在第二代嵌合抗原受體中cd2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的使用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于治療人癌癥的組合物和方法。本發(fā)明涉及施用表達(dá)CAR的基因修飾的T細(xì)胞,所述CAR具有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括將CD2并入到CAR中以在負(fù)和正方向改變CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
【專利說明】在第二代嵌合抗原受體中CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的使用
[0001]相關(guān)申請(qǐng)交叉參考
[0002]本申請(qǐng)要求2012年2月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/601,907的優(yōu)先權(quán),其全部?jī)?nèi)容通過引用而并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]具有⑶3- ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(CAR)修飾的T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)出中等水平的靶腫瘤細(xì)胞溶解和低量的細(xì)胞因子產(chǎn)生。共刺激信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,通常CD28或4 - 1BB,與第二代CAR的結(jié)合顯著地增強(qiáng)靶細(xì)胞的殺傷和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。已顯示,與TCR誘導(dǎo)的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相比,天然⑶2分子的連接導(dǎo)致了定量和定性的差異。近期的報(bào)道證明,內(nèi)源性⑶2受體的連接顯著地增強(qiáng)了從第一代CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2。
[0005]現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明,CAR T細(xì)胞需要在具有臨床有益腫瘤反應(yīng)的患者體內(nèi)移入和存活(Porter等人,2011,N Engl J Med, 365:725-33)。但是,當(dāng)太多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)達(dá)到閾值時(shí),激活誘導(dǎo)的T細(xì)胞可發(fā)生死亡(V1la等人,1996,Science.273 (5271): 104 - 6 ;Ren - Heidenreich 等人,2002, Cancer Tmmunol Immunother, 2002:417 - 23 ;Bachmann等人,1996,Eur J Immunol, 26 (9):2017 - 22 ;Ren - Heidenreich 等人,2001,Curr GeneTher, I (3): 253 - 5 ;Borthwick 等人,1996, Immunology, (4): 508 - 15)。
[0006]因此,本領(lǐng)域急需CAR組合物,其調(diào)節(jié)T細(xì)胞的反應(yīng),以提高CAR T細(xì)胞存活且提供抗腫瘤活性的有益環(huán)境。本發(fā)明解決了這一需要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明提供編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0008]在一個(gè)實(shí)施方式中,CAD包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方式中,抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方式中,抗原結(jié)合片段是Fab或scFv。在一個(gè)實(shí)施方式中,抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到腫瘤抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中,腫瘤抗原與惡性血液病相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中,腫瘤抗原與實(shí)體瘤相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中,腫瘤抗原選自⑶19、⑶20、⑶22、RORl、間皮蛋白、⑶33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR 和其任意組合。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方式中,共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)進(jìn)一步包含共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-U IC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性地與⑶83結(jié)合的配體和其任意組合。
[0011]本發(fā)明還提供分離的嵌合抗原受體(CAR),其包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0012]本發(fā)明還提供載體,其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0013]本發(fā)明還提供細(xì)胞,其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列,CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包含⑶2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞選自T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方式中,當(dāng)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到其相對(duì)應(yīng)的抗原時(shí),細(xì)胞呈現(xiàn)出抗腫瘤免疫性。
[0016]本發(fā)明還提供刺激對(duì)哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞群體或組織的T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法,該方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的經(jīng)基因修飾表達(dá)CAR的細(xì)胞,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域被選擇以特異性地識(shí)別靶細(xì)胞群體或組織。
[0017]本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中提供抗腫瘤免疫性的方法,該方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的經(jīng)基因修飾表達(dá)CAR的細(xì)胞,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,從而在哺乳動(dòng)物中提供抗腫瘤免疫性。
[0018]本發(fā)明提供治療具有腫瘤抗原表達(dá)升高相關(guān)的疾病、病癥或狀況的哺乳動(dòng)物的方法,該方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的經(jīng)基因修飾表達(dá)CAR的細(xì)胞,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,從而治療哺乳動(dòng)物。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞為自體T細(xì)胞。
[0020]本發(fā)明提供治療患有癌癥的人的方法,該方法包括給人施用經(jīng)基因改造表達(dá)CAR的T細(xì)胞,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方式中,人對(duì)至少一種化療劑有抗性。
[0022]本發(fā)明提供在診斷出癌癥的人中產(chǎn)生基因改造的T細(xì)胞的持久群體的方法,該方法包括給人施用經(jīng)基因改造表達(dá)CAR的T細(xì)胞,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中基因改造的T細(xì)胞的持久群體在施用后,在人體內(nèi)存留至少一個(gè)月。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方式中,基因改造的T細(xì)胞的持久群體包含選自如下的至少一種細(xì)胞:給人施用的T細(xì)胞、給人施用的T細(xì)胞的子代和其組合。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方式中,基因改造的T細(xì)胞的持久群體包含記憶T細(xì)胞。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方式中,癌癥為慢性淋巴細(xì)胞白血病。在一個(gè)實(shí)施方式中,慢性淋巴細(xì)胞白血病為難治性⑶19+細(xì)胞白血病和淋巴瘤。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方式中,基因改造的T細(xì)胞的持久群體在施用后,在人體內(nèi)存留至少三個(gè)月。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方式中,基因改造的T細(xì)胞的持久群體在施用后,在人體內(nèi)存留至少四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、七個(gè)月、八個(gè)月、九個(gè)月、十個(gè)月、十一個(gè)月、十二個(gè)月、兩年、或三年。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方式中,治療了癌癥。
[0029]本發(fā)明提供在診斷出癌癥的人中擴(kuò)張基因改造的T細(xì)胞群體的方法,該方法包括給人施用經(jīng)基因改造表達(dá)CAR的T細(xì)胞,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中施用的基因改造的T細(xì)胞在人體中產(chǎn)生子代T細(xì)胞群體。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方式中,在人體中的子代T細(xì)胞包含記憶T細(xì)胞。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方式中,T細(xì)胞為自體T細(xì)胞。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方式中,人對(duì)至少一種化學(xué)治療劑有抗性。
[0033]本發(fā)明包括調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量的方法,所述方法包含經(jīng)基因改造T細(xì)胞以表達(dá)CAR,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含⑶2的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方式中,調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量降低T調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。
[0035]本發(fā)明包括降低活化誘導(dǎo)的鈣流入T細(xì)胞的量的方法。所述的方法包含基因改造T細(xì)胞以表達(dá)CAR,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含⑶2的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和⑶3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方式中,降低活化誘導(dǎo)的鈣流入T細(xì)胞的量防止T細(xì)胞的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]當(dāng)與附圖共同閱讀時(shí),將更好地理解下列的本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式的詳細(xì)描述。為了闡述本發(fā)明的目的,目前優(yōu)選的實(shí)施方式示于附圖中。但是,應(yīng)理解,本發(fā)明不限于示于附圖中的實(shí)施方式的精確安排和手段。
[0038]圖1 描述了抗 CD19-CD2 ζ CAR 的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0039]圖2描述了實(shí)例實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,實(shí)例實(shí)驗(yàn)表明T細(xì)胞從CD3/CD2信號(hào)活化和增殖。正常人供體 CD4 和 CD8T 細(xì)胞用涂有 a CD2(T11.1 和 TH.2)、a CD3 (0ΚΤ3)和 a CD28 (9.3)抗體的磁珠刺激。絕對(duì)細(xì)胞數(shù)和群體倍增表明細(xì)胞增殖。細(xì)胞大小代表細(xì)胞活化的狀態(tài)。由CD2/CD3信號(hào)進(jìn)行的活化足以誘導(dǎo)細(xì)胞的活化和增殖。
[0040]圖3描述了實(shí)例實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,實(shí)例實(shí)驗(yàn)表明CD2CAR釋放具有有效免疫反應(yīng)特征的細(xì)胞因子。mRNA CAR-電穿孔的正常人供體T細(xì)胞與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí),以及測(cè)量細(xì)胞因子分泌。與SS128z (頂部)相似,IL-2和IFN- Y在SSl⑶2z中增加。但是,⑶2信號(hào)減少在SS128⑶2z中的細(xì)胞因子分泌。與⑶19ζ和⑶1928ζ相比,⑶19⑶2z CAR產(chǎn)生相似量的IL-2和IFN-g。
[0041]圖4描述了實(shí)例實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,實(shí)例實(shí)驗(yàn)表明具有CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR有效殺傷腫瘤細(xì)胞。mRNA CAR-電穿孔的正常人供體T細(xì)胞在不同效應(yīng)器:靶標(biāo)比率下與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)18小時(shí)(左)和4小時(shí)(右)。在兩個(gè)試驗(yàn)中,CD2CAR均有效地消除腫瘤細(xì)胞,與具有⑶3z或⑶28z信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR相當(dāng)。
[0042]圖5描述了實(shí)例實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,實(shí)例實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)CAR-電穿孔的正常人供體T細(xì)胞與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)5天時(shí),CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域提高了 T-細(xì)胞增殖。在3天的刺激后,⑶2CAR-T細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異,但在5天后⑶2CAR-T細(xì)胞數(shù)量增加兩倍,其表示當(dāng)加入到CAR中時(shí),CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域有助于增加T-細(xì)胞增殖。
[0043]圖6描述了實(shí)例實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,實(shí)例實(shí)驗(yàn)表明具有除⑶3 ζ之外的⑶28、⑶2、⑶137信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞的鈣流入反應(yīng)。CAR-電穿孔的正常人供體T細(xì)胞負(fù)載有Indo-1AM 鈣指示劑,且在記錄開始30秒后,用間皮蛋白-Fe融合蛋白刺激。顯示了結(jié)合鈣(Indo-1紫色)與游離鈣(Indo-1藍(lán)色)隨時(shí)間的比值。對(duì)SSlz添加⑶2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域增加了鈣流入信號(hào),但不如SS128Z鈣流入強(qiáng)烈。
【具體實(shí)施方式】
[0044]本發(fā)明涉及治療癌癥的組合物和方法,癌癥包括,但不局限于,惡性血液病和實(shí)體瘤。本發(fā)明涉及經(jīng)修飾表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移的策略。CAR為分子,其結(jié)合對(duì)所需抗原(例如,腫瘤抗原)基于抗體的特異性與T細(xì)胞受體活化細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,以產(chǎn)生表現(xiàn)出特異抗腫瘤細(xì)胞免疫活性的嵌合蛋白。
[0045]本發(fā)明提供了⑶2并入CAR以改變T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生,所述T細(xì)胞被改造以表達(dá)包含⑶2的CAR。如本文別處討論的,⑶2可并入到CAR中,以負(fù)和正調(diào)節(jié)T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此,CAR中⑶2的使用可改變CAR T細(xì)胞存活和活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的閾值。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的量的方法。該方法包含基因改造T細(xì)胞,以表達(dá)CAR,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0047]在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供降低活化誘導(dǎo)的鈣流入T細(xì)胞的量的方法。該方法包含基因改造T細(xì)胞以表達(dá)CAR,其中CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0048]本發(fā)明一般涉及經(jīng)基因改造穩(wěn)定地表達(dá)所需CAR的T細(xì)胞的使用。表達(dá)CAR的T細(xì)胞在此稱為CAR T細(xì)胞或CAR修飾的T細(xì)胞。優(yōu)選地,細(xì)胞可經(jīng)基因修飾穩(wěn)定地表達(dá)在其表面上的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,賦予MHC獨(dú)立性的新抗原特異性。在一些情況中,T細(xì)胞經(jīng)基因修飾穩(wěn)定地表達(dá)CAR,所述CAR結(jié)合特定抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域與⑶3- ζ鏈或Fe Y Rl蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域到單個(gè)嵌合蛋白質(zhì)中。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR包含具有抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中,采用了與CAR中的一個(gè)結(jié)構(gòu)域天然相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中,跨膜結(jié)構(gòu)域可被選擇或通過氨基酸取代修飾,以避免這樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)合到相同或不同表面膜蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域,從而最小化與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用。優(yōu)選,跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)镃DSa鉸鏈結(jié)構(gòu)域。
[0050]對(duì)于細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域,本發(fā)明的CAR可設(shè)計(jì)成本身包含⑶2、⑶28和/或4-1ΒΒ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或者與任何其他所需的在本發(fā)明CAR情況下有用的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中,CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可設(shè)計(jì)成進(jìn)一步包含CD3-(的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。例如,CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可包括,但不局限于,⑶3- ζ、⑶2、4-1ΒΒ和⑶28信號(hào)傳導(dǎo)模塊和其組合。因此,本發(fā)明提供C AR T細(xì)胞和它們用于過繼治療的方法。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可通過向細(xì)胞引入慢病毒載體產(chǎn)生,所述慢病毒載體包含所需的CAR,例如包含抗⑶19、⑶8 α鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域以及人⑶2和CD3(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR T細(xì)胞能夠體內(nèi)復(fù)制,產(chǎn)生導(dǎo)致持續(xù)腫瘤控制的長(zhǎng)期持久性。
[0052]在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可通過向細(xì)胞轉(zhuǎn)染編碼所需CAR的RNA產(chǎn)生,所述CAR,例如包含抗⑶19、⑶8 α鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域以及人⑶2和⑶3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR。在一個(gè)實(shí)施方式中,CAR在基因修飾的CAR T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。
[0053]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及采用淋巴細(xì)胞輸注施用表達(dá)CAR的基因修飾的T細(xì)胞,用于患有癌癥或有患有癌癥風(fēng)險(xiǎn)的患者的治療。優(yōu)選,在治療中采用自體淋巴細(xì)胞輸注。自體PBMC從需要治療的患者收集,且采用在此描述的和本領(lǐng)結(jié)構(gòu)域已知的方法活化和擴(kuò)張T細(xì)胞,并且然后輸注回患者。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及用于患有癌癥的患者治療的表達(dá)CAR的基因修飾的T細(xì)胞。本發(fā)明基于下列發(fā)現(xiàn):在CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域顯著地影響在CAR修飾的T細(xì)胞中的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及鈣信號(hào)傳導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方式中,CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的包含增加了細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方式中,CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的包含減少了細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此,CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,單獨(dú)或與其他細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組合,在腫瘤部位正和負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的生產(chǎn)。在另一實(shí)施方式中,CAR內(nèi)⑶2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域降低鈣流入,從而防止基因修飾的CAR的活化-誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0055]在又一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明一般涉及處于形成癌癥風(fēng)險(xiǎn)的患者的治療。本發(fā)明還包括治療惡性腫瘤或自身免疫性疾病,其中患者的化療和/或免疫治療導(dǎo)致患者顯著的免疫抑制,從而增加患者形成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0056]本發(fā)明包括采用表達(dá)抗⑶19CAR的T細(xì)胞,其包含⑶3-ζ和⑶2共刺激結(jié)構(gòu)域(也稱為CART19T細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CART19T細(xì)胞可經(jīng)受強(qiáng)烈的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)張,且可建立CD19特異性記憶細(xì)胞,其在血液和骨髓中以高水平持續(xù)延長(zhǎng)量的時(shí)間。在一些情況中,輸注到患者內(nèi)的本發(fā)明的CART19T細(xì)胞可消除晚期化療耐藥CLL患者體內(nèi)的白血病細(xì)胞。但是,本發(fā)明不限于CART19T細(xì)胞。相反,本發(fā)明包含融合一個(gè)或更多細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的任意抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如,抗間皮蛋白),所述細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域選自CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD137(4-1BB)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和其任意組合。
