一種快速提取高分子量絲素蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速提取高分子量絲素蛋白的方法，從成熟昆蟲體內(nèi)取出一對絲腺體，除去其外層的上皮組織，可得到一段清澈透明的條帶，將條帶蛋白浸漬在去離子水或PBS中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白等等，本發(fā)明操作簡單，生產(chǎn)周期短，提取工藝簡單、高效，沒有復(fù)雜繁瑣的提取材料過程，時間上大為節(jié)省。提取過程中未使用其它有毒性的化學試劑，制備條件溫和，成本顯著降低，不產(chǎn)生其它廢棄物，對環(huán)境零污染。
【專利說明】一種快速提取高分子量絲素蛋白的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種絲素蛋白溶液及絲素粉的提取方法，屬于天然高分子領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]來源于家蠶、野蠶(如柞蠶、天蠶、蓖麻蠶)和蜘蛛等吐絲昆蟲的絲蛋白具有優(yōu)良的生物相容性、無免疫排斥、可生物降解性以及本質(zhì)是天然蛋白質(zhì)的特點，在紡織、化妝品、食品、環(huán)境保護、生物材料、組織工程等領(lǐng)域受到高度的關(guān)注。天然絲蛋白在昆蟲體內(nèi)合成、分泌，并且以高濃度(家蠶中部絲腺蛋白可達30wt%)的絲蛋白溶液的形式貯存在各種絲腺中。
[0003]然而，昆蟲吐出絲蛋白便立即凝固成絲纖維，此時很難再將絲纖維溶于普通的緩沖溶劑中，使得提取和加工絲蛋白變得很困難。在相關(guān)技術(shù)和方法中，只能在條件苛刻(如:高溫條件)的環(huán)境下將絲蛋白纖維溶于強酸、強堿、CaCl2、LiBr、LiSCN等化學溶劑中，這些化學溶劑都屬于強腐蝕性溶液，溶劑的成本高，不僅對生物體有毒副作用，腐蝕生產(chǎn)設(shè)備，帶來試劑殘留的風險，有違于相應(yīng)的生物安全標準，而且廢棄的溶劑對環(huán)境有很大的危害；在生產(chǎn)、制備絲素蛋白的過程中，經(jīng)過化學試劑處理得到的再生絲蛋白，因為其分子量大為下降，也不能滿足生產(chǎn)上的需要。綜上所述，目前還沒有一種提取工藝簡單，加工成本低廉，對環(huán)境無污染，最大限度保存絲素蛋白分子量的制備方法。如何消除生物材料中殘留的化學試劑以及如何有效保留絲素蛋白的分子量，是提取、制備絲素蛋白中亟待解決的關(guān)鍵難題，對拓展絲素蛋白在各領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要推動的作用。
[0004]于同隱等(絲素蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，《高等學?；瘜W學報》，第17卷第2期，1996年2月28日，第323-325頁)研究發(fā)現(xiàn)，解剖五齡熟蠶，取出絲腺體，可得到凝膠狀的絲素蛋白。然而該方法只簡單地闡述了如何從中部絲腺提取絲腺體的方法，該方法得到的絲素蛋白實際上為絲素凝膠，而非絲素溶液。凝膠狀態(tài)下的絲素蛋白直接干燥可以得到絲素蛋白粉，然而絲素凝膠制備具有高強度力學性能以及形貌規(guī)則的支架材料還遠遠不夠，因此不具備加工性。如何從家蠶體內(nèi)提取出具有高濃度的絲蛋白溶液，是現(xiàn)在急需解決的問題之
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，而提供一種提取工藝簡單，加工條件溫和、快速，成本低廉，對環(huán)境無污染的原位提取高分子量絲素蛋白的方法。本專利中使用的不同緩沖溶液能夠溶解絲素蛋白凝膠并最大限度保存絲素蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和分子量。這種方法可用于家蠶、野蠶(含柞蠶、天蠶、蓖麻蠶)和蜘蛛等絲蛋白的提取。為紡織、化妝品、食品、環(huán)境保護、生物材料、組織工程等領(lǐng)域提供新方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006]本課題組研究發(fā)現(xiàn):在成熟昆蟲絲腺里(如5齡家蠶第七天)，絲素蛋白在絲腺體中合成和分泌達到最高峰，而且絲膠蛋白可以通過清洗去除，所以，本發(fā)明提出通過從絲腺中提取絲素凝膠并溶解成溶液的快速方法，本發(fā)明具體是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明公開了一種快速提取高分子量絲素蛋白的方法，所述的制備方法包括如下步驟:
[0008](I)從成熟昆蟲體內(nèi)取出一對絲腺體，除去其外層的上皮組織，可得到一段清澈透明的條帶；
