑或發(fā)色試劑，可W觀察該來(lái)源不同的二種探針是否處于相同場(chǎng)所（同一分子內(nèi)）。通過(guò) 觀察到該二種探針處于相同場(chǎng)所（同一分子內(nèi)），可檢測(cè)出檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的存在。作 為用于放大信號(hào)的試劑，可W使用PreAmplifierMixQT(Affymetrix公司），AmplifierMix QT(Affymetrix公司）、LabelProbeMix(Affymetrix公司）、及LabelProbeDiluent QT(Affymetrix公司）。
[0177]另夕b本說(shuō)明書(shū)中的"嚴(yán)格條件"是指：作為用于雜交的條件，為"5XSSPE、 SXDenhar化'S液、0.5%十二焼基硫酸軸（sodiumdode巧1sulfate、SDS)、50% 甲醜胺、 200yg/mL娃魚(yú)精子DNA、42°C過(guò)夜"該樣的條件，作為用于清洗的條件，為"0. 5XSSC、 0. 1%SDS、42°C"該樣的條件。"更嚴(yán)格條件"是指；作為用于雜交的條件，為"5XSS陽(yáng)、 SXDenhar化'S液、0. 5%SDS、50%甲醜胺、200yg/mL娃魚(yú)精子DNA、42°C過(guò)夜"該樣的條 件，作為用于清洗的條件，為"0. 2XSSC、0. 1%SDS、65°C"該樣的條件。
[0178] 此外，可W利用RT-PCR等基因擴(kuò)增技術(shù)。對(duì)于RT-PCR法，通過(guò)在基因的擴(kuò)增過(guò)程 中使用PCR擴(kuò)增監(jiān)測(cè)（實(shí)時(shí)PCR)法佑enomeRes.，6(10)，986, 1996)，可對(duì)檢測(cè)對(duì)象多核巧 酸的存在進(jìn)一步進(jìn)行定量的分析。作為PCR擴(kuò)增監(jiān)測(cè)法，例如可W使用ABIPRISM7900( 7 古義，厶乂'公司）。實(shí)時(shí)PCR為公知的方法，市售有用于其的裝置及試劑盒， 可利用它們簡(jiǎn)便地進(jìn)行。
[0179] 本發(fā)明中的融合基因或融合蛋白的檢測(cè)可通過(guò)直接檢測(cè)從受試者得到的試樣中 的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸所編碼的多膚（W下稱為"檢測(cè)對(duì)象多膚"）的存在來(lái)實(shí)施。"FGFR3和 TACC3的融合蛋白"為檢測(cè)對(duì)象多核巧酸所編碼的多膚（即，檢測(cè)對(duì)象多膚）。檢測(cè)對(duì)象多 膚中，將由序列號(hào)2所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚稱為FGFR3-TACC3融合多膚VI，將由序 列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚稱為FGFR3-TACC3融合多膚v2,將由序列號(hào)6所示的 氨基酸序列構(gòu)成的多膚稱為FGFR3-TACC3融合多膚v3,將由序列號(hào)26所示的氨基酸序列 構(gòu)成的多膚稱為FGFR3-TACC3融合多膚v5a，將由序列號(hào)28所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚 稱為FGFR3-TACC3融合多膚V化。將FGFR3-TACC3融合多膚vl、FGFR3-TACC3融合多膚v2、 FGFR3-TACC3融合多膚v3、FGFR3-TACC3融合多膚v5a、FGFR3-TACC3融合多膚V化統(tǒng)稱為 FGFR3-TACC3 融合多膚（FGFR3-TACC3 融合蛋白）。
[0180] 例如，在對(duì)檢測(cè)對(duì)象多膚進(jìn)行檢測(cè)的步驟中，檢測(cè)也可W通過(guò)將免疫學(xué)測(cè)定法及 酶活性測(cè)定法組合后的方法等來(lái)實(shí)施，其中所述免疫學(xué)測(cè)定法通過(guò)制備源自從受試者得到 的試樣（例如從受試者得到的癌組織或細(xì)胞）的可溶化液，并將其中所含的檢測(cè)對(duì)象多膚 與相對(duì)于構(gòu)成融合多膚的各蛋白質(zhì)的抗體（例如，相對(duì)于FGFR3的抗體和相對(duì)于TACC3的 抗體）進(jìn)行組合來(lái)進(jìn)行。另外，也可W通過(guò)免疫組織染色技術(shù)來(lái)實(shí)施檢測(cè)，其中所述免疫組 織染色技術(shù)通過(guò)將進(jìn)行了適宜前處理（例如除去石蠟）的由某受試者得到的試樣（例如 FFPE切片）中所含的檢測(cè)對(duì)象多膚與構(gòu)成融合多膚的各蛋白質(zhì)的抗體（例如相對(duì)于FGFR3 的抗體和相對(duì)于TACC3的抗體）進(jìn)行組合來(lái)進(jìn)行。作為該些方法，可列舉：將特異性的單克 隆抗體或多克隆抗體用于檢測(cè)對(duì)象多膚的酶免疫測(cè)定法、雙抗體夾也化ISA法、英光免疫 測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、Western印跡法、免疫組織染色等方法。
[0181] 利用免疫組織染色技術(shù)的檢測(cè)可根據(jù)W-分子單位特異性地檢測(cè)目標(biāo)多膚的公 知的技術(shù)ProximityLigationAssay(^t-Met)Iods. 2006 ;995-1000)來(lái)實(shí)施。更具體而 言，使用識(shí)別上述融合多膚的源自FGFR3基因的部分的抗體和識(shí)別上述融合多膚的源自 TACC3基因的部分的抗體，并利用上述技術(shù)檢測(cè)該二個(gè)抗體識(shí)別同一分子，從而對(duì)檢測(cè)對(duì)象 多膚的存在進(jìn)行檢測(cè)。更具體而言，檢測(cè)可通過(guò)如下步驟實(shí)施；i)使識(shí)別所述融合多膚的 源自FGFR3基因的部分的抗體（一次抗體）及識(shí)別所述融合多膚的源自TACC3基因的部分 的抗體（一次抗體）與從受試者得到的試樣相接觸的步驟；ii)添加與該一次抗體分別結(jié) 合的并且連結(jié)有寡核巧酸的二次抗體的步驟；iii)添加溶液從而進(jìn)行連接反應(yīng)的步驟，其 中該溶液含有連結(jié)有該寡核巧酸的二次抗體所、與該二次抗體所連結(jié)的該寡核巧酸部分互 補(bǔ)的二種寡核巧酸、W及在它們接近時(shí)使其連接從而在該二次抗體間可形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的連 接酶；iv)沿所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使核酸伸長(zhǎng)的步驟；V)使能夠與伸長(zhǎng)的核酸雜交的經(jīng)標(biāo)記 的寡核巧酸探針雜交的步驟；Vi)檢測(cè)該標(biāo)記信號(hào)的步驟。作為某種方案，可W使用PLA探 針或DuolinkII試劑試劑盒W及DuolinkIIBri曲tfield試劑試劑盒（Olink公司）中 所含的試劑。
[0182] 在從由受試者得到的試樣中檢測(cè)出本發(fā)明檢測(cè)方法中的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸或檢 測(cè)對(duì)象多膚的情況下，該受試者為具有該多核巧酸或該多膚陽(yáng)性的癌的對(duì)象（患者），因此 成為通過(guò)抑制本發(fā)明多膚的物質(zhì)（在某種方案中為化合物AZD4547、化合物DovitiniKA 合物BGJ398或化合物L(fēng)Y2874455)進(jìn)行治療的適用對(duì)象。
[0183] <本發(fā)明的檢測(cè)用試劑盒、本發(fā)明的引物組、本發(fā)明的探針組〉
[0184] 含有本發(fā)明的引物組的檢測(cè)用試劑盒中至少含有W能夠特異性地?cái)U(kuò)增本發(fā)明檢 測(cè)方法中的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的方式所設(shè)計(jì)的正義引物及反義引物（也稱為引物組）。本 發(fā)明的引物組為起到檢測(cè)對(duì)象多核巧酸擴(kuò)增用的引物作用的多核巧酸組。
[0185] 本發(fā)明的引物組包括該樣的引物組，其含有根據(jù)源自FGFR3基因的部分設(shè)計(jì)的正 義引物W及根據(jù)源自TACC3基因的部分設(shè)計(jì)的反義引物，并且是用于檢測(cè)FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物組，其中，該反義引物由在嚴(yán)格條件下（優(yōu)選更嚴(yán)格條件下） 與"檢測(cè)對(duì)象多核巧酸"雜交的核酸分子（優(yōu)選至少16個(gè)堿基的核酸分子）構(gòu)成，該正義 引物由在嚴(yán)格條件下（優(yōu)選更嚴(yán)格條件下）與"檢測(cè)對(duì)象多核巧酸"的互補(bǔ)鏈雜交的核酸 分子（優(yōu)選至少16個(gè)堿基的核酸分子）構(gòu)成。
[0186] 在本發(fā)明的引物組中，也可WW與含有該融合多核巧酸的融合點(diǎn)（上述）的部分 對(duì)應(yīng)的方式來(lái)設(shè)計(jì)正義引物或反義引物的一者。
[0187] 作為本發(fā)明的引物組的具體的方案，可列舉選自由W下（1)?（5)構(gòu)成的組中的 引物組：
[018引 （1)由序列號(hào)1的堿基編號(hào)1到2280間任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸 構(gòu)成的正義引物W及由與序列號(hào)1的堿基編號(hào)2281到2856間任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿 基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成的反義引物的引物組；
[0189] (2)由序列號(hào)3的堿基編號(hào)1到2280間任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸 構(gòu)成的正義引物W及由與序列號(hào)3的堿基編號(hào)2281到2961間任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿 基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成的反義引物的引物組；
[0190] (3)由序列號(hào)5的堿基編號(hào)1到2368間任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸 構(gòu)成的正義引物W及由與序列號(hào)5的堿基編號(hào)2369到3003間任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿 基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成的反義引物的引物組；
[0191] (4)由序列號(hào)25的堿基編號(hào)1?2242中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸 構(gòu)成的正義引物W及由與序列號(hào)25的堿基編號(hào)2243?3144中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿 基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成的反義引物的引物組；
[0192] (5)由序列號(hào)27的堿基編號(hào)1?2233中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核巧酸 構(gòu)成的正義引物W及由與序列號(hào)27的堿基編號(hào)2234?3135中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿 基的寡核巧酸互補(bǔ)的寡核巧酸構(gòu)成的反義引物的引物組。
[0193] 在上述引物組中，優(yōu)選的是，正義引物和反義引物的選擇位置的間隔為化bW下， 或者由正義引物和反義引物擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為化bW下。
[0194] 另外，本發(fā)明的引物通常具有15?40個(gè)堿基、優(yōu)選具有16?24個(gè)堿基、進(jìn)一步 優(yōu)選具有18?24個(gè)堿基、特別優(yōu)選具有20?24個(gè)堿基的鏈長(zhǎng)。
[0195] 在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，本發(fā)明的引物組可用于檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的擴(kuò)增及檢 巧1|。另外，本發(fā)明的引物組中所含的各引物沒(méi)有特別限定，例如，可通過(guò)化學(xué)合成法來(lái)制造。
[0196] 含有本發(fā)明的探針組的檢測(cè)用試劑盒中至少含有W能夠特異性地與本發(fā)明檢測(cè) 方法中的檢測(cè)對(duì)象多核巧酸雜交的方式設(shè)計(jì)的、根據(jù)源自FGFR3基因的部分（例如，上述融 合多核巧酸（mRNA)的FGFR3基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì)的探針組W及根據(jù)源自TACC3 基因的部分（例如，上述融合多核巧酸（mRNA)的TACC3基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì)的探 針組（也稱為探針組），W及將雜交后的信號(hào)放大的試劑。該探針組為起到與檢測(cè)對(duì)象多核 巧酸雜交的探針組作用的多核巧酸的組。
[0197] 本發(fā)明的探針組包括該樣的探針組，該探針組含有根據(jù)源自FGFR3基因的部分 (例如上述融合多核巧酸（mRNA)的FGFR3基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì)的探針和根據(jù)源自 TACC3基因的部分（例如上述融合多核巧酸（mRNA)的TACC3基因區(qū)域內(nèi)的任意部分）設(shè)計(jì) 的探針，所述探針組用于檢測(cè)FGFR3基因和TACC3基因的融合基因，其中各探針由與"檢測(cè) 對(duì)象多核巧酸"雜交的核酸分子構(gòu)成。
[0198] 在某種方案中，各探針為分支DNA探針化ranchedDNAprobe)，基于序列信息的分 支DNA探針可W從Affymetrix公司獲得。
[0199] 作為本發(fā)明的探針組的具體的方案，可列舉選自由W下（1)?（3)構(gòu)成的組中的 探針組：
[0200] (1)探針組，其含有：多種由鄰接的探針對(duì)所構(gòu)成的探針組（優(yōu)選含有20種探針 組），其中該鄰接的探針對(duì)含有與序列號(hào)1的堿基編號(hào)1?2280中任意的連續(xù)的至少16 個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸；W及多種由鄰接的探針對(duì)所構(gòu)成的探針組（優(yōu)選含有20種探針 組），其中該鄰接的探針對(duì)含有與序列號(hào)1的堿基編號(hào)2281?2856中任意的連續(xù)的至少 16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸；
[0201] (2)探針組，其含有：多種由鄰接的探針對(duì)所構(gòu)成的探針組（優(yōu)選含有20種探針 組），其中該鄰接的探針對(duì)含有與序列號(hào)3的堿基編號(hào)1?2280中任意的連續(xù)的至少16 個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸；W及多種由鄰接的探針對(duì)所構(gòu)成的探針組（優(yōu)選含有20種探針 組），其中該鄰接的探針對(duì)含有與序列號(hào)3的堿基編號(hào)2281?2961中任意的連續(xù)的至少 16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸；