[0057]
[0058]除非另有定義,本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管可在測(cè)試本發(fā)明的實(shí)踐中使用類似于或等于本文描述的那些的任何方法和物質(zhì),但優(yōu)選的材料和方法在本文中進(jìn)行描述。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明中,將使用以下術(shù)語。
[0059]也應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅是為了描述【具體實(shí)施方式】的目的,并不意欲是限制性的。
[0060]本文使用冠詞“一個(gè)(a) ”和“一個(gè)(an) ”,指的是該冠詞語法對(duì)象的一個(gè)或多于一個(gè)(即,指的是至少一個(gè))。以例子說明,“一個(gè)元件”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)的元件。
[0061]如本文使用的“大約”,當(dāng)指的是可測(cè)量的值諸如量、時(shí)間期間等時(shí),表示包括從給定值± 20 %或± 10 %的變化,更優(yōu)選± 5 %,甚至更優(yōu)選± I %,以及仍更優(yōu)選±0.1%的變化,只要這種變化適于實(shí)施公開的方法。
[0062]“活化”,如本文所用的,指的是已經(jīng)被充分刺激以誘導(dǎo)可檢測(cè)的細(xì)胞增殖的T細(xì)胞的狀態(tài)。活化也可與誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和可檢測(cè)的效應(yīng)器功能相關(guān)。術(shù)語“活化的T細(xì)胞”等指的是經(jīng)歷細(xì)胞分裂的T細(xì)胞。
[0063]術(shù)語“抗體”,如本文所用的,指的是與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子??贵w可為源于自然源或源于重組源的完整的免疫球蛋白,并可為完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)部分??贵w通常為免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存在,包括例如,多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈抗體和人源化抗體(Harlow 等,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY ;Harlow 等,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor, New York ;Houston等,1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 ;Bird等,1988,Science242:423-426)。
[0064]術(shù)語“抗體片段”指的是完整抗體的一部分,并指的是完整抗體的抗原決定可變區(qū)。抗體片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、scFv抗體和由抗體片段形成的線性抗體、scFv抗體和多特異性抗體。
[0065]“抗體重鏈”,如本文所用的,指的是以它們自然存在構(gòu)象存在于所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。
[0066]“抗體輕鏈”,如本文所用的,指的是以它們自然存在構(gòu)象存在于所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較小的鏈,K和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。
[0067]如本文所用的,術(shù)語“合成抗體”,指利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體,諸如例如,由如本文所述的噬菌體表達(dá)的抗體。該術(shù)語也應(yīng)當(dāng)被解釋為指已經(jīng)由DNA分子的合成產(chǎn)生的抗體,所述DNA分子編碼抗體并且該DNA分子表達(dá)抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列,其中DNA或氨基酸序列已經(jīng)利用本領(lǐng)域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得。
[0068]如本文所用的,術(shù)語“抗原”或“Ag”被定義為激發(fā)免疫反應(yīng)的分子。該免疫反應(yīng)可涉及抗體產(chǎn)生,或特異性免疫活性細(xì)胞的活化,或兩者。技術(shù)人員將理解任何大分子——實(shí)際上包括所有的蛋白質(zhì)或肽,可用作抗原。此外,抗原可源自重組或基因組DNA。技術(shù)人員將理解任何DNA—其包括編碼引起免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列,因此編碼如本文使用的術(shù)語“抗原”。此外,本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解抗原不必單獨(dú)地由基因的全長(zhǎng)核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發(fā)明包括但不限于,多于一個(gè)的基因的部分核苷酸序列的用途,并且這些核苷酸序列以不同的組合進(jìn)行布置,以引起期望的免疫反應(yīng)。此外,技術(shù)人員將理解抗原根本不必由“基因”進(jìn)行編碼。容易顯而易見的是抗原可被產(chǎn)生、合成或可源自生物學(xué)樣本。這種生物學(xué)樣本可包括但不限于組織樣本、腫瘤樣本、細(xì)胞或生物學(xué)流體。
[0069]如本文所用的,術(shù)語“抗腫瘤效應(yīng)”,指的是生物學(xué)效應(yīng),其可由腫瘤體積的減少、腫瘤細(xì)胞數(shù)的減少、轉(zhuǎn)移數(shù)的減少、預(yù)期壽命的增加或與癌性狀況相關(guān)的各種生理癥狀的改善清楚表示。“抗腫瘤效應(yīng)”也可由本發(fā)明的肽、多核苷酸、細(xì)胞和抗體在預(yù)防腫瘤在第一位置發(fā)生的能力清楚表示。
[0070]根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語“自體抗原”指由免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤識(shí)別為外源(foreign)的任何自身抗原。自體抗原包括但不限于細(xì)胞蛋白、磷蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞脂質(zhì)、核酸、糖蛋白,包括細(xì)胞表面受體。[0071 ] 如本文所用的,術(shù)語“自身免疫疾病”被定義為由自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生的病癥。自體免疫疾病是對(duì)自身抗原的不適當(dāng)和過度反應(yīng)的結(jié)果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秀(alopecia greata)、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腿腺炎、克羅恩氏疾病、糖尿病(I型)、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯氏疾病、吉蘭-巴雷綜合征、橋本氏疾病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、尋常型天皰瘡、牛皮癬、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、斯耶格倫氏綜合征、脊椎關(guān)節(jié)病變、甲狀腺炎、血管炎、白癜風(fēng)、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎等坐寸ο
[0072]如本文所用的,術(shù)語“自體”指關(guān)于源自相同個(gè)體的任何物質(zhì),它隨后被再次引入該個(gè)體。
[0073]“同種異基因(allogeneic)”指的是源自相同物種的不同動(dòng)物的移植物。
[0074]“異種(xenogeneic) ”指的是源自不同物種的動(dòng)物的移植物。
[0075]如本文所用的,術(shù)語“癌癥”被定義為以畸變細(xì)胞的快速和失控生長(zhǎng)為特征的疾病。癌細(xì)胞可局部蔓延或通過血流和淋巴系統(tǒng)蔓延至身體的其他部分。各種癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0076]如本文使用的術(shù)語“共刺激配體”包括特異性結(jié)合T細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)(cognate)共刺激分子的抗原呈遞細(xì)胞(例如,aAPC、樹突細(xì)胞、B細(xì)胞等等)上的分子,由此除了通過例如將TCR/CD3復(fù)合物與用肽負(fù)載的MHC分子結(jié)合提供的初級(jí)信號(hào)之外,還提供介導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào),所述T細(xì)胞反應(yīng)包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配體可包括但不限于 CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-Ll、PD_L2、4_1BBL、0X40L、可誘導(dǎo)的共刺激配體(ICOS-L)、細(xì)胞間粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G, MICA、MICB, HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結(jié)合Toll配體受體的激動(dòng)劑或抗體和與B7-H3特異性結(jié)合的配體。共刺激配體也包括,特別是與存在于T細(xì)胞上的共刺激分子特異性結(jié)合的抗體,和與⑶83特異性結(jié)合的配體,所述共刺激分子諸如但不限于⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、CD30、CD40、PD-U IC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。
[0077]“共刺激分子”指的是與共刺激配體特異性結(jié)合的T細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合伴侶,由此介導(dǎo)T細(xì)胞的共刺激反應(yīng),諸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHCI類分子、BTLA和Toll配體受體。
[0078]如本文所用的,“共刺激信號(hào)”指的是與初級(jí)信號(hào)結(jié)合,諸如TCR/CD3連接作用,導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和/或關(guān)鍵分子的上調(diào)或下調(diào)的信號(hào)。
[0079]“疾病”是動(dòng)物的一種健康狀態(tài),其中動(dòng)物不能保持穩(wěn)態(tài),和其中如果不改善該疾病,則動(dòng)物的健康繼續(xù)惡化。與之相比,動(dòng)物中的“病癥”是一種健康狀態(tài),其中動(dòng)物能夠保持穩(wěn)態(tài),但其中動(dòng)物的健康狀態(tài)與它沒有處于該病癥相比不太有利。保持不治療,病癥不必定引起動(dòng)物健康狀態(tài)的進(jìn)一步降低。
[0080]如本文所用的,“有效量”,指提供治療性或預(yù)防性益處的量。
[0081]“編碼”指的是多核苷酸諸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特異性序列用作模板合成在生物學(xué)過程中的其他多聚體和大分子的固有性質(zhì),所述多聚體和大分子具有核苷酸(即,rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一個(gè)和由其產(chǎn)生的生物學(xué)性質(zhì)。因此,如果相應(yīng)于那個(gè)基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì),則基因編碼蛋白質(zhì)。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的編碼鏈,和用作轉(zhuǎn)錄基因或cDNA的模板的非編碼鏈兩者,都可被稱為編碼那個(gè)基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物。
[0082]如本文所用的,“內(nèi)源的”指的是來自有機(jī)體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)的或在有機(jī)體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的任何物質(zhì)。
[0083]如本文所用的,術(shù)語“外源的”指的是任何從有機(jī)體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)引入的或在有機(jī)體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外產(chǎn)生的物質(zhì)。
[0084]如本文所用的,術(shù)語“表達(dá)”被定義為由它的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0085]“表達(dá)載體”指的是包括重組多核苷酸的載體,所述重組多核苷酸包括可操作地連接至待表達(dá)的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包括足夠的用于表達(dá)的順式作用元件;用于表達(dá)的其他元件可由宿主細(xì)胞供應(yīng)或在體外表達(dá)系統(tǒng)中供應(yīng)。表達(dá)載體包括所有本領(lǐng)域已知的那些,諸如并入重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(例如,裸露或包含在脂質(zhì)體中)和病毒(例如,慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
[0086]“同源的”指的是兩個(gè)多肽之間或兩個(gè)核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。當(dāng)兩個(gè)比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(shí),例如,如果兩個(gè)DNA分子的每一個(gè)中的位置被腺嘌呤占據(jù),則所述分子在那個(gè)位置上是同源的。兩個(gè)序列之間的同源性百分比為由兩個(gè)序列共有的匹配或同源的位置數(shù)除以比較的位置數(shù)XlOO的函數(shù)。例如,如果兩個(gè)序列中10個(gè)位置中的6個(gè)是匹配或同源的,則兩個(gè)序列是60%同源的。以例子說明,DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50 %的同源性。通常,當(dāng)比對(duì)兩個(gè)序列以給出最大同源性時(shí),進(jìn)行比較。
[0087]如本文所用的,術(shù)語“免疫球蛋白”或“Ig”被定義為起到抗體作用的一類蛋白質(zhì)。由B細(xì)胞表達(dá)的抗體有時(shí)被稱為BCR(B細(xì)胞受體)或抗原受體。包括在該類蛋白質(zhì)中的五個(gè)成員為IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA為存在于身體分泌物諸如唾液、淚液、母乳、胃腸分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初級(jí)抗體。IgG是最常見的循環(huán)抗體。IgM是在多數(shù)對(duì)象的初級(jí)免疫反應(yīng)中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它在凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合和其他抗體反應(yīng)中是最有效的免疫球蛋白,并且在抵御細(xì)菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗體功能的免疫球蛋白,但可用作抗原受體。IgE是在暴露于過敏原后,通過引起從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放介體,介導(dǎo)速發(fā)過敏性的免疫球蛋白。
[0088]如本文所用的,“指導(dǎo)物質(zhì)”包括出版物、記錄、圖表或任何其他可用于傳達(dá)本發(fā)明組合物和方法的有用性的表達(dá)媒介。本發(fā)明的試劑盒的指導(dǎo)物質(zhì)可例如被附加在包含本發(fā)明的核酸、肽和/或組合物的容器上,或與包含核酸、肽和/或組合物的容器一起運(yùn)送??蛇x地,指導(dǎo)物質(zhì)可與容器分開地運(yùn)送,目的是指導(dǎo)物質(zhì)和化合物由接受者配合使用。
[0089]“分離的”指從自然狀態(tài)改變或移出。例如,天然存在于活動(dòng)物中的核酸或肽不是“分離的”,但部分或完全與它的自然狀態(tài)的共存物質(zhì)分離的同一核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白可以以基本上純化的形式存在,或例如,可存在于非自然環(huán)境,諸如宿主細(xì)胞。
[0090]在本發(fā)明的內(nèi)容中,對(duì)于通常發(fā)生的核酸堿基使用以下縮寫。“A”指的是腺苷,“C”指的是胞嘧啶,“G”指的是鳥苷,“T”指的是胸苷,和“U”指的是尿苷。
[0091]除非另有規(guī)定,“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此簡(jiǎn)并版本并編碼相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質(zhì)或RNA的核苷酸序列也可包括內(nèi)含子,其程度為編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列可在某些版本中包含內(nèi)含子(一個(gè)或多個(gè))。
[0092]如本文所用的,“慢病毒”指的是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的屬。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中慢病毒是唯一能夠感染非分裂細(xì)胞的;它們可傳遞顯著量的遺傳信息進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA,所以它們是基因傳遞載體的最有效的方法之一。HIV、S1V和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的載體提供了完成顯著水平基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移的工具。
[0093]如本文所用的,術(shù)語“調(diào)節(jié)”指與缺少治療或化合物的對(duì)象中的反應(yīng)水平相比,和/或與以其他方式相同但未治療的對(duì)象中的反應(yīng)水平相比,介導(dǎo)對(duì)象中反應(yīng)水平的可檢測(cè)的增加或減少。該術(shù)語包括擾亂和/或影響天然信號(hào)或反應(yīng),由此介導(dǎo)對(duì)象優(yōu)選人的有益的治療性反應(yīng)。
[0094]除非另有規(guī)定,“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此簡(jiǎn)并版本并編碼相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。
[0095]術(shù)語“可操作地連接”指的是調(diào)節(jié)序列和異源核酸序列之間的功能連接,其產(chǎn)生后者的表達(dá)。例如,當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄形挥谂c第二核酸序列的功能關(guān)系中時(shí),第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如,如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá),則啟動(dòng)子被可操作地連接至編碼序列。通常地,可操作地連接的DNA序列是鄰近的,其中在相同的閱讀框中必須連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)。
[0096]術(shù)語“過表達(dá)的”腫瘤抗原或腫瘤抗原的“過表達(dá)”意欲表明相對(duì)于來自組織或器官的正常細(xì)胞的表達(dá)水平,來自疾病區(qū)如患者的特定組織或器官內(nèi)的實(shí)體瘤的細(xì)胞中腫瘤抗原表達(dá)的異常水平。具有以腫瘤抗原過表達(dá)為特征的實(shí)體瘤或血液學(xué)惡性腫瘤的患者可由本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定確定。
[0097]免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括例如皮下(s.c)、靜脈內(nèi)(1.v.)、肌肉內(nèi)(1.m.)或胸骨內(nèi)注射,或注入技術(shù)。
[0098]術(shù)語“患者”、“對(duì)象”、“個(gè)體”等等在本文中可交換使用,并指的是服從本文描述方法的任何動(dòng)物或其細(xì)胞,不論是體外或原位。在一些非限制性實(shí)施方式中,患者、對(duì)象或個(gè)體為人。
[0099]如本文所用的,術(shù)語“多核苷酸”被定義為核苷酸鏈。此外,核酸為核苷酸的多聚體。因此,如本文所用的,核酸和多核苷酸是可交換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸為可被水解成單體“核苷酸”的多核苷酸的一般常識(shí)。單體核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的,多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域可用的任何手段獲得的所有的核酸序列,所述手段包括但不限于重組手段,即,從重組文庫或細(xì)胞基因組,利用普通克隆技術(shù)和PCR?等等克隆核酸序列,和合成手段。
[0100]如本文所用的,術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可交換使用,并指的是由肽鍵共價(jià)連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個(gè)氨基酸,和對(duì)可構(gòu)成蛋白質(zhì)或肽的序列的氨基酸的最大數(shù)目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質(zhì),所述肽或蛋白質(zhì)包括通過肽鍵相互連接的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸。如本文所用的,該術(shù)語指的是短鏈,其在本領(lǐng)域中也例如通常被稱為肽、寡肽和寡聚體;和較長(zhǎng)鏈,其在本領(lǐng)域中通常被稱為蛋白質(zhì),其具有很多類型?!岸嚯摹卑ɡ缟飳W(xué)活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
[0101]如本文所用的,術(shù)語“啟動(dòng)子”被定義為開始多核苷酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄需要的,由細(xì)胞的合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器識(shí)別的DNA序列。
