下游生物處理裝置制造方法
【專利摘要】在單一裝置中提供分泌重組蛋白質(zhì)的X大規(guī)模下游處理，其中在多個(gè)生物反應(yīng)器的內(nèi)含物的收集和純化的同時(shí)合并多個(gè)生物反應(yīng)器的內(nèi)含物，由此顯著節(jié)省制造的時(shí)間與成本。有時(shí)可能必需將批量分成多個(gè)次批量，然后使這些次批量在一起以形成最終均勻批量。在最終滅菌的情況下，通過高壓釜的容量確定批量大小。在連續(xù)制造中，所述批量必須對(duì)應(yīng)于所定義的生產(chǎn)部分，以其預(yù)期均勻性為特征。
【專利說明】下游生物處理裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明大體上涉及使用分泌祀蛋白的生物培養(yǎng)物大規(guī)模制造祀蛋白的領(lǐng)域，其中 在多個(gè)生物反應(yīng)器的內(nèi)含物的收集和純化的同時(shí)在下游生物處理裝置中合并多個(gè)生物反 應(yīng)器的內(nèi)含物，由此顯著節(jié)省制造的時(shí)間與成本。

【背景技術(shù)】
[0002] 使用例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CH0)或其它類似細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模制造 祀蛋白目前占現(xiàn)今所用所有重組制造方法的約四分之H。隨著更多的祀蛋白、尤其是單克 隆抗體（MAB)的專利到期，存在W下正在上升的未得到滿足的需求；將買得起的、容易安裝 與操作并且調(diào)節(jié)挑戰(zhàn)更少的制造系統(tǒng)。目前所用的系統(tǒng)無論其成本如何，都不提供該些優(yōu) 點(diǎn)。作為一實(shí)例，用于提供至少20%的單一 MAB的世界市場的哺乳動(dòng)物細(xì)胞制造設(shè)施可W 花費(fèi)超過$1億用于cGMP生產(chǎn)。對(duì)此類巨大投資的要求一直W來使許多公司在該個(gè)制造領(lǐng) 域之外，導(dǎo)致該些產(chǎn)品的全球壟斷和價(jià)格控制。
[0003] 存在開發(fā)W可能的最低成本制造祀蛋白的方法的大量未得到滿足的需求并且該 可W通過各種概念的新穎組合來實(shí)現(xiàn)，包括：
[0004] a.使用更小的生物反應(yīng)器，通過合并輸出W符合CGMP批量的定義的CFR 21要求 產(chǎn)生大批量，從而降低按比例擴(kuò)大和驗(yàn)證的成本，降低污染失敗的成本并且使用更小的制 造設(shè)施；
[0005] b.消除W下高成本步驟：細(xì)胞分離、營養(yǎng)介質(zhì)體積減少和兀長的色譜柱加載；
[0006] C.允許使用逐步或梯度洗脫來純化；
[0007] d.在單一容器中在全自動(dòng)條件下進(jìn)行所有W上操作W允許無人值守式操作。
[0008] 本發(fā)明提供一種用于通過在新穎系統(tǒng)中合并所有W上關(guān)鍵要素來控制祀蛋白制 造成本的新穎解決方案，所述新穎系統(tǒng)主要可W用于制造在營養(yǎng)介質(zhì)中分泌的祀蛋白類 型，更具體地說如單克隆抗體的大劑量產(chǎn)品，其中資金成本要求明顯降低并且可能的操作 成本最低，并且用于開發(fā)和制造新產(chǎn)品的周轉(zhuǎn)時(shí)間最短。更一股地說，本發(fā)明可W用于匯 集、收集并且純化所表達(dá)的或在任何純化階段的任何重組物質(zhì)。代表性實(shí)例將是匯集并濃 縮在蛋白質(zhì)再折疊階段的祀蛋白。
[0009] 所主張的新穎下游處理系統(tǒng)不是已知技術(shù)的明顯結(jié)果；必須創(chuàng)建若干新穎步驟、 硬件組件和方法W使該個(gè)系統(tǒng)功能達(dá)到最佳。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 藥物生產(chǎn)批量大小根據(jù)CFR 21 (聯(lián)邦注冊代碼）定義為各成分的均勻混合物。"批 量"或"批次"如WHO GMP準(zhǔn)則（TRS 908附件4)中定義為"在單一工藝或一系列工藝中處理 W使得其預(yù)計(jì)為均勻的所定義數(shù)量的起始材料、包裝材料或產(chǎn)品。有時(shí)可能必需將批量劃 分成多個(gè)次批量，然后一起引入該些次批量W形成最終均勻批量。在最終滅菌的情況下，通 過高壓蓋的容量確定批量大小。在連續(xù)制造過程中，所述批量必須對(duì)應(yīng)于所定義的生產(chǎn)部 分，w其預(yù)期均勻性為特征。批量大小可w定義為固定數(shù)量或w固定時(shí)間間隔產(chǎn)生的量"。
[0011] 在制造更小的次批量并且將其匯集在一起的那些情況下，需要將它們合并在更大 的容器中，在所述容器中，次批量可W混合為均勻混合物。然而，在許多情況下，更大的容器 可W是禁止使用的，例如在潔凈室中，并且因此存在發(fā)明將允許在容器之間混合并且不需 要在更大容器中混合整個(gè)內(nèi)含物的系統(tǒng)的未得到滿足的需求。
[0012] 混合多個(gè)容器的內(nèi)含物的想法還提供許多重要的財(cái)務(wù)和調(diào)節(jié)優(yōu)點(diǎn)。
[0013] 在合并更小的次批量W產(chǎn)生更大批量方面存在其它優(yōu)點(diǎn)。藥物制造科學(xué)教示我們 改變批量的大小不是簡單的練習(xí)。隨著批量大小改變，混合動(dòng)力學(xué)W及在制造工藝中發(fā)生 的任何反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)也改變，并且因此，需要制造者進(jìn)行研究W驗(yàn)證制造條件，從而確保特 定的批量大小將始終如一地產(chǎn)生相同產(chǎn)品。因此，制造者需要投入大量的時(shí)間和金錢來驗(yàn) 證不同批量大小，W符合其針對(duì)特定產(chǎn)品數(shù)量的需要。
[0014] 使用生物反應(yīng)器生物制造例如蛋白質(zhì)等產(chǎn)品面對(duì)甚至更大的挑戰(zhàn)，因?yàn)樯锓磻?yīng) 器容器中的液體（營養(yǎng)介質(zhì)和生物培養(yǎng)物）體積的改變顯著改變了始終如一地產(chǎn)生產(chǎn)品所 需的條件。具有顯著重要性的因素包括容器的幾何形狀、氣化量、液體的量和攬動(dòng)性質(zhì)并且 因此，除非實(shí)踐制造工藝并且對(duì)制造工藝的各種參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)校正，否則不可能預(yù)測制造 工藝的行為。
[0015] 因?yàn)楫a(chǎn)品的制造者通常面對(duì)一次制造更大或更小批量的選擇，所W所進(jìn)行的最明 顯的練習(xí)是驗(yàn)證若干批量大小并且基于當(dāng)前制造需要使用特定批量大小。不同批量大小的 使用還需要制造可用的不同大小的器皿，和生物反應(yīng)器的其它技術(shù)附接件，使維持若干經(jīng) 驗(yàn)證批量大小的成本極高。然而，因?yàn)殪氲鞍字圃熳畎嘿F并且通常具有較短的存放期，因此 制造者不可避免的不維持若干經(jīng)驗(yàn)證批量大小。
[0016] 因?yàn)樯锓磻?yīng)器主要采用液體內(nèi)含物，所W它們更容易混合并且尋找W將符合 FDA根據(jù)CFR 21針對(duì)單一批量的要求的方式混合若干生物反應(yīng)器的內(nèi)含物的解決方案將 通過降低驗(yàn)證所需的批量的數(shù)量并且向制造者提供在制造設(shè)備中使用更少的變化形式隨 意生產(chǎn)不同批量大小的靈活性，顯著降低制造成本。