[0202] (3)探針組，其含有：多種由鄰接的探針對(duì)所構(gòu)成的探針組（優(yōu)選含有20種探針 組），其中該鄰接的探針對(duì)含有與序列號(hào)5的堿基編號(hào)1?2368中任意的連續(xù)的至少16 個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸；W及多種由鄰接的探針對(duì)所構(gòu)成的探針組（優(yōu)選含有20種探針 組），其中該鄰接的探針對(duì)含有與序列號(hào)5的堿基編號(hào)2369?3003中任意的連續(xù)的至少 16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核巧酸。
[0203] 在此，由鄰接的探針對(duì)所構(gòu)成的探針組多的情況下容易獲得信號(hào)，故優(yōu)選。在某種 方案中，可使用20種左右。
[0204] 在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，本發(fā)明的探針組可用于檢測(cè)對(duì)象多核巧酸的檢測(cè)。另外， 本發(fā)明的探針組中所含的各探針沒(méi)有特別限定，例如可通過(guò)化學(xué)合成法來(lái)制造。
[0205] <本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌的治療用醫(yī)藥組合物〉
[0206] 從癌癥患者的檢體中分離鑒定的融合多核巧酸（實(shí)施例1?3)表現(xiàn)為癌的致病 基因（實(shí)施例8、實(shí)施例11)，在一部分肺癌或膀脫癌癥患者中檢測(cè)到融合多核巧酸的存在 (實(shí)施例4?6)。此外，基于本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的通過(guò)抑制本發(fā)明的多膚的活性和/或表達(dá) 來(lái)抑制銷(xiāo)定非依賴性細(xì)胞增殖（即顯示抗癌作用）該樣的新見(jiàn)解（實(shí)施例9、實(shí)施例12、實(shí) 施例13、實(shí)施例14、實(shí)施例16)可知，抑制本發(fā)明的多膚（抑制本發(fā)明的多膚的活性和/或 表達(dá)）的物質(zhì)具有治療本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌的效果。
[0207] 本發(fā)明中包括本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌的治療用醫(yī)藥組 合物，該醫(yī)藥組合物W抑制本發(fā)明的多膚的物質(zhì)（例如，通過(guò)任意一種篩選方法從后述的 醫(yī)藥組合物的有效成分所得到的物質(zhì)[例如雙鏈核酸（包含SiRNA)、蛋白質(zhì)（包含抗體或 抗體片斷）、膚、或除此W外的化合物])為有效成分。
[020引本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中的有效成分可通過(guò)對(duì)后述的醫(yī)藥組合物的有效成分進(jìn) 行篩選的方法來(lái)選擇。例如，可列舉后述的實(shí)施例9記載的化合物DovitiniMciinical CancerReserach2011 ;17:7451-7461 中記載的化合物、4-氨基-5-氣-3-[6-(4-甲基 脈嗦-I-基）-IH-苯并[d]咪哇-2-基]唾晰-2(I氨）-麗）、AZD4547 (W02008075068 實(shí)施例 154 和AACR2011,海報(bào) 3568;標(biāo)題；"CharacterizationOfAZD4547: Anorallybioavailable,potentandselectiveinhibitorofFGFRtyrosine kinasesl，2and3"中記載的化合物、N-{5-[2-化5-二甲氧基苯基）己基]-2H-化 哇-3-基} -4-[ (3R，5巧-3, 5-二甲基脈嗦-1-基]苯甲醜胺）、及BGJ398(Journal ofMedicinalChemistry2011 ;54;7066-7083 中記載的化合物、3-(2,6-二 氯-3,5-二甲氧基-苯基）-1-{6-[4-(4-己基-脈嗦-1-基）、實(shí)施例21中記載的 化合物L(fēng)Y2874455(W02010129509 實(shí)施例 1;MolCancerTher, 2011，10,2200-2210 ; (R)-似-2-{4-巧-{5-[1-(3, 5-二氯化巧-4-基）己氧基]-IH-日引哇-3-基}己帰 基]-IH-化哇-1-基}己醇）。另外，可列舉；制造例1?5、實(shí)施例29及實(shí)施例30中所 記載的化合物，即5- [ (2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N- {3-甲氧基-4- [4- (4-甲 基脈嗦-1-基）脈巧-1-基]苯基}嚼巧-2-胺（化合物A)、2-[4-({5-[化6-二 氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-IH-化哇-1-基]己醇（化合物B)、 (2時(shí)-3-[4-({5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-把-化 哇-1-基]丙焼-1,2-二醇（化合物C)、5-[化6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧 基]-N-[4-(4-甲基脈嗦-1-基）苯基]嚼巧-2-胺（化合物D)、5-[化6-二氣-3, 5-二 甲氧基予基）氧基]-N-U-甲基-5-[ (4-甲基脈嗦-1-基）甲基]-IH-化哇-3-基}嚼 巧-2-胺（化合物巧。
[0209] 另外，可W將從公知的具有FGFR3抑制活性的低分子化合物（FGFR3抑制劑）中通 過(guò)后述的篩選醫(yī)藥組合物的有效成分的方法所選出的化合物用作本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中 的有效成分。特別是可示出化合物AZD4547、化合物Dovitinib、化合物BGJ398及化合物 LY2874455。
[0210] 作為本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的有效成分所示出的雙鏈核酸由雙鏈的核酸（RNA或 DNA)部分和優(yōu)選為正義鏈及反義鏈的3'末端的突出（*一八'一八シク）構(gòu)成，并且衍生 RNAi。RNAi為進(jìn)化性保存的現(xiàn)象，經(jīng)由利用RNaseIII內(nèi)切酶產(chǎn)生的21?23個(gè)堿基的雙鏈 核酸而產(chǎn)生佑enesDev. 15, 485-490, 2001)。3'側(cè)的突出分別為1或2個(gè)堿基的任意的核 酸，但優(yōu)選為2個(gè)堿基。需要說(shuō)明的是，上述堿基數(shù)（21?23個(gè)堿基）為包含突出在內(nèi)的 正義鏈或反義鏈各自的堿基數(shù)。另外，正義鏈及反義鏈可W為相同的堿基數(shù)，也可W為不同 的堿基數(shù)，但優(yōu)選為相同的堿基數(shù)。
[021。 作為構(gòu)成雙鏈核酸的3'側(cè)突出的核糖核酸，例如可W使用U(尿嚼巧）、A(腺嘿 嶺）、G(鳥(niǎo)嘿嶺）、或C(胞嚼巧），并且作為構(gòu)成3'側(cè)的突出的脫氧核糖核酸，例如可W使 用dT(脫氧胸腺嚼巧）、dA(脫氧腺嘿嶺）、dG(脫氧鳥(niǎo)嘿嶺）、或dC(脫氧胞嚼巧）。
[0212] 可用作本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的有效成分的雙鏈核酸為該樣的雙鏈核酸：其雙鏈部 分基于序列號(hào)1、序列號(hào)3及序列號(hào)5中記載的堿基設(shè)計(jì)，并且具有抑制本發(fā)明的多膚表達(dá) 的活性。
[0213]W抑制本發(fā)明的多膚的物質(zhì)（例如，通過(guò)后述的醫(yī)藥組合物的有效成分篩選的方 法所得到的物質(zhì)[例如雙鏈核酸、蛋白質(zhì)（包含抗體或抗體片斷）、膚、或除此W外的化合 物])為有效成分的制劑，可W根據(jù)上述有效成分的類型，使用它們的制劑化中通常使用的 藥理學(xué)上容許的載體、賦形劑和/或其他添加劑來(lái)制備成醫(yī)藥組合物。
[0214] 作為給藥，例如可列舉：利用片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、細(xì)粒劑、散劑、或口服液 體制劑等的經(jīng)口給藥，或者利用靜脈注射（包含點(diǎn)滴）、肌肉注射、或者皮下注射等注射劑、 栓劑、經(jīng)皮給藥制劑、或膀脫內(nèi)注入或經(jīng)粘膜給藥制劑等的非經(jīng)口給藥。特別是對(duì)于在胃中 消化的膚來(lái)說(shuō)，優(yōu)選靜脈注射等非經(jīng)口給藥。
[0215] 在用于經(jīng)口給藥的固體組合物中，可W混合1種W上的活性物質(zhì)和至少一種惰性 的稀釋劑，例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纖維素、輕丙基纖維素、淀粉、聚己帰基化咯焼 麗、或偏娃酸鉛酸鎮(zhèn)等。根據(jù)常規(guī)方法，上述組合物可W含有除惰性稀釋劑W外的添加劑， 例如潤(rùn)滑劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、或者溶解劑或助溶劑等。片劑或丸劑可W根據(jù)需要用糖衣或 者胃溶性或腸溶性物質(zhì)等的膜包覆。
[0216] 用于經(jīng)口的液體組合物可W包括（例如）乳劑、溶液劑、混息劑、糖漿劑、或醜劑， 并且可W含有通常所使用的惰性的稀釋劑，例如精制水或己醇。上述組合物可W含有除惰 性稀釋劑W外的添加劑，例如濕潤(rùn)劑、混息劑、甜味劑、芳香劑、或防腐劑。
[0217] 作為用于非經(jīng)口的注射劑，可W包括無(wú)菌的水性或者非水性的溶液制劑、混息劑、 或乳劑。水溶性的溶液制劑或混息劑中可W含有（例如）注射用蒸觸水或生理鹽水等作為 稀釋劑。作為非水溶性的溶液制劑或混息劑的稀釋劑，例如可W包括丙二醇、聚己二醇、植 物油（例如橄攬油）、醇類（例如己醇）、或聚山梨醇醋80等。上述組合物可進(jìn)一步含有濕 潤(rùn)劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑、溶解劑或者助溶劑、或防腐劑等。上述組合物可利用（例如） 通過(guò)細(xì)菌截留濾器的過(guò)濾、配合殺菌劑、或照射來(lái)進(jìn)行無(wú)菌化。另外，在制造無(wú)菌的固體組 合物并使用時(shí)，也可W溶解于無(wú)菌水或其他無(wú)菌用注射用介質(zhì)中來(lái)使用。
[021引給藥量可考慮有效成分（即通過(guò)醫(yī)藥組合物的有效成分的篩選方法所得到的物 質(zhì)）的活性強(qiáng)弱、癥狀、給藥對(duì)象的年齡、或性別等來(lái)適宜確定。優(yōu)選的是，腫瘤附近的血中 濃度或腫瘤內(nèi)濃度為藥劑能夠50 %抑制本發(fā)明的多膚的活性或表達(dá)時(shí)的濃度的3?30倍、 例如10倍該樣的量，并且給藥量可根據(jù)途徑而算出。例如，在經(jīng)口給藥的情況下，通常對(duì)于 成人（W體重60kg計(jì)）來(lái)說(shuō)其給藥量每天約為0. 1?lOOmg，優(yōu)選0. 1?50mg。在非經(jīng)口 給藥的情況下，對(duì)于注射劑的形態(tài)而言，每天為0.Ol?50mg，優(yōu)選為0.Ol?IOmgD
[0219] 本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的治療對(duì)象為檢測(cè)到本發(fā)明的多核巧酸和/或本發(fā)明的多 膚的存在的受試者（即，本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌癥患者）。因本發(fā) 明的多核巧酸而癌化的細(xì)胞被抑制本發(fā)明的多膚的物質(zhì)殺滅，因此，抑制本發(fā)明的多膚的 物質(zhì)成為本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或膀脫癌）的有效 治療劑。
[0220] W下示出化合物A、化合物B、化合物C、化合物D、及化合物E的制造方法。需要說(shuō) 明的是，在本文中，"ESI+"表示質(zhì)量分析中的m/z值（離子化法ESI、(M+H)+) ,"APCI/ESI+" 表示質(zhì)量分析中的m/z值（同時(shí)測(cè)定離子化法APCI和ESI、(M+H)+) ,"NMRl"表示二甲基亞 諷-de中Ih-NMR的 5 (卵m)，"NMR2"表示CDCls中的Ih-NMR的 5 (卵m)。
[0221] 制造例1化合物A的制造
[022引 （1)將3, 5-二甲氧基苯甲酸甲醋（Ig)和己膳（20mL)的混合物冰冷卻，加入 N-氣-N' -(氯甲基）H己二胺雙（四氣測(cè)酸鹽）（4. 09g)，在室溫下徹夜攬拌。向反應(yīng)混合 物中加入飽和碳酸氨軸水，用醋酸己醋萃取。有機(jī)層用飽和食鹽水清洗后，加入無(wú)水硫酸軸 及堿性娃膠，攬拌30分鐘后過(guò)濾。將濾液減壓濃縮后，將殘?jiān)猛弈z柱層析（醋酸己醋/ 己焼）精制，得到2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基苯甲酸甲醋（292mg)。
[0223] ESI+ :233.
[0224] 似將2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基苯甲酸甲醋（IOg)和四氨巧喃（50血）的混合物 冰冷卻，加入測(cè)氨化裡（3.OM四氨巧喃溶液，43mL)后，在室溫下攬拌65小時(shí)。將反應(yīng)混合 物再次冰冷卻，再加入測(cè)氨化裡（3.OM四氨巧喃溶液，14mL)，在室溫下攬拌22小時(shí)。將反 應(yīng)混合物冰冷卻，緩慢地加入到冰水（300mL)中。再緩慢地加入濃鹽酸（25mL)，在室溫下攬 拌1小時(shí)。用甲苯/醋酸己醋（1 ;1)萃取，將有機(jī)層用飽和碳酸氨軸水W及飽和食鹽水清 洗后，用無(wú)水硫酸軸干燥并過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，得到（2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基苯基） 甲醇（8. 67g)。
[0225] ESI+ :205.
[0226] (3)將化6-二氣-3,5-二甲氧基苯基）甲醇a.71g)、H己胺化57血）及四氨 巧喃（34mL)的混合物冰冷卻，加入甲賴醜氯（716UL)后，攬拌1小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加 入水，用醋酸己醋萃取。將有機(jī)層用飽和食鹽水清洗，用無(wú)水硫酸軸干燥后過(guò)濾。將濾液減 壓濃縮，得到2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基甲賴酸醋（2. 32g)。
[0227]NMR2 ;3. 04 (3H,S)、3. 88 化H,S)、5.：34 (2H,S)、6.72 (1H,t, J =8. 2Hz).
[022引（4)在2-氯-5-輕基嚼巧（4.38g)、碳酸鐘化27g)及N，N-二甲基甲醜胺 (79血）的混合物中加入2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基甲賴酸醋（7. 89g)，之后在6(TC下攬拌1小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加入水，濾取所產(chǎn)生的固體，用水清洗后，減壓干燥，得到 2-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧巧.53g)。
[0229] APCI/ESI+ :317.
