一種食品蛋白來(lái)源ace抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種食品蛋白來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；具體是以食品蛋白制備產(chǎn)生的ACE抑制肽，通過(guò)超濾、凝膠色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜解析等技術(shù)手段進(jìn)行分離鑒定，明確其氨基酸序列；然后利用-CHOH-、-COCH2-、-CH2CO-等基團(tuán)對(duì)ACE抑制肽氨基酸序列中的1-2個(gè)酰胺鍵進(jìn)行替換，成為含有非肽鍵結(jié)構(gòu)的擬肽物質(zhì)；最后利用有機(jī)合成的方法對(duì)結(jié)構(gòu)改良后的擬肽進(jìn)行合成，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備；利用本發(fā)明改良的ACE抑制肽能較好地保持其抑制活性，并提升抗蛋白酶、肽酶降解的能力，提高生物活性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種食品蛋白來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種食品蛋白來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，具體涉及一種將肽中 的酰胺鍵進(jìn)行替換，使其成為含有非肽鍵結(jié)構(gòu)的擬肽物質(zhì)的改良方法，屬于生物技術(shù)研究 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)源肽以酶、激素、神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞活素的形式在機(jī)體的生理調(diào)節(jié)中起著 重要的作用。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，食品蛋白質(zhì)氨基酸序列中的一些肽段具有廣泛的生理活 性，如促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、降血壓、免疫促進(jìn)等，在被吸收進(jìn)入人體后亦能發(fā)揮某種生理調(diào)節(jié) 活性。因此，食品蛋白質(zhì)來(lái)源的生物活性肽有著巨大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，是近些年保健食品研 究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于人體內(nèi)消化系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)和肽的吸收有著層層阻礙，生物活性肽能否 在人體內(nèi)完整地被吸收并傳送至目標(biāo)位置，產(chǎn)生生理效應(yīng)，是廣大肽類(lèi)藥物和保健品研究 者關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。
[0003] 肽和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收主要在小腸絨毛上的吸收細(xì)胞上進(jìn)行。當(dāng)肽經(jīng)口腔進(jìn)入 胃腸道，在達(dá)到吸收細(xì)胞表面之前，消化道對(duì)肽的吸收有多重的阻礙作用。腸腔內(nèi)表面的黏 液層以及消化道酶系的降解作用是肽吸收的最大阻礙。
[0004] 除了分子的大小之外，肽吸收的一個(gè)重要的要求就是肽在接近腸腔內(nèi)吸收位點(diǎn)時(shí) 在水相中的溶解性。為了進(jìn)入腸上皮細(xì)胞膜，肽分子必須斷裂其與水相的氫鍵并與膜上的 脂相反應(yīng)，要求至少有一定的親脂性。肽吸收的限速步驟是在腸腔內(nèi)壁的黏液層，以及腸上 皮細(xì)胞表面不能攪動(dòng)的水層。在到達(dá)細(xì)胞表面之前，肽必須穿過(guò)腸的黏液層。腸的黏液層 覆蓋在小腸的內(nèi)壁，由高腳細(xì)胞分泌。黏液是細(xì)胞外的一種糖蛋白，包括不可移動(dòng)的水相， 更新周期為12~24h在體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)親脂性與藥物被吸收的量有著直接的關(guān)系。然而，肽的 被動(dòng)運(yùn)輸并不嚴(yán)格隨親脂性的增加而增加，而是相反地與藥物和腸腔水相形成的氫鍵的數(shù) 目有關(guān)。促甲狀腺素釋放激素，其肽鍵可逆或不可逆的N-乙?；揎椖軌蛟黾铀幬锏奈?收。對(duì)弱酸或弱堿來(lái)說(shuō)，親水性或極性受分子負(fù)電荷影響，分子顯著地受PK以及腸腔pH的 影響。除了腸腔PH，吸收部位微環(huán)境的局部pH是影響滲透的決定因素。小的陽(yáng)離子能夠透 過(guò)腸上皮細(xì)胞之間的緊密接頭障礙。