[0017] 不存在教示關(guān)于使用小得多的混合器皿W連續(xù)方式合并若干生物反應(yīng)器的內(nèi)含 物W構(gòu)成單一批量的現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明不僅解決降低生產(chǎn)成本的該個(gè)關(guān)鍵障礙，而且教示 商用級(jí)應(yīng)用，其中可W使用用于混合液體的低成本解決方案來處理成百上千升液體。本發(fā) 明提供用于從若干生物反應(yīng)器合并極大體積的營養(yǎng)介質(zhì)的兩步法；首先，將所有生物反應(yīng) 器倒入小型混合充實(shí)室中，所述充實(shí)室然后將液體引入到與生物反應(yīng)器的大小相比小得多 的容器中。并不打算固持而是打算連續(xù)地混合并且排放出營養(yǎng)介質(zhì)和生物培養(yǎng)物，并且通 過將活性祀蛋白結(jié)合到能夠結(jié)合其的樹脂，僅保留活性祀蛋白。
[0018] 本發(fā)明提供祀蛋白的連續(xù)混合捕捉。傳統(tǒng)上，在祀蛋白已經(jīng)在生物反應(yīng)器中表達(dá) 之后，收集和純化工藝目前需要分離細(xì)胞，減少營養(yǎng)介質(zhì)的體積并且加載色譜柱。所有該些 都是極其費(fèi)時(shí)的步驟，引起所表達(dá)的祀蛋白的大量降解并且需要極大的資本投資。
[0019] 本發(fā)明組合所有工藝，更具體地說針對(duì)如單克隆抗體的祀蛋白，通過首先使用能 夠結(jié)合祀蛋白的色譜介質(zhì)捕捉所表達(dá)的祀蛋白并且然后棄去營養(yǎng)介質(zhì)和生物培養(yǎng)物；然后 洗涂祀蛋白和色譜介質(zhì)的復(fù)合物并且最后洗脫，從而使用其中排放有生物反應(yīng)器的單式下 游生物處理器獲得祀蛋白的高度純化形式。
[0020] 本發(fā)明利用許多能夠大量結(jié)合祀蛋白的樹脂的新近可用性。大多數(shù)現(xiàn)代樹脂每毫 升樹脂將結(jié)合20mg到125mg的祀蛋白。該些樹脂中的多數(shù)對(duì)祀蛋白具有高度特異性并且其 中多數(shù)可W合并W通過簡單的物理化學(xué)結(jié)合工藝從溶液中移出任何類型和數(shù)量的祀蛋白， 所述結(jié)合工藝強(qiáng)到足W在從生物反應(yīng)器去除營養(yǎng)介質(zhì)的同時(shí)保持祀蛋白與樹脂連接。所述 技術(shù)在祀蛋白純化領(lǐng)域中也有了巨大進(jìn)展，其中我們現(xiàn)在具有更好的能力通過調(diào)節(jié)洗脫緩 沖液的抑、離子強(qiáng)度或其它特征來破壞樹脂與祀蛋白之間的結(jié)合，從樹脂洗脫該些結(jié)合祀 蛋白。該允許W高度濃縮的溶液形式從生物反應(yīng)器移出祀蛋白，所述高度濃縮的溶液已準(zhǔn) 備好進(jìn)一步純化并且在一些情況下其甚至可W是供使用的最終產(chǎn)物。
[0021] 親和色譜法是基于分子構(gòu)象的分離技術(shù)，其常常利用應(yīng)用特異性樹脂。該些樹脂 具有連接到其表面的配體，其對(duì)有待分離的化合物具有特異性。最經(jīng)常地，該些配體W類似 于抗體-抗原相互作用的方式起作用。配體與其祀化合物之間的該種"鎖與鑰匙"配合使 其具有高度特異性。
[0022] 許多膜產(chǎn)品是糖蛋白并且可W通過凝集素親和色譜法純化?？蒞使清潔劑溶解產(chǎn) 品結(jié)合到已經(jīng)改性W具有共價(jià)連接的凝集素的色譜樹脂。
[0023] 免疫親和色譜樹脂采用抗體與祀蛋白的特異性結(jié)合W選擇性地純化祀蛋白。所述 程序涉及將抗體固定到柱材料，所述柱材料然后選擇性結(jié)合祀蛋白，而一切別的東西流動(dòng) 通過。
[0024] 樹脂結(jié)合技術(shù)的一些現(xiàn)有技術(shù)水平包括：
[00巧]a.諾維信（Novozymes)的新專利雙重親和多膚技術(shù)平臺(tái)用類似的但一次性技術(shù) 替換蛋白A工藝步驟。
[0026] b.來自密理博公司（Millipore Co巧.）的刺激反應(yīng)性聚合物能夠復(fù)合并操控祀 蛋白并且允許控制聚合物與祀蛋白復(fù)合物的可溶性，該導(dǎo)致在無離也機(jī)或蛋白A介質(zhì)的情 況下直接捕捉產(chǎn)物。
[0027] C.用于替換傳統(tǒng)的蛋白A和離子交換的混合模式吸附劑，用于提高選擇性和能力 并且降低滯留時(shí)間。該些具有新穎化學(xué)性質(zhì)的介質(zhì)包括疏水電荷誘導(dǎo)色譜，例如MEP和來 自帕爾公司（Pall Corp.)的 Q 與 S HyperCel。
[0028] d.整料，包括呈單件均勻柱形式的色譜介質(zhì)，例如來自BIA分離炬IA S巧arations)的對(duì)流作用介質(zhì)整體柱。
[0029] e.模擬移動(dòng)床，包括多柱逆流色譜，例如來自培邦生物系統(tǒng)（Ta巧on Biosystems) 的 BioSMB。
[0030] f.蛋白G(多個(gè)供應(yīng)商）。
[0031] g. IgG的單域駱駝衍生（駱駝科動(dòng)物）的抗體，例如來自BAC的Cap化reSelect。
[0032] h.新的無機(jī)配體，包括合成染料，例如來自普洛梅特生物科學(xué)（Prometic Biosciences)的 Mabsorbent A1P 和 A2P。
[0033] i.擴(kuò)展床吸附色譜系統(tǒng)，例如來自厄普弗朗特色譜化時(shí)ront化romatography) 的Miobust平臺(tái)。
[0034] j.來自茲克羅分離狂ir化rom S巧arations)的超耐久氧化鉛結(jié)合親和配體色譜 介質(zhì)。
[0CK3日]k.來自泰克諾格（Tecnoge)的化受體模擬配體。
[0036] 1.來自奈莎膜技術(shù)（Nysa Membrane Technologies)的 ADSEPT (先進(jìn)分離技術(shù)）。
[0037] m.來自藥物純化技術(shù)（Pure化arm Technologies)的膜親和純化系統(tǒng)。
[0038] n.來自普洛梅特生物科學(xué)、戴克斯值yax)等用于親和色譜法的?？谠O(shè)計(jì)的膚配 體。
[003引 0.涂有蛋白A和蛋白G的磁珠，例如來自茵維特羅根化vitrogen) /戴諾 值ynal)。
[0040] P.得到羅氏（Roche)(基因泰克（Genentech))許可的基于碑1蛋白或MAb的表達(dá)為 具有對(duì)色譜介質(zhì)具有親和力的可移動(dòng)的部分（標(biāo)簽）（例如組氨酸標(biāo)簽）的融合祀蛋白的 新的親和純化方法。
[0041] q.開發(fā)過程中的蛋白A替代物，包括反膠束（脂質(zhì)體）、液體營養(yǎng)介質(zhì)萃取系統(tǒng)、 結(jié)晶、固定化金屬親和色譜和新穎的膜色譜系統(tǒng)。
[0042] r.來自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)師Healthcare)的具有一次性組分的即插即用解決 方案（例如，ReadyToProcess)、具有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力的工藝開發(fā)AKTA和多柱連續(xù)捕捉。
[0043] 出人意料的是，雖然已經(jīng)在設(shè)計(jì)可用W捕捉祀蛋白的樹脂方面取得了重大進(jìn)展， 但是一直W來該些僅用于下游純化處理。向祀蛋白和宿主細(xì)胞的粗混合物中添加樹脂將無 異于教示首先濃縮營養(yǎng)介質(zhì)并且然后在所有雜質(zhì)都在所述營養(yǎng)介質(zhì)中的情況下將其加載 到柱上的當(dāng)前實(shí)踐。
