靶向硫酸軟骨素聚糖的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含VAR2CSA最小結(jié)合片段的功能結(jié)合片段,涉及針對這種VAR2CSA結(jié)合片段的抗體、編碼這種VAR2CSA片段的核酸，以及用于生產(chǎn)其的方法。本發(fā)明進一步涉及包含所述最小結(jié)合片段的VAR2CSA多肽的綴合物和融合蛋白及其用途，尤其是用于與硫酸軟骨素A(CSA)的表達如硫酸軟骨素A(CSA)的不適當(dāng)表達相關(guān)的病癥的治療的用途。
【專利說明】靶向硫酸軟骨素聚糖發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及包含VAR2CSA最小結(jié)合片段的功能結(jié)合片段，涉及針對這種VAR2CSA結(jié)合片段的抗體、編碼這種VAR2CSA片段的核酸，以及用于生產(chǎn)其的方法。本發(fā)明進一步涉及包含所述最小結(jié)合片段的VAR2CSA多肽的綴合物和融合蛋白及其用途，尤其是用于與硫酸軟骨素A(CSA)的表達、如硫酸軟骨素A(CSA)的不適當(dāng)表達相關(guān)的病癥的治療的用途。
[0002]發(fā)明背景
[0003]蛋白聚糖是與一個或多個糖胺聚糖(GAG)鏈綴合的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)分布在細胞內(nèi)部、細胞膜上和細胞外基質(zhì)中，起到多種作用:軟骨基質(zhì)的形成；組織的結(jié)構(gòu)構(gòu)成；基底膜的構(gòu)成；調(diào)節(jié)分泌小泡的作用；結(jié)合細胞因子、趨化因子、生長因子、和形態(tài)發(fā)生素(morphogen);蛋白酶受體和蛋白酶抑制劑；共同受體，酪氨酸激酶型生長因子受體；作為內(nèi)吞受體(endocytic receptor);促進細胞附著、細胞_細胞相互作用、和細胞運動性以及細胞遷移。
[0004]痕疾寄生物惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)在其復(fù)雜生命周期的幾乎所有階段中利用宿主細胞蛋白聚糖。子孢子(sporozoite)通過與高度硫酸化的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)相互作用的表面表達的環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite protein)感染肝臟中的肝細胞。紅細胞的裂殖子(merozoite)感染是由與血型糖蛋白A上的唾液酸結(jié)合的EBA-175介導(dǎo)的。此外，介導(dǎo)宿主內(nèi)皮粘附的許多惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白I(PfEMPl)蛋白已經(jīng)被描述為結(jié)合聚糖的。這些中的一種是VAR2CSA，其為PfEMPl蛋白家族中的獨特成員。VAR2CSA以高親和力結(jié)合不常見的、低硫酸化形式的硫酸軟骨素A(CSA)，其在胎盤絨毛間隙中附著至蛋白聚糖，所謂的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)。VAR2CSA是在惡性瘧原蟲(P.falciparum)感染的紅細胞上(IEs)的表面上表達的大型多結(jié)構(gòu)域蛋白(350kDa)，并且VAR2CSA-CSA相互作用是造成胎盤瘧疾(placental malaria, PM)中胎盤特異性隔離(placenta specific sequestrat1n)的原因。重要的是，來自FCR3和3D7型寄生物的重組全長VAR2CSA胞外結(jié)構(gòu)域(ecto-domain)已經(jīng)顯示出對在低納摩爾范圍內(nèi)的CSA的親和力。
[0005]CSA屬于糖胺聚糖(GAG)家族，其為附著至蛋白聚糖的、交替的氨基糖和己糖醛酸殘基的直鏈聚合物。存在多種類型的GAG，包括:硫酸軟骨素(CS)、硫酸皮膚素(DS或CSB)、硫酸乙酰肝素(HS)和肝素。盡管這些GAG的多糖骨架簡單，但是仍在修飾如硫酸化和糖醛酸鹽(酯)差向異構(gòu)中出現(xiàn)大量的差異。這是不同GAG的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和生物活性廣泛多樣的基礎(chǔ)。
[0006]CS與許多重要的因子如生長激素、細胞因子、趨化因子、和粘附分子相互作用，并且被認為參與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化、胞質(zhì)分裂、細胞增殖、分化、細胞遷移、組織形態(tài)發(fā)生、器官發(fā)生、感染、和創(chuàng)傷修復(fù)。CS鏈由N-乙?；?D-半乳糖胺(GalNAc)和葡萄糖醛酸殘基的交替單元組成。葡萄糖醛酸可以在其C2位置硫酸化并且GalNAc可以在C4和/或C6硫酸化，得到多種二糖單元。糖骨架的不同修飾允許CS鏈的結(jié)構(gòu)和功能異質(zhì)性。粘附胎盤的惡性瘧原蟲寄生物與僅在GalNAc的C4硫酸化的低硫酸化CSA特別相關(guān)。
[0007]早期的研究指出CSA是造成胎盤中IE隔離的原因。然而特異性受體是未知的。經(jīng)過進一步研究，發(fā)現(xiàn)人類胎盤含有三種不同類型的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)，但是IE與絨毛間隙中低硫酸化CSPG特異性粘附。對于這種類型的CSPG，特殊的是，僅2-8%的二糖單元是C4硫酸化的。在同時進行的旨在確定對CSA的特異性結(jié)構(gòu)要求的研究中，發(fā)現(xiàn)利用含有30-50%之間的C4硫酸化而其余50-70%二糖單元未硫酸化的CSA抑制了寄生物粘附至CSPG。顯示對CSA的最小結(jié)合抑制要求是含有最少2-3或4-5個C4硫酸化的二糖單元的十二糖(六個二糖)。