[0102]如本文所用的,術(shù)語“啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列”指可操作地連接至啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列的基因產(chǎn)物表達(dá)所需的核酸序列。在一些例子中,該序列可為核心啟動(dòng)子序列,并且在其他例子中,該序列也可包括基因產(chǎn)物表達(dá)所需的增強(qiáng)子序列和其他調(diào)節(jié)元件。啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列可例如為以組織特異方式表達(dá)基因產(chǎn)物的序列。
[0103]“組成型”啟動(dòng)子為核苷酸序列,其當(dāng)與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時(shí),使得在細(xì)胞的多數(shù)或所有生理學(xué)條件下在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。
[0104]“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子為核苷酸序列,其當(dāng)與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時(shí),使得在基本上僅當(dāng)相應(yīng)于啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物存在于細(xì)胞中時(shí),在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。
[0105]“組織-特異性”啟動(dòng)子為核苷酸序列,其當(dāng)與編碼基因或由基因規(guī)定的多核苷酸可操作地連接時(shí),使得基本上只要細(xì)胞為相應(yīng)于啟動(dòng)子的組織類型的細(xì)胞,則在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。
[0106]如本文所用的 ,關(guān)于抗體的術(shù)語“特異性結(jié)合”指識(shí)別特異性抗原但基本上不識(shí)別或結(jié)合樣本中的其他分子的抗體。例如,特異性結(jié)合來自一個(gè)物種的抗原的抗體也可結(jié)合來自一個(gè)或多個(gè)物種的抗原。但是,這種跨種反應(yīng)性本身不改變抗體的類別成為特異性的。在另一個(gè)實(shí)例中,特異性結(jié)合抗原的抗體也可結(jié)合抗原的不同等位基因形式。然而,這種交叉反應(yīng)性本身不改變抗體的類別成為特異性的。在一些例子中,術(shù)語“特異性的結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”可參考抗體、蛋白質(zhì)或肽與第二化學(xué)種類的相互作用使用,用于指該相互作用依賴化學(xué)種類上特定結(jié)構(gòu)(例如,抗原決定簇或表位)的存在;例如,抗體通常識(shí)別和結(jié)合特異性蛋白結(jié)構(gòu)而不是一般地識(shí)別和結(jié)合蛋白質(zhì)。如果抗體對(duì)表位“A”是特異性的,則在包含標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中存在包含表位A(或游離的、未標(biāo)記的A)的分子,將降低結(jié)合至抗體的標(biāo)記的A的量。
[0107]通過術(shù)語“刺激”指通過結(jié)合刺激分子(例如,TCR/⑶3復(fù)合物)與它的關(guān)聯(lián)配體,由此介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件——諸如但不限于經(jīng)TCR/CD3復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)——誘導(dǎo)的初級(jí)反應(yīng)。刺激可介導(dǎo)某些分子的改變的表達(dá),諸如TGF-β的下調(diào)和/或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的再組織坐坐寸寸ο
[0108]“刺激分子”,作為本文使用的術(shù)語,指與存在于抗原呈遞細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)刺激配體特異性結(jié)合的T細(xì)胞上的分子。
[0109]如本文所用的,“刺激配體”指如此配體,其當(dāng)存在于抗原呈遞細(xì)胞(例如,aAPC、樹突細(xì)胞、B-細(xì)胞等等)上時(shí),可與T細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合伴侶(在本文中被稱為“刺激分子”)特異性結(jié)合,由此介導(dǎo)T細(xì)胞的初級(jí)反應(yīng),其包括但不限于,活化、免疫反應(yīng)的開始、增殖等等。刺激配體在本領(lǐng)域中是公知的,并包括,特別是利用肽、抗CD3抗體、超激動(dòng)劑抗CD28抗體和超激動(dòng)劑抗CD2抗體負(fù)載的MHC I類分子。
[0110]如本文所用的,“基本上純化的”細(xì)胞為基本上不含其他細(xì)胞類型的細(xì)胞?;旧霞兓募?xì)胞也指的是已經(jīng)與以其天然發(fā)生狀態(tài)與其正常相關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞類型分離的細(xì)胞。在一些例子中,基本上純化的細(xì)胞群指的是均質(zhì)細(xì)胞群。在其他例子中,該術(shù)語簡(jiǎn)單地指的是已經(jīng)與以其天然狀態(tài)與其正常相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中,體外培養(yǎng)細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中,不在體外培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞。
[0111]如本文所用的,術(shù)語“治療性的”表示治療和/或預(yù)防。治療性效應(yīng)通過疾狀況態(tài)的抑制、緩和或根除獲得。
[0112]術(shù)語“治療有效量”指的是將引起由研究者、獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)醫(yī)生或其他臨床醫(yī)生正在尋找的組織、系統(tǒng)或?qū)ο蟮纳飳W(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的對(duì)象化合物的量。術(shù)語“治療有效量”包括以下的化合物的量:當(dāng)被施用時(shí),其足以防止治療的病癥或疾病的跡象或癥狀中的一個(gè)或多個(gè)的發(fā)展,或以一定程度減輕治療的病癥或疾病的跡象或癥狀中的一個(gè)或多個(gè)。治療有效量將根據(jù)化合物、疾病和其嚴(yán)重性、和待治療的對(duì)象的年齡、重量等而變化。
[0113]“治療”疾病,作為本文使用的術(shù)語,指降低對(duì)象經(jīng)歷的疾病或病癥的至少一種跡象或癥狀的頻率或嚴(yán)重性。
[0114]如本文所用的,術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指的是如此過程,通過該過程外源的核酸被轉(zhuǎn)移或引入宿主細(xì)胞?!稗D(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞是已經(jīng)由外源核酸轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。該細(xì)胞包括原代對(duì)象細(xì)胞和它的子代。
[0115]如本文所用的,短語“轉(zhuǎn)錄控制下”或“可操作地連接”指啟動(dòng)子處于與多核苷酸有關(guān)的正確的位置和朝向,以控制通過RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的開始和多核苷酸的表達(dá)。
[0116]“載體”為物質(zhì)組合物,其包括分離的核酸,并且其可用于傳遞分離的核酸至細(xì)胞內(nèi)部。很多載體在本領(lǐng)域中是已知的,包括但不限于線性多核苷酸、與離子或兩性分子化合物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此,術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?;虿《尽T撔g(shù)語也應(yīng)被解釋為包括便于將核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物,諸如例如聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等等。病毒載體的例子包括但不限于,腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等等。
[0117]范圍:在該公開中,本發(fā)明的多個(gè)方面可以以范圍形式中示出。應(yīng)當(dāng)理解范圍形式中的描述僅是為了方便和簡(jiǎn)潔,并不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍不可動(dòng)搖的限制。因此,范圍的描述應(yīng)被考慮為已具體公開了所有可能的子范圍以及處于那個(gè)范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例如,范圍諸如從I至6的描述應(yīng)被考慮為已具體公開了子范圍諸如從I至3、從I至4、從I至5、從2至4、從2至6、從3至6等,以及那個(gè)范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)字,例如,1、2、2.7、3、4、5、
5.3和6。不管范圍的寬度如何,這一點(diǎn)是適用的
[0118]描述
[0119]本發(fā)明提供用于治療癌癥以及其它疾病的組合物和方法。癌癥可為惡性血液病、實(shí)體瘤、原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤。采用本發(fā)明的組合物和方法可治療的其它疾病包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染以及自身免疫性疾病。
[0120]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供經(jīng)改造表達(dá)CAR的細(xì)胞(如T細(xì)胞),其中CAR T細(xì)胞展示出抗腫瘤特性。本發(fā)明的CAR可改造成包含具有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域,所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到T細(xì)胞抗原受體復(fù)合物的ζ鏈(例如,CD3- ζ )的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的CAR在T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠基于抗原結(jié)合特異性重定向抗原識(shí)別。示例性的抗原為CD19,因?yàn)樵摽乖趷盒訠細(xì)胞上表達(dá)。然而,本發(fā)明并不局限于靶向CD19。相反,本發(fā)明包括任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其在結(jié)合到其同源抗原時(shí),影響腫瘤細(xì)胞使腫瘤細(xì)胞無法生長(zhǎng),促進(jìn)死亡,或以其他方式受到影響,使得患者的腫瘤負(fù)荷減少或清除??乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選與來自共刺激分子和ζ鏈中一個(gè)或更多的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選地,抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與選自如下的一個(gè)或更多細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合:CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD137(4-1BB)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和其任意組口 ο
[0121]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR包含⑶2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。這是因?yàn)椋景l(fā)明部分地基于CAR-介導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)可進(jìn)一步通過添加共刺激結(jié)構(gòu)域而增強(qiáng)的發(fā)現(xiàn)。例如,CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的包含在正和負(fù)方向顯著影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生,其取決于在表達(dá)的CAR中其他共刺激結(jié)構(gòu)域的存在和鑒定。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明包括包含⑶2和⑶28結(jié)構(gòu)域的CAR。在一個(gè)實(shí)施方式,與表達(dá)具有⑶28但不是⑶2的CAR的T細(xì)胞相比,表達(dá)具有⑶2和CD28結(jié)構(gòu)域的CAR的修飾的T細(xì)胞釋放顯著較少的IL-2。在一個(gè)實(shí)施方式中,釋放較少IL-2的修飾的T細(xì)胞減少了免疫抑制Treg細(xì)胞的增殖。而且,CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的包含顯著減少鈣流入。在一個(gè)實(shí)施方式中,通過CD2的包含的鈣流入減少降低了活化誘導(dǎo)的CAR T細(xì)胞死亡。
[0122]在一些實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及編碼CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體,所述CAR穩(wěn)定地整合入T細(xì)胞和在其中穩(wěn)定表達(dá)。在其他實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及編碼CAR的RNA,所述RNA被轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中且在其中瞬時(shí)表達(dá)。CAR在細(xì)胞中瞬時(shí)、非整合表達(dá)減輕了與CAR在細(xì)胞中永久性整合表達(dá)相關(guān)的憂慮。
[0123]鉬合物
[0124]本發(fā)明提供了嵌合抗原受體(CAR),其包含細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含另外被稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶特異性結(jié)合成員。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或另外地細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的有效反應(yīng)所需的除抗原受體或它們的配體外的細(xì)胞表面分子。
[0125]CAR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間,或CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間,可并入間隔物結(jié)構(gòu)域。如在此使用的,術(shù)語“間隔物結(jié)構(gòu)域”通常指任何寡肽或多肽,其在多肽鏈中起到連接跨膜結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的作用。間隔物結(jié)構(gòu)域可包含高達(dá)300個(gè)氨基酸,優(yōu)選10至100個(gè)氨基酸,且最優(yōu)選25至50個(gè)氨基酸。
[0126]本發(fā)明包括表達(dá)可直接轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中的CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體構(gòu)建體。本發(fā)明還包括可直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的RNA構(gòu)建體。一種用于產(chǎn)生在轉(zhuǎn)染中使用的mRNA的方法包含用專門設(shè)計(jì)的引物的模板的體外轉(zhuǎn)錄(IVT),隨后通過聚腺苷酸的加入,以產(chǎn)生含有3’和5’非翻譯序列(“UTR,,)、5,帽和/或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、待表達(dá)的基因和聚腺苷酸尾部,在長(zhǎng)度上通常為50-2000個(gè)堿基的構(gòu)建體。如此生產(chǎn)的RNA可有效地轉(zhuǎn)染不同類型的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中,模板包括了 CAR的序列。
[0127]優(yōu)選,CAR包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域可衍生自這樣的結(jié)構(gòu)域的任何需要的來源。
[0128]抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域
[0129]細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以從任何的寬泛的各種細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或與配體結(jié)合和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)獲得。在一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可由Ig重鏈組成,其通過CHl和鉸鏈區(qū)的存在,可相應(yīng)地與Ig輕鏈共價(jià)相關(guān)聯(lián),或可通過鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的存在與其它Ig重鏈/輕鏈復(fù)合物成為共價(jià)相關(guān)聯(lián)。在后一種情況下,變成接合至嵌合構(gòu)建體的重/輕鏈復(fù)合物可構(gòu)成具有與嵌合構(gòu)建體的抗體特異性不同的特異性的抗體。根據(jù)抗體的功能、所需的結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),可使用整個(gè)鏈或截短鏈,其中CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的全部或部分可去除,或可去除鉸鏈區(qū)的全部或部分。
[0130]細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可涉及任何所需的抗原。例如,當(dāng)需要抗腫瘤CAR時(shí),選擇的待并入到CAR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可為與腫瘤相關(guān)的抗原。腫瘤可為任何類型的腫瘤,只要它具有由CAR識(shí)別的細(xì)胞表面抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中,CAR可為特異性單克隆抗體目前存在或可以在將來產(chǎn)生的一種CAR。
[0131]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR包含另外被稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶特異性結(jié)合成員。部分的選擇取決于限定靶細(xì)胞表面的配體的類型和數(shù)量。例如,抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可選擇以識(shí)別配體,該配體充當(dāng)在與特定疾狀況態(tài)相關(guān)聯(lián)的靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物??沙洚?dāng)本發(fā)明CAR中抗原部分結(jié)構(gòu)域的配體的細(xì)胞表面標(biāo)記物的實(shí)例包括與病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染、自身免疫性疾病和癌癥細(xì)胞相關(guān)的那些。
[0132]在一個(gè)實(shí)施方式中,反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體包含CAR,該CAR經(jīng)設(shè)計(jì)以通過將所需的抗原改造到CAR內(nèi)的方式涉及關(guān)注的抗原。在本發(fā)明的背景中,“腫瘤抗原”或“過度增殖性疾病抗原(hyperporoliferative disorder antigen) ”或“與過度增殖性疾病相關(guān)的抗原”指特定過度增生性病癥共有的抗原。在某些方面,本發(fā)明的過度增殖性疾病抗原衍生自癌癥,其包括,但不限于,原發(fā)或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、間皮瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、 肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臟癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
[0133]在另一個(gè)實(shí)施方式中,RNA CAR的模板經(jīng)設(shè)計(jì)以通過將所需的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域改造到CAR中的方式涉及關(guān)注的抗原。在本發(fā)明的背景中,“腫瘤抗原”或“過度增殖性疾病抗原”或“與過度增殖性疾病相關(guān)的抗原”指特定過度增生性病癥共有的抗原。在某些方面,本發(fā)明的過度增殖性疾病抗原衍生自癌癥,其包括,但不限于,原發(fā)或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、間皮瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臟癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
[0134]腫瘤抗原為蛋白質(zhì),其通過引起免疫反應(yīng),特別是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的腫瘤抗原包含一種或更多抗原性癌癥表位,抗原性癌癥表位由來自哺乳動(dòng)物的癌癥的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)免疫識(shí)別。本發(fā)明抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇將取決于特定類型的待治療的癌癥。本領(lǐng)域熟知腫瘤抗原,且其包括,例如,神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原、癌胚抗原(CEA)、β_人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、植物血凝素反應(yīng)性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、RU1、RU2 (AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ES0-1、LAGE_la、p53和prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1 (PCTA-1)、MAGE>ELF2M、嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、肝配蛋白B2、⑶22、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)-l、IGF-1I,IGF-1受體和間皮蛋白。
[0135]在一個(gè)實(shí)施方式中,腫瘤抗原包含與惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)抗原性癌癥表位。惡性腫瘤表達(dá)許多蛋白質(zhì),其可作為免疫攻擊的靶抗原。這些分子包括但不限于組織特異性抗原例如MART-1、在黑色素瘤中的酪氨酸酶和GP100以及在前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特異性抗原(PSA)。其它靶分子屬于轉(zhuǎn)化有關(guān)的分子的組,如致癌基因HER-2/neu/ErbB-2。另一組靶抗原為癌胎抗原,如癌胚抗原(CEA)。在B細(xì)胞淋巴瘤中,腫瘤特異性獨(dú)特型免疫球蛋白構(gòu)成了真正的腫瘤特異性免疫球蛋白的抗原,其為個(gè)體腫瘤獨(dú)有的。B細(xì)胞分化抗原如⑶19、⑶20和⑶37為在B細(xì)胞淋巴瘤中靶抗原的其他候選。這些抗原的一些(CEA、HER-2、⑶19、⑶20,獨(dú)特型)用作具有有限成功的單克隆抗體的被動(dòng)免疫療法的靶標(biāo)。
[0136]在本發(fā)明中所稱作的腫瘤抗原的類型也可為瘤特異性抗原(TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。TSA為腫瘤細(xì)胞獨(dú)有的且不會(huì)在體內(nèi)其它細(xì)胞上存在。TAA相關(guān)抗原不是腫瘤細(xì)胞獨(dú)有的,且相反在不能誘導(dǎo)對(duì)抗原免疫耐受狀態(tài)的條件下,也在正常細(xì)胞上表達(dá)。在使免疫系統(tǒng)能夠?qū)乖磻?yīng)的條件下,可會(huì)發(fā)生抗原在腫瘤上的表達(dá)。當(dāng)免疫系統(tǒng)不成熟并且無法反應(yīng)時(shí),在胚胎發(fā)育的過程中,TAA可為在正常細(xì)胞上表達(dá)的抗原,或者它們可為通常在正常細(xì)胞上以非常低的水平存在,但在腫瘤細(xì)胞上以高得多的水平表達(dá)的抗原。