[0009](2)將步驟(1)中的條帶蛋白浸潰在去離子水或PBS中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白；
[0010](3)將步驟(2)中的絲素蛋白收集到緩沖溶劑中，然后置于搖床上，在0-100度的溫度范圍內(nèi)振搖0.5-12個小時得到絲素蛋白溶液；
[0011](4)將步驟(3)中的絲素蛋白溶液干燥成粉或者直接用于其它材料的制備。
[0012]作為進一步地改進，本發(fā)明所述步驟(1)中，所述的含有絲素蛋白的昆蟲包括家蠶、野蠶或蜘蛛。
[0013]作為進一步地改進，本發(fā)明所述步驟(3)中，將絲素蛋白膠狀物收集到不同的緩沖溶劑中，緩沖劑是SBF、CaCl2、NaCl、KCl,Na2HPO4、(NH4) 2S04、Tris、磷酸、檸檬酸、碳酸鹽、硼酸鹽、弱酸、弱堿中的任意一種或幾種的組合。
[0014]作為進一步地改進，本發(fā)明所述步驟(3)中的絲素蛋白溶液的濃度為15wt % -30wt %。
[0015]作為進一步地改進，本發(fā)明所述步驟(4)中的絲素溶液的干燥方法包括冷凍干燥、烘干、自然干燥或噴霧干燥。
[0016]作為進一步地改進，本發(fā)明所述步驟(4)中的絲素蛋白溶液通過加工成型以膜、多孔支架、微粒和纖維形式存在，替代步驟(4)中的以粉狀的形式存在。
[0017]由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出特點:
[0018](I)絲素蛋白具有良好的生物相容性:絲素蛋白或者降解物對細胞或組織無毒性反應(yīng)；在提取過程中，因為沒有化學試劑的污染，絲素蛋白表現(xiàn)出較高的細胞粘附率和增殖率，具有良好的生物相容性，生物安全性高。
[0019](2)操作簡單，生產(chǎn)周期短:提取工藝簡單、高效，沒有復(fù)雜繁瑣的提取材料過程，時間上大為節(jié)省。
[0020](3)經(jīng)濟環(huán)保:提取過程中未使用其它有毒性的化學試劑，制備條件溫和，成本顯著降低，不產(chǎn)生其它廢棄物，對環(huán)境零污染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為實施例1中得到的絲素蛋白的SDS-PAGE電泳圖，分子量高于250kDa

【具體實施方式】
[0022]下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步地詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。
[0023]實施例1
[0024]本實施例中絲素蛋白的提取方法包括如下步驟。
[0025](I)用醫(yī)用鉗將五齡熟蠶絲腺拉出，除去上皮組織，可得到一條帶狀蛋白；
[0026](2)將步驟⑴中的蛋白浸潰在去離子水中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白；
[0027](3)將步驟(2)中的絲素蛋白放置于0.5wt%碳酸鈉水溶液中，50rpm的轉(zhuǎn)速下振搖溶解，即得到質(zhì)量分數(shù)為20%的絲素蛋白溶液，電泳結(jié)果顯示，得到的絲素蛋白分子量高于 250KDa。
[0028]實施例2
[0029]本實施例中絲素蛋白的提取方法包括如下步驟。
[0030](I)用醫(yī)用鉗將五齡熟蠶的絲腺拉出，除去前部、后部絲腺以及中部絲腺外層的上皮組織，可得到一段清澈透明的條帶狀蛋白，該條帶即為絲腺蛋白；
[0031](2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸潰在去離子水中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白凝膠；
[0032](3)將步驟⑵中的絲素蛋白放置于凝膠收集到0.2wt% Na2HPO4緩沖溶液當中，置于搖床上先在200rpm的轉(zhuǎn)速下振搖1min,再50rpm的轉(zhuǎn)速下振搖I小時得到溶液；
[0033](4)將步驟(3)中的絲素蛋白溶液添加到細胞培養(yǎng)基中，進行細胞培養(yǎng)，能夠顯著促進人MSC細胞的粘附和增殖。
[0034]實施例3
[0035]本實施例中絲素蛋白的提取方法包括如下步驟。
[0036](I)用醫(yī)用鉗將五齡熟蠶的絲腺拉出，除去前部、后部絲腺以及中部絲腺外層的上皮組織，可得到一段清澈透明的條帶狀蛋白，該條帶即為絲腺蛋白；
[0037](2)將步驟⑴中的絲腺蛋白浸潰在去離子水中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白凝膠；
[0038](3)將步驟⑵中的絲素蛋白放置于凝膠收集到0.2wt% Na2HPO4緩沖溶液當中，置于搖床上先在200rpm的轉(zhuǎn)速下振搖1min,再50rpm的轉(zhuǎn)速下振搖I小時得到溶液；