[0044] W產(chǎn)生Img/血祀蛋白并且所用樹脂的結(jié)合能力是50mg/血的細(xì)胞系為目標(biāo)，當(dāng)操 作1000L生物反應(yīng)器時(shí)，該將需要2化樹脂。適用于制造單克隆抗體的樹脂的成本可在每 升例如蛋白A$15-$20, 000的范圍內(nèi)。因此，大多數(shù)制造者將寧可使用更小數(shù)量的樹脂執(zhí)行 若干次批量的純化。然而，考慮到該些可W使用數(shù)百次，使用成本容易攤銷并且避免了制備 次批量過程中的兀長乏味和調(diào)節(jié)障礙。
[0045] 可W根據(jù)本發(fā)明處理的生物組分描述在W下各段中并且包括（但不限于）來源于 W下來源的細(xì)胞培養(yǎng)物：例如動(dòng)物（例如，倉鼠、小鼠、豬、兔、狗、魚、郵、線蟲和人類）、昆蟲 (例如蛾和蝴蝶）、植物（例如，藻類、玉米、番茄、水稻、小麥、大麥、首薦、甘藏、大豆、馬鈴 墓、窩宦、羽扇豆、煙草、油菜巧（芥花）、向日葵、憲菁、甜菜甘藏糖蜜、種子、紅花和花生）和 人類。唯一的要求是所用生物培養(yǎng)物應(yīng)該通過在營養(yǎng)介質(zhì)中分泌祀蛋白來表達(dá)祀蛋白，與 在一些情況下形成包涵體截然相反。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 本發(fā)明提供一種將多個(gè)預(yù)驗(yàn)證較小規(guī)模的生物反應(yīng)器連接到下游生物處理裝置 的方式，所述生物處理裝置固持能夠結(jié)合生物反應(yīng)器的營養(yǎng)介質(zhì)中的祀蛋白的色譜介質(zhì)W 備收集。營養(yǎng)介質(zhì)和生物培養(yǎng)物允許進(jìn)入下游生物處理裝置，引起色譜介質(zhì)向上漂浮并且 由此建立擴(kuò)展床色譜系統(tǒng)。在本發(fā)明中提供對(duì)經(jīng)典擴(kuò)展床色譜的顯著改性，其中色譜樹脂 保持在整個(gè)容器中均勻分布的連續(xù)狀態(tài)，容器例如圓筒，其固持營養(yǎng)介質(zhì)、生物培養(yǎng)物和色 譜介質(zhì)。該種改性對(duì)下游生物處理裝置的成功W及對(duì)無人值守式和自動(dòng)地操作所述裝置是 至關(guān)重要的。
[0047] 隨著營養(yǎng)介質(zhì)和生物培養(yǎng)物上升到下游生物處理裝置的頂部，該些物質(zhì)流出而色 譜介質(zhì)固持在下游生物處理裝置中，因?yàn)樵谙掠紊锾幚硌b置中安裝了過濾器；過濾器的 孔隙度小于色譜樹脂的大小（一股來講50微米到300微米）。通過祀蛋白的結(jié)合能力的先 前實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確計(jì)算色譜介質(zhì)（例如蛋白A樹脂）的數(shù)量，可W確保整個(gè)數(shù)量的祀蛋白結(jié)合到 色譜介質(zhì)。然而，充分地認(rèn)識(shí)到需要一定的反應(yīng)時(shí)間來發(fā)生結(jié)合，因此必須小也地控制營養(yǎng) 介質(zhì)從生物反應(yīng)器進(jìn)入下游生物處理裝置的流速；用于校正流速的一種測試是測量到達(dá)下 游生物處理裝置的頂部并且傾析的營養(yǎng)介質(zhì)中的重組產(chǎn)物濃度。連續(xù)監(jiān)測祀蛋白的濃度將 允許調(diào)節(jié)流速。一股來講，流出的營養(yǎng)介質(zhì)不應(yīng)該含有超過進(jìn)入濃度的1%的祀蛋白；對(duì)進(jìn) 入的營養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行采樣并且將其用作參考同時(shí)將離開裝置的營養(yǎng)介質(zhì)處理為測試頂目，判 定該點(diǎn)。只有當(dāng)進(jìn)入和出去介質(zhì)之間的濃度比是1 : 100時(shí)，才允許營養(yǎng)介質(zhì)流過；一股來 講，截止范圍將是1 : 100到2 : 100,從而保存最大數(shù)量的祀蛋白并且提供最高的裝置效 率。
[0048] 在整個(gè)營養(yǎng)介質(zhì)和生物培養(yǎng)物從多個(gè)生物反應(yīng)器移出并且穿過下游生物處理裝 置之后，在底部出口密封生物反應(yīng)器。通過裝置底部的入口添加洗涂緩沖液洗涂下游生物 處理裝置中的祀蛋白-介質(zhì)復(fù)合物并且允許從頂端流出直到移出預(yù)定層殘?jiān)鼮橹?。然后?著引入洗脫緩沖液W破壞介質(zhì)與祀蛋白之間的結(jié)合，通過使洗脫緩沖液穿過底端并且收集 通過上端的純祀蛋白溶液或通過使色譜介質(zhì)在下游生物處理裝置中沉降下來并且使洗脫 緩沖液穿過壓實(shí)的色譜介質(zhì)床并且收集通過底端的純祀蛋白溶液。
[0049] W上發(fā)明W該樣的方式操作，其中僅使用重力流，通過將下游生物處理裝置的入 口端口放置在生物反應(yīng)器出口端口層的下方，將營養(yǎng)介質(zhì)從生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)移到下游生物處 理裝置。將生物反應(yīng)器放置在下游生物處理裝置周圍并且使用相同長度的連接管可W均勻 地維持遍及多個(gè)生物反應(yīng)器的流速。顯然，存在許多用于輸送營養(yǎng)介質(zhì)到下游生物處理裝 置的機(jī)械構(gòu)件，并且該些機(jī)械構(gòu)件包括使用同樣可W適用的各種粟。然而，重力的使用確保 轉(zhuǎn)移工藝期間祀蛋白的降解降到最低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050] 圖1顯示所主張的下游處理裝置的截面?zhèn)纫晥D。
[0051] 所主張的裝置具有其最佳操作所需的許多獨(dú)特并且特殊的特征。其包含圓筒1，充 當(dāng)營養(yǎng)介質(zhì)的主要處理空間的圓柱形硬壁容器；和從多個(gè)生物反應(yīng)器進(jìn)入圓筒1的生物培 養(yǎng)物2。圓筒1的體積在一些情況下出于一種原因是重要的并且在另一種情況下出于另一 種原因是重要的。當(dāng)對(duì)其進(jìn)行操作W執(zhí)行為擴(kuò)展床色譜系統(tǒng)，從而捕捉并且純化祀蛋白時(shí)， 圓筒1的高度對(duì)于隨著營養(yǎng)介質(zhì)向上流過柱色譜樹脂3有足夠的停留時(shí)間來說很重要。圓 筒1的體積最佳是圓筒1中的色譜樹脂3的體積的至少1. 5倍到3倍。一股來講，圓筒1 的直徑和其高度的最佳關(guān)系還將從祀蛋白與色譜樹脂的結(jié)合效率的簡單研究來建立；該些 研究是特異性結(jié)合反應(yīng)并且盡管樹脂的結(jié)合能力可W是已知的，但是結(jié)合率將取決于許多 因素，包括允許接觸的時(shí)間、營養(yǎng)介質(zhì)的溫度和營養(yǎng)介質(zhì)的攬動(dòng)情況。應(yīng)該意識(shí)到所主張的 裝置提供一種用于使祀蛋白結(jié)合到色譜樹脂的擴(kuò)展色譜柱；允許結(jié)合的時(shí)間越長，結(jié)合程 度將越高；然而，柱高度的物理限制和如下文關(guān)于祀蛋白的純化所論述的其它考慮因素將 限制所用圓筒1的高度。