[0008]硫酸軟骨素蛋白聚糖4 (CSPG4)，也被稱為高分子量黑素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)或黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MSCP)，是已經(jīng)顯示由黑素瘤細胞表達的細胞表面蛋白聚糖。
[0009]CSPG4/MSCP/HMV-MAA是大型蛋白聚糖，其特征在于在蛋白骨架上具有CS鏈。這些CS鏈的硫酸化似乎主要在GalNAc (CSA)的C4上，盡管硫酸化程度是未知的。
[0010]發(fā)明目的
[0011]本發(fā)明的實施方案的一個目的是，提供適用于硫酸軟骨素聚糖的靶向和/或檢測的VAR2CSA最小功能結(jié)合片段。本發(fā)明的實施方案的其他目的是，提供用于治療與硫酸軟骨素聚糖(如CSA)的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)的病癥的方法，其中VAR2CSA多肽或其片段單獨或作為綴合物或融合蛋白質(zhì)的一部分用于靶向和/或檢測具有硫酸軟骨素聚糖的表達、如不適當(dāng)表達的組織或細胞。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，VAR2CSA利用多肽序列的最小結(jié)構(gòu)元件保持其以高親和力和特異性結(jié)合某些硫酸軟骨素蛋白聚糖的能力。更重要的是，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，VAR2CSA多肽以高且特異性的親和力結(jié)合癌細胞和組織，本發(fā)明的發(fā)明人提示這種結(jié)合借助于與在癌細胞的表面上或周圍的細胞外基質(zhì)中的硫酸軟骨素蛋白聚糖特異性相互作用。因此，本發(fā)明的發(fā)明人建議將這種特異性和高親和力的結(jié)合用于靶向具有這種具體類型硫酸軟骨素蛋白聚糖的高的或其他的表達、如不適當(dāng)表達的癌細胞或者其他組織或細胞。
[0014]因此，在第一方面中，本發(fā)明涉及一種VAR2CSA的分離的蛋白片段，所述片段由以下連續(xù)的(sequential)氨基酸序列組成:
[0015]a) IDl 和
[0016]b)DBL2Xb，以及任選的
[0017]c)ID2a。
[0018]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA的分離的蛋白片段包含ID2a。
[0019]在第二方面中，本發(fā)明涉及一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合VAR2CSA蛋白片段，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb、以及任選地c) ID2a的連續(xù)的氨基酸序列組成。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體不結(jié)合全長VAR2CSA多肽。
[0020]在第三方面中，本發(fā)明涉及編碼VAR2CSA蛋白片段的核酸分子，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb、以及任選地c) ID2a的連續(xù)氨基酸序列組成。本發(fā)明進一步涉及一種核酸探針，所述核酸探針能夠在嚴格條件下與這種核酸序列雜交。
[0021]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種載體，所述載體包含根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子。
[0022]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種包含載體的宿主細胞，所述載體包含根據(jù)本發(fā)明的分尚的核酸分子。
[0023]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于制備根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構(gòu)建體表達的條件下在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中培養(yǎng)如在本文中所定義的細胞，以及從所述培養(yǎng)基回收得到的蛋白片段。
[0024]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種綴合物或融合蛋白，其包含VAR2CSA多肽和治療或診斷效應(yīng)部分，如細胞毒性部分、螢光標記、和/或放射性標記。
[0025]應(yīng)該理解的是，對于包含VAR2CSA多肽的綴合物、融合或嵌合蛋白來說，可以使用任何如在本文中限定的VAR2CSA多肽。因此，該方面不限于使用最小結(jié)合片段。無論何時使用術(shù)語VAR2CSA多肽都適用，當(dāng)用于醫(yī)學(xué)治療、靶向或診斷時，因此是同等相關(guān)的。
[0026]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種組合物，所述組合物包含如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的抗體、或根據(jù)本發(fā)明的綴合物。
[0027]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的抗體、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物，其用作藥物或診斷劑。
[0028]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的抗體、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物，其用于診斷。
[0029]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物。