[0039](4)將步驟(3)中的絲素蛋白溶液添加到細胞培養(yǎng)基中，進行細胞培養(yǎng)，能夠顯著促進MC-3T3-E1細胞的粘附和增殖。
[0040]實施例4
[0041 ] 本實施例中絲素蛋白的提取方法包括如下步驟。
[0042](I)用醫(yī)用鉗將五齡熟蠶的絲腺拉出，除去絲腺外層的上皮組織，可得到條帶狀蛋白；
[0043](2)將步驟(1)中的蛋白用去離子水中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白；
[0044](3)將步驟(2)中的絲素蛋白放置于0.5界七％的NaCl水溶液中，振搖溶解得到質(zhì)量分數(shù)為20%的絲素蛋白溶液；
[0045](4)將步驟(3)中的1mL質(zhì)量分數(shù)為20 %的絲素溶液滴在聚乙烯板上自然干燥成膜得到絲素蛋白膜
[0046]本實施例制備而成的絲素蛋白膜具有很好的透光性好。
[0047]實施例5
[0048]本實施例中絲素蛋白的提取方法包括如下步驟。
[0049](I)用醫(yī)用鉗將五齡熟蠶的絲腺拉出，除去絲腺外層的上皮組織，可得到條帶狀蛋白；
[0050](2)將步驟⑴中的蛋白用去離子水中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白；
[0051](3)將步驟(2)中的絲素蛋白放置于0.5界七％的(NH4)2SO4水溶液中，振搖溶解得到質(zhì)量分數(shù)為20%的絲素蛋白溶液；
[0052](4)將步驟(3)中的1mL質(zhì)量分數(shù)為20%的絲素溶液滴在聚乙烯板上自然干燥成膜得到絲素蛋白膜。
[0053](5)將步驟(4)中的絲素蛋白膜浸泡在90%的甲醇中處理12小時，得到后處理的絲素蛋白膜；
[0054](6)后處理的絲素蛋白膜表面富有彈性，能夠隨意彎曲而不折斷，而傳統(tǒng)LiBr方法提取的絲素，經(jīng)過同樣的后處理方法，得到的絲素蛋白膜一折即斷，非常脆。力學性能測試表明，延展性和彈性模量都比傳統(tǒng)方法得到的絲素蛋白膜高。
[0055]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種快速提取高分子量絲素蛋白的方法，其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟: (1)從成熟昆蟲體內(nèi)取出一對絲腺體，除去其外層的上皮組織，可得到一段清澈透明的條帶； (2)將步驟(1)中的條帶蛋白浸潰在去離子水或PBS中漂洗去除絲膠蛋白，從而得到絲素蛋白； (3)將步驟(2)中的絲素蛋白收集到緩沖溶劑中，然后置于搖床上，在0-100度的溫度范圍內(nèi)振搖0.5-12個小時得到絲素蛋白溶液； (4)將步驟(3)中的絲素蛋白溶液干燥成粉或者直接用于其它材料的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取絲素蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述的含有絲素蛋白的昆蟲包括家蠶、野蠶或蜘蛛。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取絲素蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將絲素蛋白膠狀物收集到不同的緩沖溶劑中，緩沖劑是SBF、CaCl2、NaCl、KCl，Na2HPO4, (NH4)2SO4,Tr i s、磷酸、檸檬酸、碳酸鹽、硼酸鹽、弱酸、弱堿中的任意一種或幾種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取絲素蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(3)中的絲素蛋白溶液的濃度為15wt% -30wt%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取絲素蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(4)中的絲素溶液的干燥方法包括冷凍干燥、烘干、自然干燥或噴霧干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取絲素蛋白的方法，其特征在于:所述步驟(4)中的絲素蛋白溶液通過加工成型以膜、多孔支架、微粒和纖維形式存在，替代步驟(4)中的以粉狀的形式存在。
【文檔編號】C07K14/435GK104163860SQ201410327653
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】楊明英, 帥亞俊 申請人:浙江大學