[0230] (5)在氮?dú)夥障拢谑覝叵孪?-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基] 嚼巧（l.〇3g)、3-甲氧基-4-[4-(4-甲基脈嗦-1-基）脈巧-1-基]苯胺（1.29g)、l，r-聯(lián) 蔡-2, 2' -二基雙（二苯基麟H609mg)、碳酸飽化19g)及二嗯焼（20. 6血）的混合物中 加入醋酸把（146mg)，在IOOC下攬拌4小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。 將有機(jī)層用飽和食鹽水清洗，用無(wú)水硫酸鎮(zhèn)干燥后過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，將殘?jiān)猛弈z 柱層析（氯仿/甲醇/濃氨水）精制、接著用堿性娃膠柱層析（醋酸己醋）精制后，用醋 酸己醋、接著用己醇重結(jié)晶，得到5-[(2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N-{3-甲氧 基-4-[4-(4-甲基脈嗦-1-基）脈巧-1-基]苯基}嚼巧-2-胺（化合物A ;830mg)。 [023。ESI+:585.
[023引醒Rl :1.45-1. 60 (2H，m)、1.73-1. 84 (2H，m)、2. 14 (3H，s)、2. 17-2. 58 (llH，m)、 3. 24-3. 36 (2H, m)、3. 75(3H, s)、3. 87(6H, s)、5. 16(2H, s)、6. 79(1H，d, J = 8. 8Hz)、7.07(lH，t，J = 8.4Hz)、7.24(lH，dd，J = 8.8、2.4Hz)、7. 32(lH，d，J = 2. 4Hz)、 8. 29(2H, s)、9. 21(1H, s).
[0233] 制造例2化合物B的制造
[0234] (I)在氮?dú)夥障?，在室溫下向通過(guò)與制造例1(4)同樣的方法所制造的 2-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧巧OOmg)、2-(4-氨基-IH-化 哇-1-基）己醇化42mg)、1，1' -聯(lián)蔡-2, 2' -二基雙（二苯基麟）（472mg)、碳酸飽（2. 47g) 及二嗯焼（16mL)的混合物中加入醋酸把（113mg)，在lOCrC下攬拌6小時(shí)。在反應(yīng)混合物 中加入水和氯仿，通過(guò)娃藻±過(guò)濾濾除不溶物后，利用氯仿對(duì)濾液進(jìn)行萃取。有機(jī)層用飽 和食鹽水清洗，用無(wú)水硫酸鎮(zhèn)干燥后過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，將殘?jiān)猛弈z柱層析（氯仿 /甲醇）精制，得到2-[4-(巧-[化6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨 基）-IH-化哇-1-基]己醇（化合物B; 139mg)。
[0235]ESI+ :408.
[023引 醒Rl;3. 69(2H,dd,J=11. 0、5. 6Hz)、3. 87 化H,S)、4. 07(2H,t,J=5. 6Hz)、 4. 83(lH，t，J= 5. 4Hz)、5. 14(2H，s)、7. 07(lH，t，J= 8. 4Hz)、7. 45(lH，d，J= 0. 6Hz)、 7. 88 (IH,d,J= 0. 6Hz)、8. 26 (2Hs)、9. 20 (IH,s)。
[0237] 制造例3化合物C的制造
[023引 （1)在氮?dú)夥障?，在室溫下向通過(guò)與制造例1 (4)同樣的方法制造的 2-氯-5-[化6-二氯-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧（1.33g)、l-(四氨-2H-化 喃-2-基）-lH-化哇-4-胺巧13mg)、1，1' -聯(lián)蔡-2, 2' -二基雙（二苯基麟）（785mg)、碳 酸飽（4.Ilg)及二嗯焼（26. 6mL)的混合物中加入醋酸把（189mg)，在IOOC下攬拌4小時(shí)。 在反應(yīng)混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。有機(jī)層用飽和食鹽水清洗，用無(wú)水硫酸軸干燥后 過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，將殘?jiān)猛弈z柱層析（醋酸己醋/己焼）精制，得到5-[(2, 6-二 氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-[l-(四氨-2H-化喃-2-基）-lH-化哇-4-基]嚼 巧-2-胺（1.73g)。
[023引 APCI/ESI+ :448.
[0240] 似在5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N-[l-(四氨-2H-化 喃-2-基）-IH-化哇-4-基]嚼巧-2-胺化59g)及甲醇（20血）的混合物中加入4M氯化氨 /二嗯焼溶液（40mL)，在室溫下攬拌6小時(shí)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮后，在殘?jiān)屑尤腼柡?碳酸氨軸水。濾取所產(chǎn)生的固體，用二己離清洗后，減壓干燥，得到5-[(2,6-二氣-3, 5-二 甲氧基予基）氧基]-N-(1H-化哇-4-基）嚼巧-2-胺（2. 9g)。
[024"APCI/ESI+:364.
[024引 做在5-[化6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-QH-化哇-4-基）嚼 巧-2-胺巧Omg)、碳酸鐘巧7mg)及N,N-二甲基甲醜胺（ImL)的混合物中加入4-甲基苯 賴酸[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基]甲醋（118mg)，在6(TC下攬拌1小時(shí)，然 后在Iicrc下攬拌4天。在反應(yīng)混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。有機(jī)層用飽和食鹽水 清洗，用無(wú)水硫酸鎮(zhèn)干燥后過(guò)濾。將濾液減壓濃縮后，將得到的殘?jiān)猛弈z柱層析（醋酸己 醋/己焼）精制，得到5- [ (2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N- (1- {[ (4R) -2, 2-二 甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基} -IH-化哇-4-基）嚼巧-2-胺（39mg)。
[024引APCI/ESI+ :478.
[0244] (4)在5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-a-{[(4R)-2,2-二甲 基-1，3-二氧戊環(huán)-4-基]甲基} -IH-化哇-4-基）嚼巧-2-胺（45mg)及四氨巧喃（2mL) 的混合物中加入IM鹽酸（ImL),在5(TC下攬拌3小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加入飽和碳酸氨軸 水，用氯仿萃取。有機(jī)層用飽和食鹽水清洗，用無(wú)水硫酸軸干燥后過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，將 殘?jiān)猛弈z柱層析（氯仿/甲醇）精制后，用醋酸己醋固化，得到（2時(shí)-3-[4-({5-[(2,6-二 氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-IH-化哇-1-基]丙焼-1,2-二醇 (化合物C;25mg)。
[024引 ESI+ :438.
[0246] NMRl ;3. 23-3. 38(2H，m)、3. 72-3. 80(lH，m)、3. 84-3. 96(7H，m)、4. 15(lH，dd，J = 13. 8、4. IHz)、4. 67 (IH, t, J = 5.細(xì)z)、4. 91 (IH, d, J = 5. 3Hz)、5. 14 (2H, s)、7. 06 (IH, t, J = 8. 4Hz)、7. 45 (IH, d, J = 0. 6Hz)、7. 87 (IH, d, J = 0. 6Hz)、8. 26 (2H, s)、9. 21 (IH, s)。
[0247] 制造例4化合物D的制造
[024引（1)與制造例1(5)同樣地將4-(4-甲基脈嗦-1-基）苯胺、W及通過(guò)與制造例 1 (4)同樣的方法制造的2-氯-5-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧用作原料， 得到5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-[4-(4-甲基脈嗦-l-基）苯基]嚼 巧-2-胺（化合物D)。
[024引 ESI+ :472.
[0250]匪Rl :2. 21 (3H, S)、2. 41-2. 48 (4H, m)、2. 98-3. 08 (4H, m)、3. 87 (6H, S)、5. 15 (2H, S)、6. 81-6. 90 (2H, m)、7. 07 (1H, t, J = 8. 4Hz)、7. 47-7. 55 (2H, m)、8. 26 (2H, S)、 9.15(1H,S)。
[0巧1] 制造例5化合物E的制造 郵閲（1)在（1-甲基-3-硝基-IH-化哇-5-基）甲醇（398mg)、3, 4-二氨-2H-化喃(459 uL)及醋酸己醋巧血）的混合物中加入對(duì)甲苯賴酸一水合物巧6mg)，在室溫下攬拌 1. 5小時(shí)。再加入3, 4-二氨-2H-化喃（459 y L)及對(duì)甲苯賴酸一水合物巧6mg)，在室溫下 攬拌1.5小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加入水，用醋酸己醋萃取。有機(jī)層用飽和食鹽水清洗，用無(wú) 水硫酸軸干燥后過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，然后將殘?jiān)猛弈z柱層析（己焼/醋酸己醋）精 制，得到1-甲基-3-硝基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇（487mg)。
[0巧引APCI/ESI+ :242.
[0254] (2)在氮?dú)夥障拢?-甲基-3-硝基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲 基]-IH-化哇（487mg)、四氨巧喃（4. 9血）及己醇（4. 9血）的混合物中加入10%把-碳 巧Omg)。在氨氣氛下攬拌12小時(shí)后，通過(guò)娃藻±過(guò)濾除去不溶物。將濾液減壓濃縮，得到 1-甲基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇-3-胺（426mg)。
[0巧引APCI/ESI+ :212.
[0256] (3)與制造例3(1)同樣地將1-甲基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲 基]-IH-化哇-3-胺、W及通過(guò)與制造例1(4)同樣的方法制造的2-氯-5-[化6-二 氯-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧用作原料，得到5-[(2, 6-二氣-3, 5-二甲氧基予基） 氧基]-N- {1-甲基-5-[(四氨-2H-化喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇-3-基}嚼巧-2-胺。 [0巧7] APCI/ESI+ :492.
[0巧引 （4)在5-[(2,6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]-N-U-甲基-5-[(四氨-2H-化 喃-2-基氧基）甲基]-IH-化哇-3-基}嚼巧-2-胺（706mg)和甲醇巧血）的混合物中加 入4M氯化氨/二嗯焼溶液巧血)，在室溫下攬拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮后，在殘 渣中加入飽和碳酸氨軸水，用氯仿萃取。有機(jī)層用無(wú)水硫酸軸干燥后過(guò)濾。將殘?jiān)猛弈z 柱層析（醋酸己醋/己焼）精制，獲得3-({5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]嚼 巧-2-基}氨基）-1-甲基-IH-化哇-5-基]甲醇（444mg)。
[0巧引ESI+ :408.
[0260] (5)將巧-(巧-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-1-甲 基-IH-化哇-5-基]甲醇（350mg)、H己胺（359 uL)、二氯甲焼（7血）及四氨巧喃（7血） 的混合物冰冷卻，加入甲賴醜氯（120yL)后，在室溫下攬拌3小時(shí)。向反應(yīng)混合物中加入 水及醋酸己醋，濾取所產(chǎn)生的固體后，減壓干燥，得到甲賴酸巧-(巧-[化6-二氣-3, 5-二 甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨基）-1-甲基-IH-化哇-5-基]甲醋（218mg)。
[026。NMR2 ;2. 96 (3H,S)、3. 85 (3H,S)、3. 89 (6H,S)、5. 16 (2H,S)、5. 25 (2H,S)、6.68(1H,t,J=8.OHz)、6. 91 (1H,S)、7. 63 (1H,brs)、8. 24 (2H,S).
[02間 做在甲賴酸巧-(巧-[化6-二氣-3, 5-二甲氧基予基）氧基]嚼巧-2-基}氨 基）-1-甲基-IH-化哇-5-基]甲醋（795mg)和N-甲基化咯焼麗（15. 9血）的混合物中加 入1-甲基脈嗦巧OlUL)，在8(TC下攬拌2小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加入水W及飽和碳酸氨 軸水，濾取所產(chǎn)生的固體后，將濾液用氯仿萃取。有機(jī)層用飽和食鹽水清洗，用無(wú)水硫酸軸 干燥后過(guò)濾。將濾液減壓濃縮，將殘?jiān)c之前濾取的固體合并后，利用娃膠柱層析（氯仿/ 甲醇）精制，接著利用堿性娃膠柱層析（醋酸己醋/甲醇）精制后，用己醇/二異丙離固化， 得到5-[(2,6-二氣-3,5-二甲氧基予基）氧基]-N-{l-甲基-5-[(4-甲基脈嗦-l-基） 甲基]-IH-化哇-3-基}嚼巧-2-胺（化合物E; 168mg)。
[026引 ESI+ :490.