[0137]TSA或TAA抗原的非限制性實(shí)例包括下列:分化抗原如MART-1/Me IanA (MART-1)、gp100(PmeI17)、酪氨酸酶、TRP-U TRP-2和腫瘤特異性多譜系抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE, GAGE-1、GAGE-2、P15 ;過表達(dá)的胚胎抗原如CEA ;過表達(dá)的致癌基因和突變的腫瘤抑制基因如p53、RAS, HER-2/neu ;染色體易位產(chǎn)生的獨(dú)有的腫瘤抗原;如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-1GK,MYL-RAR ;和病毒抗原,如EB病毒抗原EBVA和人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白質(zhì)的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB_3、c_met、nm_23Hl、PSA、TAG-72, CA 19-9, CA72-4、CAMl 7.1、NuMa,K-ras、β -連環(huán)蛋白、CDK4、Mum-1、pl5、pl6、43-9F、5T4、791Tgp72、a-胎蛋白、β -HCG,BCA225、BTAA, CA-125、CA15_3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、C0-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7_Ag、M0V18、NB/70K、NY-C0-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2 結(jié)合蛋白 \ 親環(huán)蛋白 C-相關(guān)蛋白、TAAL6、TAG72、TLP 和 TPS。
[0138]在優(yōu)選的實(shí)施方式中,CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分靶向抗原,其包括但不限于CD19、CD20、CD22、R0R1、間皮蛋白、CD33/IL3Ra、c_Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvII1、GD-2、MY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR 等。
[0139]根據(jù)待靶向的所需的抗原,本發(fā)明的CAR可經(jīng)改造包含適當(dāng)?shù)膶?duì)所需抗原靶標(biāo)特異的抗原結(jié)合部分。例如,如果CD19為所需的待靶向的抗原,則CD19的抗體可用作抗原結(jié)合部分,并入到本發(fā)明的CAR中。
[0140]跨膜結(jié)構(gòu)域
[0141]關(guān)于跨膜結(jié)構(gòu)域,CAR可以設(shè)計(jì)為包括被融合到CAR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一實(shí)施方式中,采用與CAR中的一個(gè)結(jié)構(gòu)域自然相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些情況中,跨膜結(jié)構(gòu)域可被選擇或通過氨基酸取代修飾,以避免這樣的結(jié)構(gòu)域與相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合,從而最小化與受體復(fù)合體的其它成員的相互作用。
[0142]跨膜結(jié)構(gòu)域可由天然的或合成的來源衍生。在來源是天然的情況下,該結(jié)構(gòu)域可以衍生自任何的膜結(jié)合或跨膜蛋白質(zhì)。本發(fā)明中特定用途的跨膜結(jié)構(gòu)域可衍生自(即包含至少下列跨膜區(qū)(一個(gè)或多個(gè)))=T細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、⑶28、⑶3 ε、⑶45、⑶4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154??蛇x地,跨膜結(jié)構(gòu)域也可為合成的,在這種情況下,其將包括主要疏水的殘基,如亮氨酸和纈氨酸。優(yōu)選,在合成跨膜結(jié)構(gòu)域的各端可以發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸,色氨酸和纈氨酸三聯(lián)體。任選地,短寡肽或多肽接頭,優(yōu)選在2和10個(gè)氨基酸之間長(zhǎng)度,可形成CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域之間的連接。甘氨酸-絲氨酸二聯(lián)體提供特別合適的接頭。
[0143]細(xì)朐質(zhì)結(jié)構(gòu)域
[0144]本發(fā)明的CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或另外的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是造成其中已放置CAR的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)器功能的活化的原因。術(shù)語“效應(yīng)器功能”指的是細(xì)胞的專有功能。例如,T細(xì)胞的效應(yīng)器功能可為包括細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞溶解活性或輔助活性。因此術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指的是轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)器功能信號(hào)并指導(dǎo)細(xì)胞實(shí)施專有功能的蛋白部分。盡管通??墒褂谜麄€(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,但在很多例子中,不必使用整個(gè)鏈。就使用細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言,這種截短部分可用于代替完整的鏈,只要它轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)器功能信號(hào)。術(shù)語細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域因此指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)器功能信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。
[0145]用于本發(fā)明的CAR的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選例子包括T細(xì)胞受體(TCR)的細(xì)胞質(zhì)序列和協(xié)同行動(dòng)以在抗原受體結(jié)合后開始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共受體,以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。
[0146]已知通過TCR單獨(dú)產(chǎn)生的信號(hào)不足以完全活化T細(xì)胞,并且也需要次級(jí)或共刺激信號(hào)。因此,T細(xì)胞活化可認(rèn)為由兩個(gè)不同類的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列介導(dǎo):通過TCR開始抗原-依賴性初級(jí)活化的那些(初級(jí)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列)和以抗原-非依賴性方式起作用以提供次級(jí)或共刺激信號(hào)的那些(次級(jí)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列)。
[0147]初級(jí)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列以刺激方式或以抑制方式調(diào)節(jié)TCR復(fù)合物的初級(jí)活化。以刺激方式起作用的初級(jí)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列可包含信號(hào)傳導(dǎo)基序,其已知為基于免疫受體酪氨酸的活化基序或ΙΤΑΜ。
[0148]包含在本發(fā)明中具有具體用途的初級(jí)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列的ITAM的例子包括源于 TCR ζ、FcR Y , FcR β , CD3 Y , CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的那些。特別優(yōu)選地,本發(fā)明的CAR中的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)分子包括源于CD3- ζ的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列。
[0149]在優(yōu)選的實(shí)施方式中,CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計(jì)以本身包括CD3_(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,或可與在本發(fā)明的CAR的內(nèi)容中有用的任何其他期望的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(一個(gè)或多個(gè))聯(lián)合。例如,CAR的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可包括CD3 ζ鏈部分和共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的有效反應(yīng)所需的除抗原受體或它們的配體外的細(xì)胞表面分子。這種分子的例子包括 CD27、CD28、4-1BB(CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-U IC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和與⑶83特異性結(jié)合的配體等等。因此,盡管本發(fā)明主要以CD2作為共刺激信號(hào)傳導(dǎo)元件的例子,但其他共刺激元件也位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0150]本發(fā)明的CAR的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)部分內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)序列可以隨機(jī)或以規(guī)定的順序相互連接。任選地,短的寡肽或多肽連接體,優(yōu)選長(zhǎng)度在2和10個(gè)氨基酸,可形成該連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。
[0151]在一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設(shè)計(jì)以包括CD3_(的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD28的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設(shè)計(jì)以包括CD3- ζ的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD2的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在又一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設(shè)計(jì)以包括CD3- ζ的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD28和CD2的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在又一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設(shè)計(jì)以包括CD3- ζ的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD28、CD2及4-1ΒΒ的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0152]
[0153]本發(fā)明包括DNA構(gòu)建體,其包括CAR的序列,其中該序列包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列,其可操作地連接至細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列??捎糜诒景l(fā)明的CAR的示例性細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括但不限于⑶3- ζ、⑶28、4-1ΒΒ、⑶2等的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些情況下,CAR可包括⑶3- ζ、⑶28、4-1ΒΒ、⑶2等的任何組合。
[0154]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR包括抗⑶19scFv、人⑶8鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域以及人⑶2和⑶3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR包括SEQ ID NO:1列出的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR包括SEQ ID NO:1列出的核酸序列編碼的氨基酸序列。
[0155]編碼期望分子的核酸序列可利用在本領(lǐng)域中已知的重組方法獲得,諸如例如利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù),通過從表達(dá)基因的細(xì)胞中篩選文庫,通過從已知包括該基因的載體中得到該基因,或從包含該基因的細(xì)胞和組織中直接分離。可選地,感興趣的基因可被合成生產(chǎn),而不被克隆。
[0156]本發(fā)明也提供了其中插入本發(fā)明的DNA的載體。源于逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒的載體是實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期基因轉(zhuǎn)移的合適工具,因?yàn)樗鼈冊(cè)试S轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)期、穩(wěn)定的整合并且其在子細(xì)胞中增殖(propagat1n)。慢病毒載體具有超過源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如鼠科白血病病毒的載體的額外優(yōu)點(diǎn),因?yàn)樗鼈兛赊D(zhuǎn)導(dǎo)非增殖的細(xì)胞,諸如肝細(xì)胞。它們也具有低免疫原性的額外優(yōu)點(diǎn)。
[0157]簡(jiǎn)單概括,通常通過可操作地連接編碼CAR多肽或其部分的核酸至啟動(dòng)子,并將構(gòu)建體并入表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)編碼CAR的天然或合成核酸的表達(dá)。該載體對(duì)于復(fù)制和整合真核細(xì)胞可為合適的。典型的克隆載體包含可用于調(diào)節(jié)期望核酸序列表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、初始序列和啟動(dòng)子。
[0158]本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體也可利用標(biāo)準(zhǔn)的基因傳遞方案,用于核酸免疫和基因療法?;騻鬟f的方法在本領(lǐng)域中是已知的。見例如美國專利號(hào)5,399,346、5,580,859、5,589,466,在此通過引用全文并入。在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了基因療法載體。
[0159]該核酸可被克隆入許多類型的載體。例如,該核酸可被克隆入如此載體,其包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動(dòng)物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測(cè)序載體。
[0160]進(jìn)一步地,表達(dá)載體可以以病毒載體形式提供給細(xì)胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的并在例如 Sambrook 等(2001,Molecular Cloing:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊(cè)中進(jìn)行了描述。可用作載體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常,合適的載體包含在至少一種有機(jī)體中起作用的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、方便的限制酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記(例如,WO 01/96584 ;W0 01/29058 ;和美國專利號(hào)6,326,193)。
[0161]已經(jīng)開發(fā)許多基于病毒的系統(tǒng),用于將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如,逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了用于基因傳遞系統(tǒng)的方便的平臺(tái)。可利用在本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將選擇的基因插入載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。該重組病毒可隨后被分離和傳遞至體內(nèi)或離體的對(duì)象細(xì)胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實(shí)施方式中,使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領(lǐng)域中是已知的。在一個(gè)實(shí)施方式中,使用慢病毒載體。
[0162]額外的啟動(dòng)子元件,例如增強(qiáng)子,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄開始的頻率。通常地,這些位于起始位點(diǎn)上游的30-110bp區(qū)域中,盡管近來已經(jīng)顯示許多啟動(dòng)子也包含起始位點(diǎn)下游的功能元件。啟動(dòng)子元件之間的間隔經(jīng)常是柔性的,以便當(dāng)元件相對(duì)于另一個(gè)被倒置或移動(dòng)時(shí),保持啟動(dòng)子功能。在胸苷激酶(tk)啟動(dòng)子中,啟動(dòng)子元件之間的間隔可被增加隔開50bp,活性才開始下降。取決于啟動(dòng)子,表現(xiàn)出單個(gè)元件可合作或獨(dú)立地起作用,以起動(dòng)轉(zhuǎn)錄。
[0163]合適的啟動(dòng)子的一個(gè)例子為即時(shí)早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列為能夠驅(qū)動(dòng)可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子序列。合適的啟動(dòng)子的另一個(gè)例子為延伸生長(zhǎng)因子-1 a (EF-1 α )。然而,也可使用其他組成型啟動(dòng)子序列,包括但不限于類人猿病毒40 (SV40)早期啟動(dòng)子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子、MoMuLV啟動(dòng)子、鳥類白血病病毒啟動(dòng)子、艾伯斯坦-巴爾(Epste in-Barr)病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子、魯斯氏肉瘤病毒啟動(dòng)子、以及人基因啟動(dòng)子,諸如但不限于肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、肌球蛋白啟動(dòng)子、血紅素啟動(dòng)子和肌酸激酶啟動(dòng)子。進(jìn)一步地,本發(fā)明不應(yīng)被限于組成型啟動(dòng)子的應(yīng)用。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也被考慮為本發(fā)明的一部分。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用提供了分子開關(guān),其能夠當(dāng)這樣的表達(dá)是期望的時(shí),打開可操作地連接誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的多核苷酸序列的表達(dá),或當(dāng)表達(dá)是不期望的時(shí)關(guān)閉表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的例子包括但不限于金屬硫蛋白啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子、孕酮啟動(dòng)子和四環(huán)素啟動(dòng)子。
[0164]為了評(píng)估CAR多肽或其部分的表達(dá),被引入細(xì)胞的表達(dá)載體也可包含可選擇的標(biāo)記基因或報(bào)道基因中的任一個(gè)或兩者,以便于從尋求通過病毒載體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群中鑒定和選擇表達(dá)細(xì)胞。在其他方面,可選擇的標(biāo)記可被攜帶在單獨(dú)一段DNA上并用于共轉(zhuǎn)染程序??蛇x擇的標(biāo)記和報(bào)道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列,以便能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。有用的可選擇標(biāo)記包括例如抗生素抗性基因,諸如neo等等。
[0165]報(bào)道基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并用于評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)序列的功能性。通常地,報(bào)道基因?yàn)橐韵禄?其不存在于受體有機(jī)體或組織或由受體有機(jī)體或組織進(jìn)行表達(dá),并且其編碼多肽,該多肽的表達(dá)由一些可容易檢測(cè)的性質(zhì)例如酶活性清楚表示。在DNA已經(jīng)被引入受體細(xì)胞后,報(bào)道基因的表達(dá)在合適的時(shí)間下進(jìn)行測(cè)定。合適的報(bào)道基因可包括編碼熒光素酶、β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶的基因或綠色螢光蛋白基因(例如,U1-Tei等,2000FEBS Letters479:79-82)。合適的表達(dá)系統(tǒng)是公知的并可利用已知技術(shù)制備或從商業(yè)上獲得。通常,顯示最高水平的報(bào)道基因表達(dá)的具有最少5個(gè)側(cè)翼區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子區(qū)可被連接至報(bào)道基因并用于評(píng)價(jià)試劑調(diào)節(jié)啟動(dòng)子-驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力。
[0166]將基因引入細(xì)胞和將基因表達(dá)入細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在表達(dá)載體的內(nèi)容中,載體可通過在本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細(xì)胞,例如,哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞。例如,表達(dá)載體可通過物理、化學(xué)或生物學(xué)手段轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞。
[0167]將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等等。生產(chǎn)包括載體和/或外源核酸的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的。見例如 Sambrook 等(2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, New York)。將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的優(yōu)選方法為磷酸鈣轉(zhuǎn)染。
[0168]將感興趣的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體,特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動(dòng)物例如人細(xì)胞的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒1、腺病毒和腺伴隨病毒等等。見例如美國專利號(hào)5,350,674和5,585,362。
