一種海馬活性糖蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種海馬活性糖蛋白的制備方法，特點(diǎn)是包括以下步驟：a.將冷凍干燥后的海馬粉粹，采用CO2超臨界流體萃取技術(shù)脫除脂肪酸；配置0～0.25mol/L的NaCl浸提液，與脫脂海馬按照1:10～1:35（mL/g）的比例混合于錐形瓶中，搖勻后首先進(jìn)行超聲波輔助提取20min，再置于水浴鍋中于30℃～80℃下熱水浸提1～6h，最后濾紙過(guò)濾，上清液即為糖蛋白混合溶液；b.海馬糖蛋白的純化：采取Sevage法和乙醇分級(jí)沉淀法。將粗純品用蒸餾水復(fù)溶，3500Da透析袋透析72h脫鹽，冷凍干燥，得到海馬糖蛋白粗純品，優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)、高效，全程無(wú)有毒有害試劑的殘留和污染，并確保了制取糖蛋白的活性。
【專利說(shuō)明】一種海馬活性糖蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種糖蛋白的制備方法，尤其是涉及一種海馬活性糖蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海馬為海龍科動(dòng)物，性溫、味甘、歸肝、腎經(jīng)，屬于藥食同源類生物，是名貴的海洋滋補(bǔ)藥物，在我國(guó)素有“北方人參，南方海馬”之稱，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2005《中國(guó)藥典》收載原動(dòng)物主要有五種..錢(qián)致海馬Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder、刺海馬/Zhistrix Kaup、大海馬/Z kuda Bleeker、三斑海馬/Z trimaculatus Leach 或小海馬(海蛆)漢japonicus Kaup的干燥體。夏、秋二季捕撈,洗凈,曬干；或除去皮膜及內(nèi)臟,曬干。
[0003]海馬藥用歷史悠久，歷代古醫(yī)籍及我國(guó)藥典歷次版本一部(中藥部分)均有收載。公元739年，《本草拾遺》古醫(yī)籍中陳藏器首次使用海馬之名；《神農(nóng)本草》古醫(yī)籍中記載--海馬性溫、味甘、無(wú)毒，具有強(qiáng)身補(bǔ)腎、舒筋活絡(luò)、止痛止血、退熱生肌、強(qiáng)心明目、祛疾止喘、夫人催生等功能；明代《本草綱目》記載:海馬雌雄成對(duì)，其性溫暖，有交感之意，故難產(chǎn)及陽(yáng)虛房中方術(shù)多用之，具有暖水臟、壯陽(yáng)道之功能。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證明海馬具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和化 學(xué)活性成分，含有大量的鎂、鈣，其次為鋅、鐵、鍶、錳，少量的鈷、鎳、銅和鉻，還含有大量的硬脂酸、膽留醇、膽留二醇，其不飽和脂肪酸占總脂肪酸比例較高，其中多烯不飽和脂肪酸EPA (二十碳五烯酸)和DHA (二十二碳六烯酸)較為豐富。海馬具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、調(diào)氣活血等功效，臨床上主要用于治療陽(yáng)痿、遺尿、虛喘、癥積等。目前對(duì)海馬化學(xué)成分的研究主要集中在氨基酸、微量元素、磷脂、脂肪酸和留體類等，對(duì)水溶性組分的研究較少，所以海馬水溶性組分的研究有利于人們對(duì)海馬的認(rèn)識(shí)更加完整。
[0004]海洋擁有特殊的生態(tài)環(huán)境，賦予了海洋生物異于陸生生物所特有的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)，具有特異的高活性、高藥效。近年來(lái)對(duì)海洋藥物的研究越發(fā)深入，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)糖蛋白具有很好的醫(yī)療保健功效，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、提高免疫力等活性。糖蛋白涉及細(xì)胞的定向歸巢、糖蛋白毒素及激素作用機(jī)制，可使藥物選擇性地集中到病灶，提高藥效，而不影響正常組織的生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)的功能，降低不良反應(yīng)。海馬蛋白質(zhì)含量豐富，聞達(dá)70%左右?，F(xiàn)代科學(xué)已證明80%以上的蛋白質(zhì)都是糖蛋白，包括許多酶、激素、毒素、載體蛋白、免疫球蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、凝集素、受體、粘液組分等，甚至過(guò)去人們一直認(rèn)為是“純”的多糖，如糖原和纖維素，亦含有少量共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)海馬糖蛋白的制備的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有高效、快速并能保持糖蛋白活性的海馬糖蛋白制備方法。
