一種從鳀魚中分離的活性多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種從鳀魚發(fā)酵液中分離的活性多肽，本發(fā)明得到的抗神經(jīng)細胞損傷多肽分子量為2,181Da；由天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸等十一種氨基酸組成，是一種新型的具有活性活性的多肽。本發(fā)明獲得的多肽在谷氨酸鹽對神經(jīng)細胞損傷模型中，本發(fā)明的活性多肽的加入可以顯著提高PC12神經(jīng)細胞的存活率，在終濃度為50μg/mL時，細胞存活率與損傷組比較提高了26.4％，有效地減輕了谷氨酸鹽誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷。另外，對其神經(jīng)細胞保護作用的細胞機理研究發(fā)現(xiàn)，活性多肽的加入顯著增加了胞內(nèi)的總抗氧化能力，且對SOD活力的增加有一定促進作用。
【專利說明】一種從鍉魚中分離的活性多肽
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多肽分離【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從鍉魚中分離的活性多肽，具有抗神經(jīng)細胞損傷的功能。
【背景技術(shù)】
[0002]鍉魚廣泛分布于太平洋西北部、新西蘭、澳大利亞、印度洋、非洲東岸及南非沿岸等南北半球的溫帶水域，是世界上單一漁業(yè)品種產(chǎn)量最高的魚種，系集群性小型中上層魚類，資源豐富。由于鍉魚富含脂肪、酶活高、易被氧化而腐爛變質(zhì)，因此不能長期儲存，我國俗稱“離水爛”。我國東海、黃海和渤海均產(chǎn)之，資源豐富，年漁獲量可達幾十萬噸。長期以來由于對其利用價值認識不足，未被大規(guī)模的開發(fā)利用。而隨著人們生活水平的提高，鍉魚很少直接食用，大多僅被簡單加工成養(yǎng)殖用的飼料、魚糜；而且在加工過程中會產(chǎn)生大量鍉魚副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物如果隨意丟棄而不加以利用會帶來極大的環(huán)境污染及資源浪費。鍉魚有很高的營養(yǎng)價值，含有8種人體必須氨基酸、不飽和脂肪酸和?；撬?，另外還富含維生素A、E等。此外，鍉魚及其加工副產(chǎn)物作為一種重要的海洋蛋白資源，在氨基酸組成和序列上與陸地生物蛋白資源有很大差異，且在種類和數(shù)量上都遠遠大于陸地及淡水蛋白資源，然而這些資源并未得到充分利用。如果能將其進一步開發(fā)和利用，將大幅提高鍉魚及其副產(chǎn)物的附加值，為充分利用這一海洋資源開辟新的途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種從鍉魚發(fā)酵液中分離的活性多肽，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的活性多肽，是從鍉魚中分離的，其制備方法包括如下的步驟:
[0005]I)將鍉魚濃縮液加入2~6倍體積的水后，再加入鍉魚濃縮液重量I~8%的蛋白酶，在40~70°C下酶解2~24h制成酶解液；
[0006]其中鍉魚濃縮液將鍉魚或鍉魚加工的副產(chǎn)物粉碎，過濾除去雜質(zhì)后，濾液在80~100°C加熱0.5~IOh至粘稠半固態(tài)狀得到的；
[0007]2)在步驟I)的酶解液中加入鍉魚酶解液重量I %~10%的麩皮，滅菌后接入米曲霉發(fā)酵3~7d獲得發(fā)酵液；
[0008]3)將步驟2)制備的發(fā)酵液過濾，濾液滅菌后得到鍉魚發(fā)酵母液成品；
[0009]4)將步驟3)得到的鍉魚發(fā)酵母液成品進行冷凍干燥成干粉后，再用超純水溶解，溶解液通過濾膜過濾后，濾液用葡聚糖G-15進行分離，上樣量為0.2~2mL，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.2~2mL/min，檢測波長為220nm，分管收集洗脫27~30min的洗脫液；
[0010]5)將步驟4)得到的洗脫液濃縮后用DEAE-S印harose FF離子交換柱層析進行分離純化:濃縮后的樣品上ρΗ7.5~8.5的5mM Tris-HCl緩沖液平衡的DEAE-S印harose FF離子交換柱，采用濃度為2mol/L NaCl梯度洗脫，流速為0.2~2mL/min，檢測波長為220nm，分管收集洗脫3~6min的洗脫液；[0011]6)將步驟5)得到的組份進一步過SB-C18半制備柱，柱溫25°C，上樣量20~100 μ L，紫外波長220nm，流速0.5~2mL/min，流動相A為乙腈，流動相B中含0.1~I %的三氟乙酸；分管收集12~13.5min的洗脫液，干燥后即為分離的抗神經(jīng)細胞損傷活性多肽。
[0012] 本發(fā)明得到的抗神經(jīng)細胞損傷多肽分子量為2，ISlDa0
[0013]上述方法制備的活性多肽，用4.6 X 250nm的XDB-C18分析柱測定分離多肽的純度；流速為0.5~2mL/min，其中流動相A為甲醇，流動相B為水。