[0169]將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的化學(xué)手段包括膠體分散系統(tǒng),諸如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠;和基于脂質(zhì)的系統(tǒng),包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)遞送工具(delivery vehicle)的示例性膠體系統(tǒng)為脂質(zhì)體(例如,人造膜囊)。
[0170]在使用非病毒傳遞系統(tǒng)的情況下,示例性傳遞工具為脂質(zhì)體??紤]使用脂質(zhì)制劑,以將核酸引入宿主細(xì)胞(體外、離體(ex vivo)或體內(nèi))。在另一方面,該核酸可與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的核酸可被封裝入脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中,散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi),經(jīng)與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者都相關(guān)聯(lián)的連接分子附接至脂質(zhì)體,陷入脂質(zhì)體,與脂質(zhì)體復(fù)合,分散在包含脂質(zhì)的溶液中,與脂質(zhì)混合,與脂質(zhì)聯(lián)合,作為懸浮液包含在脂質(zhì)中,包含在膠束中或與膠束復(fù)合,或以其他方式與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與組成相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)、脂質(zhì)/DNA或脂質(zhì)/表達(dá)載體不限于溶液中的任何具體結(jié)構(gòu)。例如,它們可存在于雙分子層結(jié)構(gòu)中,作為膠束或具有“坍縮的(collapsed)”結(jié)構(gòu)。它們也可簡(jiǎn)單地被散布在溶液中,可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質(zhì)為脂肪物質(zhì),其可為天然發(fā)生或合成的脂質(zhì)。例如,脂質(zhì)包括脂肪小滴,其天然發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)以及包含長(zhǎng)鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺類、氨基醇類和醛類的該類化合物中。
[0171]適于使用的脂質(zhì)可從商業(yè)來源中獲得。例如,二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(“DMPC”)可從Sigma, St.Louis, MO 中獲得;憐酸二嫁臘酯(“DCP”)可從K&K Laboratories (Plainview,NY)中獲得;膽固醇(“Choi”)可從Calb1chem-Beh環(huán)中獲得;二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂質(zhì)可從 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)中獲得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂質(zhì)原液可被保存在大約-20°C下。氯仿用作唯一的溶劑,因?yàn)樗燃状几菀渍舭l(fā)?!爸|(zhì)體”為通用術(shù)語,其包括通過產(chǎn)生封閉的脂雙層或聚集體而形成的多種單一和多層脂質(zhì)工具。脂質(zhì)體可以以具有含有磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊泡結(jié)構(gòu)為特征。多層脂質(zhì)體具有由水性介質(zhì)分開的多個(gè)脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮在過量的水性溶液中時(shí),它們自發(fā)形成。在形成封閉的結(jié)構(gòu)和使水和溶解的溶質(zhì)陷入脂雙層之間前,該脂質(zhì)成分經(jīng)歷自身重排(Ghosh等,191Glycob1logy5:505-10)。然而,也包括與正常的囊泡結(jié)構(gòu)相比具有溶液中的不同結(jié)構(gòu)的組合物。例如,脂質(zhì)可呈現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)或僅作為脂質(zhì)分子的非均一聚集體而存在。同樣考慮的是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-核酸復(fù)合物。
[0172]不管用于將外源核酸弓丨入宿主細(xì)胞,或以其他方式將細(xì)胞暴露于本發(fā)明的抑制劑的方法,為了證實(shí)在宿主細(xì)胞中存在重組DNA序列,可實(shí)施多種測(cè)定。這樣的測(cè)定包括例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的“分子生物學(xué)”測(cè)定,諸如DNA印跡法和RNA印跡法、RT-PCR和PCR ;“生物化學(xué)”測(cè)定,諸如例如通過免疫學(xué)手段(EL1SA和蛋白質(zhì)印跡)或通過本文描述的鑒定落入本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑的測(cè)定,檢測(cè)特定肽的存在或不存在。
[0173]RNA 轉(zhuǎn)染
[0174]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明基因修飾的T細(xì)胞通過引入RNA被修飾。在一個(gè)實(shí)施方式中,體外轉(zhuǎn)錄的RNA CAR可以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的形式被引入細(xì)胞。通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-產(chǎn)生的模板的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA。來自任何來源感興趣的DNA可直接通過使用適當(dāng)?shù)囊锖蚏NA聚合酶的PCR轉(zhuǎn)化成用于體外mRNA合成的模板。DNA的來源可以,例如,基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他適當(dāng)?shù)腄NA來源。用于體外轉(zhuǎn)錄的期望的模板是本發(fā)明的CAR。例如,用于RNA CAR的模板包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域,其包括抗腫瘤抗體的單鏈可變區(qū);包括CDSa的鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域;和包括CD3-4的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD2的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
[0175]在一個(gè)實(shí)施方式中,用于PCR的DNA包括可讀框。DNA可來自天然產(chǎn)生的DNA序列,所述序列來自有機(jī)體基因組。在一個(gè)實(shí)施方式中,DNA為基因的一部分的全長(zhǎng)感興趣基因。基因可包括一些或全部的5’和/或3’非翻譯區(qū)(UTR)。基因可包括外顯子和內(nèi)含子。在一個(gè)實(shí)施方式中,用于PCR的DNA為人基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中,用于PCR的DNA為包括5’和3’ UTR的人基因。DNA可可選地為通常不在天然產(chǎn)生的有機(jī)體中表達(dá)的人工DNA序列。示例性人工DNA序列為包括連接(ligate)在一起以形成編碼融合蛋白的可讀框的基因部分的序列。連接在一起的DNA的部分可來自單一有機(jī)體或來自多于一個(gè)有機(jī)體。
[0176]可用作用于PCR 的DNA的來源的基因包括編碼多肽的基因,其對(duì)有機(jī)體提供治療性或預(yù)防效果或可用于診斷有機(jī)體的疾病或狀況。優(yōu)選的基因?yàn)橐韵禄?其有助于短期治療,或其中有關(guān)于劑量或所表達(dá)基因的安全性的關(guān)注。例如,對(duì)于治療癌癥、自體免疫狀況、寄生蟲的、病毒的、細(xì)菌的、真菌的或其他的感染,所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因(一個(gè)或多個(gè))可編碼擔(dān)當(dāng)用于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的配體或受體的多肽,或可起到刺激或抑制有機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用。在一些實(shí)施方式中,不期望具有持久持續(xù)的免疫系統(tǒng)的刺激,也不必產(chǎn)生在成功治療后延續(xù)的變化,因?yàn)檫@可隨后引出新的問題。對(duì)于自體免疫狀況的治療,可期望驟然抑制或壓制免疫系統(tǒng),但不是長(zhǎng)期的,其可導(dǎo)致患者變得對(duì)感染過度敏感。
[0177]PCR用于產(chǎn)生用于mRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板,其用于轉(zhuǎn)染。用于進(jìn)行PCR的方法是本領(lǐng)域廣泛已知的。設(shè)計(jì)用于PCR的引物,以具有與用作用于PCR的模板的DNA的區(qū)基本上互補(bǔ)的區(qū)?!盎旧匣パa(bǔ)的”,如本文所用,指的是在核苷酸的序列中大多數(shù)或所有的引物序列中的堿基是互補(bǔ)的,或一個(gè)或多個(gè)堿基是非互補(bǔ)的,或錯(cuò)配的。基本上互補(bǔ)的序列能夠在用于PCR的退火條件下,用預(yù)期的DNA靶標(biāo)退火或雜交。引物可被設(shè)計(jì)以與DNA模板的任何部分基本上互補(bǔ)。例如,可設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增通常在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的基因的部分(可讀框),包括5’和3’UTR。也可設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增編碼特定感興趣結(jié)構(gòu)域的基因的部分。在一個(gè)實(shí)施方式中,設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增包括全部或部分的5’和3’UTR的人cDNA的編碼區(qū)。可用于PCR的引物通過本領(lǐng)域廣泛已知的合成方法產(chǎn)生?!罢蛞铩睘榘ㄅc在位于要擴(kuò)增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互補(bǔ)的核苷酸的區(qū)域的引物。本文使用的“上游”指的是對(duì)于相對(duì)于編碼鏈擴(kuò)增的DNA序列的位置5’?!胺聪蛞铩笔前ㄅc位于要擴(kuò)增的DNA序列下游的雙鏈DNA模板基本上互補(bǔ)的核苷酸區(qū)域的引物。本文使用的“下游”指的是對(duì)于相對(duì)于編碼鏈擴(kuò)增的DNA序列的位置3’。
[0178]任何可用于PCR的DNA聚合酶可用于本文公開的方法。試劑和聚合酶從很多來源商業(yè)可得。
[0179]也可使用具有促進(jìn)穩(wěn)定性和/或翻譯效率的能力的化學(xué)結(jié)構(gòu)。RNA優(yōu)選具有5’和3’UTR。在一個(gè)實(shí)施方式中,5’UTR的長(zhǎng)度在O和3000個(gè)核苷酸之間。添加至編碼區(qū)的5’和3’UTR序列的長(zhǎng)度可通過不同的方法改變,包括但不限于,設(shè)計(jì)對(duì)UTR的不同區(qū)域退火的PCR的引物。利用該方法,本領(lǐng)域技術(shù)人員可在轉(zhuǎn)錄RNA的轉(zhuǎn)染后修改實(shí)現(xiàn)最優(yōu)翻譯效率所需要的5’和3’UTR長(zhǎng)度。
[0180]5’和3’UTR可為針對(duì)感興趣基因的天然產(chǎn)生的、內(nèi)源性5’和3’UTR??蛇x地,對(duì)感興趣基因不是內(nèi)源性的UTR序列可通過將UTR序列并入正向和反向引物或通過模板的任何其他修飾添加。對(duì)感興趣基因不是內(nèi)源性的UTR序列的使用可有助于修改RNA的穩(wěn)定性和/或翻譯效率。例如,已知3’ UTR序列中AU-富集的元件可降低mRNA的穩(wěn)定性。因此,基于本領(lǐng)域廣泛已知的UTR性質(zhì),可選擇或設(shè)計(jì)3’ UTR,以增加轉(zhuǎn)錄RNA的穩(wěn)定性。
[0181]在一個(gè)實(shí)施方式中,5’UTR可包括內(nèi)源性基因的Kozak序列??蛇x地,當(dāng)對(duì)感興趣基因不是內(nèi)源性的5’UTR如上述通過PCR添加時(shí),共有Kozak序列可通過添加5’UTR序列重新設(shè)計(jì)。Kozak序列可增加一些RNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率,但似乎不是所有的RNA都需要以實(shí)現(xiàn)有效的翻譯。對(duì)于很多mRNA的Kozak序列的需要是本領(lǐng)域已知的。在其他實(shí)施方式中,5’ UTR可源于RNA病毒,其RNA基因組在細(xì)胞中是穩(wěn)定的。在其他實(shí)施方式中,不同的核苷酸類似物可用于3’ 或5’ UTR,以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
[0182]為了能夠?qū)崿F(xiàn)從DNA模板合成RNA,而不需要基因克隆,轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子應(yīng)被附接至轉(zhuǎn)錄的序列的DNA模板上游。當(dāng)擔(dān)當(dāng)RNA聚合酶的啟動(dòng)子的序列被添加至正向引物的5’末端時(shí),RNA聚合酶啟動(dòng)子變?yōu)椴⑷朕D(zhuǎn)錄的可讀框的PCR產(chǎn)物上游。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,啟動(dòng)子為T7聚合酶啟動(dòng)子,如本文其他地方描述的。其他有用的啟動(dòng)子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子。對(duì)于T7、T3和SP6啟動(dòng)子的共有核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。
[0183]在優(yōu)選的實(shí)施方式中,mRNA具有5’末端上的帽和3’poly (A)尾兩者,其確定細(xì)胞中的核糖體結(jié)合、翻譯開始和mRNA的穩(wěn)定性。在環(huán)形DNA模板上,例如質(zhì)粒DNA,RNA聚合酶產(chǎn)生長(zhǎng)的多聯(lián)產(chǎn)物,其不適于真核細(xì)胞中的表達(dá)。在3’UTR末端上線性化的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正常尺寸的mRNA,其在真核轉(zhuǎn)染中不是有效的,即使它在轉(zhuǎn)錄后多聚腺苷酸化。
[0184]在線性DNA模板上,噬菌體T7RNA聚合酶可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的3’末端超過模板的最后喊基(Schenborn 和 Mierendorf, Nuc Acids Res.,13:6223-36 (1985) ;Nacheva 和Berzal-Herranz, Eur.J.B1chem., 270:1485-65(2003))。
[0185]polyA/T延伸進(jìn)入DNA模板的整合的常規(guī)方法為分子克隆。然而整合入質(zhì)粒DNA的polyA/T序列可引起質(zhì)粒不穩(wěn)定性,這是為何從細(xì)菌細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA模板通常以缺失和其他差錯(cuò)被高度污染。這使克隆程序不僅是費(fèi)力和耗時(shí)的,而且經(jīng)常是不可靠的。這是為何允許用polyA/T3’ 一段序列而不是克隆的DNA模板的構(gòu)建方法是高度期望的。
[0186]轉(zhuǎn)錄的DNA模板的polyA/T片段可在PCR期間通過使用包括polyT尾諸如10T尾(尺寸可為50-5000T)的反向引物,或在PCR后通過任何其他方法,包括但不限于DNA連接或體外重組而產(chǎn)生。Poly(A)尾也提供了對(duì)RNA的穩(wěn)定性并減少了它們的降解。通常,poly(A)尾的長(zhǎng)度與轉(zhuǎn)錄的RNA穩(wěn)定性正相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方式中,poly(A)尾在100和5000個(gè)腺苷之間。
[0187]RNA的Poly⑷尾可在通過使用poly⑷聚合酶諸如大腸桿菌polyA聚合酶(E-PAP)的體外轉(zhuǎn)錄后進(jìn)一步延長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中,增加poly (A)尾長(zhǎng)度從100個(gè)核苷酸至300和400個(gè)之間的核苷酸導(dǎo)致RNA的翻譯效率增加大約兩倍。另外,不同的化學(xué)基團(tuán)附接至3’末端可增加mRNA穩(wěn)定性。這樣的附接可包括修飾的/人工的核苷酸、適配體和其他化合物。例如,ATP類似物可利用poly (A)聚合酶并入poly (A)尾。ATP類似物可進(jìn)一步增加RNA的穩(wěn)定性。
[0188]5’帽也為RNA分子提供了穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,通過本文公開的方法生產(chǎn)的RNA包括5’帽。5’帽利用本領(lǐng)域已知的并在本文中描述的技術(shù)提供(Cougot等,Trends in B1chem.Sc1.,29:436-444 (2001) ;St印inski 等,RNA, 7:1468-95 (2001);Elango 等,B1chim.B1phys.Res.Commun., 330:958-966 (2005))。
[0189]通過本文公開的方法生產(chǎn)的RNA也可包括內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒的、染色體的或人工設(shè)計(jì)的序列,其起動(dòng)結(jié)合至mRNA的不依賴帽的核糖體,并便于翻譯的開始??砂ㄈ魏芜m于細(xì)胞電穿孔的溶質(zhì),所述溶質(zhì)可包括促進(jìn)細(xì)胞滲透性和生存力的因素,諸如糖、肽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗氧化劑和表面活性劑。
[0190]RNA可利用很多不同方法中的任一種引入靶細(xì)胞,所述方法例如商業(yè)可得的方法,其包括但不限于電穿孔(Amaxa Nucleofector-1I (Amaxa B1systems, Cologne, Germany))
,(ECM830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)或 Gene Pulser II(B1Rad, Denver, Col0.), Multipora tor (Eppendort, Hamburg Germany),利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法的陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚合物包封、肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或生物射彈粒子遞送系統(tǒng)諸如“基因槍”(見例如,Nishikawa 等,Hum Gene Ther.,12 (8): 861-70 (2001))。
[0191]基因修飾的T細(xì)胞
[0192]在一些實(shí)施方式中,CAR序列利用反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體傳遞入細(xì)胞。表達(dá)CAR的反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體可利用作為運(yùn)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或包封的、結(jié)合的或裸載體的無細(xì)胞局部或全身傳遞,傳遞入不同類型的真核細(xì)胞以及傳遞入組織和整個(gè)有機(jī)體。所用方法可用于其中穩(wěn)定表達(dá)是需要的或充足的任何目的。
[0193]在其他實(shí)施方式中,CAR序列利用體外轉(zhuǎn)錄的mRNA傳遞入細(xì)胞。體外轉(zhuǎn)錄的mRNACAR可利用作為運(yùn)載體的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或包封的、結(jié)合的或裸mRNA的無細(xì)胞局部或全身傳遞,傳遞入不同類型的真核細(xì)胞以及傳遞入組織和整個(gè)有機(jī)體。所用方法可用于其中瞬時(shí)表達(dá)是需要的或充足的任何目的。
[0194]所公開的方法可在基礎(chǔ)研究和療法中,在癌癥、干細(xì)胞、急性和慢性感染以及自體免疫疾病的領(lǐng)域中,調(diào)整T細(xì)胞活性,包括評(píng)估基因修飾的T細(xì)胞殺死靶癌癥細(xì)胞的能力。
[0195]該方法也提供了通過改變例如啟動(dòng)子或輸入RNA的量,在寬范圍中控制表達(dá)水平的能力,使其可能單獨(dú)調(diào)節(jié)表達(dá)水平。此外,基于PCR的mRNA產(chǎn)生的技術(shù)大大促進(jìn)具有不同結(jié)構(gòu)和它們結(jié)構(gòu)域的組合的嵌合受體mRNA的設(shè)計(jì)。例如,改變?cè)谙嗤?xì)胞中的多嵌合受體上的不同細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器/共刺激因子(costimulator)結(jié)構(gòu)域允許確定受體組合的結(jié)構(gòu),所述受體組合評(píng)估對(duì)抗多抗原靶標(biāo)的最高水平的細(xì)胞毒性,同時(shí)對(duì)于正常細(xì)胞的最低細(xì)胞毒性。
[0196]本發(fā)明RNA轉(zhuǎn)染方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是RNA轉(zhuǎn)染是基本上瞬時(shí)的和無載體的:RNA轉(zhuǎn)基因可被傳遞至淋巴細(xì)胞并在簡(jiǎn)短的體外細(xì)胞活化之后在其中表達(dá),作為最小表達(dá)盒,而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下,轉(zhuǎn)基因整合入宿主細(xì)胞基因組是不可能的。細(xì)胞的克隆是不必要的,因?yàn)镽NA的轉(zhuǎn)染效率和它均勻修飾整個(gè)淋巴細(xì)胞群的能力。
[0197]T細(xì)胞通過體外轉(zhuǎn)錄的RNA(IVT-RNA)的基因修飾利用兩種不同的策略,其兩者已經(jīng)在不同的動(dòng)物模型中成功測(cè)試。細(xì)胞通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或電穿孔,利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地,期望利用不同的修飾使IVT-RNA穩(wěn)定,以便實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的IVT-RNA的持久表達(dá)。
[0198]一些IVT載體在文獻(xiàn)中已知,其以標(biāo)準(zhǔn)化的方式用作體外轉(zhuǎn)錄的模板,并且其已經(jīng)以產(chǎn)生穩(wěn)定化的RNA轉(zhuǎn)錄物的方式進(jìn)行基因修飾。目前用于本領(lǐng)域的方案基于具有以下結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體:能夠?qū)崿F(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄的5’RNA聚合酶啟動(dòng)子,隨后是通過未翻譯區(qū)(UTR)位于3’和/或5’的側(cè)翼的感興趣基因,和包括50-70A核苷酸的3’多聚腺苷酸盒。在體外轉(zhuǎn)錄前,環(huán)形質(zhì)粒通過II型限制酶在多聚腺苷酸盒下游線性化(識(shí)別序列對(duì)應(yīng)于切割位點(diǎn))。多腺苷酸盒因此對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄物中后面的Poly(A)序列。作為該程序的結(jié)果,一些核苷酸作為酶切割位點(diǎn)的部分在線性化后保持,并延長(zhǎng)或掩蓋3’末端上的poly(A)序列。不清楚該非生理學(xué)懸突(overhang)是否影響從這樣的構(gòu)建體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。
[0199]RNA具有超過更多傳統(tǒng)質(zhì)?;虿《痉椒ǖ臄?shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)。來自RNA來源的基因表達(dá)不需要轉(zhuǎn)錄,并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后快速產(chǎn)生。進(jìn)一步地,因?yàn)镽NA不得不僅獲得接近細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核的機(jī)會(huì),并且因此通常的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)致極高的轉(zhuǎn)染率。另外,基于質(zhì)粒的方法要求驅(qū)動(dòng)感興趣基因表達(dá)的啟動(dòng)子在研究的細(xì)胞中是活性的。