[0264] 醒Rl;2. 14(3H，s)、2. 18-2. 53 巧H，m)、3.45(2H，s)、3.67(3H，s)、3.87WH，s)、 5. 15 (2H,S)、6. 46 (1H,S)、7. 06 (1H,t,J=8. 4Hz)、8. 26 (2H,S)、9. 42 (1H,S)。
[0265] <醫(yī)藥組合物的有效成分的篩選方法〉
[0266] 醫(yī)藥組合物的有效成分的篩選方法包括[1]抑制本發(fā)明的多膚的物質(zhì)的篩選方 法和[2]本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（優(yōu)選肺癌或膀脫癌）的治療劑 的篩選方法。
[0267] [1]抑制本發(fā)明的多膚（抑制本發(fā)明的多膚的活性和/或表達(dá)）的物質(zhì)的篩選方 法
[026引抑制本發(fā)明的多膚的物質(zhì)的篩選方法只要包括下述步驟（i)?（iii)即可，沒(méi)有 特別限定：
[0269] (i)使試驗(yàn)物質(zhì)與本發(fā)明的多膚或表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞接觸的步驟；
[0270] (ii)分析該多膚是否被抑制了的步驟；W及
[0271] (iii)選擇抑制該多膚的物質(zhì)的步驟。
[0272] 本篩選方法包括W下的方法。
[0273] (a)體外（invitro)型篩選方法；
[0274] 抑制本發(fā)明的多膚的活性的物質(zhì)篩選方法，其特征在于，包含；（1)使試驗(yàn)物質(zhì)與 本發(fā)明的多膚接觸的步驟；(2)分析該多膚的活性是否被抑制了的步驟；W及（3)選擇抑制 該多膚的活性的物質(zhì)的步驟。
[0275] 化）細(xì)胞型篩選方法；
[0276] 抑制本發(fā)明的多膚的活性的物質(zhì)篩選方法，其特征在于，包含；（1)使試驗(yàn)物質(zhì)與 表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞接觸的步驟；（2)分析該多膚的活性是否被抑制了的步驟；W及 (3)選擇抑制該多膚的活性的物質(zhì)的步驟。
[0277] (C)表達(dá)抑制型篩選方法
[027引抑制本發(fā)明的多膚的表達(dá)的物質(zhì)篩選方法，其特征在于，包含；（1)使試驗(yàn)物質(zhì)與 表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞接觸的步驟；（2)分析該多膚的表達(dá)是否被抑制了的步驟；W及 (3)選擇抑制該多膚的表達(dá)的物質(zhì)的步驟。
[0279] W下對(duì)各篩選方法進(jìn)行說(shuō)明。表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞包括天然表達(dá)本發(fā)明的多 膚的細(xì)胞、W及通過(guò)用含有本發(fā)明的多核巧酸的載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化從而表達(dá)了本發(fā)明的 多膚的細(xì)胞，但是作為表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)用含有本發(fā)明的多核巧酸的載 體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化從而使本發(fā)明的多膚得W表達(dá)的細(xì)胞。
[0280] (a)體外型篩選方法
[0281] 體外型篩選方法包括該樣的方法；在精制后的本發(fā)明的多膚中添加試驗(yàn)物質(zhì)使其 接觸（接觸步驟）、與未接觸試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)的本發(fā)明的多膚的活性進(jìn)行比較從而分析通過(guò)該 試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本發(fā)明的多膚的活性（分析步驟）、選擇抑制本發(fā)明的多膚的活性的 物質(zhì)（即本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（優(yōu)選肺癌或膀脫癌）的治療 劑）。
[0282] 具體而言，在醫(yī)藥組合物的有效成分的篩選方法中，各步驟（例如）可如下實(shí)施。 在精制后的本發(fā)明的多膚中添加試驗(yàn)物質(zhì)使其接觸后，添加ATP并測(cè)定該多膚的活性。作 為對(duì)照，使該精制后的多膚與試驗(yàn)物質(zhì)的溶劑（例如DMSO)混合接觸后，添加ATP并測(cè)定該 多膚的活性。作為背景對(duì)照，可W設(shè)定未添加ATP的條件。分析本發(fā)明的多膚的活性是否 通過(guò)試驗(yàn)物質(zhì)受到抑制。本發(fā)明的多膚的活性（即自我磯酸化活性）是否通過(guò)試驗(yàn)物質(zhì)受 到抑制，可通過(guò)分析由試驗(yàn)物質(zhì)引起的本發(fā)明的多膚的酪氨酸磯酸化水平的變化來(lái)判定。 目P，與添加（即接觸）溶劑對(duì)照時(shí)比較，在添加（即接觸）試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)本發(fā)明的多膚的活性 (即自我磯酸化活性）受到抑制的情況下，將該試驗(yàn)物質(zhì)選擇為抑制本發(fā)明的多膚的活性 的物質(zhì)（即本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（優(yōu)選肺癌或膀脫癌）的治療 劑）。在上述步驟中，在添加ATP之前添加膚基質(zhì)并混合、W及將相對(duì)于該膚基質(zhì)的磯酸化 活性作為本發(fā)明的多膚的活性進(jìn)行分析（即，通過(guò)分析由本發(fā)明的多膚引起的膚基質(zhì)的磯 酸化水平的變化來(lái)判定通過(guò)試驗(yàn)物質(zhì)本發(fā)明的多膚的活性是否受到抑制），除此W外，按照 與上述同樣的方式進(jìn)行的篩選方法也包含在本發(fā)明的體外型篩選方法中。在上述方法中， 將抑制50% W上活性時(shí)的濃度為10 y M W下、優(yōu)選為1 y M W下、進(jìn)一步優(yōu)選為0. 1 y M W下 的物質(zhì)選擇為抑制本發(fā)明的多膚的活性的物質(zhì)。例如，可W將實(shí)施例21的方法用作本發(fā)明 的體外型篩選方法。
[0283] 化）細(xì)胞型篩選方法
[0284] 細(xì)胞型篩選方法包括該樣的方法；將表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)混合 (即添加）使其接觸（接觸步驟）、與未接觸試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)的本發(fā)明的多膚的活性進(jìn)行比較從 而分析通過(guò)該試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本發(fā)明的多膚的活性（分析步驟）、選擇抑制本發(fā)明的 多膚的活性的物質(zhì)（即本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（優(yōu)選肺癌或膀脫 癌）的治療劑）。具體而言，例如可如下實(shí)施。
[02財(cái)首先，使表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)或溶劑對(duì)照（例如DMSO)分別接觸。 將細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后，使用將培養(yǎng)的細(xì)胞溶解而制備的細(xì)胞溶解液，通過(guò)使用了公知的 SDS電泳法及抗磯酸化FGFR3抗體（例如Cell Si即aling Technology公司）的免疫印跡 來(lái)測(cè)定本發(fā)明的多膚的活性（即自我磯酸化活性），由此分析通過(guò)試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本 發(fā)明的多膚的活性（即自我磯酸化活性）。通過(guò)試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本發(fā)明的多膚的活性， 可通過(guò)分析由試驗(yàn)物質(zhì)引起的本發(fā)明的多膚的酪氨酸磯酸化水平的變化來(lái)判定。目P，與添 加（即接觸）溶劑對(duì)照時(shí)進(jìn)行比較，在添加（即接觸）試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)抑制了本發(fā)明的多膚的 活性的情況下，選擇該試驗(yàn)物質(zhì)作為抑制本發(fā)明的多膚的活性的物質(zhì)（即本發(fā)明的多核巧 酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（優(yōu)選肺癌或膀脫癌）的治療劑）。
[0286] (C)表達(dá)抑制型篩選方法
[0287] 表達(dá)抑制型篩選方法包括該樣的方法；將表達(dá)本發(fā)明的多膚的細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)混 合（即添加）使其接觸（接觸步驟）、與未接觸試驗(yàn)物質(zhì)時(shí)的本發(fā)明的多膚的表達(dá)進(jìn)行比較 從而分析通過(guò)該試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本發(fā)明的多膚的表達(dá)（分析步驟）、選擇抑制本發(fā)明 的多膚的表達(dá)的物質(zhì)（即本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（特別是肺癌或 膀脫癌）的治療劑）。具體而言，例如可如下實(shí)施。
[028引使表達(dá)本發(fā)明的多膚的任意細(xì)胞與試驗(yàn)物質(zhì)或溶劑對(duì)照（例如DMSO)分別接觸。 培養(yǎng)后，制備細(xì)胞的提取物，接著，使用提取物分析通過(guò)試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本發(fā)明的多膚 的表達(dá)。是否抑制了本發(fā)明的多膚的表達(dá)可通過(guò)是否抑制了本發(fā)明的多膚的mRNA或蛋白 質(zhì)的表達(dá)來(lái)分析。更具體而言，通過(guò)公知的表達(dá)量分析方法、例如nodhern印跡法、定量的 PCR法或免疫印跡法、ELISA法等來(lái)鑒定存在于上述細(xì)胞提取液中的本發(fā)明的多膚的mRNA 或蛋白質(zhì)的量。通過(guò)試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本發(fā)明的多膚的表達(dá)可通過(guò)分析由試驗(yàn)物質(zhì)引起 的本發(fā)明的多膚的表達(dá)量的變化來(lái)判定。目P，與溶劑對(duì)照接觸時(shí)比較，在試驗(yàn)物質(zhì)接觸時(shí)本 發(fā)明的多膚的表達(dá)量（mRNA或蛋白質(zhì)量）降低的情況下，將該試驗(yàn)物質(zhì)選擇為抑制本發(fā)明 的多膚的表達(dá)的物質(zhì)（即本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（優(yōu)選肺癌或膀 脫癌）的治療劑）。
[0289] [2]本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌治療劑的篩選方法
[0290] 抑制本發(fā)明的多膚（抑制本發(fā)明的多膚的活性和/或表達(dá)）的物質(zhì)的篩選方法可 用作本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（優(yōu)選肺癌或膀脫癌）的治療劑的篩 選方法。目P，本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌的治療劑的篩選方法包括上 述[1]中抑制本發(fā)明的多膚的物質(zhì)的篩選方法中的i)、ii)及iii)。
[0291] 在本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌的治療劑的篩選方法中，優(yōu)選 還包括W下步驟：分析試驗(yàn)物質(zhì)是否抑制了本發(fā)明的多膚、并選擇抑制本發(fā)明的多膚的物 質(zhì)，然后確認(rèn)所選試驗(yàn)物質(zhì)具有本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（特別是 肺癌或膀脫癌）治療活性。
[0292] 確認(rèn)所選試驗(yàn)物質(zhì)具有本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌治療活 性的步驟；
[0293]作為確認(rèn)所選物質(zhì)具有本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（特別 是肺癌或膀脫癌）治療活性的步驟，可列舉實(shí)施公知的評(píng)價(jià)方法或其改良后的方法的步 驟，例如實(shí)施對(duì)表達(dá)了本發(fā)明的多膚的培養(yǎng)細(xì)胞或腫瘤模型動(dòng)物用所選物質(zhì)進(jìn)行處置并分 析的方法（臨床腫瘤學(xué)第二版、癌和化學(xué)療法公司）。
[0294]作為確認(rèn)所選物質(zhì)具有本發(fā)明的多核巧酸陽(yáng)性或本發(fā)明的多膚陽(yáng)性的癌（特別 是肺癌或膀脫癌）治療活性的步驟，優(yōu)選的是，（1)使用源自人類癌癥（特別是肺癌或膀脫 癌）的內(nèi)源性地表達(dá)本發(fā)明的多膚的癌細(xì)胞，確認(rèn)所選試驗(yàn)物質(zhì)具有該細(xì)胞的增殖抑制作 用和/或細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)作用的步驟、（2)確認(rèn)所選試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)表達(dá)了本發(fā)明的多膚的轉(zhuǎn)化 細(xì)胞的銷(xiāo)定非依存性增殖具有抑制作用的步驟、和/或（3)確認(rèn)所選試驗(yàn)物質(zhì)對(duì)將表達(dá)本 發(fā)明的多核巧酸的細(xì)胞接種于裸鼠而形成的腫瘤增殖具有抑制作用的步驟。
[0295] 在上述的使用裸鼠的方法中，可W使用將內(nèi)源性地表達(dá)本發(fā)明的多膚的癌細(xì)胞、 或通過(guò)本發(fā)明的多膚的表達(dá)而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞移植于皮下、皮內(nèi)、腹腔或各臟器而得到的腫瘤 模型動(dòng)物，即荷癌模型動(dòng)物（例如移植了NIH3T3細(xì)胞的裸鼠等，該NIH3T3細(xì)胞表達(dá)了本發(fā) 明的多膚）。
[0296] 作為醫(yī)藥組合物的有效成分的篩選方法中所使用的試驗(yàn)物質(zhì)，沒(méi)有特別限定，例 如可列舉市售的化合物（包括膚）、化學(xué)文件中所登記的各種公知化合物（包括膚）、通過(guò) 組合化學(xué)技術(shù)（N.Terrettetal.,DrugDiscov.Today, 4(1) :41,1999)得到的化合物組、 微生物的培養(yǎng)上清液、源自植物或海洋生物的天然成分、動(dòng)物組織提取物、雙鏈核酸、抗體 或抗體片斷、或者對(duì)通過(guò)醫(yī)藥組合物的有效成分的篩選法所選擇的化合物（包括膚）進(jìn)行 化學(xué)或生物學(xué)修飾后的化合物（包括膚）。
[0297] 實(shí)施例
[029引下面，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳述，但本發(fā)明并不受限于該實(shí)施例。另外，在沒(méi) 有特別說(shuō)明的情況下，可依據(jù)公知的方法進(jìn)行實(shí)施。另外，在使用市售的試劑或試劑盒等的 情況下，可根據(jù)市售品的指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行實(shí)施。
[0299] [實(shí)施例l]FGFR3-TACC3_vl的分離
[0300] 對(duì)于肺癌臨床檢體（美國(guó)7ス，3シK公司）200檢體，使用逆轉(zhuǎn)錄酶 (SuperScriptIII,Iifetechnologies公司）及隨機(jī)引物（隨機(jī)引物，Iifetechnologies公 司）并依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。
[0301] 接著，使用序列號(hào)7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列號(hào)8所示的FGFR3_TACC3_ RT_R的引物，W上述得到的cDNA為模板，使用DNA聚合酶（TaKaRaEx化9Jakara-Bio株 式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98C10砂、55°C15砂、68C1分鐘30砂進(jìn)行30次循環(huán)）。然后，W 10倍稀釋后的上述PCR產(chǎn)物為模板，使用序列號(hào)9所示的FGFR3_TACC3_nested_F及序列 號(hào)10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶進(jìn)行PCR(將98°C15 砂、55°C15砂、68°C1分鐘進(jìn)行30次循環(huán)）。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，結(jié)果僅在樣品Lg344 中得到約500個(gè)堿基對(duì)化P)的PCR產(chǎn)物。
[030引然后，通過(guò)雙脫氧測(cè)序法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列確定炬i曲yeTerminator v3.I切cleSequencingKit;lifetechnologies公司）。結(jié)果可知，約 500bp的PCR產(chǎn)物為 NCBI中所注冊(cè)的FGFR3基因（NMJ)Ol163213. 1)的編碼序列（W下CD巧的外顯子18的3' 末端與TACC3基因（NM_006342. 1)的CDS的外顯子11的5'末端融合的序列。
[0303] 對(duì)于源自扁平上皮肺癌患者肺癌組織的RNA(美國(guó)7義，3シF公司）Lg344檢 體RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄酶（SuperScriptIII、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物 (oligo(dT) 20引物、Iifetechnologies公司）并依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合 成cDNA。
[0304] 接著，使用序列號(hào)11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列號(hào)12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作為模板，使用DNA聚合酶 〇(OD-plus-Ver. 2 ;東洋紡織株式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98C15砂、6(TC15砂、68C3分鐘30 砂進(jìn)行25次循環(huán)）。然后，W10倍稀釋后的上述PCR產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列號(hào) 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引 物并使用相同的DNA聚合酶進(jìn)行PCR(將98°C15砂、55°C15砂、68°C3分鐘30砂進(jìn)行25 次循環(huán)）。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，結(jié)果得到約2. 9化P的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到克隆 載體（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。插入物通過(guò)雙脫氧測(cè)序法 來(lái)石角定序列炬igDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。 結(jié)果可知，在約2.她bp的PCR產(chǎn)物中，存在NCBI中所登記的FGFR3基因（NM_001163213.I) 的從CDS的5'末端到外顯子18的3'末端與TACC3基因（NM_006342. 1)的從CDS的外顯 子11的5'末端到CDS的3'末端融合的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（FGFR3-TACC3_vl)(序列號(hào)1)。將由序 列號(hào)1編碼的多膚示于序列號(hào)2。