[0052] 通過提供多孔結(jié)構(gòu)小于色譜樹脂3個(gè)的直徑的底部過濾器4將色譜樹脂3滯留在 圓筒1中；所述多孔結(jié)構(gòu)一股來講應(yīng)該是50微米到300微米；請(qǐng)注意在典型色譜制備型柱 中，使用通常需要施加壓力或需要非常長的時(shí)間使緩沖液穿過色譜樹脂床的非常細(xì)的過濾 器。通過底蓋5將底部過濾器4保持在適當(dāng)?shù)奈恢?，所述底蓋可W移開W便完全cGMP清潔 裝置W及移出色譜介質(zhì)3,所述色譜介質(zhì)再使用。底蓋5具有底部液體端口 6,其一股來講 將在頂蓋的中也中；底部液體端口 6具有底部采樣端口 7,其又具有用于開始和停止?fàn)I養(yǎng)介 質(zhì)的流動(dòng)的底部采樣端口控制閥8和用于在采樣之前去除生物培養(yǎng)物的過濾器9。底部液 體端口 6具有底部流量控制閥10,并且連接到充實(shí)室11，所述充實(shí)室具有多個(gè)端口 12和連 接到充實(shí)室端口 11中的每一個(gè)的控制閥13 ;充實(shí)室11能夠連接到其它生物反應(yīng)器和洗涂 或洗脫緩沖液的來源并且還用于使洗涂緩沖液或洗脫緩沖液離開裝置。
[0053] 圓筒1的頂側(cè)還設(shè)置有用于保持色譜樹脂3的頂部過濾器14 ;通過頂蓋15將頂 部過濾器14保持在適當(dāng)?shù)奈恢?，所述頂蓋具有至少一個(gè)上部液體端口 16,其連接到上部采 樣端口 17和用于開始并停止?fàn)I養(yǎng)介質(zhì)的采樣的上部采樣端口閥18和用于在采樣之前去除 生物培養(yǎng)物的過濾器19。上部液體端口 16連接到上部流量控制閥20,其然后排出營養(yǎng)介 質(zhì)并且還用于在填充柱模式純化方案中引入洗脫緩沖液。
[0054] 在圓筒1的內(nèi)部安裝螺旋體21，其通過螺旋軸22連接到放置在圓筒1外部的電動(dòng) 機(jī)23 ;軸22穿過安裝在頂部過濾器14的中也中的密封滾珠軸承24并且穿過頂蓋15的中 也中的孔；螺旋軸22的底部安置在嵌入在底部過濾器4中的螺旋軸插口 25中；當(dāng)螺旋體旋 轉(zhuǎn)時(shí)，該有助于防止螺旋體擺動(dòng)。
[0055] 螺旋體18是所主張的發(fā)明的關(guān)鍵要素；其形狀是圓錐形，其中較大的葉片在底部 并且較小的葉片在頂部。因?yàn)槭褂寐菪w的目的是提供液體向上的層流運(yùn)動(dòng)，所W在底部 與在頂部的葉片的直徑比是關(guān)鍵。最佳地，底部葉片將覆蓋圓筒1的直徑的約80%并且頂 部葉片將是圓筒1的直徑的約20%。當(dāng)W介于Irpm到20rpm范圍內(nèi)的緩慢速度旋轉(zhuǎn)時(shí)，其 W保持營養(yǎng)介質(zhì)層流的掃描移動(dòng)引起營養(yǎng)介質(zhì)從底部到頂部的溫和運(yùn)動(dòng)。該通過保持營養(yǎng) 介質(zhì)均勻地息浮在整個(gè)圓筒中產(chǎn)生新穎的色譜樹脂流化床。沒有該種特征，樹脂與祀蛋白 之間的接觸效率降到最低并且捕捉祀蛋白的效率降低。隨著色譜樹脂與祀蛋白變得飽和， 該變得更加重要。該種創(chuàng)新元素提供一種完全飽和色譜樹脂同時(shí)維持營養(yǎng)介質(zhì)的快速流動(dòng) 的方法。
[0056] 維持圓筒中的雷諾數(shù)巧巧nolds number ;Re)小于10, 000很重要；該個(gè)數(shù)值由攬 拌容器中的密度、粘度、攬動(dòng)器的直徑、攬動(dòng)器的轉(zhuǎn)速（rpm)該五種因素通過W下方程式確 定：
[0057] Re = [(pND2)/u ]，其中P是密度并且y是粘度；ND是速度，D是直徑并且 N是轉(zhuǎn)速（RPMKR.K.辛諾特化K. Sinnott)庫爾森和理查森的化學(xué)工程（Coulson & Richardson' s Chemical Engineering)，第 6 卷：化學(xué)工程設(shè)計(jì)（Chemical Engineering Desi即），第4版（己特沃斯-海涅曼炬utterworth-Heinemann))第473頁]。
[0058] 圓筒1具有用于保持營養(yǎng)介質(zhì)在最佳溫度的附加的加熱或冷卻構(gòu)件26 ;值得注意 的是，所主張的裝置提供營養(yǎng)介質(zhì)的連續(xù)流動(dòng)但流速是較慢的速度并且因此有可能維持一 定溫度，給出與圓筒1的壁的熱交換的標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)。描述各種方法并且所述方法包括使用夾 套圓筒1、用加熱或冷卻毯包裹圓筒1、當(dāng)目的是加熱內(nèi)含物時(shí)使圓筒暴露于紅外燈W及在 本領(lǐng)域中普遍地可用的許多其它裝置。
[0059] 所主張的裝置豎直地放在支座27上，所述支座一股是環(huán)架但將研究適合于將所 主張的裝置牢牢地放置在豎直位置的任何其它構(gòu)件。值得注意的是，所主張的發(fā)明采用將 營養(yǎng)介質(zhì)從生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)移到所主張的裝置的重力流方法；出于該個(gè)原因，支撐構(gòu)件26應(yīng) 該具有該樣的機(jī)械性質(zhì)，其將允許所主張的發(fā)明安置在低于生物反應(yīng)器的最低部分的那一 層，營養(yǎng)介質(zhì)從生物反應(yīng)器的最低部分移出并且轉(zhuǎn)移到所主張的發(fā)明。
[0060] W上在圖中所描述的祀蛋白收集和純化裝置一股在生物反應(yīng)器周期結(jié)束時(shí)使用， 其中多個(gè)生物反應(yīng)器同時(shí)連接到所主張的裝置。每一個(gè)裝置中所含色譜介質(zhì)的量將通過祀 蛋白的結(jié)合效率容易地計(jì)算。舉例來說，蛋白A色譜介質(zhì)顯示30mg/mL到50mg/mL色譜介 質(zhì)的結(jié)合。假定在2,00化生物反應(yīng)器中使用1，00化營養(yǎng)介質(zhì)并且生產(chǎn)周期已經(jīng)結(jié)束，CH0 不再產(chǎn)生足夠數(shù)量的祀蛋白的時(shí)刻。進(jìn)一步假定重組細(xì)胞系的生產(chǎn)力是約1G/L ;因此，在 此情況下，將在營養(yǎng)介質(zhì)溶液中移出并且純化約1000G祀蛋白。
[0061] 在理論的基礎(chǔ)上，假定結(jié)合下端是30mg/mU將需要約3化色譜介質(zhì)來結(jié)合溶液中 實(shí)質(zhì)上所有的祀蛋白。應(yīng)該注意到，雖然蛋白A對(duì)單克隆抗體具有相當(dāng)大的特異性，但是有 可能色譜介質(zhì)的結(jié)合能力將由于營養(yǎng)介質(zhì)中其它組分的結(jié)合而受損。該可W容易地通過W 下加 W研究：抽取小體積的營養(yǎng)介質(zhì)并且向其中添加遞增量的所用色譜介質(zhì)直到溶液中祀 蛋白的濃度達(dá)到預(yù)定低值為止。該將稱作滴定營養(yǎng)介質(zhì)。
[0062] 本發(fā)明合并多個(gè)生物反應(yīng)器的處理，舉例來說，如上所述，每一個(gè)需要3化體積的 蛋白A來純化祀蛋白。假定合并五個(gè)生物反應(yīng)器的內(nèi)含物，該將需要16化色譜樹脂并且 考慮到應(yīng)該是主要固持容器體積的至少兩倍，將需要23化來處理500化營養(yǎng)介質(zhì)；合并 500化介質(zhì)的傳統(tǒng)系統(tǒng)將在500化容器中合并單獨(dú)的體積，該是一種昂貴的練習(xí)。實(shí)際上， 在本發(fā)明中所需要的全部就是小于10%所述大小的容器。