[0014]上述的蛋白酶包括各種來源的蛋白酶:植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等)、動物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草桿菌蛋白酶、鏈霉菌蛋白酶等)；以及各種條件的蛋白酶(中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶等)以及各種蛋白酶按照一定比例復(fù)配得到的復(fù)合蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶等)。
[0015]本發(fā)明的活性多肽分子量為2，181Da，由天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸等十一種氨基酸組成，是一種新型的具有活性活性的多肽。本發(fā)明獲得的多肽在谷氨酸鹽對神經(jīng)細胞損傷模型中，本發(fā)明的活性多肽的加入可以顯著提高PC12神經(jīng)細胞的存活率，在終濃度為50 μ g/mL時，細胞存活率與損傷組比較提高了 26.4%，有效地減輕了谷氨酸鹽誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷。另外，對其神經(jīng)細胞保護作用的細胞機理研究發(fā)現(xiàn)，活性多肽的加入顯著增加了胞內(nèi)的總抗氧化能力，且對SOD活力的增加有一定促進作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:G_15凝膠柱層析洗脫圖譜；
[0017]圖2 =P2洗脫峰獲得的多肽的DEAE-S印harose FF離子交換柱色譜圖；
[0018]圖3:峰A獲得的多肽的反相高效液相色譜圖；
[0019]圖4:f3洗脫峰獲得的多肽的純度鑒定圖譜；
[0020]圖5:f3洗脫峰的一級和二級質(zhì)譜圖；
[0021]圖6:f3洗脫峰獲得的多肽對谷氨酸鹽誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的影響圖；
[0022]圖7:培養(yǎng)細胞形態(tài)學(xué)圖片。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明的活性多肽是把鍉魚濃縮液進行酶解，加入麩皮后滅菌，接入米曲霉后發(fā)酵后，再依次經(jīng)過G-15凝膠色譜柱、DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜柱以及SB-C18半制備柱分離純化制得的，制備過程以抗神經(jīng)細胞損傷活性的篩選為指標(biāo)，制備步驟如下
[0024]I)將鍉魚濃縮液加入鍉魚濃縮液體積2~6倍的水后，同時加入鍉魚濃縮液重量I~8%的蛋白酶，在40~70°C下酶解2~24h，溫度升至85~100°C，加熱5~20min使酶失活。
[0025]2)把步驟I制得的鍉魚酶解液加入鍉魚酶解液重量的I %~10%的麩皮，121 °C滅菌20min,冷卻至室溫后接入米曲霉發(fā)酵3~7d。
[0026]3)把步驟2得到的發(fā)酵液用紗布過濾、100°C滅菌20min后得到鍉魚發(fā)酵母液成
品O
[0027]4)將步驟3得到的鍉魚發(fā)酵母液成品用冷凍干燥機進行濃縮后，過膜后的樣品首先用葡聚糖G-15進行分離，上樣量為0.2~2mL，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.2~2mL/min，檢測波長為220nm，分管收集吸光值大于0.1且具有抗神經(jīng)細胞損傷活性的組分。
[0028]抗神經(jīng)細胞損傷活性的測定方法為:將PC12細胞按每孔5X103個左右接種于96孔板，當(dāng)細胞生長匯合率達到70~80%時，用含8%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液換液，加入收集的多肽樣品，每個濃度設(shè)定3個平行，培養(yǎng)3h后，每孔加入最佳成模濃度的谷氨酸鹽(lOmmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。另設(shè)空白、模型(損傷)組。用結(jié)晶紫染色法測定其吸光值。設(shè)定空白組的平均吸光度值為100%，其余組與之比較即得細胞存活率(細胞的存活率與其吸光度值呈正比)，細胞存活率大于模型(損傷)組的即為有抗神經(jīng)細胞損傷活性的組分。
[0029]5)將步驟4得到的具有最高抗神經(jīng)細胞損傷活性組份濃縮后進一步用DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析進行分離純化。濃縮后的樣品上5mM Tris-HClpH7.5~8.5緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF離子交換柱(18X80mm)，米用濃度為O~2mol/L NaCl梯度洗脫，流速為0.2~2mL/min，檢測波長為220nm，分管收集吸光值大于0.1且具有抗神經(jīng)細胞損傷活性的組分。
[0030]6)將步驟5得到的具有最高抗神經(jīng)細胞損傷活性的組分進一步過SB-C18 (9.4 X 250mm)半制備柱，柱溫25°C，上樣量20~100 μ L，紫外波長220nm，流速0.5~2mL/min，流動相A為乙腈，流動相B中含0.1~I %的三氟乙酸，按照一定的洗脫程序進行洗脫。
[0031]對步驟6得到的具有最高抗神經(jīng)細胞損傷活性的組分用XDB-C18分析柱(4.6 X 250nm)進行純化；流速為0.5~2mL/min，流動相A為甲醇，流動相B為水，洗脫至純度達到95%以上。