[0200]在另一方面,RNA構(gòu)建體可通過電穿孔傳遞入細(xì)胞。見例如,核酸構(gòu)建體進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的電穿孔的制劑和方法,如US 2004/0014645、US 2005/0052630AU US2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1 中教導(dǎo)的。包括任何已知細(xì)胞類型的電穿孔需要的電場(chǎng)強(qiáng)度的各種參數(shù)通常在有關(guān)研究文獻(xiàn)以及本領(lǐng)域很多專利和申請(qǐng)中已知。見例如美國專利號(hào)6,678,556、美國專利號(hào)7,171,264和美國專利號(hào)7,173,116。用于電穿孔的治療性應(yīng)用的裝置是商業(yè)可得的,例如,MedPulser? DNA電穿孔療法系統(tǒng)(Inov1/Genetronics, San Diego, Calif.),并且在諸如美國專利號(hào) 6, 567, 694 ;美國專利號(hào)6,516,223、美國專利號(hào)5,993,434、美國專利號(hào)6,181,964、美國專利號(hào)6,241,701和美國專利號(hào)6,233,482的專利中描述;電穿孔也可用于體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞,如例如US20070128708A1中描述的。電穿孔也可用于體外傳遞核酸進(jìn)入細(xì)胞。因此,利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的很多可用的設(shè)備和電穿孔系統(tǒng)中的任一個(gè)進(jìn)入包括表達(dá)構(gòu)建體的核酸的細(xì)胞的電穿孔介導(dǎo)的給藥呈現(xiàn)了令人興奮的傳遞感興趣RNA至靶細(xì)胞的新方法。
[0201]T細(xì)朐的來源
[0202]在本發(fā)明的T細(xì)胞的擴(kuò)張和基因修飾之前,從對(duì)象獲得T細(xì)胞的來源。T細(xì)胞可獲得自許多來源,包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,可使用本領(lǐng)域可用的任何數(shù)量的T細(xì)胞系。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,T細(xì)胞可獲得自使用技術(shù)人員已知的任何數(shù)量的技術(shù),比如ficoll分離從受試者收集的單位血液。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,通過單采血液成分術(shù)獲得來自個(gè)體的循環(huán)血液的細(xì)胞。單采血液成分術(shù)產(chǎn)物典型地含有淋巴細(xì)胞,包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞,其他成核白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。在一個(gè)實(shí)施方式中,可清洗通過單采血液成分術(shù)收集的細(xì)胞,以移除血漿部分并將細(xì)胞放置在適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)基中,用于隨后的處理步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗。在可選實(shí)施方式中,清洗溶液缺少鈣并可缺少鎂或可缺少很多——如果不是全部——二價(jià)陽離子。而且,令人驚訝地,在缺少鈣的情況下的最初活化步驟導(dǎo)致放大的活化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解沖洗步驟可通過本領(lǐng)域已知的方法,如根據(jù)制造者說明書通過利用半自動(dòng)化的“流通”離心機(jī)(例如,Cobe2991毛細(xì)腔式洗片器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver5)完成。沖洗之后,細(xì)胞可重新懸浮在各種生物相容性緩沖液中,比如,例如,無Ca2+、無Mg2+PBS、PlasmaLyte A、或其它具有或沒有緩沖液的鹽溶液??蛇x地,可移除單采血液成分術(shù)樣本的不期望成分和細(xì)胞直接重新懸浮在培養(yǎng)基中。
[0203]在另一實(shí)施方式中,通過溶解紅細(xì)胞和耗減單核細(xì)胞從外周血分離T細(xì)胞,例如,通過利用PERC0LL?梯度的離心或通過對(duì)流離心洗脫法。特定的T細(xì)胞亞群,如⑶3+、⑶28+、⑶4+、⑶8+、⑶45RA+和⑶45R0+T細(xì)胞可通過陽性或陰性選擇技術(shù)而進(jìn)一步分離。例如,在一個(gè)實(shí)施方式中,T細(xì)胞通過與抗⑶3/抗⑶28 (即,3x28)-結(jié)合的珠,如DYNABEADS?M-450⑶3/⑶28T溫育足以用于期望的T細(xì)胞陽性選擇的時(shí)期而分離。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述時(shí)期是30分鐘。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,所述時(shí)期的范圍是30分鐘至36小時(shí)或更長(zhǎng)和它們之間的所有整數(shù)值。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,所述時(shí)期是至少1、2、3、4、5或6小時(shí)。在再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,所述時(shí)期是10至24小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,溫育時(shí)期是24小時(shí)。對(duì)于T細(xì)胞從具有白血病的患者的分離,使用更長(zhǎng)的溫育時(shí)間,如24小時(shí)可增加細(xì)胞產(chǎn)率。更長(zhǎng)的溫育時(shí)間可用于在存在與其它細(xì)胞類型相比幾乎很少的T細(xì)胞的任何情況中分離T細(xì)胞,如在從腫瘤組織或從缺乏免疫的個(gè)體分離腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)中。進(jìn)一步,更長(zhǎng)的溫育時(shí)間可增加CD8+T細(xì)胞的捕獲效率。因此,通過只是縮短或延長(zhǎng)允許T細(xì)胞結(jié)合CD3/CD28珠的時(shí)間和/或通過增加或減少珠與T細(xì)胞的比(如本文所進(jìn)一步描述的),T細(xì)胞亞群可在培養(yǎng)開始或在所述過程期間的其它時(shí)間點(diǎn)優(yōu)先選擇。另外,通過增加或減少珠或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗體的比,T細(xì)胞亞群可在培養(yǎng)開始或在其它期望的時(shí)間點(diǎn)優(yōu)先選擇。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到多輪選擇還可用于本發(fā)明的上下文中。在某些實(shí)施方式中,可期望在活化和擴(kuò)張過程中進(jìn)行選擇操作和使用“未選擇的”細(xì)胞。“未選擇的”細(xì)胞還可進(jìn)行進(jìn)一步的輪次選擇。
[0204]通過陰性選擇的T細(xì)胞群的富集可利用涉及對(duì)陰性選擇的細(xì)胞獨(dú)特的表面標(biāo)記的抗體的組合完成。一種方法為細(xì)胞分選和/或選擇,其經(jīng)陰性磁性免疫粘附或使用針對(duì)存在于陰性選擇的細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記的單克隆抗體的混合物的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。例如,為了通過陰性選擇富集⑶4+細(xì)胞,單克隆抗體混合物通常包括對(duì)⑶14、⑶20、⑶lib、⑶16、HLA-DR和⑶8的抗體。在某些實(shí)施方式中,可期望或?qū)φ{(diào)節(jié)T細(xì)胞富集或陽性選擇通常表達(dá)CD4+、CD25+、CD62Lh1、GITR+和FoxP3+。可選地,在某些實(shí)施方式中,T調(diào)節(jié)細(xì)胞通過抗C25結(jié)合的珠或其它相似的選擇方法排除。
[0205]對(duì)于通過陽性或陰性選擇分離期望的細(xì)胞群,可改變細(xì)胞和表面(例如,顆粒諸如珠)的濃度。在某些實(shí)施方式中,可期望顯著減少其中珠和細(xì)胞被混合在一起的體積(即,增加細(xì)胞濃度),以確保細(xì)胞和珠的最大接觸。例如,在一個(gè)實(shí)施方式中,使用20億細(xì)胞/ml的濃度。在一個(gè)實(shí)施方式中,使用10億細(xì)胞/ml的濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,使用多于I億細(xì)胞/ml。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X106細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。還在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用75、80、85、90、95或100父106細(xì)胞/1111的細(xì)胞濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,可使用125或150X 16細(xì)胞/ml的濃度。使用高濃度可產(chǎn)生增加的細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活化和細(xì)胞擴(kuò)張。進(jìn)一步,高細(xì)胞濃度的使用允許更有效的細(xì)胞捕獲,所述細(xì)胞可微弱表達(dá)感興趣的靶抗原,如CD28-陰性T細(xì)胞,或來自存在許多細(xì)胞的樣品(即,白血病的血、腫瘤組織等)。這樣的細(xì)胞群體可具有治療價(jià)值和將期望獲得。例如,利用高細(xì)胞濃度允許更有效的通常具有較弱CD28表達(dá)的CD8+T細(xì)胞的選擇。
[0206]在相關(guān)的實(shí)施方式中,可期望使用更低濃度的細(xì)胞。通過顯著稀釋T細(xì)胞和表面(例如,顆粒諸如珠)的混合物,顆粒和細(xì)胞之間的相互作用被最小化。這選擇表達(dá)高數(shù)量的結(jié)合至顆粒的期望抗原的細(xì)胞。例如,在稀濃度,CD4+T細(xì)胞比CD8+T細(xì)胞表達(dá)更高水平的CD28并更有效地被捕獲。在一個(gè)實(shí)施方式中,使用的細(xì)胞濃度是5X 106/ml。在其它實(shí)施方式中,使用的濃度可以是約lX105/ml至IX 106/ml,和其間的任何整數(shù)值。
[0207]在其它實(shí)施方式中,細(xì)胞可在旋轉(zhuǎn)器上以不同的速度在2-10°C或在室溫溫育不同長(zhǎng)度的時(shí)間。
[0208]用于刺激的T細(xì)胞可也在沖洗步驟之后冷凍。盡管不希望被理論限制,通過去除細(xì)胞群體中的粒細(xì)胞和以一些程度去除單核細(xì)胞,冷凍和隨后的解凍步驟提供了更均一的產(chǎn)物。在移除血漿和血小板的沖洗步驟之后,細(xì)胞可懸浮在冷凍液中。盡管許多冷凍液和參數(shù)是本領(lǐng)域已知的并且將用于該背景下,但是一種方法包括使用含有20% DMSO和8%人血清白蛋白的PBS,或含有10%右旋糖酐40和5%右旋糖、20%人血清白蛋白和7.5% DMSO,或 31.25% Plasmalyte-A,31.25%右旋糖 5%、0.45% NaCl、10%右旋糖酐 40 和 5%右旋糖、20%人血清白蛋白、和7.5% DMSO的培養(yǎng)基,或含有例如,Hespan和PlasmaLyte A的其他適當(dāng)?shù)募?xì)胞冷凍媒介 ,然后細(xì)胞以每分鐘1°的速度被冷凍至_80°C并且存儲(chǔ)在液氮儲(chǔ)罐的蒸汽相中??墒褂檬芸乩鋬龅钠渌椒ㄒ约霸赺20°C下或液氮中不受控的即刻冷凍。
[0209]在某些實(shí)施方式中,將冷凍保存的細(xì)胞解凍和沖洗,如本文所描述的,和允許在利用本發(fā)明的方法活化之前在室溫放置I小時(shí)。
[0210]在本發(fā)明的背景中還考慮在當(dāng)如本文所描述的擴(kuò)張的細(xì)胞可能需要時(shí)之前的時(shí)期來自對(duì)象的血液樣品的采集或單采血液成分術(shù)產(chǎn)物。像這樣,將被擴(kuò)張的細(xì)胞來源可在需要的任何時(shí)間點(diǎn)采集,并且將期望的細(xì)胞,如T細(xì)胞,分離和冷凍用于以后用于任何數(shù)目的將獲益于T細(xì)胞治療的疾病或狀況——如本文描述的那些——的T細(xì)胞治療。在一個(gè)實(shí)施方式中,血液樣品或單采血液成分術(shù)取自通常健康的對(duì)象。在某些實(shí)施方式中,血液樣品或單采血液成分術(shù)取自通常健康的對(duì)象,其瀕臨發(fā)展疾病的危險(xiǎn),但是其尚未發(fā)展疾病,并將感興趣的細(xì)胞分離和冷凍用于以后使用。在某些實(shí)施方式中,可將T細(xì)胞擴(kuò)張、冷凍和在以后的時(shí)間使用。在某些實(shí)施方式中,樣品采集自如本文描述的具體疾病的診斷之后不久但是在任何治療之前的患者。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,細(xì)胞分離自來自在任何數(shù)目的相關(guān)治療形式之前對(duì)象的血液樣品或單采血液成分術(shù),所述治療形式包括但不限于用藥劑的治療,所述藥劑如那他珠單抗、依法珠單抗、抗病毒藥,化學(xué)療法,輻照,免疫抑制劑,如環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麥考酚酯和FK506、抗體、或其它免疫燒蝕劑如CAMPATH、抗CD3抗體、環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、類固醇、FR901228,和輻照。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶一鈣調(diào)磷酸酶(環(huán)孢菌素和FK506)或抑制對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)重要的P70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等,Cell66:807-815, 1991 ;Henderson等,Tmmun.73:316-321,1991 ;Bierer 等,Curr.0pin, Tmmun.5:763-773,1993)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,將細(xì)胞分離用于患者與冷凍用于以后與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法(XRT)、環(huán)磷酰胺或抗體諸如0KT3或CAMPATH的T細(xì)胞燒蝕療法結(jié)合(例如,之前、同時(shí)或之后)使用。在另一個(gè)實(shí)施方式中,將細(xì)胞在之前分離并可冷凍用于以后用于在B-細(xì)胞燒蝕療法諸如與CD20反應(yīng)的試劑例如Rituxan后的治療。
[0211]在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中,T細(xì)胞獲自治療之后不久的患者。從這一點(diǎn)上,已觀察到以下某些癌癥治療,特別是用損害免疫系統(tǒng)的藥物的治療之后,當(dāng)患者將正常地從治療恢復(fù)時(shí)的時(shí)期期間治療之后不久,獲得的T細(xì)胞質(zhì)量可以是最佳的或提高它們離體擴(kuò)張的能力。同樣,利用本文描述的方法離體操作之后,這些細(xì)胞可處于優(yōu)選狀態(tài)用于提高的移入和體內(nèi)擴(kuò)張。因此,在本發(fā)明的背景內(nèi)考慮在該恢復(fù)期期間采集血細(xì)胞,包括T細(xì)胞、樹突細(xì)胞或造血譜系的其它細(xì)胞。進(jìn)一步,在某些實(shí)施方式中,動(dòng)員(例如,用GM-CSF的動(dòng)員)和條件處理計(jì)劃可用于在對(duì)象中產(chǎn)生條件,其中偏愛特定細(xì)胞類型的再增殖、再循環(huán)、再生和/或擴(kuò)張,特別是在治療之后的限定的時(shí)間窗期間。例證性的類型包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞。
[0212]T細(xì)胞的活化和擴(kuò)張
[0213]不論在T細(xì)胞基因修飾以表達(dá)期望的CAR之前或之后,T細(xì)胞都可通常使用以下所述的方法活化和擴(kuò)張:例如美國專利6,352,694 ;6,534,055 ;6,905,680 ;6,692,964 ;5,858,358 ;6,887,466 ;6,905,681 ;7,144,575 ;7,067,318 ;7,172,869 ;7,232,566 ;7,175,843 ;5,883,223 ;6,905,874 ;6,797,514 ;6,867,041 ;和美國專利申請(qǐng)公布號(hào)20060121005。
[0214]通常地,本發(fā)明的T細(xì)胞通過與表面的接觸進(jìn)行擴(kuò)張,所述表面具有附著于其的刺激CD3/TCR復(fù)合物相關(guān)信號(hào)的試劑和刺激T細(xì)胞表面上的共刺激分子的配體。特別地,T細(xì)胞群可如本文所述的諸如通過與固定在表面上的抗CD3抗體或其抗原-結(jié)合片段或抗⑶2抗體接觸,或通過和與鈣離子載體組合的蛋白激酶C激活劑(例如,苔蘚抑制素)接觸進(jìn)行刺激。對(duì)于T細(xì)胞表面上的輔助分子的共刺激,使用結(jié)合輔助分子的配體。例如,T細(xì)胞群可在適于刺激T細(xì)胞增殖的條件下與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。為了刺激⑶4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞的增殖,抗⑶3抗體和抗⑶28抗體??耿?8抗體的實(shí)例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone, Bcsancon, France),可用作本領(lǐng)域通常已知的其它方法(Berg et al., Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998 ;Haanen et al., J.Exp.Med.190(9):13191328, 1999 ;GarIand et al., J.1mmunoIMeth.227(1-2):53-63,1999)。
[0215]在某些實(shí)施方式中,T細(xì)胞的初級(jí)刺激信號(hào)和共刺激信號(hào)可通過不同的方案提供。例如,提供每個(gè)信號(hào)的試劑可在溶液中或連接至表面。當(dāng)連接至表面時(shí),試劑可被連接至同一表面(即,以“cis”形式)或分開的表面(即,以“trans”形式)。可選地,一種試劑可被連接至表面和另一種試劑處于溶液中。在一個(gè)實(shí)施方式中,提供共刺激信號(hào)的試劑被結(jié)合至細(xì)胞表面,并且提供初級(jí)活化信號(hào)的試劑在溶液中或被連接至表面。在一些實(shí)施方式中,兩種試劑可都在溶液中。在另一個(gè)實(shí)施方式中,試劑可處于可溶形式,隨后被交聯(lián)至表面,諸如表達(dá)Fe受體或抗體的細(xì)胞或?qū)⒔Y(jié)合該試劑的其他結(jié)合劑。在這點(diǎn)上,見例如用于人造抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)的美國專利申請(qǐng)公布號(hào)20040101519和20060034810,其被考慮用于活化和擴(kuò)張本發(fā)明的T細(xì)胞。
[0216]在一個(gè)實(shí)施方式中,兩種試劑被固定在珠上,在同一珠即“cis”上或分開的珠即“trans”上。作為例子,提供初級(jí)活化信號(hào)的試劑為抗CD3抗體或其抗原-結(jié)合片段,和提供共刺激信號(hào)的試劑為抗CD28抗體或其抗原-結(jié)合片段;并且兩種試劑都以相等的分子數(shù)量被共固定至同一珠。在一個(gè)實(shí)施方式中,使用結(jié)合至用于⑶4+T細(xì)胞擴(kuò)張和T細(xì)胞生長(zhǎng)的珠的每種抗體的1:1比率。在本發(fā)明的某些方面中,使用結(jié)合至珠的抗CD3:CD28抗體的比率,以便與利用1:1比率觀察到的擴(kuò)張相比,觀察到T細(xì)胞擴(kuò)張的增加。在一個(gè)實(shí)施方式中,與利用1:1比率觀察到的擴(kuò)張相比,觀察到約I至約3倍增加。在一個(gè)實(shí)施方式中,結(jié)合至珠的⑶3:⑶28抗體的比率處于100:1至1:100的范圍中和其間的所有整數(shù)值。在本發(fā)明的一個(gè)方面中,比抗⑶3抗體更多的抗⑶28抗體被結(jié)合至顆粒,即⑶3:⑶28的比率小于I。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,結(jié)合至珠的抗⑶28抗體與抗⑶3抗體的比率大于2:1。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中,使用結(jié)合至珠的抗體的1:100的⑶3:⑶28比率。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用結(jié)合至珠的抗體的1:75的CD3:CD28比率。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,使用結(jié)合至珠的抗體的1:50的⑶3:⑶28比率。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用結(jié)合至珠的抗體的1:30的⑶3:⑶28比率。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,使用結(jié)合至珠的抗體的1:10的⑶3:⑶28比率。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用結(jié)合至珠的抗體的1:3的CD3:CD28比率。還在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用結(jié)合至珠的抗體的3:1的⑶3:⑶28比率。
[0217]從1:500至500:1和其間任何整數(shù)值的顆粒與細(xì)胞的比率可用于刺激T細(xì)胞或其他靶細(xì)胞。因?yàn)樵诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員可容易地領(lǐng)會(huì)到,顆粒與細(xì)胞的比率可取決于相對(duì)于靶細(xì)胞的顆粒大小。例如,小尺寸的珠僅可結(jié)合一些細(xì)胞,而較大的珠能結(jié)合很多。在某些實(shí)施方式中,細(xì)胞與顆粒的比率在從1:100至100:1的范圍內(nèi)和其間任何整數(shù)值,和在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,該比率包括1:9至9:1和其間任何整數(shù)值,也可用于刺激T細(xì)胞??耿?-和抗CD28-結(jié)合的顆粒與產(chǎn)生T細(xì)胞刺激的T細(xì)胞的比率可如以上記錄的變化,然而某些優(yōu)選的值包括 1:100、1: 50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1: 1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1 和 15:1,一個(gè)優(yōu)選的比率為至少 1:1 顆粒每個(gè) T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中,使用1:1或更小的顆粒與細(xì)胞的比率。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中,優(yōu)選的顆粒:細(xì)胞比率為1:5。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,顆粒與細(xì)胞的比率可根據(jù)刺激天數(shù)而改變。例如,在一個(gè)實(shí)施方式中,顆粒與細(xì)胞的比率在第一天為從1:1至10:1,和額外的顆粒此后每天或每隔一天直至10天,以從1:1至1:10的最終比率(基于添加日的細(xì)胞計(jì)數(shù))被添加至細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中,顆粒與細(xì)胞的比率在刺激的第一天為1:1并在刺激的第三和第五天被調(diào)節(jié)至1:5。在另一個(gè)實(shí)施方式中,顆粒在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添加,以在第一天最終比率為1:1,并在刺激的第三和第五天最終比率為1:5。在另一個(gè)實(shí)施方式中,顆粒與細(xì)胞的比率在刺激的第一天為2:1并在刺激的第三和第五天被調(diào)節(jié)至I: 10。在另一個(gè)實(shí)施方式中,顆粒在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添加,以在第一天最終比率為1:1,和在刺激的第三和第五天最終比率為1:10。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解多種其他比率可適于用于本發(fā)明。特別地,比率將根據(jù)顆粒大小和細(xì)胞大小和類型而變化。
[0218]在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中,細(xì)胞諸如T細(xì)胞,與包被試劑的珠組合,隨后分離該珠和細(xì)胞,并且隨后培養(yǎng)該細(xì)胞。在一個(gè)可選實(shí)施方式中,在培養(yǎng)前,不分離包被試劑的珠和細(xì)胞,而是在一起進(jìn)行培養(yǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,珠和細(xì)胞首先通過施加力諸如磁力被聚集,產(chǎn)生增加的細(xì)胞表面標(biāo)記的連接作用,由此誘導(dǎo)細(xì)胞刺激。