[0305] 另外，為了將FGFR3-TACC3_vl的ORF全長(zhǎng)表達(dá)為蛋白質(zhì)，將上述克隆載體用限制 酶BamHI進(jìn)行37°C、3小時(shí)的酶反應(yīng)，從而對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制，再用 EcoRI進(jìn)行37C、3小時(shí)的酶反應(yīng)，從而對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制。將含有該 ORF的DNA片斷克隆到存在于表達(dá)載體（pMXs-puro;Cosmobio公司）的多克隆位點(diǎn)中的 BamHI及EcoRI位點(diǎn)中，從而構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒（FGFR3-TACC3_vl/pMXs-puro)。
[0306][實(shí)施例 2]FGFR3-TACC3_v2 的分離
[0307] 對(duì)于膀脫癌臨床檢體（美國(guó)7ス，3シF公司）59檢體，使用逆轉(zhuǎn)錄酶 (SuperScriptni、lifetechnologies公司）及隨機(jī)引物（隨機(jī)引物、Iifetechnologies公 司）并依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。
[030引接著，使用序列號(hào)7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列號(hào)8所示的FGFR3_TACC3_ 尺1'_1?的引物，W上述得到的cDNA作為模板，使用DNA聚合酶（TaKaRaExTaqJakara-Bio 株式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98C10砂、55C15砂、68C1分鐘30砂進(jìn)行30次循環(huán)）。然 后，W10倍稀釋后的上述PCR產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)9所示的FGFR3_TACC3_nested_F 及序列號(hào)10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶進(jìn)行PCR(將 98C15砂、55C15砂、68C1分鐘進(jìn)行30次循環(huán)）。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，結(jié)果可知，在 樣品Bdioe檢體中得到約6(K)bp的PCR產(chǎn)物。
[0309] 然后，通過(guò)雙脫氧測(cè)序法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列確定炬i曲ye Terminator v3. I切cle Sequencing Kit;lifetechnologies公司）。結(jié)果可知，約600bp的PCR產(chǎn)物為 NCBI中所注冊(cè)的FGFR3基因（NMJ)Ol 163213. 1)的CDS的外顯子18的3'末端與TACC3基 因（NM_006342. 1)的CDS的外顯子10的5'末端融合的序列。
[0310] 對(duì)于源自膀脫癌患者膀脫癌組織的RNA(美國(guó)7義，3シF公司）Bdioe檢 體RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄酶（SuperScriptlll、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物 (oligo(dT) 20引物、Iifetechnologies公司）并依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從 而合成cDNA。
[0311] 接著，使用序列號(hào)11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列號(hào)12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作為模板，使用DNA聚合酶 化OD-plus-Ver. 2 ;東洋紡織株式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98C15砂、6(TC15砂、68C3分30砂 進(jìn)行25次循環(huán)）。然后，W10倍稀釋后的上述PCR產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列號(hào) 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物 并使用相同的DNA聚合酶進(jìn)行PCR(將98C15砂、55C15砂、68C3分30砂進(jìn)行25次循 環(huán)）。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，結(jié)果可知得到約3. 0化P的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到克隆 載體（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。插入物通過(guò)雙脫氧測(cè)序法 來(lái)石角定序列炬igDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。 結(jié)果可知，在約3. 0化P的PCR產(chǎn)物中，存在NCBI中所注冊(cè)的FGFR3基因（NM_001163213.I) 的從CDS的5'末端到外顯子18的3'末端與TACC3 (NM_006342. 1)的從CDS的外顯子10 的5'末端到CDS的3'末端融合的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（FGFR3-TACC3_v2)(序列號(hào)3)。將由序列號(hào)3 編碼的多膚示于序列號(hào)4。
[0312]另外，為了將FGFR3-TACC3_v2的ORF全長(zhǎng)表達(dá)為蛋白質(zhì)，將上述克隆載體用限制 酶進(jìn)行37〇C、3小時(shí)的酶反應(yīng)，對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制，再用EcoRI進(jìn) 行37C、3小時(shí)的酶反應(yīng)，對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制。將含有該ORF的DNA片 斷克隆到存在于表達(dá)載體（pMXs-puro;Cosmobio公司）的多克隆位點(diǎn)中的BamHI及EcoRI 位點(diǎn)中，從而構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒（FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro)。
[031引[實(shí)施例3]FGFR3-TACC3_v3的分離
[0314] 對(duì)于膀脫癌臨床檢體（美國(guó)7ス，3シF公司）59檢體，使用逆轉(zhuǎn)錄酶 (SuperScriptni、lifetechnologies公司）及隨機(jī)引物（隨機(jī)引物、Iifetechnologies公 司）并依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而合成cDNA。
[0315] 接著，使用序列號(hào)7所示的FGFR3_TACC3_RT_F及序列號(hào)8所示的FGFR3_TACC3_ 尺1'_1?的引物，W上述得到的cDNA作為模板，使用DNA聚合酶（TaKaRaExTaqJakara-Bio 株式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98C10砂、55C15砂、68C1分鐘30砂進(jìn)行30次循環(huán)）。然后，W 10倍稀釋后的上述PCR產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)9所示的FGFR3_TACC3_nested_F及序列 號(hào)10所示的FGFR3_TACC3_nested_R的引物并使用相同的DNA聚合酶進(jìn)行PCR(將98C15 砂、55C15砂、68C1分鐘進(jìn)行30次循環(huán)）。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，結(jié)果可知在樣品B加21 檢體中得到約65化P的PCR產(chǎn)物。
[031引然后，通過(guò)雙脫氧測(cè)序法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列確定炬i曲ye Terminator v3. I切cle Sequencing Kit;lifetechnologies公司）。結(jié)果可知，約650bp的PCR產(chǎn)物為 NCBI中所注冊(cè)的FGFR3基因（NM_001163213. 1)的CDS的外顯子19的中間序列與TACC3基 因（NM_006342. 1)的內(nèi)含子10-11的一部分融合，再與TACC3基因的CDS的外顯子11的5' 末端融合的序列。
[0317]對(duì)于源自膀脫癌患者膀脫癌組織的RNA(美國(guó)7ス，3シF公司）B加21檢 體RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄酶（SuperScriptlll、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物 (oligo(dT) 20引物、Iifetechnologies公司）并依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合 成cDNA。 防31引接著，使用序列號(hào)11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列號(hào)12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作為模板，使用DNA聚合酶 〇(OD-plus-Ver. 2 ;東洋紡織株式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98°C15砂、60°C15砂、68°C3分鐘30 砂進(jìn)行25次循環(huán)）。然后，W10倍稀釋后的上述PCR產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列號(hào) 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引物 并使用相同的DNA聚合酶進(jìn)行PCR(將98C15砂、55C15砂、68C3分鐘30砂進(jìn)行25次 循環(huán)）。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，結(jié)果可知得到約3.0化P的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到克 隆載體（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。插入物通過(guò)雙脫氧測(cè)序 法石角定序列炬igDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。 結(jié)果可知，在約3. 0化P的PCR產(chǎn)物中，存在NCBI中所注冊(cè)的FGFR3基因（NM_001163213.I) 的從CDS的5'末端到外顯子19的中間序列與TACC3基因（NM_006342. 1)的內(nèi)含子10-11 的一部分融合，再與TACC3的從CDS的外顯子11的5'末端到CDS的3'末端融合的轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物（FGFR3-TACC3_v3)(序列號(hào)5)。將由序列號(hào)5編碼的多膚示于序列號(hào)6。
[0319] 另外，為了將FGFR3-TACC3_v3的ORF全長(zhǎng)表達(dá)為蛋白質(zhì)，將上述克隆載體用限制 酶進(jìn)行37〇C、3小時(shí)的酶反應(yīng)，對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制，再用EcoRI進(jìn) 行37C、3小時(shí)的酶反應(yīng)，對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制。將含有該ORF的DNA片 斷克隆到存在于表達(dá)載體（pMXs-puro;Cosmobio公司）的多克隆位點(diǎn)中的BamHI及EcoRI 位點(diǎn)中，從而構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒（FGFR3-TACC3_v3/pMXs-puro)。
[0320][實(shí)施例 4]FGFR3-TACC3_vl的檢測(cè)
[032。從源自肺癌臨床檢體的RNA(美國(guó)7義，3シF公司）200樣品制作cDNA，W cDNA作為基質(zhì)，W序列號(hào)15所示的FGFR3-TACC3 (F18T11)_qPCR_F及序列號(hào)16所示 的FGFR3-TACC3(F18Tll)_qPCR_R作為引物組，使用定量PCR試劑盒（PowerSYBRGreen PCRMasterMix;lifetechnologies公司），通過(guò)應(yīng)用生物系統(tǒng)7900HT系統(tǒng)進(jìn)行定量 PCR(95C10分鐘之后，將95C15砂、59C60砂進(jìn)行45次循環(huán)），測(cè)定基因表達(dá)量。結(jié)果，在 肺癌檢體中，僅在上述的樣品L的44中確認(rèn)到擴(kuò)增。另外，由源自膀脫癌臨床檢體的RNA(美 國(guó)7ス，3シF公司）59樣品制作cDNA，WCDNA作為基質(zhì)按同樣方式實(shí)施，結(jié)果從多個(gè)檢 體確認(rèn)到擴(kuò)增。
[032引[實(shí)施例5]FGFR3-TACC3_v2的檢測(cè)
[032引 由源自膀脫癌臨床檢體的RNA(美國(guó)7義，3シF公司）59樣品制作cDNA， WcDNA作為基質(zhì)，W序列號(hào)17所示的FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_F及序列號(hào)18所示 的FGFR3-TACC3(F18T10)_qPCR_R作為引物組，使用定量PCR試劑盒（PowerSYBRGreen PCRMasterMix;lifetechnologies公司），通過(guò)應(yīng)用生物系統(tǒng)7900HT系統(tǒng)進(jìn)行定量 PCR(95°C10分鐘之后，將95C15砂、59C60砂進(jìn)行45次循環(huán)），測(cè)定基因表達(dá)量。結(jié)果， 在膀脫癌檢體中，從多個(gè)檢體確認(rèn)到擴(kuò)增。
[0324][實(shí)施例 6]FGFR3-TACC3_v3 的檢測(cè)
[032引由源自膀脫癌臨床檢體的RNA(美國(guó)7義，3シF公司）59樣品制作cDNA，WcDNA作為基質(zhì)，W序列號(hào)19所示的FGFR3-TACC3(F19Tll)_qPCR_F及序列號(hào)20所示 的FGFR3-TACC3(F19Tll)_qPCR_R作為引物組，使用定量PCR試劑盒（PowerSYBRGreen PCRMasterMix;lifetechnologies公司），通過(guò)應(yīng)用生物系統(tǒng)7900HT系統(tǒng)進(jìn)行定量 PCR(95C10分鐘之后，將95C15砂、59C60砂進(jìn)行45次循環(huán)），測(cè)定基因表達(dá)量。結(jié)果， 在膀脫癌檢體中，從多個(gè)檢體確認(rèn)到擴(kuò)增。
[0326][實(shí)施例7]FGFR3-TACC3_vl的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒溶液的制作
[0327]使用FGFR3-TACC3_vl/pMXs-puro(實(shí)施例 1) 9yg、轉(zhuǎn)染試劑（FUGE肥（注冊(cè)商 標(biāo)）皿、Roche公司）對(duì)Platinum-E細(xì)胞實(shí)施轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，交換含有10%牛血清 (NICHIREIBI0SCIENCE公司）的D-MHM培養(yǎng)基值U化ecco'SModifiedEagleMedium培養(yǎng) 基；Invitrogen公司），進(jìn)一步采集24小時(shí)的培養(yǎng)基上清液，W制作逆轉(zhuǎn)錄酶病毒溶液。 [032引[實(shí)施例引FGFR3-TACC3_vl的銷(xiāo)定非依賴性增殖亢進(jìn)作用的研究
[0329] 在實(shí)施例7中的使用FGFR3-TACC3_vl/pMXs-puro制作的病毒溶液中W4yg/mL 的濃度添加化Iybrene任olybrene;SIGMA-ALDRICH公司）后，添加到NI冊(cè)T3細(xì)胞中使其感 染。添加6小時(shí)后，交換為含有10%牛血清（NICHIREIBI0SCIENCE公司）的D-MEM培養(yǎng)基， 感染1天后，交換為含有10 %牛血清（NICHIREIBI0SCIENCE公司）及1yg/mL的嘿嶺霉素 (SIGMA-ALDRICH公司）的D-MBl培養(yǎng)基（Invitrogen公司），在 5%C〇2存在下、在 37°C下 繼續(xù)培養(yǎng)4周，獲得穩(wěn)定表達(dá)FGFR3-TACC3_vl的NI冊(cè)T3細(xì)胞。（命名為FGFR3-TACC3_vl 表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞。）
[0330] 為了研究FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的銷(xiāo)定非依賴性增殖亢進(jìn)能力， 將FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及感染有作為空載體的pMXs-puro的NI冊(cè)T3細(xì)胞 (Mock/NI冊(cè)T3細(xì)胞）分別W每一個(gè)孔為IXIO3個(gè)的方式用含有10%牛血清（NICHIREI BIOSCIENCE公司）的D-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）接種到96孔球形板（Sumilon Cellti曲t Spheloi貼6U;住友Bakelite公司）中。在5%C〇2存在下、在37°C下培養(yǎng)后， 使用細(xì)胞數(shù)測(cè)定試劑（CEIXTITER-Glo? Luminescent Cell Vi油ility Assay ;Promega公 司）并依據(jù)手冊(cè)的方法測(cè)定次日值ayl)及四日后值ay4)的細(xì)胞數(shù)。檢測(cè)時(shí)使用了發(fā)光 測(cè)定裝置。從化yl到化y4為止，Mock/NI冊(cè)T3細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)未增加，與此相對(duì)，從 化yl到化y4為止，確認(rèn)到FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)增加約3. 1 倍。由上可知，F(xiàn)GFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞顯示銷(xiāo)定非依賴性細(xì)胞增殖。
[033。[實(shí)施例9]融合多膚抑制劑對(duì)于FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的銷(xiāo)定非依 賴性細(xì)胞增殖抑制作用
[0332] 銷(xiāo)定非依賴性細(xì)胞增殖的測(cè)定（菌落法等）已知作為研究化合物抗癌作用（藥理 效果）的體系（臨床腫瘤學(xué)第二版，癌和化學(xué)療法公司）。作為代替菌落法的測(cè)定細(xì)胞非粘 接性增殖的方法，有使用如上所述的球形板的方法。