[0063] 在W上實(shí)例中使用本發(fā)明，將允許營養(yǎng)介質(zhì)從若干個(gè)生物反應(yīng)器進(jìn)入所主張的裝 置的主容器中，在所述容器中，隨著營養(yǎng)介質(zhì)從底部上升通過過濾盤，祀蛋白將結(jié)合到色譜 樹脂，所述過濾盤截留色譜介質(zhì)W免離開容器；在頂部的另一個(gè)過濾器將介質(zhì)截留在頂端。 成功捕捉步驟的關(guān)鍵是允許流動(dòng)營養(yǎng)介質(zhì)處于允許最佳結(jié)合的速率。溫和混合是本發(fā)明到 關(guān)鍵并且該通過推動(dòng)營養(yǎng)介質(zhì)向上的螺旋葉片的新穎設(shè)計(jì)來提供。
[0064] 最佳處理將從營養(yǎng)介質(zhì)移出實(shí)質(zhì)上所有祀蛋白；為了確保該一點(diǎn)，本發(fā)明引入自 動(dòng)化系統(tǒng)，其控制安裝在裝置兩端的流量控制閥；雙重采樣方法，其中對(duì)進(jìn)入的營養(yǎng)介質(zhì)和 出去的營養(yǎng)介質(zhì)連續(xù)采樣并且使用進(jìn)入的營養(yǎng)介質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，容易計(jì)算流出所述裝置并且 棄去的營養(yǎng)介質(zhì)中祀蛋白的數(shù)量。如果所排出的液體中祀蛋白的濃度上升，那么關(guān)閉閥口 并且將營養(yǎng)介質(zhì)截留在主容器中直到達(dá)到完全結(jié)合為止。假設(shè)大量營養(yǎng)介質(zhì)流出，那么本 發(fā)明中所述的自動(dòng)化系統(tǒng)允許自動(dòng)化操作，該是大規(guī)模商業(yè)制造的關(guān)鍵要求。
[0065] 本發(fā)明引入自動(dòng)處理批量的系統(tǒng)，其中在營養(yǎng)介質(zhì)的入口點(diǎn)和出口點(diǎn)該兩個(gè)點(diǎn)連 續(xù)地測量祀蛋白的濃度；使樣品首先通過截留任何生物培養(yǎng)物的過濾器過濾W降低息浮粒 子的干擾。使用入口點(diǎn)的營養(yǎng)介質(zhì)作為參考樣品并且出口點(diǎn)的營養(yǎng)介質(zhì)充當(dāng)分光光度檢 測裝置中的樣品。檢測技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中普遍可獲得并且不是所主張的。（M.H.西莫尼 安（M.H.Simonian),分光光度測定蛋白質(zhì)濃度（Spectro地otometric determination of protein concentration),細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南（Qirr. Protocol. Cell Biol),附錄 3b, 2002)。使用在280皿A(280)和205皿A(205)測量的吸光度，通過與參考比較來計(jì)算蛋 白質(zhì)濃度；但在本發(fā)明中，目的不是測量濃度而是參考與標(biāo)準(zhǔn)之間的相對(duì)濃度?？紤]到介 質(zhì)中將存在溶解的雜質(zhì)和溶菌液和不純蛋白質(zhì)，可W使用A(280)和A(205)方法。可W使 用光譜英光計(jì)或?yàn)V光英光計(jì)來測量樣品溶液的固有英光發(fā)射；將該個(gè)值與參考溶液的發(fā)射 進(jìn)行比較W確定相對(duì)濃度。存在兩種比色方法：布拉德福比色法炬ra壯ord colorimetric method),基于染料考馬斯亮藍(lán)（Coomassie brilliant blue)與相關(guān)蛋白的結(jié)合；和勞里法 (Lowry method),其測量蛋白質(zhì)樣品中酪氨醜基殘基的比色反應(yīng)。然而，本發(fā)明不限制所用 檢測方法的類型；在不斷發(fā)展的蛋白質(zhì)檢測科學(xué)的情況下，有可能設(shè)計(jì)包括分光光度法、英 光測定法、紅外或激光的一連串試驗(yàn)，從而提供營養(yǎng)介質(zhì)中祀蛋白濃度的相對(duì)測量結(jié)果。
[0066] 在整個(gè)營養(yǎng)介質(zhì)已經(jīng)穿過容器之后，使用洗涂緩沖液來替換營養(yǎng)介質(zhì)W在連續(xù)的 基礎(chǔ)上洗掉色譜樹脂，在此之后，W類似方式引入洗脫緩沖液W在穿過頂部液體端口的流 出物中收集經(jīng)純化祀蛋白溶液。然而，若干種其它純化方法可用于在同一裝置設(shè)計(jì)內(nèi)使用。 其中一種需要使洗脫緩沖液停留在容器中持續(xù)一段時(shí)間W允許色譜介質(zhì)與祀蛋白之間的 結(jié)合完全分解并且然后去除穿過底部液體端口的洗脫緩沖液。或者，可W從底部液體端口 排出洗涂緩沖液并且當(dāng)洗脫緩沖液可W通過頂部液體端口引入時(shí)，使色譜樹脂沉降下來作 為填充柱，并且允許洗脫緩沖液W單一緩沖液形式或W梯度洗脫緩沖液形式穿過色譜樹脂 床，W收集洗脫緩沖液的各個(gè)部分并且合并含有最高濃度和最少雜質(zhì)的部分，從而得到最 終處理產(chǎn)物。
[0067] 在第一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種符合U. S. FDA CFR 21定義合并若干個(gè)次批量W 產(chǎn)生大的單一批量的方法，通過允許使用更小的生物反應(yīng)器降低生產(chǎn)成本，降低較大批量 變壞的風(fēng)險(xiǎn)并且消除具有若干種大小的生物反應(yīng)器W及用于混合若干個(gè)生物反應(yīng)器的內(nèi) 含物的較大容器的資金成本。該種新穎方法使甚至小型公司都可能W最低的資金和運(yùn)作成 本開發(fā)并制造大商業(yè)規(guī)模批量。
[0068] 本發(fā)明排除了在產(chǎn)生較大數(shù)量的祀蛋白時(shí)安裝較大生物反應(yīng)器的需求。通過允許 多個(gè)生物反應(yīng)器的內(nèi)含物在進(jìn)入所主張的裝置之前在充實(shí)室中混合來滿足混合較小次批 量W制造較大批量的調(diào)節(jié)遵從性；其次，隨著多個(gè)生物反應(yīng)器的整個(gè)內(nèi)含物穿過含有固定 數(shù)量的色譜樹脂的所主張的裝置，所捕捉的祀蛋白W更小的體積量構(gòu)成單一批量并且由此 減少了與處置大容器相關(guān)的問題。
[0069] 在第二實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種在收集祀蛋白的過程中避免若干個(gè)步驟的方 法，包括分離細(xì)胞、減小營養(yǎng)介質(zhì)的體積并且加載色譜柱，所有該些實(shí)質(zhì)上都增加了設(shè)備的 資金成本、設(shè)備的運(yùn)作成本、用于完成該些步驟和引起祀蛋白降解所需的兀長時(shí)間。在本發(fā) 明中，含有宿主細(xì)胞和祀蛋白的營養(yǎng)介質(zhì)用裝置中所含的將結(jié)合所有或?qū)嵸|(zhì)上所有帶電或 不帶電分子物質(zhì)的色譜介質(zhì)或色譜介質(zhì)的組合經(jīng)歷非特異性或特異性處理，該個(gè)步驟之后 是通過用洗涂緩沖液簡單地洗涂色譜介質(zhì)-祀蛋白復(fù)合物，從所述復(fù)合物去除細(xì)胞和其它 組分的殘?jiān)?br> [0070] 本發(fā)明由此排除了在收集產(chǎn)物過程中的主要障礙，所述障礙涉及使用細(xì)濾器濾出 不大于5 y的宿主細(xì)胞，從而截留例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞等宿主細(xì)胞。當(dāng)使用大體積介質(zhì) 時(shí)，該個(gè)工藝耗費(fèi)非常長的時(shí)間，增加了過濾器、粟、容器和空間管理的巨大成本。該個(gè)步驟 然后一股接著濃縮步驟，在濃縮步驟中，使用錯(cuò)流或微濾工藝，將營養(yǎng)介質(zhì)的體積最多減少 到其體積的十分之一，該耗費(fèi)非常長的時(shí)間來完成并且再次增加了設(shè)備和人力的巨大成本 并且在一些情況下引起祀蛋白降解。