[0219]作為例子,可通過允許附接抗⑶3和抗⑶28的順磁珠(3x28珠)接觸T細(xì)胞,來連接細(xì)胞表面蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞(例如,14至19個(gè)T細(xì)胞)和珠(例如,以I: I比率的DYNABEADS? M-450CD3/CD28T順磁珠)在緩沖液優(yōu)選PBS (沒有二價(jià)陽離子諸如,鈣和鎂)中進(jìn)行聯(lián)合。此外,本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易理解可使用任何細(xì)胞濃度。例如,靶細(xì)胞可在樣本中非常稀少并僅占0.01%的樣本,或整個(gè)樣本(即,100% )可包括感興趣的靶細(xì)胞。因此,任何細(xì)胞數(shù)量都在本發(fā)明的內(nèi)容內(nèi)。在某些實(shí)施方式中,可期望顯著降低其中顆粒和細(xì)胞混合在一起的體積(即,增加細(xì)胞濃度),以確保細(xì)胞和顆粒的最大接觸。例如,在一個(gè)實(shí)施方式中,使用大約20億細(xì)胞/ml的濃度,在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用多于I億細(xì)胞/ml。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,使用細(xì)胞濃度10、15、20、25、30、35、40、45或50X106細(xì)胞/ml。還在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用細(xì)胞濃度75、80、85、90、95或100X 16細(xì)胞/ml,在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,可使用125或150X 16細(xì)胞/ml的濃度。利用高濃度可產(chǎn)生增加的細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活化和細(xì)胞擴(kuò)張。進(jìn)一步地,使用高細(xì)胞濃度允許更有效地捕獲可微弱表達(dá)感興趣的靶抗原的細(xì)胞,諸如CD28-陰性T細(xì)胞。這樣的細(xì)胞群可具有治療價(jià)值并將在某些實(shí)施方式中期望獲得。例如,利用高濃度的細(xì)胞允許更有效選擇正常具有更弱CD28表達(dá)的⑶8+T細(xì)胞。
[0220]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,混合物可被培養(yǎng)數(shù)個(gè)小時(shí)(大約3個(gè)小時(shí))至大約14天或其間任何個(gè)小時(shí)的整數(shù)值。在另一個(gè)實(shí)施方式中,混合物可被培養(yǎng)21天。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,珠和T細(xì)胞在一起培養(yǎng)大約八天。在另一個(gè)實(shí)施方式中,珠和T細(xì)胞在一起培養(yǎng)2-3天。也可期望數(shù)個(gè)周期的刺激,以便T細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間可為60天或更多天。適于T細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如,最小必需培養(yǎng)基或RPMl培養(yǎng)基1640或X-vivol5, (Lonza)),其可包含增殖和存活必需的因子,包括血清(例如,胎?;蛉搜?、白細(xì)胞介素-2 (IL-2) 、胰島素、IFN- Y、IL-4、IL-7、GM-CSF, IL-10、IL-12、IL-15、TGFp 和TNF-α或技術(shù)人員已知的用于細(xì)胞生長(zhǎng)的任何其他添加劑。用于細(xì)胞生長(zhǎng)的其他添加劑包括但不限于表面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)和還原劑諸如N-乙?;?半胱氨酸和 2-巰基乙醇。培養(yǎng)基可包括 RPMI1640、AM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F_12、X_Vivol5 和X-Vivo20、優(yōu)化物(Optimizer),具有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素、無血清或補(bǔ)充適當(dāng)量的血清(或血漿)或限定的激素組,和/或足夠T細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)張量的細(xì)胞因子(一個(gè)或多個(gè))??股?,例如青霉素和鏈霉素,僅被包括在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中,而不包括在注入對(duì)象的細(xì)胞培養(yǎng)物中。靶細(xì)胞被保持在支持生長(zhǎng)必需的條件下,例如,適當(dāng)?shù)臏囟?例如,37°C )和氣氛(例如,空氣加5% CO2)。
[0221]已經(jīng)暴露于變化刺激時(shí)間的T細(xì)胞可顯示不同的特性。例如,典型的血液或單采的(apheresed)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)物具有比細(xì)胞毒性或抑制T細(xì)胞群(Tc,CD8+)更多的輔助T細(xì)胞群(TH,⑶4+)。刺激⑶3和⑶28受體引起的T細(xì)胞的離體擴(kuò)張產(chǎn)生T細(xì)胞群體,其在約8-9天之前主要由Th細(xì)胞組成,而在約8-9之后,T細(xì)胞群體包括漸增的更大的Tc細(xì)胞群體。因此,取決于治療目的,用主要包括Th細(xì)胞的T細(xì)胞群注入對(duì)象可為有利的。類似地,如果已經(jīng)分離了 Tc細(xì)胞的抗原-特異性亞型,則它可有益于以更大的程度擴(kuò)張?jiān)搧喰汀?br>
[0222]進(jìn)一步地,除了⑶4和⑶8標(biāo)記,其他表型標(biāo)記在細(xì)胞擴(kuò)張過程的進(jìn)程期間,也顯著地但以大部分可重復(fù)地變化。因此,這種重復(fù)性使針對(duì)具體目的調(diào)節(jié)活化的T細(xì)胞產(chǎn)物的能力能夠?qū)崿F(xiàn)。
[0223]治療性應(yīng)用
[0224]本發(fā)明包括經(jīng)修飾表達(dá)CAR的細(xì)胞(例如,T細(xì)胞),該CAR將特異性抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域與⑶3-ζ、⑶28、4-1ΒΒ、⑶2或其任意組合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域聯(lián)合。因此,在一些例子中,修飾的T細(xì)胞可引起CAR-介導(dǎo)的T-細(xì)胞反應(yīng)。
[0225]本發(fā)明提供了 CAR改變初級(jí)T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的特異性的用途。因此,本發(fā)明也提供了刺激對(duì)哺乳動(dòng)物的靶細(xì)胞群或組織的T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法,其包括以下步驟:施用給哺乳動(dòng)物表達(dá)CAR的T細(xì)胞,其中CAR包括特異性地與預(yù)定標(biāo)靶相互作用的結(jié)合部分,包括例如人CD3(的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的ζ鏈部分,和共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)。
[0226]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明包括一類細(xì)胞療法,其中T細(xì)胞被基因修飾以表達(dá)CAR并且CAR T細(xì)胞被注入至需要其的受試者中。注入的細(xì)胞能夠殺死受試者中的腫瘤細(xì)胞。不像抗體療法,CAR T細(xì)胞能夠在體內(nèi)復(fù)制,產(chǎn)生可導(dǎo)致持續(xù)的腫瘤控制的長(zhǎng)期持久性。
[0227]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可經(jīng)歷穩(wěn)固的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)張并可持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間量。在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的CAR T細(xì)胞發(fā)展成可被重新活化以抑制任何額外腫瘤形式或生長(zhǎng)的特異性記憶T細(xì)胞。例如,本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可經(jīng)歷強(qiáng)大的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)張和在血液和骨髓中以高水平持續(xù)延長(zhǎng)量的時(shí)間和形成特異的記憶T細(xì)胞。不希望被任何具體理論限制,在遇到并隨后消除表達(dá)替代抗原的靶細(xì)胞后,CAR T細(xì)胞可體內(nèi)分化成中心記憶樣狀態(tài)。
[0228]不希望被任何具體理論限制,由CAR-修飾T細(xì)胞引起的抗腫瘤免疫性反應(yīng)可以是主動(dòng)或被動(dòng)免疫反應(yīng)。另外,CAR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可以是過繼免疫療法的一部分,其中CAR-修飾T細(xì)胞誘導(dǎo)特異性針對(duì)CAR中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)。例如,CAR Τ19引起特異性針對(duì)表達(dá)CD19的細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
[0229]盡管本文公開的數(shù)據(jù)具體公開了 mRNA包括來自FMC63鼠單克隆抗體的抗⑶19scFv,或抗間皮蛋白SSlscFv,連同人⑶8 α鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域以及人⑶2和⑶3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,本發(fā)明應(yīng)解釋為包括對(duì)構(gòu)建體組成部分中的每一個(gè)的任何數(shù)量的變化,如本文其他地方所述的。即,本發(fā)明包括CAR中任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生特異性針對(duì)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR-介導(dǎo)的T-細(xì)胞反應(yīng)的用途。例如,本發(fā)明CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可靶向腫瘤抗原,用于治療癌癥的目的。
[0230]可治療的癌癥包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤,以及血管化的腫瘤。癌癥可包括非實(shí)體瘤(諸如血液學(xué)腫瘤,例如白血病和淋巴瘤)或可包括實(shí)體瘤。用本發(fā)明的CAR治療的癌癥類型包括但不限于癌、胚細(xì)胞瘤和肉瘤,和某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、和惡性瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌癥和兒童腫瘤/癌癥。
[0231]血液學(xué)癌癥為血液或骨髓的癌癥。血液學(xué)(或血原性)癌癥的例子包括白血病,包括急性白血病(諸如急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓細(xì)胞性、早幼粒細(xì)胞性、粒-單核細(xì)胞性、單核細(xì)胞性和紅白血病)、慢性白血病(諸如慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(無痛和高等級(jí)形式)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合征、多毛細(xì)胞白血病和脊髓發(fā)育不良。
[0232]實(shí)體瘤為通常不包含囊腫或液體區(qū)的組織的異常腫塊。實(shí)體瘤可為良性或惡性的。不同類型的實(shí)體瘤以形成它們的細(xì)胞類型命名(諸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。實(shí)體瘤諸如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細(xì)胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS腫瘤(諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤(諸如腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤和混合神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(也已知為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)星形細(xì)胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤(menang1ma)、神經(jīng)細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和腦轉(zhuǎn)移)。
[0233]在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明CAR的抗原結(jié)合部分部分被設(shè)計(jì)為治療具體的癌癥。例如,設(shè)計(jì)為靶向⑶19的CAR可用于治療癌癥和病癥,包括但不限于前-BALL (兒童指征)、成人ALL、套細(xì)胞淋巴瘤、擴(kuò)散大B-細(xì)胞淋巴瘤,同種異體骨髓移植后的補(bǔ)救等等。
[0234]在另一實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向⑶22,以治療擴(kuò)散大B-細(xì)胞淋巴瘤。
[0235]在一個(gè)實(shí)施方式中,癌癥和病癥包括但不限于前-B ALL(兒童指征)、成人ALL、套細(xì)胞淋巴瘤、擴(kuò)散大B-細(xì)胞淋巴瘤,同種異體骨髓移植后的補(bǔ)救等等可使用靶向CD19、⑶20、⑶22和RORl的CAR的組合治療。
[0236]在一個(gè)實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向間皮蛋白,以治療間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。在另一實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向CD33/IL3Ra,以治療急性骨髓性白血病等等。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向c-Met,以治療三陰性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等等。
[0237]在一個(gè)實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向PSMA,以治療前列腺癌等等。在另一實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向糖脂F(xiàn)77,以治療前列腺癌等等。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向EGFRvIII,以治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等等。
[0238]在一個(gè)實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向⑶-2,以治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤,黑素瘤等等。在另一實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向NY-ES0-1TCR,以治療骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,CAR可設(shè)計(jì)為靶向MAGE A3TCR,以治療骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
[0239]然而,本發(fā)明不應(yīng)被解釋為僅限于本文公開的抗原標(biāo)靶和疾病。相反地,本發(fā)明應(yīng)被解釋為包括任何與可使用CAR治療的疾病相關(guān)的抗原標(biāo)靶。
[0240]本發(fā)明的CAR-修飾T細(xì)胞也可用作對(duì)哺乳動(dòng)物離體免疫和/或體內(nèi)療法的疫苗類型。優(yōu)選地,哺乳動(dòng)物為人。
[0241]對(duì)于離體免疫,以下中的至少一項(xiàng)在將細(xì)胞施用進(jìn)入哺乳動(dòng)物前在體外發(fā)生:i)擴(kuò)張細(xì)胞,?)將編碼CAR的核酸引入細(xì)胞,和/或iii)冷凍保存細(xì)胞。
[0242]離體程序在本領(lǐng)域中是公知的,并在以下更完全地進(jìn)行討論。簡(jiǎn)單地說,細(xì)胞從哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)中分離并用表達(dá)本文公開的CAR的載體進(jìn)行基因修飾(即,體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。CAR-修飾的細(xì)胞可被施用給哺乳動(dòng)物接受者,以提供治療益處。哺乳動(dòng)物接受者可為人,和CAR-修飾的細(xì)胞可相對(duì)于接受者為自體的。可選地,細(xì)胞可相對(duì)于接受者為同種異基因的、同基因的(syngeneic)或異種的。
[0243]在此通過引用并入的在美國專利號(hào)5,199,942中描述的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的離體擴(kuò)張程序,可被應(yīng)用至本發(fā)明的細(xì)胞。其他合適的方法在本領(lǐng)域中是已知的,因此本發(fā)明不限于細(xì)胞離體擴(kuò)張的任何具體方法。簡(jiǎn)單地說,T細(xì)胞的離體培養(yǎng)和擴(kuò)張包括:(I)從外周血收獲物或骨髓外植體收集來自哺乳動(dòng)物的CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞;和(2)離體擴(kuò)張這樣的細(xì)胞。除了美國專利號(hào)5,199,942中描述的細(xì)胞生長(zhǎng)因子,其他因子諸如flt3-L、IL-U IL-3和c_kit配體,也可用于培養(yǎng)和擴(kuò)張細(xì)胞。
[0244]除了就離體免疫而言使用基于細(xì)胞的疫苗之外,本發(fā)明也提供了體內(nèi)免疫以引起針對(duì)患者中抗原的免疫反應(yīng)的組合物和方法。
[0245]通常地,如本文所述活化和擴(kuò)張的細(xì)胞可用于治療和預(yù)防無免疫反應(yīng)的個(gè)體中產(chǎn)生的疾病。特別地,本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞用于治療癌癥。在某些實(shí)施方式中,本發(fā)明的細(xì)胞用于治療處于形成癌癥風(fēng)險(xiǎn)中的患者。因此,本發(fā)明提供了治療或預(yù)防癌癥的方法,其包括施用給需要其的對(duì)象治療有效量的本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞。
[0246]本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞可被單獨(dú)施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組分諸如IL-2或其他細(xì)胞因子或細(xì)胞群結(jié)合施用。簡(jiǎn)單地說,本發(fā)明的藥物組合物可包括如本文所述的靶細(xì)胞群,與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結(jié)合。這樣的組合物可包括緩沖液諸如中性緩沖鹽水、硫酸鹽緩沖鹽水等等;碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白質(zhì);多肽或氨基酸諸如甘氨酸;抗氧化劑;螯合劑諸如EDTA或谷胱甘肽;佐劑(例如,氫氧化鋁);和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制用于靜脈內(nèi)施用。
[0247]本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由這樣的因素確定,如患者的狀況、和患者疾病的類型和嚴(yán)重度——盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠捎膳R床試驗(yàn)確定。
[0248]當(dāng)指出“免疫學(xué)上有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤-抑制有效量”或“治療量”時(shí),待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師確定,其考慮患者(對(duì)象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移程度和狀況的個(gè)體差異。可通常指出:包括本文描述的T細(xì)胞的藥物組合物可以以14至19個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量,優(yōu)選15至16個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量——包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值——施用。T細(xì)胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細(xì)胞可通過使用免疫療法中公知的注入技術(shù)(見例如Rosenberg等,New Eng.J.0f Med.319:1676,1988)施用。對(duì)于具體患者的最佳劑量和治療方案可通過監(jiān)測(cè)患者的疾病跡象并因此調(diào)節(jié)治療由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
[0249]在某些實(shí)施方式中,可期望向?qū)ο笫┯没罨腡細(xì)胞,并隨后重新抽取(redraw)血液(或?qū)嵤﹩尾裳撼煞中g(shù)),根據(jù)本發(fā)明活化來自其中的T細(xì)胞,和用這些活化和擴(kuò)張的T細(xì)胞再注入該患者。該過程可每幾個(gè)周進(jìn)行多次。在某些實(shí)施方式中,T細(xì)胞可從1cc至400cc的血液抽取中進(jìn)行活化。在一些實(shí)施方式中,T細(xì)胞從20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或10cc的血液抽取中進(jìn)行活化。不被理論所束縛,利用多份血液抽取/多個(gè)再輸注方案可用于選出某些T細(xì)胞群。
[0250]對(duì)象組合物的施用可以以任何方便的方式進(jìn)行,包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈內(nèi)(1.V.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的T細(xì)胞組合物通過皮內(nèi)或皮下注射被施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的T細(xì)胞組合物優(yōu)選通過1.V.注射施用。T細(xì)胞的組合物可被直接注入腫瘤、淋巴結(jié)或感染位置。
[0251]在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,利用本文描述的方法或本領(lǐng)域已知的其他將T細(xì)胞擴(kuò)張至治療性水平的方法活化和擴(kuò)張的細(xì)胞,與任何數(shù)量的有關(guān)治療形式結(jié)合(例如,之前、同時(shí)或之后)施用給患者,所述治療形式包括但不限于用試劑進(jìn)行治療,諸如抗病毒療法、西多福韋和白細(xì)胞介素-2、阿糖胞苷(也已知為ARA-C)或?qū)S患者的那他珠單抗治療或?qū)εFぐ_患者的厄法珠單抗治療或?qū)ML患者的其他治療。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,本發(fā)明的T細(xì)胞可與以下結(jié)合使用:化療、輻射、免疫抑制劑,諸如,環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和FK506,抗體或其他免疫燒蝕劑諸如CAM PATH、抗-CD3抗體或其他抗體療法、細(xì)胞毒素、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢菌素、FK506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、FR901228、細(xì)胞因子和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶一鈣調(diào)磷酸酶(環(huán)孢菌素和FK506)或抑制對(duì)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)重要的P70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等,Cell66:807-815, 1991 ;Henderson 等,Tmmun.73:316-321, 1991 ;Bierer 等,Curr.0pin, Tmmun.5:763-773, 1993)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中,本發(fā)明的細(xì)胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法(XRT)、環(huán)磷酰胺或抗體諸如0KT3或CAMPATH的T細(xì)胞燒蝕療法結(jié)合(例如,之前、同時(shí)或之后)而施用給患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的細(xì)胞組合物在B-細(xì)胞燒蝕療法諸如與CD20反應(yīng)的試劑例如Rituxan后進(jìn)行施用。例如,在一個(gè)實(shí)施方式中,對(duì)象可經(jīng)歷高劑量化療,之后進(jìn)行外周血干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)治療。在一些實(shí)施方式中,在移植后,對(duì)象接受本發(fā)明的擴(kuò)張的免疫細(xì)胞的注入。在一個(gè)額外的實(shí)施方式中,擴(kuò)張的細(xì)胞在外科手術(shù)前或外科手術(shù)后施用。