[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種海馬活性糖蛋白的制備方法，包括以下步驟:(1)海馬前處理:將海馬洗凈凍好后，于-40°c下冷凍干燥48-72h，再用粉碎機(jī)粉碎，然后采用CO2超臨界流體萃取技術(shù)脫除脂肪酸，得到脫脂海馬粉；
(2)海馬糖蛋白提取:將步驟(1)得到的脫脂海馬粉與NaCl濃度為O~0.25mol/L的浸提液按(10~35) g =ImL的比例混合于錐形瓶中搖勻后，首先進(jìn)行超聲波輔助提取20min，再置于水浴鍋中于30°C~80°C下浸提I~6h后，用濾紙過(guò)濾，得到的上清液即為海馬糖蛋白混合溶液；
(3)海馬糖蛋白粗純化:將步驟(2)得到的海馬糖蛋白溶液減壓濃縮至原體積的四分之一，得到糖蛋白樣品液，將糖蛋白樣品液采用Sevage法除游離蛋白，脫蛋白一次，4°C靜置過(guò)夜，棄下層游離蛋白層；收集上層糖蛋白溶液，進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀，然后將沉淀收集，將沉淀用丙酮、乙醚各洗滌2次，然后用蒸餾水復(fù)溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脫鹽，冷凍干燥，得到海馬糖蛋白粗純品。
[0007]步驟(1)中所述的CO2超臨界流體萃取技術(shù)進(jìn)行脫脂的條件為:載氣為高純度CO2,萃取壓強(qiáng)35MPa、萃取時(shí)間135min、萃取溫度58°C、分離釜溫度80°C、CO2流量15L/h，其中萃取時(shí)間依次由動(dòng)態(tài)萃取IOmin和靜態(tài)萃取125min組成。
[0008]步驟(2)中所述的超聲波輔助提取的條件為:超聲功率500W，超聲時(shí)間20min。
[0009]步驟(2)中所述的浸提液中NaCl濃度為0.08mol/L，所述的浸提溫度為72.77°C,所述的浸提時(shí)間為4.27h，所述的脫脂海馬粉與所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g:lmL。此條件為海馬糖蛋白提取的最佳工藝參數(shù)。
[0010]步驟(3)中所述的Sevage法除游離蛋白的條件為:糖蛋白樣品液與Sevage試劑比例為4:1，所述的Sevage試劑由氯仿與正丁醇按5:1的比例混合而成。
[0011]步驟(3)中所述的乙醇分級(jí)沉淀?xiàng)l件為:將收集的糖蛋白溶液層依次加入無(wú)水乙醇，分別在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇濃度下得到的沉淀。
[0012]步驟(3)得到的海馬糖蛋白粗純品進(jìn)行精純化的過(guò)程為:取海馬糖蛋白粗純品按質(zhì)量體積比0.2g:5mL的比例溶解在去離子水中，過(guò)0.45 μ m濾膜后取樣品液，將樣品液上DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，上樣后分別用0.05,0.1,0.5mol/L NaHC03進(jìn)行階段性洗脫，每個(gè)濃度洗脫120min，517nm處采用苯酚硫酸法檢測(cè)糖出峰位置，280nm處采用紫外吸收法檢測(cè)蛋白質(zhì)出峰位置，分別收集含有糖蛋白組分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷凍干燥，得到不同分子量的海馬糖蛋白精純品。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明首次公開(kāi)了一種海馬活性糖蛋白的制備方法，采用NaCl濃度為O~0.25mol/L的浸提液浸提并超聲波輔助提取，省時(shí)、高效，且工藝簡(jiǎn)單、操作方便，并避免了酸堿及酶解對(duì)原始糖蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，全程無(wú)有毒有害試劑的殘留和污染，確保了制取海馬糖蛋白的活性；Sevage法脫蛋白一次并靜置過(guò)夜能夠有效的脫除游離蛋白質(zhì)，且避免了脫蛋白次數(shù)過(guò)多導(dǎo)致的糖蛋白損失；乙醇分級(jí)沉淀法能夠有效的將不同分子量階段的糖 蛋白純化出來(lái)，保證了制取糖蛋白種類的完整性；透析法能夠有效的脫除鹽分，并且去除了小分子雜質(zhì)；糖蛋白的檢測(cè)技術(shù)采取分別測(cè)定糖和蛋白質(zhì)含量，通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行糖和蛋白質(zhì)得率的共同優(yōu)化工藝，以達(dá)到糖蛋白的最優(yōu)提取條件。在此最優(yōu)提取工藝條件下，進(jìn)行了三次提取驗(yàn)證，海馬糖蛋白粗純品的理論得率為7.037%,實(shí)際得率平均為6.977%，具有較好的重復(fù)性?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為浸提時(shí)間對(duì)海馬糖蛋白提取實(shí)驗(yàn)中糖和蛋白質(zhì)得率的影響；