[0071] 本發(fā)明將該兩個(gè)步驟合并成一個(gè)簡單步驟。爭論是如果打算從含有宿主細(xì)胞的復(fù) 合物混合物收集并濃縮祀蛋白，那么為何從混合物移出祀蛋白而不是去除W大得多的數(shù)量 存在的其它組分不是更有效。將此視為逆向教示。
[0072] 在本發(fā)明中，采用祀蛋白的那些特有的特征W通過與色譜介質(zhì)或色譜介質(zhì)的混合 物的非特異性結(jié)合而將它們與混合物的其余部分分離。顯然，該樣非特異性捕捉祀蛋白還 將捕捉混合物的其它組分并且僅僅需要使用更大數(shù)量的色譜介質(zhì)或可W具有對(duì)祀蛋白的 特異性親和力的特定類型的色譜介質(zhì)。祀蛋白-色譜介質(zhì)復(fù)合物的移出是比宿主細(xì)胞的 移出或混合物體積的減少簡單得多的工藝；將研究任何機(jī)械工藝，例如傾析、離也或甚至過 濾。值得注意的是，所有工藝當(dāng)中最慢的將是過濾但可W使用甚至非常大孔徑的過濾器并 且因?yàn)槟康氖鞘占癁V液，不是洗脫液，所W大大降低了制造成本。
[0073] 在第H實(shí)施例中，本發(fā)明允許使用擴(kuò)展床色譜系統(tǒng)在捕捉祀蛋白的相同容器中純 化祀蛋白。擴(kuò)展床色譜系統(tǒng)允許所主張的裝置的連續(xù)操作，提供自動(dòng)化控制，從而W無人值 守式操作獲得捕捉和純化的最高水平。
[0074] 本發(fā)明還可W使用混合床色譜介質(zhì)，其可W含有離子色譜介質(zhì)、疏水性色譜介質(zhì) 和親和色譜介質(zhì)，所有該些一起使用來優(yōu)化收集效率。良好確立了離子色譜介質(zhì)的使用由 于電離的對(duì)數(shù)性質(zhì)因而不允許完全捕捉產(chǎn)物；本發(fā)明中所用的色譜介質(zhì)的組合允許祀蛋白 的更完全回收。
[0075] 在第四實(shí)施例中，本發(fā)明允許使用標(biāo)準(zhǔn)柱純化和梯度洗脫曲線W及逐步洗脫曲線 純化祀蛋白；在該個(gè)比較中，所主張的發(fā)明類似于常規(guī)色譜柱起作用，具有其所有的限制但 是沒有加載柱的兀長步驟。
[0076] 在第五實(shí)施例中，本發(fā)明教示用于將生物反應(yīng)器的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到所主張的裝置的 重力流方法；該種方法使得對(duì)祀蛋白的應(yīng)力相比于按慣例使用蠕動(dòng)粟時(shí)大大減少，并且因 此提高了生產(chǎn)產(chǎn)率。
[0077] 在第六實(shí)施例中，本發(fā)明教示在優(yōu)選地包含圓錐螺旋體的裝置中使用新穎混合組 分，所述螺旋體推動(dòng)液體內(nèi)含物向上同時(shí)維持液體的層流，降低對(duì)祀蛋白的應(yīng)力并且還有 助于維持色譜介質(zhì)的完整性；沒有現(xiàn)有掲示內(nèi)容使用混合系統(tǒng)用于色譜系統(tǒng)。
[0078] 上述實(shí)施例不W任何方式包含可能使用本發(fā)明的所有實(shí)施例并且本領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)許多其它的特定針對(duì)于復(fù)雜工藝的應(yīng)用或甚至應(yīng)用于該類需要可能不是 立即顯現(xiàn)的那些工藝中。
[0079] 不存在關(guān)于使用色譜介質(zhì)來收集祀蛋白的現(xiàn)有技術(shù)；阿羅拉（Arora)等人的在 2007年12月11日頒布的美國專利7306934教示多孔固體離子交換晶片的用途，其用于固 定生物分子，所述晶片包含含有+2價(jià)過渡金屬陽離子的生物分子捕捉色譜介質(zhì)的組合；其 還教示一種分離性生物反應(yīng)器，其包含陽極和陰極、多個(gè)反應(yīng)室，所述反應(yīng)室中的至少一些 由多孔固體離子交換晶片（上述）形成，所述晶片具有生物分子捕捉色譜介質(zhì)與離子交換 色譜介質(zhì)的組合并且具有固定在所述生物分子捕捉色譜介質(zhì)上的基因工程化標(biāo)記的生物 分子，所述多孔固體離子交換晶片中的每一者內(nèi)插在陽離子交換膜與陰離子交換膜之間， W及在陽極與陰極之間提供電勢的機(jī)構(gòu)。本發(fā)明顯著不同于由阿羅拉教示的分離性生物反 應(yīng)器。首先，本發(fā)明并不需要使用電極、具有+2價(jià)過渡陽離子的色譜介質(zhì)或固定化金屬離 子親和色譜法。邸I (電去離子）的使用和標(biāo)簽的特殊使用W及用W去除捕捉的產(chǎn)物（主要 酶）的溶劑的限制性性質(zhì)使得此專利的教示內(nèi)容明顯不同于本發(fā)明。此外，阿羅拉專利添 加了硬件，該增加了處理產(chǎn)物純化的成本，而本發(fā)明將若干個(gè)工藝組合成一個(gè)而無需添加 任何新的成本要素。
[0080] 使用擴(kuò)展床色譜來純化祀蛋白的想法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，例如美國專利 7, 608, 583,其教示使用擴(kuò)展床色譜來純化膜島素。本發(fā)明的新穎方面是將擴(kuò)展床色譜原理 與一種工藝組合，所述工藝合并多個(gè)生物反應(yīng)器的內(nèi)含物、捕捉并且純化祀蛋白。然而，向 傳統(tǒng)色譜法提供多功能性需要若干種創(chuàng)新修改，包括一種將柱中的色譜樹脂截留在兩個(gè)末 端的方法、一種混合色譜柱中的內(nèi)含物的構(gòu)件和一組允許使用逐步和梯度洗脫的端口和控 制件。
[0081] 本文所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括公開、專利申請(qǐng)和專利特此W引用的方式并入， 其引用程度就如同每一個(gè)參考文獻(xiàn)單獨(dú)地并且特定地指示為W引用的方式并入并且全文 闡述于本文中一股。
[0082] 除非本文另外指示或明顯與內(nèi)容相矛盾，否則在描述本發(fā)明的內(nèi)容中（尤其在所 附權(quán)利要求書的內(nèi)容中）使用術(shù)語"一（a/an)"和"所述"和類似指示物應(yīng)理解為涵蓋單數(shù) 與復(fù)數(shù)。除非另外指出，否則術(shù)語"包含"、"具有"、"包括"和"含有"應(yīng)理解為開放式術(shù)語 (即，意指"包括（但不限于）"）。除非本文另外指示，否則本文中值范圍的敘述僅打算充 當(dāng)個(gè)別提及屬于所述范圍內(nèi)的每個(gè)獨(dú)立值的速記方法，并且每個(gè)獨(dú)立值并入本說明書中， 如同在本文中個(gè)別地?cái)⑹鲆还伞３潜疚牧硗庵甘净蛄硗饷黠@與內(nèi)容相矛盾，否則本文所 述的所有方法都可W按任何合適的順序進(jìn)行。除非另外主張，否則本文中所提供的任何和 所有實(shí)例或例示性語言（例如，"例如"）的使用僅打算更好地闡明本發(fā)明并且不對(duì)本發(fā)明 的范圍施加限制。本說明書中的任何語言都不應(yīng)該理解為指示實(shí)施本發(fā)明所必需的任何未 主張要素。