[0333] 將FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞W每一個(gè)孔為lX103個(gè)的方式用含有10% 牛胎兒血清的DMEM培養(yǎng)基接種于96孔球形板（SumilonCellti曲tSpheloi貼6U;住友 Bakelite公司）中。另外，作為陽(yáng)性對(duì)照用，準(zhǔn)備了僅添加有培養(yǎng)基的孔。在5% (?存在 下、在37°C下培養(yǎng)一晚后，添加Dovitinib、AZD4547及BGJ398使最終濃度為lOOnM。作為 陰性對(duì)照，W與化合物添加時(shí)濃度（0. 1%)相同的方式添加化合物的溶劑即DMS0。然后，在 5%C〇2存在下、在37°C下培養(yǎng)4天，添加細(xì)胞數(shù)測(cè)定試劑（CellTiter-Glo?Luminescent CellVi油ilityAssay;Promega公司）并攬拌20分鐘后，使用發(fā)光測(cè)定裝置測(cè)定。將陽(yáng) 性對(duì)照、陰性對(duì)照的值分別設(shè)為100%抑制值、0%抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。結(jié) 果，Dovitinib、AZD4547 及BGJ398 的抑制 ％ 分別為 40 %、74 %、92 %。
[0334] W上的結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)GFR3-TACC3融合多膚的抑制劑能夠抑制表達(dá)FGFR3-TACC3_vl 的癌細(xì)胞或腫瘤的增殖。
[0335] 該說(shuō)明，可通過(guò)本發(fā)明的檢測(cè)方法辨別適用對(duì)象來(lái)實(shí)行定制醫(yī)療，其中，該適用對(duì) 象預(yù)期利用本發(fā)明的多膚抑制劑進(jìn)行治療是有效的。
[0336][實(shí)施例10]FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒溶液的制備
[0337]使用實(shí)施例2及3中制作的FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v3/ pMXs-puro并依據(jù)實(shí)施例7的方法制備逆轉(zhuǎn)錄酶病毒溶液。
[033引[實(shí)施例11]FGFR3-TACC3_v2及FGFR3-TACC3_v3的銷(xiāo)定非依賴性增殖亢進(jìn)作用的 研究
[0339]使用實(shí)施例 10 中的利用FGFR3-TACC3_v2/pMXs-puro及FGFR3-TACC3_v3/ pMXs-puro制備的病毒溶液，依據(jù)實(shí)施例8的方法獲得穩(wěn)定表達(dá)FGFR3-TACC3_v2及 FGFR3-TACC3_v3的NI冊(cè)T3細(xì)胞。（分別命名為FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及 FGFR3-TACC3_v3 表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞。）
[0340]為 了研究FGFR3-TACC3_v2 表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3 表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì) 胞的銷(xiāo)定非依賴性增殖亢進(jìn)能力，通過(guò)與實(shí)施例8同樣的方法進(jìn)行研究。從化yl到化y4 為止，Mock/NI冊(cè)T3細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)未增加，與此相對(duì)，從化yl到化y4為止，確認(rèn)到 FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)增加約2. 8倍。另外，從化yl到化y4 為止，確認(rèn)到FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)增加約2. 3倍。由上可知， FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞表現(xiàn)出銷(xiāo)定非依 賴性細(xì)胞增殖。
[034。[實(shí)施例12]本發(fā)明的多膚抑制劑對(duì)于FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及 FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NIH3T3細(xì)胞的銷(xiāo)定非依賴性細(xì)胞增殖抑制作用
[0342]通過(guò)與實(shí)施例9同樣的方法進(jìn)行FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及 FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞增殖抑制作用的評(píng)價(jià)。結(jié)果，Dovitinib、AZD4547及 BGJ398對(duì)FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的抑制％分別為21 %、60 %、90 %。另外， Dovitinib、AZD4547 及BGJ398 對(duì)FGFR3-TACC3_v3 表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞的抑制 ％分別為 32 %、 51%、87%。
[034引 W上結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)GFR3-TACC3融合多膚抑制劑能夠抑制表達(dá)FGFR3-TACC3_v2及 FGFR3-TACC3_v3的癌細(xì)胞或腫瘤的增殖。
[0344] 該說(shuō)明，可通過(guò)本發(fā)明的檢測(cè)方法辨別適用對(duì)象來(lái)實(shí)行定制醫(yī)療，其中，該適用對(duì) 象可預(yù)期利用FGFR3-TACC3融合多膚抑制劑進(jìn)行治療是有效的。
[0345][實(shí)施例13]FGFR3-TACC3融合多膚抑制劑對(duì)FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞、 FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞、FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的抗腫瘤試驗(yàn)
[0346] 將息浮于磯酸緩沖生理鹽水（Phosphatebufferedsaline、PB巧中的 FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞3XIO6個(gè)注射移植于4周歲的雄性cann.Cg-FoxnlNu/ 化Icrlj(Nu/Nu)裸鼠（日本化arlesRiver公司）的背部皮下。移植3天后，開(kāi)始給予作 為FGFR3-TACC3融合多膚抑制劑的AZD4547及BGJ398。溶劑組及化合物組W各4只到5只 進(jìn)行試驗(yàn)，將AZD4547及BGJ398息浮在0. 5%甲基纖維素（methylCELLULOSE、信越化學(xué)工 業(yè)株式會(huì)社）/99. 5%蒸觸水組成的溶劑中，分別經(jīng)口給藥30mg/kg。給藥在11天內(nèi)1天進(jìn) 行1次，從第二天開(kāi)始每3天測(cè)定體重及腫瘤直徑。使用下式計(jì)算腫瘤體積。
[0347][腫瘤體積（mm3)]=[腫瘤的長(zhǎng)徑（mm) ]X[腫瘤的短徑（mm) ] 2X0. 5
[034引將化合物給藥開(kāi)始日W及給藥結(jié)束日的溶劑組的腫瘤體積分別設(shè)為100%抑制、 0%抑制，算出AZD4547 及BGJ398 的抑制率。結(jié)果，AZD4547 及BGJ398 將FGFR3-TACC3_vl 表達(dá)/NIH3T3細(xì)胞（腫瘤）的增殖分別抑制了 51%、90%。
[0349]同樣地研究了對(duì)于FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的抗腫瘤作用。結(jié)果，AZD4547及BGJ398將FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì) 胞（腫瘤）的增殖分別抑制了61%及90%。另外，將FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞 (腫瘤）的增殖分別抑制了 73%及88%。
[0350][實(shí)施例14]通過(guò)FGFR3-TACC3融合多膚抑制劑給藥對(duì)FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞、FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞、FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞腫瘤 的激酶抑制作用
[0巧。除了下述W外，與實(shí)施例13同樣地觀察AZD4547及BGJ398的激酶抑制作用。移植FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞3XIO6個(gè)，在移植3天后開(kāi)始給予AZD4547及BGJ398。 溶劑組及化合物組各W5只進(jìn)行試驗(yàn)，在最終給藥4小時(shí)后解剖，摘出腫瘤。然后，使用溶 角軍液（CellLysisBuffer；CellSignalingTechnology公司、PhosphataseInhibitor Cocktail;ThermoScientific公司、Complete;Roche公司）迅速地制備腫瘤的蛋白質(zhì)提取 液，使用ELISA試劑盒（R&D公司）實(shí)施腫瘤內(nèi)的總FGFR3及磯酸化FGFR3的測(cè)定。ELISA依 據(jù)隨附的步驟書(shū)來(lái)實(shí)施，但是檢測(cè)改為利用化學(xué)發(fā)光試劑炬M化學(xué)發(fā)光化ISA基質(zhì)；Roche 公司）及發(fā)光測(cè)定裝置（ARVOferki址Imer公司）進(jìn)行的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
[0巧2] 將用總FGFR3值對(duì)磯酸化FGFR3值進(jìn)行修正后的值（磯酸化FGFR3/總FGFR3)設(shè) 為磯酸化水平，將溶劑組的磯酸化水平設(shè)為0%抑制、W絕對(duì)值0作為100%抑制，從而算出 各化合物組的酪氨酸自我磯酸化抑制率。結(jié)果，與溶劑組相比，AZD4547及BGJ398組中腫 瘤內(nèi)的FGFR3-TACC3融合多膚Vl的酪氨酸自我磯酸化分別減少了 58%、77%。
[0巧3] 對(duì)于FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞也 同樣地進(jìn)行了研究，結(jié)果，與溶劑組相比，AZD4547及BGJ398組中腫瘤內(nèi)的FGFR3-TACC3_v2 的酪氨酸自我磯酸化分別減少了 54%、66%。另外，腫瘤內(nèi)的FGFR3-TACC3_v3的酪氨酸自 我磯酸化分別減少了 78%、85%。
[0巧4] 由該些結(jié)果可確認(rèn)，上述動(dòng)物模型中的AZD4547及BGJ398的抗腫瘤作用是基于抑 制腫瘤內(nèi)的FGFR3-TACC3融合多膚的激酶活性的作用。
[0巧引[實(shí)施例切從源自膀脫癌患者的細(xì)胞株RT-112中分離FGFR3-TACC3_vl防356] 對(duì)于由源自膀脫癌患者的細(xì)胞株RT-112(從Leibniz-InstitutDSMZ-Deutsche SammlungvonMikroorganismenundZeHkulturenGmbH購(gòu)入）精制的RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄 酶（SuperScriptlll、Iifetechnologies公司）及oligo(dT)引物（oligo(dT) 20 引物、 Iifetechnologies公司）并依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。 防357] 接著，使用序列號(hào)11所示的FGFR3-TACC3_cloning_F及序列號(hào)12所示 的FGFR3-TACC3_cloning_R的引物，W上述得到的CDNA作為模板，使用DNA聚合酶 〇(OD-plus-Ver. 2 ;東洋紡織株式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98°C15砂、60°C15砂、68°C3分鐘30 砂進(jìn)行25次循環(huán)）。然后，W10倍稀釋后的上述PCR產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)13所示的 FGFR3_TACC3_cloning_BamHI_F及序列號(hào) 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的引 物并使用相同的DNA聚合酶進(jìn)行PCR(將98C15砂、55C15砂、68C3分30砂進(jìn)行25次 循環(huán)）。PCR反應(yīng)后，進(jìn)行電泳，結(jié)果得到約2. 9化P的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到克隆載 體（TOPOXLPCRCloningKit;lifetechnologies公司）中，通過(guò)雙脫氧測(cè)序法（Bi曲ye Terminatorv3. 1 切cleSequencingKit;lifetechnologies公司）確定插入物的序列，結(jié) 果可知，與NCBI中所注冊(cè)的FGFR3基因（NM_001163213. 1)的從CDS的5'末端到外顯子18 的3'末端和TACC3基因（NM_006342. 1)的從CDS的外顯子11的5'末端到CDS的3'末端 融合的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（FGFR3-TACC3_vl)(序列號(hào)1)相同。
[0巧引[實(shí)施例16]FGFR3-TACC3融合多膚抑制劑對(duì)源自膀脫癌患者的細(xì)胞株RT-112的 銷(xiāo)定非依賴性細(xì)胞增殖抑制作用
[0359] 將RT-112細(xì)胞W每一個(gè)孔為2XIO3個(gè)的方式用含有10 %牛胎兒血清的RPMI1640 培養(yǎng)基接種于96孔球形板（SumilonCellti曲tSpheloi貼6U;住友Bakelite公司）中。 另外，作為陽(yáng)性對(duì)照用，準(zhǔn)備了僅添加有培養(yǎng)基的孔。在5% (?存在下、在37C下培養(yǎng)一晚 后，分別添加Dovitinib、AZD4547及BGJ398使得最終濃度為lOOnM。作為陰性對(duì)照，W與化 合物添加時(shí)的濃度（0. 1% )相同的方式添加化合物的溶劑即DMS0。然后，在5% (?存在下、 在37°C下培養(yǎng)5天，添加細(xì)胞數(shù)測(cè)定試劑（CellTiter-Glo?LuminescentCellVi油ility Assay;Promega公司）并攬拌20分鐘后，使用發(fā)光測(cè)定裝置測(cè)定。將陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照 的值分別設(shè)為100%抑制值、0%抑制值，算出各化合物的增殖抑制％。結(jié)果，Dovitinib、 AZD4547 及BGJ398 的抑制 ％ 分別為 80 %、90 %、90 %。
[0360][實(shí)施例17]FGFR3-TACC3融合多膚的檢測(cè)
[036。 如下構(gòu)建檢測(cè)細(xì)胞中的FGFR3-TACC3融合多膚的方法。培養(yǎng)FGFR3-TACC3_vl 表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞W及作為陰性對(duì)照的NIH3T3細(xì)胞。用PBS清洗1次后，將細(xì)胞用溶 角軍液（CellLysisBuffer；CellSignalingTechnology公司、PhosphataseInhibitor Cocktail;ThermoScientific公司、Complete;Roche公司）在冰上溶解 10 分鐘。離也后 向得到的上清液中添加抗FGFR3抗體（SIGMA-ALDRICH公司），在4°C下反應(yīng)一晚。然后，添 加蛋白G微珠（ProteinGSe地aroseAhstFlow;GEHealthcare公司）并進(jìn)行 4 小時(shí) 免疫沈降。離也后用清洗液（組成與上述的溶解液相同）將沉降物清洗4次，添加SDS溶 液后煮沸5分鐘從而使沉淀物息浮。離也后對(duì)該上清液進(jìn)行了使用抗TACC3抗體巧and Dsystems公司）的免疫印跡。結(jié)果，在FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的免疫沈降物 中檢測(cè)到了FGFR3-TACC3融合多膚VI，但在NI冊(cè)T3細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到。對(duì)FGFR3-TACC3_ v2表達(dá)/NIH3T3細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NIH3T3細(xì)胞也同樣地進(jìn)行了研究，結(jié)果，在 FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的免疫沈降物中， 分別檢測(cè)到FGFR3-TACC3融合多膚v2及FGFR3-TACC3融合多膚v3。另外，還通過(guò)同樣的方 法對(duì)RT-112細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果檢測(cè)到FGFR3-TACC3融合多膚Vl。
[0362] 由W上的結(jié)果可知，通過(guò)組合使用抗FGFR3抗體及抗TACC3抗體，可檢測(cè)在表達(dá) FGFR3-TACC3融合多膚的癌細(xì)胞或癌組織中的本發(fā)明的多膚的存在，并且可判定本發(fā)明的 多膚陽(yáng)性的癌癥患者。
[0363][實(shí)施例1引利用原位雜交（ISH)法檢測(cè)FGFR3-TACC3_vl表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞、 FGFR3-TACC3_v2表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞的福爾馬林固定 石蠟包埋（FFP巧切片中的FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)
[0364]將FGFR3-TACC3_vl表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞、FGFR3-TACC3_v2 表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞或 FGFR3-TACC3_v3表達(dá)/NI冊(cè)T3細(xì)胞W3XIO6個(gè)移植于4周歲雄性裸鼠（CAnN.Cg-Foxnlnu/ 化1化Ij(nu/nu)、日本化arles化ver)的皮下，15天后，確認(rèn)細(xì)胞塊的增殖，從而制作荷癌 小鼠。
[0365] 從所制作的荷癌小鼠中切出含有增殖的癌細(xì)胞的組織，用生理鹽水清洗后，用 10%中性緩沖福爾馬林（SIGMA-ALDRICH公司）在室溫下固定48?144小時(shí)，使用自動(dòng)包 埋裝置（Tissue-TekVIP、SakuraFinetekJapan株式會(huì)社）依據(jù)常規(guī)方法脫水后，包埋于 石蠟（TissuePrep、株式會(huì)社化lma)中。將石蠟包埋后的組織樣品切成Sum厚的FF陽(yáng)切 片。