[0252]施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療狀況的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實(shí)踐實(shí)施。例如,CAMPATH的劑量對(duì)于成人患者將通常在I至大約10mg的范圍中,通常每天施用,持續(xù)I和30天之間的時(shí)期。盡管在一些例子中可使用上至40mg每天的較大劑量(美國專利號(hào)6,120,766中描述),但優(yōu)選的日劑量為I至1mg每天。
[0253]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例
[0254]本發(fā)明通過參考以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行描述。這些實(shí)施例僅出于說明性的目的提供,并不意欲為限制性的,除非另有規(guī)定。因此,本發(fā)明決不應(yīng)被解釋為限于以下實(shí)施例,而是應(yīng)被解釋為包括由于本文提供的教導(dǎo)變得顯而易見的任何和全部的變化。
[0255]沒有進(jìn)一步的描述,相信利用先前的描述和以下的說明性實(shí)施例,本領(lǐng)域技術(shù)人員可制造和利用本發(fā)明的化合物,并實(shí)踐請(qǐng)求保護(hù)的方法。以下工作實(shí)施例因此具體指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,并不解釋為以任何方式限制本公開背景的剩余部分。
[0256]實(shí)施例1:在第二代嵌合抗原受體中CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的使用
[0257]共刺激結(jié)構(gòu)域并入到嵌合抗原受體可提高細(xì)胞因子產(chǎn)生和靶細(xì)胞殺傷。CD2為共刺激分子,其可影響鈣介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。在此考查CAR中CD2細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的包含是否影響鈣流入/信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞因子產(chǎn)生。
[0258]現(xiàn)在描述在這些實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法。
[0259]含CD2 的 CAR
[0260]將⑶2共刺激結(jié)構(gòu)域克隆到各種⑶19或間皮蛋白特異的CAR中。例如,圖1展示了抗 CD19-CD2z CAR 的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0261]T 細(xì)朐
[0262]血液樣品從University of Pennsylvania 的 Human Immunology Core 獲得。利用RosetteSep試劑盒(干細(xì)胞技術(shù)),將外周血⑶4+和⑶8+T細(xì)胞負(fù)分離。細(xì)胞于37°C和5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)充了 10 % FCS、100-U/ml青霉素、100 μ g/ml硫酸鏈霉素、1mM Hepes0對(duì)于刺激,⑶4+和⑶8+T細(xì)胞與如下的組合一起培養(yǎng):a CD2 (T11.1 和 Til.2)、a CD3 (0ΚΤ3)和 / 或 a CD28 (9.3)抗體包被的磁珠。
[0263]mRNA 電穿孔
[0264]人T細(xì)胞用mRNA電穿孔以表達(dá)⑶28:⑶3 ζ結(jié)構(gòu)域、⑶28:⑶2:⑶3 ζ或⑶2:⑶3 ζ結(jié)構(gòu)域。此外,制備CAR以僅表達(dá)⑶2、⑶28或⑶3 ζ結(jié)構(gòu)域。通過下列方法,用CAR mRNA電穿孔供體T細(xì)胞。在培養(yǎng)的第10天,收集且電穿孔磁珠活化的T細(xì)胞。采用了兩種電穿孔系統(tǒng):BTX CM830 (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA,美國),和 Maxcyte (Maxcyte公司,Rockville,MD,美國)。對(duì)于采用BTX CM830的電穿孔,經(jīng)受電穿孔的刺激的T細(xì)胞用OPT1-MEM(Invitrogen)洗滌三次,且以l_3xl08/ml的最終濃度再懸浮于OPT1-MEM中。隨后,0.1至0.2ml的細(xì)胞與10μ g/0.1ml T細(xì)胞的IVT RNA(或如指定的)混合,且在2_mm小試管(Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA,美國)內(nèi)電穿孔。對(duì)于采用 Maxcyte 的電穿孔,按照說明書,采用帶有集成程序的0C-400處理室(Maxcyte公司,Rockville,MD,美國)。通過流式細(xì)胞儀驗(yàn)證CAR的表達(dá)。洗滌細(xì)胞且懸浮于FAC緩沖液(PBS加0.1 %疊氮化鈉和0.4% BSA)中。將生物素標(biāo)記的多克隆山羊抗小鼠F(ab) 2抗體(抗Fab,JacksonImmunoresearch, Wes t Grove, PA)加入到試管中,且細(xì)胞在4°C溫育25分鐘并洗漆兩次。然后用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈親和素(BD Pharmingen, San Diego, CA)對(duì)細(xì)胞染色。
[0265]細(xì)朐因子分泌
[0266]洗滌表達(dá)間皮蛋白或⑶19的K562靶細(xì)胞,且以16細(xì)胞/mL懸浮于RlO中。各靶細(xì)胞類型中的十萬個(gè)加入到96孔圓底板中(Corning)的2個(gè)孔中的每一個(gè)。洗滌效應(yīng)器CAR T細(xì)胞培養(yǎng)物,且以16細(xì)胞/mL懸浮于RlO中。在96細(xì)胞板的指定孔中,十萬個(gè)效應(yīng)器T細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合。此外,制備了只含T細(xì)胞的孔。將板于37°C下溫育18至20小時(shí)。溫育后,收獲上清液,且采用標(biāo)準(zhǔn)方法(Pierce,Rockford, IL)進(jìn)行針對(duì)IL-2和IFN- Y的ELISA測(cè)定。
[0267]特異靶標(biāo)裂解
[0268]mRNA電穿孔的CAR T細(xì)胞與各種腫瘤細(xì)胞株共培養(yǎng),且通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)特異靶標(biāo)裂解分析。
[0269]測(cè)量鈣流入
[0270]將mRNA電穿孔的CAR T細(xì)胞負(fù)載indo_l,并用間皮蛋白-Fe融合蛋白刺激。通過觀察結(jié)合鈣與游離鈣的比率在刺激后測(cè)量細(xì)胞中的鈣流入。
[0271]現(xiàn)在描述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0272]益果
[0273]獲得正常人供體CD4和CD8T細(xì)胞,且用a CD2 (Tl 1.1和TH.2)、a CD3 (0ΚΤ3)和/或aCD28(9.3)抗體包被的磁珠的組合刺激。刺激后,通過觀察絕對(duì)細(xì)胞數(shù)和群體倍增評(píng)估細(xì)胞增殖,而細(xì)胞的活化是通過測(cè)量細(xì)胞大小評(píng)估。由CD2/CD3信號(hào)的活化足夠誘導(dǎo)CD4與CD8T細(xì)胞群的細(xì)胞活化和細(xì)胞增殖(圖2)。
[0274]人T細(xì)胞用針對(duì)各種包含或不包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR構(gòu)建體的mRNA電穿孔。mRNA電穿孔的T細(xì)胞與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí),其之后測(cè)量細(xì)胞因子分泌。在SSl-⑶2z中,IL-2和IFN- Y分泌增加,類似于在SSl_28z中觀察到的。但是,IL-2和IFN- Y分泌在SS1-28CD2Z中減少。類似地,與抗-CD19-Z和抗-CD19_28z相比,抗-CD19_CD2z產(chǎn)生類似的IL-2和IFN- Y,但I(xiàn)L-2和IFN- Y分泌在抗-⑶19-28⑶2CAR中減少(圖3)。觀察到CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域允許CAR T細(xì)胞增殖,同時(shí)減少細(xì)胞因子分泌在一些治療情況中可以是重要的。例如,在一個(gè)案例中,由于高水平的細(xì)胞因子,用含有CD28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CD19CAR治療的白血病患者死亡(Brentjens et al, 2010, Mol Ther, 8 (4): 666-8)。類似地,結(jié)腸癌患者在注射含有⑶28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的her2/neu CAR T細(xì)胞后不久死亡(Morganet al, 2010, Mol Ther, 18(4):843-51)。
[0275]為評(píng)估含⑶2的CAR的腫瘤殺傷能力,將mRNA電穿孔的T細(xì)胞在效應(yīng)器與靶標(biāo)的比率變化的情況下與靶腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)4小時(shí)后,抗-⑶19-⑶2z CAR有效地消除K562-CD19腫瘤細(xì)胞,而SSl-CD2z CAR有效地消除K562_meso腫瘤細(xì)胞。而且,共培養(yǎng)18小時(shí)后,SSl-⑶2z展示了對(duì)K562-meSO腫瘤細(xì)胞的有效殺傷(圖4)。
[0276]為評(píng)估鈣信號(hào),將mRNA電穿孔的T細(xì)胞負(fù)載Indo-1AM鈣指示劑,且用間皮蛋白-Fe融合蛋白質(zhì)刺激(記錄后30秒)。隨著時(shí)間的推移,記錄結(jié)合鈣與游離鈣的比率。與SS1-28Z (沒有CD2)相比,CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的包含抑制鈣流量(圖5),如在SSl_28CD2z中由鈣流入的減少可以看出的。盡管不希望堅(jiān)持任何具體的理論,但觀察到CD2信號(hào)傳導(dǎo)減少鈣流量可能與減少的細(xì)胞因子分泌有因果關(guān)系。這在一些治療情況中可以是重要的。例如,在一個(gè)案例中, 由于高水平的細(xì)胞因子,用含有CD28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CD19CAR治療的白血病的患者死亡(Brentjens et al, 2010, Mol Ther, 8 (4): 666-8)。類似地,結(jié)腸癌患者在注射含有⑶28信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的her2/neu CAR T細(xì)胞后不久死亡(Morgan etal, 2010, Mol Ther,18 (4):843-51)。
[0277]在此呈現(xiàn)的結(jié)果顯示,與28z CAR相同,⑶2z CAR誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生,證明增殖優(yōu)于第一代CAR(單獨(dú)z),且展示介于28z和BBz所觀察到的之間的鈣流量反應(yīng)(圖6)。
[0278]在此報(bào)道,在第二代CAR中⑶2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的使用影響CAR-T細(xì)胞的IL_2和IFN-Y產(chǎn)生,且展示類似的靶細(xì)胞裂解。這些結(jié)果證明,⑶2可用于第二代CAR分子以在負(fù)和正方向改變CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生,且通過改變CAR T細(xì)胞存活和活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的閾值,可具有對(duì)在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)可持續(xù)性和有效性的影響??紤]到SS-128Z CAR的高自我活化,SSl-⑶2z可為對(duì)體內(nèi)間皮蛋白腫瘤攻擊更具耐受的CAR,且可降低活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
[0279]本文引用的每一和每個(gè)專利、專利申請(qǐng)和出版物的公開內(nèi)容在此都通過引用全文并入本文。盡管已經(jīng)參考【具體實(shí)施方式】公開了本發(fā)明,但顯而易見的是可由本領(lǐng)域技術(shù)人員想出本發(fā)明的其他實(shí)施方式和變形,而不脫離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。所附權(quán)利要求意欲被解釋為包括所有這樣的實(shí)施方式和等同變形。
【權(quán)利要求】
1.編碼嵌合抗原受體(CAR)的分離的核酸序列,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列,其包含SEQID NO:1所述的核酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w或其抗原結(jié)合片段。
4.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到腫瘤抗原。
5.權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)進(jìn)一步包含共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,所述共刺激分子選自⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、⑶30、⑶40、PD-UIC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性地與⑶83結(jié)合的配體和其任意組合。
6.分離的嵌合抗原受體(CAR),其包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求6所述的分離的CAR,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w或其抗原結(jié)合片段。
8.權(quán)利要求6所述的分離的CAR,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到腫瘤抗原。
9.權(quán)利要求6所述的分離的CAR,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)進(jìn)一步包含共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性地與⑶83結(jié)合的配體和其任意組合。
10.細(xì)胞,其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列,所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求10所述的細(xì)胞,其中所述核酸包含SEQID NO:1所述的核酸序列。
12.權(quán)利要求10所述的細(xì)胞,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w或其抗原結(jié)合片段。
13.權(quán)利要求10所述的細(xì)胞,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到腫瘤抗原。
14.權(quán)利要求10所述的細(xì)胞,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)進(jìn)一步包含共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD_1、IC0S、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性地與⑶83結(jié)合的配體和其任意組合。
15.權(quán)利要求14所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞選自T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
16.權(quán)利要求10所述的細(xì)胞,其中當(dāng)所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到其相應(yīng)的抗原時(shí),所述細(xì)胞展示出抗腫瘤免疫性。
17.載體,其包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸序列,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包含⑶2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
18.權(quán)利要求17所述的載體,其中編碼CAR的所述分離的核酸序列包含SEQID NO:1所述的核酸序列。
19.權(quán)利要求17所述的載體,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w或其抗原結(jié)合片段。
20.權(quán)利要求17所述的載體,其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到腫瘤抗原。
21.權(quán)利要求17所述的載體,其中所述共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)進(jìn)一步包含共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD_1、ICOS、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性地與⑶83結(jié)合的配體和其任意組合。
22.刺激對(duì)哺乳動(dòng)物祀細(xì)胞群體或組織的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法,所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的經(jīng)基因修飾表達(dá)CAR的細(xì)胞,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,且其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域被選擇以特異性地識(shí)別所述靶細(xì)胞群體或組織。
23.在哺乳動(dòng)物中提供抗腫瘤免疫性的方法,所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的經(jīng)基因修飾表達(dá)CAR的細(xì)胞,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含⑶2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,從而在所述哺乳動(dòng)物中提供抗腫瘤免疫性。
24.治療具有與腫瘤抗原表達(dá)升高相關(guān)的疾病、病癥或狀況的哺乳動(dòng)物的方法,所述方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的經(jīng)基因修飾表達(dá)CAR的細(xì)胞,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,從而治療所述哺乳動(dòng)物。
25.權(quán)利要求24所述的方法,其中所述細(xì)胞為自體T細(xì)胞。
26.權(quán)利要求24所述的方法,其中所述腫瘤抗原選自⑶19、⑶20、⑶22、RORl、間皮蛋白、CD33/IL3Ra、c_Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvII1、⑶-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR 和其任意組合。
27.治療患有癌癥的人的方法,所述方法包括給所述人施用經(jīng)基因改造表達(dá)CAR的T細(xì)胞,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
28.權(quán)利要求27所述的方法,其中所述人對(duì)至少一種化療劑有抗性。
29.在診斷出癌癥的人中產(chǎn)生基因改造的T細(xì)胞的持久群體的方法,所述方法包括給所述人施用經(jīng)基因改造表達(dá)CAR的T細(xì)胞,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中所述基因改造的T細(xì)胞的持久群體在施用后在所述人體內(nèi)存留至少一個(gè)月。
30.權(quán)利要求29所述的方法,其中所述基因改造T細(xì)胞的持久群體包含選自如下的至少一種細(xì)胞:施用給所述人的T細(xì)胞、施用給所述人的T細(xì)胞的子代和其組合。
31.權(quán)利要求29所述的方法,其中所述基因改造的T細(xì)胞的持久群體包含記憶T細(xì)胞。
32.權(quán)利要求29所述的方法,其中所述基因改造的T細(xì)胞的持久群體在施用后在所述人體內(nèi)存留至少三個(gè)月。
33.權(quán)利要求29所述的方法,其中所述基因改造的T細(xì)胞的持久群體在施用后在所述人體內(nèi)存留至少四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、七個(gè)月、八個(gè)月、九個(gè)月、十個(gè)月、十一個(gè)月、十二個(gè)月、兩年或三年。
34.權(quán)利要求29所述的方法,其中治療了所述癌癥。
35.在診斷出癌癥的人中擴(kuò)張基因改造的T細(xì)胞群體的方法,所述方法包括給所述人施用經(jīng)基因改造表達(dá)CAR的T細(xì)胞,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含CD2信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3 ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,其中所述施用的基因改造的T細(xì)胞在所述人體中產(chǎn)生子代T細(xì)胞群體。
36.權(quán)利要求35所述的方法,其中在所述人體內(nèi)的所述子代T細(xì)胞包括記憶T細(xì)胞。
37.權(quán)利要求35所述的方法,其中所述T細(xì)胞為自體T細(xì)胞。
38.權(quán)利要求35所述的方法,其中所述子代T細(xì)胞的群體在施用后在所述人體內(nèi)存留至少三個(gè)月。
39.權(quán)利要求35所述的方法,其中所述子代T細(xì)胞的群體在施用后在所述人體內(nèi)存留至少四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、七個(gè)月、八個(gè)月、九個(gè)月、十個(gè)月、十一個(gè)月、十二個(gè)月、兩年或三年。
40.調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量的方法,所述方法包括基因改造所述T細(xì)胞以表達(dá)CAR,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含⑶2的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
41.權(quán)利要求40所述的方法,其中調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌的所述細(xì)胞因子量減少了T調(diào)節(jié)性細(xì)胞的增殖。
42.降低活化誘導(dǎo)的鈣流入T細(xì)胞的量的方法,所述方法包括基因改造所述T細(xì)胞以表達(dá)CAR,其中所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、包含⑶2的共刺激信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和CD3(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
43.權(quán)利要求42所述的方法,其中降低所述活化誘導(dǎo)的鈣流入T細(xì)胞的量防止所述T細(xì)胞的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK104136458SQ201380010713
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月22日
【發(fā)明者】C·H·瓊, J·朔勒, A·D·波西 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞大學(xué)董事會(huì)