圖2為浸提液中NaCl濃度對(duì)海馬糖蛋白提取實(shí)驗(yàn)中糖和蛋白質(zhì)得率的影響；
圖3為浸提溫度對(duì)海馬糖蛋白提取實(shí)驗(yàn)中糖和蛋白質(zhì)得率的影響；
圖4為液料比對(duì)海馬糖蛋白提取實(shí)驗(yàn)中糖和蛋白質(zhì)得率的影響；
圖5為纖維素DEAE-52陰離子交換柱對(duì)海馬糖蛋白粗品的純化效果。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016]一、實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法
(I)糖蛋白中糖含量的測(cè)定
海馬糖蛋白中的糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法。配置0.lmg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水補(bǔ)足至2mL，然后加入ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液，充分振蕩混勻后沿比色管壁迅速加入5mL濃硫酸，讓硫酸能均勻地沿壁流下，室溫下充分反應(yīng)30min ;取適量反應(yīng)液在20(T600nm下進(jìn)行掃描，蒸懼水做空白樣，確定其最大吸收波長(zhǎng)為488nm ;在488nm處測(cè)樣品吸光度,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y = 0.7434 x -0.0012，R2 = 0.9995，其中x為吸光度值，y為糖的質(zhì)量濃度μ g/mL。樣品液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，以同樣的方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品液中糖含量。
[0017](2)糖蛋白中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
海馬糖蛋白中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。將0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL的95%乙醇中，再加入IOOmL 85%磷酸，最后用蒸餾水定容至1000mL,抽濾，棕色瓶保存?zhèn)溆?。用牛血清配?.lmg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取O、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水補(bǔ)足至lmL，再加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混勻，室溫下靜置IOmin后于595nm處測(cè)各樣品的吸光度，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y =
0.5932 X +0.0017，R2 = 0.9997，其中x為吸光度值，y為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度μ g/mL。樣品液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，以同樣的方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品液中蛋白質(zhì)含量。
[0018]二、具體實(shí)施例 實(shí)施例1
一種海馬活性糖蛋白的制備方法，包括以下步驟:
(1)海馬前處理:將海馬洗凈凍好后，于-40V下冷凍干燥48-72h，再用粉碎機(jī)粉碎，然后采用CO2超臨界流體萃取技術(shù)脫除脂肪酸，得到脫脂海馬粉；其中CO2超臨界流體萃取技術(shù)進(jìn)行脫脂的條件為:載氣為高純度CO2，萃取壓強(qiáng)35MPa、萃取時(shí)間135min、萃取溫度58°C、分離釜溫度80°C、CO2流量15L/h，其中萃取時(shí)間依次由動(dòng)態(tài)萃取IOmin和靜態(tài)萃取125min 組成；