[0366] 將準(zhǔn)備的FF陽(yáng)切片在微量恒溫儀化eatblock) (MG-2200 ;東京理化器械株式會(huì) 社）上在6(TC下加熱15分鐘后，用10%福爾馬林（和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）在室溫下固定 30分鐘。用PBS(Invitrogen公司）清洗3次，完全干燥，用二甲苯（和光純藥工業(yè)株式會(huì) 社）在室溫下處理10分鐘。接著，將FF陽(yáng)切片用PBS清洗3次，用預(yù)處理液（Affymetrix 公司）在IOOC下煮沸10分鐘。進(jìn)而用精制水清洗2次，用PBS清洗1次，用蛋白酶溶液 (Affymetrix公司）在培養(yǎng)器化ybEZHybridizationSystem；AdvancedCellDiagnostics 公司）內(nèi)在4(TC下處理20分鐘。然后，用PBS清洗3次，用4%福爾馬林（和光純藥工業(yè) 株式會(huì)社）在室溫下固定5分鐘，用PBS清洗3次。將相對(duì)于FGFR3基因佑enBank注冊(cè) 編號(hào)；NM_000142. 3)的堿基序列中與全部突變共通的堿基編號(hào)2851?4281為特異性的 brance曲NA探針（QuantiGeneViewRNAProbeSetType4;Affymetrix公司）、W及相對(duì) 于TACC3基因（GenBank注冊(cè)編號(hào)；NM_006342. 1)的堿基序列中堿基編號(hào)2200?2838為 特異性的brancedDNA探針（QuantiGeneViewRNAProbeSetTypel;Affymetrix公司） 用ProbeSetDiluentQT(Affymetrix公司）稀釋 40 倍，制作ProbeSetSolution。將 本溶液添加至FFPE切片，在培養(yǎng)器內(nèi)在4(TC下反應(yīng)2小時(shí)，使其與多核巧酸（mRNA)雜 交。然后，將FFPE切片用WashBuffeHAffymetrix公司）清洗 3 次，用PreAmplifierMix QT(Affymetrix公司）在培養(yǎng)器內(nèi)在40°C下反應(yīng)25分鐘。進(jìn)而將FF陽(yáng)切片用WashBuffer 清洗3次，用AmplifierMixQT(Affymetrix公司）在培養(yǎng)器內(nèi)在40°C下反應(yīng)15分鐘。用 WashBuffer清洗3次，用含有25分之1容量的L油elProbeMix(Affymetrix公司）的 L油elProbeDiluentQT(Affymetrix公司）在細(xì)胞培養(yǎng)器內(nèi)在40°C下反應(yīng)30分鐘。接 著，用WashBuffer清洗2次，用PBS清洗1次，用含有英光色素DAPI(Affymetrix公司）的 PBS在室溫下反應(yīng)15分鐘。用PBS清洗2次后，用封入劑EcoMount(BiocareMedical公 司）封入，用共聚焦激光顯微鏡（LSM700;CarlZeiss公司）進(jìn)行英光觀察。FGFR3-TACC3_ Vl表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞、FGFR3-TACC3_v2 表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞及FGFR3-TACC3_v3 表達(dá) /NI冊(cè)T3 細(xì)胞的FFPE切片的任意一者中均檢測(cè)到FGFR3的信號(hào)及TACC3的信號(hào)，而且，F(xiàn)GFR3的信 號(hào)和TACC3的信號(hào)幾乎共位（共局在）。由此說(shuō)明，在含有強(qiáng)制地表達(dá)了FGFR3-TACC3融合 基因的細(xì)胞的FFPE切片中，F(xiàn)GFR3的信號(hào)和TACC3的信號(hào)共位。
[0367][實(shí)施例19]利用I甜法檢測(cè)RT-112細(xì)胞中的FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA) [036引按與實(shí)施例18同樣的步驟制作源自人膀脫癌患者的細(xì)胞株RT-112細(xì)胞及源自人 胃癌患者的細(xì)胞株服C-39細(xì)胞的FF陽(yáng)標(biāo)本，利用I甜法進(jìn)行FGFR3-TACC3融合多核巧酸 (mRNA)的檢巧IJ。采用實(shí)施例18中利用微量恒溫儀的處理之后的方法進(jìn)行處理，并英光觀察 封入后的標(biāo)本。利用INCellAnalyzer2000(GEHealthcare公司）對(duì)獲得的圖像進(jìn)行解 析，結(jié)果，在表達(dá)FGFR3-TACC3_vl的RT-112細(xì)胞（實(shí)施例15)的FF陽(yáng)切片中檢測(cè)到多個(gè) 共位的FGFR3的信號(hào)和TACC3的信號(hào)，與此相對(duì)，在通過(guò)實(shí)施例23記載的RT-PCR確認(rèn)到未 表達(dá)FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)的服C-39細(xì)胞的FF陽(yáng)切片中，幾乎未檢測(cè)到共位 的FGFR3的信號(hào)和TACC3的信號(hào)。由此說(shuō)明，在含有內(nèi)源性地表達(dá)FGFR3-TACC3融合基因 的細(xì)胞的FF陽(yáng)切片中，F(xiàn)GFR3的信號(hào)和TACC3的信號(hào)共位，而在未表達(dá)FGFR3-TACC3融合 基因的細(xì)胞中未共位，因此，通過(guò)測(cè)定該樣的共位信號(hào)，可W判定有無(wú)FGFR3-TACC3融合基 因。
[036引[實(shí)施例20]利用I細(xì)法檢測(cè)源自膀脫癌患者的FFPE切片中的FGFR3-TACC3融合 多核巧酸（mRNA)
[0370] 將源自購(gòu)自美國(guó)7ステクシF公司的膀脫癌患者組織的FF陽(yáng)切片通過(guò)實(shí)施例18 中的利用微量恒溫儀的處理之后的方法進(jìn)行處理，并且英光觀察封入后的切片。利用IN CellAnalyzer2000(GEHealthcare公司）對(duì)獲得的圖像進(jìn)行分析，結(jié)果，與通過(guò)實(shí)施例 23記載的RT-PCR法確認(rèn)到未表達(dá)FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)的源自膀脫癌患者組 織的FF陽(yáng)切片相比，在通過(guò)實(shí)施例23記載的RT-PCR法確認(rèn)了表達(dá)FGFR3-TACC3_v2的源 自膀脫癌患者組織的FFPE切片中，共位的FGFR3的信號(hào)和TACC3的信號(hào)數(shù)量明顯較多。
[0371] 對(duì)于購(gòu)自英國(guó)TissueSolutions公司的多個(gè)源自膀脫癌患者組織的FFPE切片， 也通過(guò)同樣的方法研究FGFR3的信號(hào)和TACC3的信號(hào)的共位。結(jié)果，與通過(guò)實(shí)施例23記載 的RT-PCR法確認(rèn)到未表達(dá)FGFR3-TACC3融合多核巧酸（mRNA)的源自膀脫癌患者組織的 FF陽(yáng)切片相比，在通過(guò)前述實(shí)施例記載的RT-PCR法確認(rèn)了表達(dá)FGFR3-TACC3融合多核巧 酸（mRNA)的源自膀脫癌患者組織的FFPE切片中，共位的FGFR3的信號(hào)和TACC3的信號(hào)數(shù) 明顯較多。
[0372] 由此說(shuō)明，在源自膀脫癌患者組織的FFPE切片中，通過(guò)觀察共位的信號(hào)，也可判 定有無(wú)FGFR3-TACC3融合基因。
[037引[實(shí)施例川化合物對(duì)FGFR3-TACC3融合多膚的體外激酶活性的抑制作用
[0374] (1)FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)質(zhì)粒
[0375] (FGFR3-TACC3-V1 (N-FLAG) /pcDNA3.1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3-V2 (N-FLAG)/ pcDNA3.l/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)/pcDNA3.1/Zeo(+))的構(gòu)建
[0376] 為了獲得在5'末端融合有FLAG標(biāo)簽的FGFR3-TACC3融合多核巧酸，使用實(shí)施 例1、2及3中克隆的載體作為模板，實(shí)施在5'末端附加FLAG標(biāo)簽的PCR。使用序列號(hào) 21 所示的FGFR3_N_FLAG_BamHI及序列號(hào) 14 所示的FGFR3_TACC3_cloning_EcoRI_R的 引物W及DNA聚合酶化OD-plus-Ver. 2 ;東洋紡織株式會(huì)社）進(jìn)行PCR(將98C15砂、 55C15砂、68C3分鐘30砂進(jìn)行12次循環(huán)）。將PCR產(chǎn)物克隆到克隆載體（TOPOXL PCRCloningKit;lifetechnologies公司）中。通過(guò)雙脫氧測(cè)序法確定插入物的序列 (BigDyeTerminatorv3.!CycleSequencingKit;lifetechnologies公司）。結(jié)果石角認(rèn) 了；PCR產(chǎn)物為在序列號(hào)1、序列號(hào)3及序列號(hào)5中所記載的序列中刪除了編碼第一甲硫 氨酸的3個(gè)堿基（ATG)并在5'末端附加有編碼起始密碼子和FLAG標(biāo)簽的核酸序列（序 列號(hào)22)而得到的核酸序列。將由此編碼的多膚分別稱為FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融 合多膚、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多膚及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多膚，并將 它們總稱為FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多膚。另外，為了構(gòu)建將附加有該些FLAG序列的 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)的ORF全 長(zhǎng)表達(dá)為蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，將上述克隆載體用限制酶BamHI在37C下進(jìn)行3小時(shí)的酶反 應(yīng)，對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制，再用EcoRI在37C下進(jìn)行3小時(shí)的酶反應(yīng)，并 對(duì)經(jīng)限制酶處理了的DNA片斷進(jìn)行精制。將含有該ORF的DNA片斷克隆到存在于表達(dá)載體 (PCDNA3.l/Zeo(+) ;lifetechnologies公司）的多克隆位點(diǎn)中的BamHI及EcoRI位點(diǎn)中，從 而構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒（FGFR3-TACC3_vl(N-化AG) /pcDNA3. 1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2 (N-化AG) / pcDNA3. 1/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_v3(N-FLAG)/pcDNA3. 1/Zeo(+))。
[0377] (2)FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多膚的獲得
[037引在實(shí)施轉(zhuǎn)染前一天，將每張涂布有膠原的15cm盤(pán)中的0. 5XIO7個(gè)肥K293細(xì)胞用 含有10%牛胎兒血清的D-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)10張。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，F(xiàn)GFR3-TACC3_vl(N-FLAG)/ PCDNA3. 1/Zeo(+)、FGFR3-TACC3_v2(N-FLAG)/pcDNA3. 1/Zeo(+)及FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG) /pcDNA3. 1/Zeo(+)分別在每張盤(pán)中為27yg、并使用轉(zhuǎn)染試劑（FUGE肥（注 冊(cè)商標(biāo)）皿；Roche公司）81iiL，對(duì)肥K293細(xì)胞實(shí)施轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，去除培養(yǎng) 基，用PBS清洗3次，加入1血的PBS，利用細(xì)胞刮伊（Corning公司）剝離細(xì)胞后，回 收于聚丙帰制管中。W120化pm離也5分鐘后，去除上清液，加入150yL的細(xì)胞溶解 液巧01111化13肥1(口服.0)、1501111化(：1、1%^-40、11111邸14、蛋白酶抑制劑。0。1^311 complete(Roche-Diagnostics株式會(huì)社））并在冰上培養(yǎng)30分鐘使細(xì)胞溶解。將離也 后得到的上清液中存在的FGFR3-TACC3_v1 (N-FLAG)融合多膚、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG) 融合多膚及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多膚分別使用M2抗體親和凝膠（ANTI-FLAG M2A巧nityGel;SIGMA-ALDRICH公司）并依據(jù)制品信息中所記載的方法進(jìn)行精制。清洗 及溶出分別使用清洗液巧01111化13肥1(口服.0)、1501111化(：1、1%^-40、11111邸14、蛋 白酶抑制劑cocktailcomplete(Roche-Dia即OStics株式會(huì)社））、溶出液（20mMTris 肥l(pH7.4)、10mMMgCl2、10mMMnCl2、0.5mg/mL化AGP巧tide),得到IOOyL的溶出液。 對(duì)于溶出液進(jìn)行使用了抗FGFR3抗體（CellSi即alingTechnology公司）及抗FLAGM2 抗體（SIGMA-ALDRICH公司）的免疫印跡W及銀染色，從而確認(rèn)了可得到FGFR3-TACC3_ Vl(N-FLAG)融合多膚、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多膚及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融 合多膚。
[0379] (3)FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多膚的體外激酶活性的檢測(cè)
[0380] 使用激酶活性檢測(cè)試劑盒（HTRFKinEASE-TK;Cisbio公司）對(duì)相對(duì)于上述精制的 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多膚、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多膚及FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG)融合多膚的膚基質(zhì)的磯酸化活性進(jìn)行研究。使用384孔的Low-volumeBlack plate(Corning公司），W上述溶出液的I倍稀釋溶液、3倍稀釋溶液或10倍稀釋溶液各 1yL作為酶源，向試劑盒隨附的SXKinasebuffer中分別W最終濃度為ImM及SmM的方 式添加DTT及Mg",作為反應(yīng)溶液。進(jìn)行添加使得作為基質(zhì)的試劑盒隨附的TKSubstrate 的最終濃度為2.0uM、并且未添加ATP或者ATP的最終濃度為IOOyM，最終容量為 5. 0yL，并分別在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，依據(jù)試劑盒推薦的方法制備Sa-XL665及TK Antibody-Eu(K)溶液，分別添加2. 5yL在室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，檢測(cè)HTRF的計(jì)數(shù)（即膚基 質(zhì)的磯酸化）。結(jié)果可知，相對(duì)于未添加ATP而言，添加ATP時(shí)，HTRF的計(jì)數(shù)在添加含有上述 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多膚、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多膚或FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG)融合多膚的各溶出液1倍稀釋溶液1yL時(shí)，分別增加了約38倍、約40倍及約 38倍；在添加上述溶出液3倍稀釋溶液1yL時(shí)，分別增加了約27倍、34倍、31倍；在添加 上述溶出液10倍稀釋溶液1yL時(shí)，分別增加了 5倍、18倍、11倍。
[0381] 如上所述，通過(guò)使用激酶活性檢測(cè)試劑盒，可W檢測(cè)FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合 多膚的體外激酶活性。
[0382] (4)化合物對(duì)FGFR3-TACC3 (N-FLAG)融合多膚的體外激酶活性的抑制作用
[0383] 使用上述激酶活性檢測(cè)試劑盒及同樣的384孔板來(lái)研究化合物Dovitinib、 AZD4547、BGJ398 及LY2874455 對(duì)FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多膚、FGFR3-TACC3_ v2 (N-FLAG)融合多膚及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多膚的體外激酶活性的抑制作用。 將1.OyL的各化合物溶液WDMSO的最終濃度為0. 1 %、化合物的最終濃度中Dovitinib 為luMUOOnMUOnM、AZD4547 及BGJ398 分另Ij為 100nM、10nM、lnM、LY2874455 為lOnM、 lnM、0.InM的方式進(jìn)行添加，或者作為對(duì)照，添加DMSO使其為0. 1 %，對(duì)于FGFR3-TACC3_ Vl(N-FLAG)融合多膚，添加上述溶出液2倍稀釋溶液1yL;對(duì)于FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG) 融合多膚，添加上述溶出液3倍稀釋溶液1yL;W及對(duì)于FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多 膚，添加上述溶出液3倍稀釋溶液1yL。接著，W最終濃度為2. 0yM的方式添加作為基質(zhì) 的試劑盒隨附的TKSubstrate,在室溫下反應(yīng)15分鐘。接著，W未添加ATP或者ATP的最 終濃度為100yM的方式添加，最終容量為5. 0yL，并分別在室溫下反應(yīng)一小時(shí)。此外，分 別添加2. 5yL的與上述（3)的方法同樣制備的Sa-XL665及TKAntibody-Eu(K)溶液，在 室溫下反應(yīng)1時(shí)間后，檢測(cè)HTRF的計(jì)數(shù)。將不存在化合物下（將DMSO設(shè)為與添加化合物 時(shí)的濃度相同即0. 1% )的未添加ATP及添加ATP時(shí)的磯酸化的計(jì)數(shù)分別設(shè)為100%抑制、 0%抑制，由下式算出由化合物引起的FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多膚、FGFR3-TACC3_ v2 (N-FLAG)融合多膚及FGFR3-TACC3_v3 (N-FLAG)融合多膚的激酶活性的抑制％。
[0384][化合物的激酶活性抑制（％)] = (1-[添加化合物且添加ATP時(shí)的磯酸化的計(jì) 數(shù)-未添加化合物且未添加ATP時(shí)的磯酸化的計(jì)數(shù)]/ [未添加化合物但添加ATP時(shí)的磯酸 化的計(jì)數(shù)-未添加化合物且未添加ATP時(shí)的磯酸化的計(jì)數(shù)])X100
[0385] 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)化合物Dovitinib、AZD4547、BGJ398及LY2874455抑制 了精制 FGFR3-TACC3_vl(N-FLAG)融合多膚、FGFR3-TACC3_v2 (N-FLAG)融合多膚及FGFR3-TACC3_ v3 (N-FLAG)融合多膚對(duì)于膚基質(zhì)的磯酸化活性。各化合物的各個(gè)最終濃度下的對(duì)于膚基質(zhì) 的抑制比例（％)示于表1。
[0386] [表 1]
[0387]

【權(quán)利要求】