[0083] 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例描述于本文中，包括本發(fā)明人已知的進(jìn)行本發(fā)明的最佳模 式。在閱讀前文描述之后，那些優(yōu)選實(shí)施例的變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W變得顯而 易見。本發(fā)明人期望熟練的業(yè)內(nèi)人±適當(dāng)時(shí)采用此類變化，并且本發(fā)明人打算W不同于本 文中特定描述的其它方式來實(shí)施本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括適用法律所允許的隨附權(quán)利要 求書中所引述的主題的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外明顯與內(nèi)容相 矛盾，否則本發(fā)明涵蓋上述要素 W其所有可能的變化形式的任何組合。
【權(quán)利要求】
1. 一種下游處理裝置，其用于匯集、收集并且純化靶蛋白，所述裝置包含： a. 具有頂部開口、底部開口的容器，其中所述容器適用于固持營養(yǎng)介質(zhì)、生物培養(yǎng)物和 色譜介質(zhì)； b. 覆蓋所述容器的所述頂部開口的頂部過濾器和覆蓋所述底部開口的底部過濾器，所 述過濾器能夠截留所述色譜介質(zhì)； c. 可移動(dòng)的頂蓋，其用于將所述頂部過濾器固定在適當(dāng)?shù)奈恢貌⑶疫M(jìn)一步包含至少一 個(gè)頂部液體端口和頂部流量控制閥； d. 連接到所述頂部液體端口的頂部采樣端口，其進(jìn)一步包含頂部采樣端口閥和能夠去 除所述生物培養(yǎng)物的過濾器； e. 可移動(dòng)的底蓋，其用于將所述底部過濾盤固定在適當(dāng)?shù)奈恢貌⑶疫M(jìn)一步包含底部液 體端口、底部流量控制閥和充實(shí)室，所述充實(shí)室具有多個(gè)液體端口和關(guān)閉并打開所述液體 端口的構(gòu)件； f. 連接到所述底部液體端口的底部采樣端口、底部采樣端口閥和用于去除所述生物培 養(yǎng)物的過濾器； g. 混合設(shè)備，其能夠保持所述色譜介質(zhì)均勻地懸浮在整個(gè)所述容器中；以及 h. 所述容器的立式支座。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其進(jìn)一步包含加熱元件、冷卻元件、至少一個(gè) 用于測量所述容器的內(nèi)含物的濁度的裝置和/或用于測量所述容器的所述內(nèi)含物的溫度 的傳感器。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的下游處理裝置，其進(jìn)一步包含自動(dòng)控制以下的電子構(gòu) 件： a. 響應(yīng)于在所述頂部和所述液體端口中的所述靶蛋白的濃度比打開和關(guān)閉所述底部 流量控制閥； b. 所述加熱和冷卻元件； c. 所述容器的響應(yīng)于所述營養(yǎng)介質(zhì)的溫度的所述內(nèi)含物；和/或 d. 響應(yīng)于所述容器中的濁度的測量結(jié)果的差異控制所述混合構(gòu)件的強(qiáng)度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3所述的下游處理裝置，其中所述容器是圓筒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4所述的下游處理裝置，其中所述容器包含塑料、金屬或玻璃。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述容器是一次性的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述容器是柔性的并且容納在剛性容器 內(nèi)部。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述容器具有介于所述容器中所固持的 所述色譜介質(zhì)的體積的1. 5倍到3倍范圍內(nèi)的內(nèi)體積。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述頂部過濾器和所述底部過濾器兩者 包含通過剛性多孔結(jié)構(gòu)、剛性陶瓷板或多孔塑料隔板支撐的柔性塑料或金屬網(wǎng)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述頂部過濾器和所述底部過濾器兩 者具有介于50微米到300微米范圍內(nèi)的多孔結(jié)構(gòu)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述混合設(shè)備包含通過在所述容器外 部的磁場源操作的水平安置的磁性攪拌器。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述混合設(shè)備是通過在所述容器外部 的電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)的中心旋轉(zhuǎn)踏板、渦輪機(jī)或螺旋槳。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述混合設(shè)備包含堅(jiān)直安置在所述容 器中并且尖端朝上的圓錐螺旋葉片，并且軸的下端支撐在所述底部過濾器的中心中的插口 中并且所述軸的上端在穿過在所述頂部過濾器的中心中的密封滾珠軸承和所述頂蓋之后 連接到外部電動(dòng)機(jī)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的下游處理裝置，其中所述螺旋葉片的基底的直徑介于所述 容器的直徑的80%到95%的范圍內(nèi)并且所述螺旋葉片的所述尖端的直徑介于所述容器的 直徑的10%到25%的范圍內(nèi)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的下游處理裝置，其中所述螺旋體以lrpm到20rpm的速度旋 轉(zhuǎn)并且沿著將所述容器的所述內(nèi)含物以層流模式從底部移動(dòng)到頂部的方向操作。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的下游處理裝置，其中所述用于測量所述容器中的所述營養(yǎng) 介質(zhì)的濁度的傳感器至少一個(gè)安置在所述頂部過濾器下方并且至少一個(gè)安置在所述底部 過濾器上方，并且調(diào)節(jié)所述混合構(gòu)件的強(qiáng)度以在所述容器中獲得均勻濁度。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述立式支座包含環(huán)架、吊鉤、掛鉤或 平坦表面。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述色譜介質(zhì)包含能夠結(jié)合靶蛋白的 樹脂。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的下游處理裝置，其中所述樹脂包含離子交換樹脂、疏水性 樹脂、親和樹脂或其混合物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的下游處理裝置，其中所述樹脂包含蛋白質(zhì)或肽作為配體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的下游處理裝置，其中所述樹脂具有針對(duì)靶蛋白的特異性親 和力。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述色譜介質(zhì)包含多種樹脂。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下游處理裝置，其中所述充實(shí)室能夠通過重力流從多個(gè)來 源接收所述營養(yǎng)介質(zhì)和緩沖液。
24. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的下游處理裝置，其中所述加熱和/或冷卻元件包含包裹在所 述容器周圍的電阻加熱元件、包裹在所述容器周圍的液體冷卻或加熱護(hù)套、經(jīng)放置以包圍 所述容器的加熱或冷卻箱、與所述容器緊密鄰近放置的紅外燈或?qū)⒓訜峄蚶鋮s空氣吹到所 述容器上的風(fēng)扇。
25. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的下游處理裝置，其中在所述頂部采樣端口和所述底部采樣 端口中的所述靶蛋白的濃度比在1 : 100到2 : 100之間的范圍內(nèi)。
26. -種用于匯集、收集并純化在多個(gè)生物反應(yīng)器的營養(yǎng)介質(zhì)中表達(dá)的靶蛋白的方法， 其包含： a. 提供根據(jù)權(quán)利要求1到25所述的下游處理裝置； b. 使所述下游處理裝置定位在使所述頂部液體端口在營養(yǎng)介質(zhì)或緩沖液的多個(gè)來源 的最低層的下方的高度； c. 關(guān)閉所述底部流量控制閥； d. 將所述充實(shí)室的所述液體端口連接到含有所述營養(yǎng)介質(zhì)的需要匯集、收集并且純化 已經(jīng)在所述營養(yǎng)介質(zhì)中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的多個(gè)生物反應(yīng)器； e. 移開所述頂蓋并且向所述容器中添加足以結(jié)合準(zhǔn)備處理的所述營養(yǎng)介質(zhì)中所存在 的基本上所有靶蛋白的量的色譜介質(zhì)； f. 將所述頂蓋放回原處并且打開所述頂部流量控制閥； g. 打開所述底部流量控制閥； h. 在重力壓力下，起始所述營養(yǎng)介質(zhì)從多個(gè)生物反應(yīng)器穿過所述充實(shí)室進(jìn)入所述容器 中的流動(dòng)并且允許所述營養(yǎng)介質(zhì)填充所述容器； i. 關(guān)閉所述底部流量控制閥； i.起始所述混合設(shè)備以獲得所述色譜介質(zhì)在所述容器中的均勻分布，如通過在所述容 器的頂部、中間和底部的所述傳感器測量濁度并且通過所述電子構(gòu)件自動(dòng)調(diào)節(jié)所述混合構(gòu) 件的速度以獲得均勻濁度所指出； k. 如果需要，那么加熱或冷卻所述容器的所述內(nèi)含物到預(yù)定水平，并且通過所述電子 控制構(gòu)件自動(dòng)維持所述營養(yǎng)介質(zhì)中的所述預(yù)定溫度； l. 將所述頂部采樣端口連接到能夠測量所述靶蛋白的濃度的分光光度計(jì)的測試連續(xù) 流動(dòng)池并且將所述底部采樣端口連接到對(duì)照連續(xù)流動(dòng)池，并且當(dāng)在所述頂部采樣端口和所 述底部采樣端口中的濃度比達(dá)到1 : 100時(shí)開啟所述底部流量控制閥并且當(dāng)所述比率達(dá)到 2 : 100時(shí)關(guān)閉所述底部流量控制閥； m. 允許所述電子控制構(gòu)件打開并關(guān)閉所述底部流量控制閥并且維持營養(yǎng)介質(zhì)從多個(gè) 生物反應(yīng)器到所述容器中的流動(dòng)并且允許所述營養(yǎng)介質(zhì)從所述頂部液體端口流出并且棄 去所述營養(yǎng)介質(zhì)直到所有生物反應(yīng)器的內(nèi)含物已經(jīng)穿過所述容器為止； n. 關(guān)閉所述底部流量控制閥和所述充實(shí)室的所述液體端口并且從所述充實(shí)室斷開所 述生物反應(yīng)器； 〇.打開所述底部流量控制閥以允許所述容器中的所述營養(yǎng)介質(zhì)通過所述充實(shí)室中的 未占用端口中的一者排放出去并且然后關(guān)閉所述端口； P.使所述充實(shí)室的所述液體端口連接到適用于洗掉所述容器中的任何殘?jiān)南礈炀?沖液的至少一個(gè)來源和能夠破壞所述靶蛋白與所述色譜介質(zhì)的結(jié)合的洗脫緩沖液的至少 一個(gè)來源； q. 起始所述洗滌緩沖液穿過所述充實(shí)室進(jìn)入所述容器中的流動(dòng)并且允許所述洗滌緩 沖液從所述頂部液體端口排放出去直到在所排出的洗滌緩沖液中達(dá)到預(yù)定最低水平的殘 漁為止； r. 停止所述洗滌緩沖液的所述流動(dòng)； s. 停止所述混合構(gòu)件； t. 打開所述充實(shí)室中的所述未占用的液體端口中的一者以允許所述洗滌緩沖液從所 述容器排放出去并且關(guān)閉所述充實(shí)室的所述液體端口； u. 起始洗脫緩沖液穿過所述充實(shí)室的流動(dòng)以填充所述容器并且關(guān)閉洗脫緩沖液到所 述充實(shí)室的流動(dòng)； V. 關(guān)閉所述底部流量控制閥； W. 起始所述混合構(gòu)件； X. 繼續(xù)混合所述容器的所述內(nèi)含物持續(xù)預(yù)定時(shí)間以允許完全破壞所述靶蛋白與所述 色譜介質(zhì)之間的所述結(jié)合； y. 停止所述混合構(gòu)件；以及 z. 打開所述底部流量控制閥和所述充實(shí)室中的所述未占用的液體端口中的一者并且 在預(yù)滅菌容器中收集所述洗脫緩沖液作為所述靶蛋白的經(jīng)純化濃縮溶液。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中當(dāng)相繼使用一種以上洗滌緩沖液時(shí)，重復(fù)所述 步驟（P)到⑴。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中當(dāng)在逐步洗脫法中相繼使用一種以上洗脫緩沖 液時(shí)，重復(fù)所述步驟（u)到（z)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中用以下步驟替換所述步驟（u)到（z):打開所 述底部流量控制閥；通過所述頂部液體端口以預(yù)定速率添加所述洗脫緩沖液；允許所述洗 脫緩沖液在重力流下穿過所述容器中的所述色譜介質(zhì)；當(dāng)其穿過所述充實(shí)室液體端口出現(xiàn) 時(shí)，以多個(gè)定時(shí)部分形式收集所述洗脫緩沖液；選擇含有所述靶蛋白的最高濃度的部分并 且將它們匯集在滅菌容器中作為所述靶蛋白的經(jīng)純化濃縮溶液。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中以梯度洗脫緩沖液形式引入所述洗脫緩沖液。
31. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中用以下步驟替換所述步驟（u)到（z):打開所述 頂部和底部控制閥；起始洗脫緩沖液通過所述充實(shí)室進(jìn)入所述容器中的流動(dòng)；起始所述混 合構(gòu)件；允許所述洗脫緩沖液填充所述容器并且穿過所述頂部過濾器，并且收集在通過所 述頂部液體端口的所述洗脫緩沖液的流出物中的靶蛋白的經(jīng)純化形式；使所述洗脫緩沖液 的所述流動(dòng)繼續(xù)并且收集靶蛋白的經(jīng)純化形式直到所收集的洗脫緩沖液中的濃度達(dá)到預(yù) 定最低水平為止。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK104395334SQ201380020287
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月21日
【發(fā)明者】薩爾法拉茨·尼亞齊 申請(qǐng)人:醫(yī)用蛋白國際有限責(zé)任公司