(2)海馬糖蛋白提取:將步驟(1)得到的脫脂海馬粉與NaCl濃度為0.08mol/L的浸提液按21.41:1 (g / mL)的比例混合于錐形瓶中搖勻后，首先于超聲功率500W的條件下進(jìn)行超聲波輔助提取20min，再置于水浴鍋中于72.77°C下浸提4.27h后，用濾紙過(guò)濾，得到的上清液即為海馬糖蛋白混合溶液；此條件為海馬糖蛋白提取的最佳工藝參數(shù)；
(3)海馬糖蛋白粗純化:將步驟(2)得到的海馬糖蛋白溶液減壓濃縮至原體積的四分之一，得到糖蛋白樣品液，將糖蛋白樣品液采用Sevage法除游離蛋白，脫蛋白一次，4°C靜置過(guò)夜，棄下層游離蛋白層；收集上層糖蛋白溶液進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀，然后將沉淀收集，分別用丙酮、乙醚各洗滌2次，然后用蒸餾水復(fù)溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脫鹽，冷凍干燥，得到海馬糖蛋白粗純品，其中Sevage法除游離蛋白的條件為:糖蛋白樣品液與Sevage試劑比例為4:1, Sevage試劑由氯仿與正丁醇按5:1的比例混合而成；乙醇分級(jí)沉淀?xiàng)l件為:將收集的糖蛋白溶液層依次加入無(wú)水乙醇，分別在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%,90%時(shí)于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇濃度下得到的沉淀。
[0019]實(shí)施例2
基本同上述實(shí)施例1，其區(qū)別在于:步驟(2)中浸提液為蒸餾水(即NaCl濃度為0)，且浸提液與脫脂海馬粉按照1:10 (mL/g)的比例混合于錐形瓶中，超聲20min后于30°C水浴鍋中熱水浸提6h，最后過(guò)濾得海馬糖蛋白混合溶液。
[0020]實(shí)施例3
基本同實(shí)施例1，其區(qū)別在于:步驟(2)中的浸提液的NaCl濃度為0.25mol/L，且浸提液與脫脂海馬按照1:35 (mL/g)的比例混合于錐形瓶中，超聲20min后于80°C水浴鍋中熱水浸提lh，最后過(guò)濾得海馬糖蛋白混合溶液。
[0021]實(shí)施例4
基本同實(shí)施例1，其區(qū)別在于:步驟(2)中的浸提液的NaCl濃度為0.01mol/L，且浸提液與脫脂海馬按照1:10 (mL/g)的比例混合于錐形瓶中，超聲20min后于40°C水浴鍋中熱水浸提2h，最后過(guò)濾得海馬糖蛋白混合溶液。
[0022]實(shí)施例4
基本同實(shí)施例1，其區(qū)別在于:將步驟(3)得到的海馬糖蛋白粗純品進(jìn)行精純化，其過(guò)程具體為:取海馬糖蛋白粗純品按質(zhì)量體積比0.2g:5mL的比例溶解在去離子水中，過(guò)
0.45 μ m濾膜后取樣品液，將樣品液上DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，上樣后分別用0.05,0.1,0.5mol/L NaHC03進(jìn)行階段性洗脫，每個(gè)濃度洗脫120min，517nm處采用苯酚硫酸法檢測(cè)糖出峰位置，280nm處采用紫外吸收法檢測(cè)蛋白質(zhì)出峰位置，分別收集含有糖蛋白組分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷凍干燥，得到不同分子量的海馬糖蛋白精純品。
[0023]三、對(duì)比試驗(yàn)
最佳提取條件的確定:海馬前處理和提取操作如實(shí)施例1，分別對(duì)影響海馬糖蛋白提取得率的浸提時(shí)間、浸提液鹽濃度、浸提溫度和液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。
[0024]對(duì)浸提時(shí)間進(jìn)行單因素設(shè)計(jì):設(shè)置浸提時(shí)間分別為l、2、3、4、5、6h，其他條件分別控制為浸提液鹽濃度0.lmol/L、浸提溫度50°C、液料比1:25 (mL/g)。結(jié)果如圖1所示，由圖可知制備海馬糖蛋白的最佳浸提時(shí)間為4h。
[0025]對(duì)浸提液鹽濃度進(jìn)行單因素設(shè)計(jì):配置不同NaCl濃度的浸提液，分別為0、0.05、
0.10,0.15,0.20,0.25mol/L，其他條件分別控制為浸提時(shí)間4h、浸提溫度50°C、液料比l:25(mL/g)0結(jié)果如圖2所示，由圖可知制備海馬糖蛋白的最佳浸提液鹽濃度為0.05 mol/L0[0026]對(duì)浸提溫度進(jìn)行單因素設(shè)計(jì):調(diào)節(jié)浸提溫度分別為3o°c、4o°c、5(rc、6(rc、7(rc、80°C，其他條件控制:浸提時(shí)間4h、鹽濃度0.05 mol/L、液料比l:25(mL/g)。結(jié)果如圖3所示，由圖可知制備海馬糖蛋白的最佳浸提溫度為70°C。
[0027]對(duì)液料比進(jìn)行單因素設(shè)計(jì):浸提液與海馬的液料比(單位mL/g)分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，其他條件控制:浸提時(shí)間4h、鹽濃度0.05mol/L、溫度70°C。結(jié)果如圖4所不，由圖可知制備海馬糖蛋白的最佳液料比為1:20 (mL/g)。