[0032]步驟I中的蛋白酶包括各種來源的蛋白酶:植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等)、動物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草桿菌蛋白酶、鏈霉菌蛋白酶等)；以及各種條件的蛋白酶(中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶等)以及各種蛋白酶按照一定比例復(fù)配得到的復(fù)合蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶等)。
[0033]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0034]實施例1鍉魚發(fā)酵母液的制備
[0035]將鍉魚副產(chǎn)物用絞碎機絞碎后進行粗濾除雜，然后在80°C加熱2h至粘稠半固態(tài)狀得到鍉魚濃縮液；將鍉魚濃縮液按照(1:3，w/w)的比例加入水，混勻后加入鍉魚濃縮液重量3%的風(fēng)味蛋白酶，60°C酶解5h，得到鍉魚酶解液。將得到的鍉魚酶解液中加入酶解液重量5%的麩皮，121°C滅菌20min，接入米曲霉，30°C發(fā)酵，發(fā)酵周期為3d。發(fā)酵結(jié)束后將得到的發(fā)酵液用紗布過濾，100°C滅菌20min，得到鍉魚發(fā)酵母液成品。
[0036]對鍉魚發(fā)酵母液及發(fā)酵前的酶解液理化指標(biāo)進行了測定，測定結(jié)果見表1:
[0037]表1:鍉魚發(fā)酵前后各項指標(biāo)的測定
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種活性多肽，其特征在于，所述的活性多肽的制備方法包括如下的步驟: 1)將鍉魚濃縮液加入2~6倍體積的水后，再加入鍉魚濃縮液重量I~8%的蛋白酶，在40~70°C下酶解2~24h制成酶解液； 2)在步驟I)的酶解液中加入鍉魚酶解液重量1%~10%的麩皮，滅菌后接入米曲霉發(fā)酵3~7d獲得發(fā)酵液； 3)將步驟2)制備的發(fā)酵液過濾，濾液滅菌后得到鍉魚發(fā)酵母液成品； 4)將步驟3)得到的鍉魚發(fā)酵母液成品進行冷凍干燥成干粉后，再用超純水溶解，溶解液通過濾膜過濾后，濾液用葡聚糖G-15進行分離,上樣量為0.2~2mL,以蒸懼水為洗脫液，流速為0.2~2mL/min，檢測波長為220nm，分管收集洗脫27~30min的洗脫液； 5)將步驟4)得到的洗脫液濃縮后用DEAE-SepharoseFF離子交換柱層析進行分離純化:濃縮后的樣品上ρΗ7.5~8.5的5mM Tris-HCl緩沖液平衡的DEAE-S印harose FF離子交換柱，采用濃度為2mol/L NaCl梯度洗脫，流速為0.2~2mL/min，檢測波長為220nm，分管收集洗脫3~6min的洗脫液； 6)將步驟5)得到的洗脫液組份過SB-C18半制備柱，柱溫25°C，上樣量20~100μ L，紫外波長220nm，流速0.5~2mL/min，流動相A為乙腈，流動相B中含0.1~1 %的三氟乙酸；分管收集12~13.5min的洗脫液，干燥后即為活性多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的步驟1)中鍉魚濃縮液是將鍉魚或鍉魚加工的副產(chǎn)物粉碎，過濾除去雜質(zhì)后，濾液在80~100°C加熱0.5~1Oh至粘稠半固態(tài)狀得到的。
3.如權(quán)利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的步驟1)中的蛋白酶為植物蛋白酶、動物蛋白酶、微生物蛋白酶中的任一種或幾種。
4.如權(quán)利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的植物蛋白酶為木瓜蛋白酶和/或菠蘿蛋白酶。
5.如權(quán)利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的動物蛋白酶為胃蛋白酶和/或胰蛋白酶。
6.如權(quán)利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的微生物蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶和/或鏈霉囷蛋白酶。
7.如權(quán)利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的多肽分子量為2，ISlDa0
8.權(quán)利要求1所述的活性多肽的純度測定方法，其特征在于，所述的測定方法是將活性多肽用4.6X250nm的XDB-C18分析柱測定純度；其流速為0.5~2mL/min，其中流動相A為甲醇，流動相B為水。
9.權(quán)利要求1所述的活性多肽在制備抗神經(jīng)細胞損傷制品中的應(yīng)用。
10.一種抗神經(jīng)細胞損傷制品，其特征在于，所述的制品包含有藥理有效濃度的權(quán)利要求I所述的活性多肽。
【文檔編號】C07K1/18GK103937864SQ201410173125
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月26日
【發(fā)明者】毛相朝, 于小航, 薛長湖 申請人:中國海洋大學(xué)