[0005] 肽除了在胃部黏液的穿透非常困難外，胃液中的胃蛋白酶和鹽酸將會(huì)在pH2飛之 間引起蛋白質(zhì)的水解，特別是那些含天門(mén)冬氨酸的蛋白質(zhì)。大肽在胃部高度敏感，而小肽在 這個(gè)環(huán)境中卻很穩(wěn)定。小腸上部的腸道酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶 A和B等在pH8左右的活性最強(qiáng)，有各自的專(zhuān)一性，通過(guò)協(xié)作使得每一種蛋白質(zhì)都容易被酶 解，能夠在l〇min內(nèi)將蛋白質(zhì)的30%~40%降解成2~6個(gè)氨基酸殘基的小肽。雖然大部分蛋 白質(zhì)完全地被降解成小的片段，但還有相當(dāng)一部分小肽在這些腸道酶中能夠保持穩(wěn)定。在 腸道中限制吸收最主要的阻礙是刷狀緣膜上的肽酶和腸上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的酶。在腸道刷 狀緣膜上的外肽酶與內(nèi)肽酶能夠?qū)⑽傅鞍酌负鸵让府a(chǎn)生的寡肽和蛋白質(zhì)片段酶解成氨基 酸，二肽或三肽。對(duì)于四肽或以上的肽，在刷狀緣膜超過(guò)90%被水解，三肽109Γ60%，而二肽 是10%。選擇性降解三肽的肽酶位于刷狀緣膜，二肽較容易通過(guò)這個(gè)膜，卻容易被細(xì)胞質(zhì)中 的酶降解。腸上皮細(xì)胞內(nèi)含有最豐富的水解小肽的肽酶，這些酶主要作用于二肽，對(duì)三肽也 有一定作用。有證據(jù)顯示，含脯氨酸、羥脯氨酸的小肽或氨基酸容易被吸收進(jìn)入門(mén)靜脈并在 血液中以完整的形式出現(xiàn)，這些肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)肽酶有一定的抵抗力。另外，某些氨基酸表現(xiàn)出 具有調(diào)節(jié)刷狀緣膜肽酶活性的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種ACE抑制肽結(jié)構(gòu)的改良方法，解決食品蛋白來(lái)源活性肽在消 化系統(tǒng)易被降解、吸收性能差及生物學(xué)效應(yīng)弱的問(wèn)題。
[0007] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 一種食品蛋白來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，按如下步驟進(jìn)行： (1)利用蛋白酶解、微生物發(fā)酵法降解食品蛋白質(zhì)產(chǎn)生的ACE抑制肽，通過(guò)超濾、凝膠 色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜解析等技術(shù)手段進(jìn)行分離鑒定，明確其氨基酸序列，一般含有2-5 個(gè)氨基酸殘基。
[0008] (2)利用-CH0H-、-C〇-CH2-、-CH2C〇-等基團(tuán)對(duì)ACE抑制肽氨基酸序列中的1-2個(gè) 酰胺鍵進(jìn)行替換，成為含有非肽鍵結(jié)構(gòu)的擬肽物質(zhì)，對(duì)使其不能被蛋白酶、肽酶識(shí)別，提高 其穩(wěn)定性與吸收性能，提高生物利用度，增強(qiáng)生物活性。
[0009] (3)利用有機(jī)合成的方法對(duì)結(jié)構(gòu)改良后的擬肽進(jìn)行合成，進(jìn)一步進(jìn)行毒理學(xué)性質(zhì)、 藥效性質(zhì)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等藥理學(xué)性質(zhì)檢測(cè)分析，明確活性及產(chǎn)品特征后即可進(jìn)行大規(guī) 模生產(chǎn)制備。
[0010] 本發(fā)明對(duì)幾種已明確鑒定結(jié)構(gòu)的生物活性肽，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，改變肽的一個(gè)或 幾個(gè)酰胺鍵為非酰胺鍵結(jié)構(gòu)，骨架結(jié)構(gòu)上鏈接的局部結(jié)構(gòu)往往與原肽分子中的活性基團(tuán)在 結(jié)構(gòu)（或電性、疏水性等）上有相似性，而且在空間的取向及相對(duì)位置也有一定程度的與原 肽的相似性。肽酰胺鍵的任意取代（除酯鍵外）形成擬肽，可提高抗蛋白酶、肽酶降解的能 力。肽的一個(gè)或幾個(gè)酰胺鍵被其它一些基團(tuán)取代，其生物半衰期和代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生 有利變化。用不同的原子或基團(tuán)替代酰胺鍵，引起電性分布、疏水-親水的分配性、分子的 偶極距、氫鍵形成能力的改變，從而增強(qiáng)抵抗蛋白酶降解能力，影響活性強(qiáng)度。酶的擬肽類(lèi) 抑制劑是國(guó)內(nèi)外研究較多的人工合成抑制劑。國(guó)內(nèi)外多肽模擬成功的例子很多，如絲氨酸 蛋白酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、組織蛋白酶S抑制劑、氨肽酶N抑制劑等都是由肽結(jié)構(gòu) 模擬設(shè)計(jì)而來(lái)，與原肽相比其活性及生物利用度均獲得大幅度提高。為提高ACE抑制肽的 抑制活性和穩(wěn)定性，須根據(jù)ACE的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)其酰胺鍵進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。提高ACE抑制肽的 抑制活性，須在不改變藥效基團(tuán)的條件下對(duì)ACE抑制肽的酰胺鍵進(jìn)行親脂基團(tuán)替換，增強(qiáng) 擬肽的親脂性以提高細(xì)胞膜通透性和穩(wěn)定性。研究表明，以酮基改造酰胺鍵可提高多肽藥 物分子的通透性和穩(wěn)定性。各種酮肽的主要功能是用作蛋白酶抑制劑，酮肽作為ACE抑制 劑已有較好的研究成果，如Aim等設(shè)計(jì)合成的ACE抑制劑和Kim等設(shè)計(jì)合成的ACE抑制劑。 因此，酰胺鍵的酮基替換通常能較好地保持ACE抑制肽的抑制活性，并提升抗蛋白酶、肽酶 降解的能力。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，利用肽鍵擬肽化結(jié)構(gòu)改良的方法改變肽的一個(gè)或幾個(gè)酰胺鍵為 非酰胺鍵結(jié)構(gòu)，骨架結(jié)構(gòu)上鏈接的局部結(jié)構(gòu)往往與原肽分子中的活性基團(tuán)在結(jié)構(gòu)(或電性、 疏水性等）上有相似性，而且在空間的取向及相對(duì)位置也有一定程度的與原肽的相似性，能 較好地保持ACE抑制肽的抑制活性，并提升抗蛋白酶、肽酶降解的能力，提高生物活性。本 發(fā)明不僅能夠豐富食品蛋白來(lái)源活性肽結(jié)構(gòu)改良的理論，也為食品蛋白活性肽的深度開(kāi)發(fā) 應(yīng)用提供良好的示范作用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為L(zhǎng)HP的結(jié)構(gòu)改良方案。