[0028]運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇浸提時(shí)間、鹽濃度、溫度、液料比四個(gè)因素的較優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析如表1、表2、表3所不。
[0029]表1海馬糖蛋白提取工藝因素響應(yīng)面設(shè)計(jì)表
【權(quán)利要求】
1.一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)海馬前處理:將海馬洗凈凍好后，于-40°c下冷凍干燥48-72h，再用粉碎機(jī)粉碎，然后采用CO2超臨界流體萃取技術(shù)脫除脂肪酸，得到脫脂海馬粉； (2)海馬糖蛋白提取:將步驟(1)得到的脫脂海馬粉與NaCl濃度為O~0.25mol/L的浸提液按(10~35) g =ImL的比例混合于錐形瓶中搖勻后，首先進(jìn)行超聲波輔助提取20min，再置于水浴鍋中于30°C~80°C下浸提I~6h后，用濾紙過(guò)濾，得到的上清液即為海馬糖蛋白混合溶液； (3)海馬糖蛋白粗純化:將步驟(2)得到的海馬糖蛋白溶液減壓濃縮至原體積的四分之一，得到糖蛋白樣品液，將糖蛋白樣品液采用Sevage法除游離蛋白，脫蛋白一次，4°C靜置過(guò)夜，棄下層游離蛋白層；收集上層糖蛋白溶液，進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀，然后將沉淀收集，將沉淀用丙酮、乙醚各洗滌2次，然后用蒸餾水復(fù)溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脫鹽，冷凍干燥，得到海馬糖蛋白粗純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述的CO2超臨界流體萃取技術(shù)進(jìn)行脫脂的條件為:載氣為高純度CO2，萃取壓強(qiáng)35MPa、萃取時(shí)間135min、萃取溫度58 V、分離釜溫度80 V、CO2流量15L/h，其中萃取時(shí)間依次由動(dòng)態(tài)萃取IOmin和靜態(tài)萃取125min組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的超聲波輔助提取的條件為:超聲功率500W，超聲時(shí)間20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的浸提液中NaCl濃度為0.08mol/L，所述的浸提溫度為72.77°C，所述的浸提時(shí)間為4.27h，所述的脫脂海馬粉與所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g:lmL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的Sevage法除游離蛋白的條件為:糖蛋白樣品液與Sevage試劑比例為4:1,所述的Sevage試劑由氯仿與正丁醇按5:1的比例混合而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的乙醇分級(jí)沉淀?xiàng)l件為:將收集的糖蛋白溶液層依次加入無(wú)水乙醇，分別在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)于4°C沉淀12h，最后收集各乙醇濃度下得到的沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬活性糖蛋白的制備方法，其特征在于步驟(3)得到的海馬糖蛋白粗純品進(jìn)行精純化的過(guò)程為:取海馬糖蛋白粗純品按質(zhì)量體積比0.2g:5mL的比例溶解在去離子水中，過(guò)0.45 μ m濾膜后取樣品液，將樣品液上DEAE-52纖維素陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，上樣后分別用0.05,0.1,0.5mol/L NaHC03進(jìn)行階段性洗脫，每個(gè)濃度洗脫120min，在280nm處采用紫外吸收法檢測(cè)糖蛋白的出峰位置，分別收集含有糖蛋白組分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷凍干燥，得到不同分子量的海馬糖蛋白精純品。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK103923201SQ201410129587
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】徐永健, 宿宇婷, 姜展志 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)