1. 纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3 (FGFR3)基因和轉(zhuǎn)化酸性卷曲螺旋含蛋白3 (TACC3)基因 的融合基因或者FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，包括檢測(cè)從受試者得 到的試樣中的、編碼下述多肽的多核苷酸或該多肽的存在的步驟， 所不多肽含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、 序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨 基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序列，并且具有腫瘤 形成能力。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多肽是含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461? 947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨 基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列，并且具有 腫瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸 編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10 個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多肽是含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、 序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序列，并且具有腫 瘤形成能力的多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多肽是含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序 列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列 號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入 1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中,所述多肽為由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列 號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。 6. FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的檢測(cè)用試劑盒，其含有以能夠特異性地?cái)U(kuò)增 編碼下述多肽的多核苷酸的方式設(shè)計(jì)的正義引物及反義引物： 所述多肽含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、 序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨 基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列的同源性為90 %以上的氨基酸序列，并且具有腫瘤 形成能力。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述多肽是含有序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461? 947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨 基酸編號(hào)461?1043或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列，并且具有 腫瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸 編號(hào)461?982、序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996、序列號(hào)26的氨基酸編號(hào)461?1043 或序列號(hào)28的氨基酸編號(hào)461?1040所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插入1?10 個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述多肽是含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào) 6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序列，并且具有 腫瘤形成能力的多肽。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述多肽是含有序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、 序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽；或者是含有在序 列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或插 入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述多肽為由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、 序列號(hào)26或序列號(hào)28所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
11. 一種用于檢測(cè)FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的引物組，選自由下述a)?e) 構(gòu)成的組： a) 引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)1所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交 的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、以及由在嚴(yán)格條件下與該多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸分 子所構(gòu)成的正義引物； b) 引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)3所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交 的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、以及由在嚴(yán)格條件下與該多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸分 子所構(gòu)成的正義引物； c) 引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)5所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜交 的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、以及由在嚴(yán)格條件下與該多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸分 子所構(gòu)成的正義引物； d) 引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)25所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜 交的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、以及由在嚴(yán)格條件下與該多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸 分子所構(gòu)成的正義引物； e) 引物組，其含有由在嚴(yán)格條件下與由序列號(hào)27所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸雜 交的核酸分子所構(gòu)成的反義引物、以及由在嚴(yán)格條件下與該多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸 分子所構(gòu)成的正義引物。
12. 正義引物和反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)1的堿基編號(hào)1?2280 中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)1的堿基編號(hào) 2281?2856中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸構(gòu)成。
13. 正義引物和反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)3的堿基編號(hào)1?2280 中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)3的堿基編號(hào) 2281?2961中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸構(gòu)成。
14. 正義引物和反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)5的堿基編號(hào)1?2368 中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)5的堿基編號(hào) 2369?3003中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸構(gòu)成。
15. 正義引物和反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)25的堿基編號(hào)1?2242 中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)25的堿基編號(hào) 2243?3144中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸構(gòu)成。
16. 正義引物和反義引物的引物組，所述正義引物由序列號(hào)27的堿基編號(hào)1?2233 中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸構(gòu)成，所述反義引物由與序列號(hào)27的堿基編號(hào) 2234?3135中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸構(gòu)成。
17. 用于檢測(cè)FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的探針組，選自由下述a)?c)構(gòu)成 的組： a) 探針組，其包含由含有與序列號(hào)1的堿基編號(hào)1?2280中任意的連續(xù)的至少16個(gè) 堿基互補(bǔ)的寡核苷酸的鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的多種探針組、以及由含有與序列號(hào)1的堿基編 號(hào)2281?2856中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核苷酸的鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的多 種探針組； b) 探針組，其包含由含有與序列號(hào)3的堿基編號(hào)1?2280中任意的連續(xù)的至少16個(gè) 堿基互補(bǔ)的寡核苷酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組、以及由含有與序列號(hào)3的堿基編 號(hào)2281?2961中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核苷酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成 的探針組； c) 探針組，其包含由含有與序列號(hào)5的堿基編號(hào)1?2368中任意的連續(xù)的至少16個(gè) 堿基互補(bǔ)的寡核苷酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成的探針組、以及由含有與序列號(hào)5的堿基編 號(hào)2369?3003中任意的連續(xù)的至少16個(gè)堿基互補(bǔ)的寡核苷酸的多種鄰接的探針對(duì)構(gòu)成 的探針組。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的檢測(cè) 方法，其特征在于，所述檢測(cè)多核苷酸的存在的步驟包括：使用從受試者得到的試樣以及權(quán) 利要求17所述的探針組進(jìn)行原位雜交的步驟；將雜交的信號(hào)放大的步驟；以及檢測(cè)所述信 號(hào)重疊的步驟。 19. FGFR3基因和TACC3基因的融合基因的檢測(cè)用試劑盒，其含有用于檢測(cè)FGFR3基因 和TACC3基因的融合基因的權(quán)利要求17所述的探針組以及將雜交后的信號(hào)放大的試劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)方法，其特 征在于，所述檢測(cè)多肽的存在的步驟包括：i)使識(shí)別源自該多肽的FGFR3基因的部分的抗 體（一次抗體）以及識(shí)別源自該多肽的TACC3基因的部分的抗體（一次抗體）與從受試者 得到的試樣接觸的步驟；ii)添加與該一次抗體分別結(jié)合、并且連結(jié)有寡核苷酸的各自的 二次抗體的步驟；iii)添加連接溶液從而進(jìn)行連接反應(yīng)的步驟，其中該連接溶液含有與該 二次抗體所連結(jié)的所述寡核苷酸部分互補(bǔ)的二種寡核苷酸、以及在它們接近時(shí)使其連接從 而在該二次抗體間能夠形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的連接酶；iv)沿所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使核酸伸長(zhǎng)的步 驟、v)將能夠與伸長(zhǎng)后的核酸雜交的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交的步驟；以及vi)檢測(cè)該 標(biāo)記信號(hào)的步驟。 21. FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)用試劑盒，其用于權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述 的FGFR3和TACC3的融合蛋白的檢測(cè)方法中，并且含有：識(shí)別源自所述融合多肽的FGFR3基 因的部分的抗體（一次抗體）以及識(shí)別源自所述融合多肽的TACC3基因的部分的抗體（一 次抗體），與該一次抗體分別結(jié)合并且連結(jié)有寡核苷酸的二次抗體，與該二次抗體所連結(jié)的 該寡核苷酸部分互補(bǔ)的二種寡核苷酸，在它們接近時(shí)使其連接從而在該二次抗體間能夠形 成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的連接酶，以及經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針。 22. FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或者FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌 的治療用醫(yī)藥組合物，含有抑制下述多肽的物質(zhì)： 所述多肽含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序 列、并且具有腫瘤形成能力。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多肽是含有序列號(hào)2的氨基酸編 號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所不 的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461? 947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所不的氨基酸 序列中缺失、取代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能 力的多肽。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多肽為由序列號(hào)2的氨基酸編號(hào) 461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所不的 氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
25. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多肽是含有與序列號(hào)2、序列號(hào)4 或序列號(hào)6所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力 的多肽。
26. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的醫(yī)藥組合物，其中所述多肽是含有序列號(hào)2、序列號(hào)4或序 列號(hào)6所示的氨基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽；或者是含有在序列號(hào)2、序列號(hào) 4或序列號(hào)6所示的氨基酸序列中含有缺失、取代和/或插入1?10個(gè)氨基酸而得到的氨 基酸序列，并且具有腫瘤形成能力的多肽。
27. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述多肽為由序列號(hào)2、序列號(hào)4或序 列號(hào)6所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
28. 根據(jù)權(quán)利要求22?27中任一項(xiàng)所述的癌治療用醫(yī)藥組合物，其中，所述抑制多肽 的物質(zhì)為Dovitinib、AZD4547、BGJ398 或LY2874455。
29. 根據(jù)權(quán)利要求22?27中任一項(xiàng)所述的癌治療用醫(yī)藥組合物，其中，所述癌為肺癌 或膀胱癌。
30. 抑制下述多肽的物質(zhì)用于制造FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或FGFR3 和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌治療用醫(yī)藥組合物的應(yīng)用： 所述多肽含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。
31. 抑制下述多肽的物質(zhì)用于治療FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或FGFR3 和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌的應(yīng)用： 所述多肽含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。 3 2.抑制下述多肽的物質(zhì)，其用于治療FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌： 所述多肽含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。 33.FGFR3基因和TACC3基因的融合基因陽(yáng)性或FGFR3和TACC3的融合蛋白陽(yáng)性的癌的 治療方法，包括給對(duì)象施予有效量的抑制下述多肽的物質(zhì)： 所述多肽含有與序列號(hào)2的氨基酸編號(hào)461?947、序列號(hào)4的氨基酸編號(hào)461?982 或序列號(hào)6的氨基酸編號(hào)461?996所示的氨基酸序列的同源性為90%以上的氨基酸序 列，并且具有腫瘤形成能力。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK104379740SQ201380012774
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月8日
【發(fā)明者】鈴木淳, 淺海真, 角山和久, 西村耕一, 森中紹文, 山內(nèi)智弘, 吉野正康, 吉崎浩亮 申請(qǐng)人:安斯泰來(lái)制藥株式會(huì)社