[0013] 圖2為VP的結(jié)構(gòu)改良方案。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。
[0015] 實(shí)施例1 (l)Leu-His-Pr〇 (代號(hào)LHP)是一種具有較強(qiáng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的三肽。LHP 對(duì)ACE的體外抑制活性IC5(I為1. 6 μ M。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，LHP對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠具有較強(qiáng) 的降血壓作用，但在6-8h內(nèi)降血壓效應(yīng)逐漸減弱，24h后大鼠血壓基本恢復(fù)到原來(lái)的水平。
[0016] (2)LHP有兩個(gè)酰胺鍵，對(duì)LHP N端第一個(gè)酰胺鍵（-C0NH-)用酮甲基（-C0CH2_) 基團(tuán)取代（圖1)，形成的酮肽LHP-X，進(jìn)行有機(jī)合成。
[0017] (3 )改良后的擬肽LHP-X在pH 5-9范圍內(nèi)，隨著pH的增加，LHP-X的溶解度均有 所下降，而LHP-X的溶解度比LHP的溶解度要高，其脂溶性系數(shù)提高70-80%，降血壓效應(yīng)可 延長(zhǎng)10-15以上。
[0018] 實(shí)施例2 (1 )Val-Pro (代號(hào)VP)是一種ACE抑制肽，對(duì)ACE的體外抑制活性IC5(I為2. 4 μ M，中、 高劑量的Val-Trp對(duì)SHR均有一定的降血壓效果。
[0019] (2)VP肽鍵中的-C0-用-CH0H-替代，成為類(lèi)肽產(chǎn)物VP-X (圖2)，進(jìn)行有機(jī)合成。
[0020] (3)改良后的擬肽VP-X在pH 7. 0的溶解度比LHP的溶解度要高，脂溶性系數(shù)提高 50-60%，降血壓效應(yīng)可延長(zhǎng)10小時(shí)以上。
【權(quán)利要求】
1. 一種食品蛋白質(zhì)來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，其特征在于：利用食品蛋白質(zhì)降 解產(chǎn)生的ACE抑制肽，通過(guò)改變其肽鍵結(jié)構(gòu)為非肽鍵結(jié)構(gòu)，提高其在消化系統(tǒng)種的穩(wěn)定性 和生物利用度，增強(qiáng)生物活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品蛋白質(zhì)來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，其特征在 于：ACE抑制肽是食品蛋白通過(guò)酶解、發(fā)酵或自溶方式產(chǎn)生的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種食品蛋白質(zhì)來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，其特征 在于：ACE抑制肽是由食品蛋白降解產(chǎn)生的含有2-5個(gè)氨基酸殘基的肽類(lèi)，通過(guò)超濾、凝膠 色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜解析技術(shù)手段進(jìn)行分離鑒定出明確的氨基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種食品蛋白質(zhì)來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，其特征在于： 利用-CH0H-、-C0CH2-、-CH 2C0-基團(tuán)對(duì)ACE抑制肽氨基酸序列中的1-2個(gè)酰胺鍵進(jìn)行替換， 成為含有非肽鍵結(jié)構(gòu)的擬肽物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)改良。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品蛋白質(zhì)來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，其特征在 于：采用有機(jī)合成的方法對(duì)結(jié)構(gòu)改良后的肽進(jìn)行合成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種食品蛋白質(zhì)來(lái)源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，其特 征在于：有機(jī)合成ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良肽合成后進(jìn)一步進(jìn)行毒理學(xué)性質(zhì)、藥效性質(zhì)、藥物 代謝動(dòng)力學(xué)藥理學(xué)性質(zhì)檢測(cè)分析，明確活性及產(chǎn)品特征后即可進(jìn)行大規(guī)模合成制備。
【文檔編號(hào)】C07K5/083GK104140456SQ201410354871
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】曹文紅, 章超樺, 郝記明, 熊皓平, 曹湛慧 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)