[0030]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于在生物樣品中檢測如在本文中所定義的蛋白片段、或根據(jù)本發(fā)明的綴合物的方法，所述方法包括:a)獲得生物樣品；b)使所述生物樣品與根據(jù)本發(fā)明的抗體接觸；以及c)檢測所述抗體與所述蛋白片段或綴合物的復(fù)合物，如果存在的話；作為所述樣品中存在所述蛋白片段或綴合物的指示。
[0031]因此，提供用于測量生物樣品中VAR2CSA蛋白片段的水平的方法?？梢詫⑵渥鳛橹委煹囊徊糠帧⒂糜诒O(jiān)視治療的進度、或者備選地作為制備根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽的制備方法的一部分而使用和應(yīng)用。
[0032]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物用于制備藥物的用途。
[0033]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物，用于治療與涉及CSA的表達、如不適當(dāng)表達的病癥相關(guān)的任何適應(yīng)證，如在癌癥、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、多發(fā)性硬化、神經(jīng)損傷后的愈合、軟骨修復(fù)、傷口愈合中，以及在銀屑病中。
[0034]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于治療與CSA的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)的任何適應(yīng)證的方法，如在癌癥、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、多發(fā)性硬化、由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的病理病癥、軟骨和疤痕組織的病癥中，如在風(fēng)濕病、軟骨修復(fù)或傷口愈合中，或者在銀屑病中；所述方法包括向需要其的受試者施用治療上或預(yù)防上有效量的如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物。
[0035]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防與CSA的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)的適應(yīng)證或病癥的發(fā)生的方法，如在癌癥、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的病理病癥、軟骨和疤痕組織的病癥中，如在風(fēng)濕病、軟骨修復(fù)或傷口愈合中，或者在銀屑病中；所述方法包括向需要其的受試者施用治療上或預(yù)防上有效量的如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物。
[0036]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物的用途，所述用途是在體液如血液、血漿、尿液、唾液、糞便、腦脊液、淋巴液、胃液、胸膜液、軟骨液、精子，和/或組織中作為生物標記物，如用于檢測CSA的表達、如不適當(dāng)表達的工具，用于與CSA的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)的適應(yīng)證或病癥的診斷和/或預(yù)后，如惡性疾病、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的病理病癥、軟骨和疤痕組織的病癥中，如在風(fēng)濕病或傷口愈合中，或者癌癥疾病，如腦腫瘤、肝腫瘤和生殖道中的腫瘤。
[0037]應(yīng)該理解的是，如在本文中所使用的，術(shù)語生物標記物意指，當(dāng)被引入至生物體中以檢測CSA表達時，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽、綴合物和融合蛋白作為用于與CSA的表達、如CSA的不適當(dāng)表達相關(guān)的適應(yīng)證或病癥的診斷和/或預(yù)后的工具的用途。
[0038]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物的用途，所述用途是用于受試者的免疫，如在疫苗中。
[0039]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物的用途，所述用途是作為靶向部分，用于分離表達⑶44和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的細胞。
[0040]表1.由VAR2CSA多肽靶向的潛在分子
[0041]蛋白IDl蛋白ID2基因名稱
NG2CSPG4cspg4
神經(jīng)聚糖(neurogl^can)和神經(jīng) CSPG5ngc
聚糖-C_'___
神經(jīng)菌毛蛋白(neuropilin)-l NRP-1-CSNRPl
CS___
APLP2和APP(并且當(dāng)加入淀粉樣前體狀蛋白2APLP2
CSA時蛋白被稱為硫酸軟骨素蛋白聚糖(Appicans))___
SnoreSnorc
Tom?rc}iulii1-2TENB2TMEFF2
血栓調(diào)節(jié)蛋白 CD141 THBD(Ihrombon1diilin)___
β聚糖轉(zhuǎn)化生長因子β受體IIITGFBR3
多配體蛋白聚糖(syndecan)lCDI38SDCl
多配體蛋白聚糖2CD362SDC2
多配體蛋白聚糖3SDC3
多配體蛋白聚糖4雙棲蛋白聚糖(amphiglycan)SDC4
CSPG8CSPG8Cd44
磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC1-6
(glvpican)l-6(kun I og 5)___
短蛋白聚糖(brevican)CSPG7
潤滑素(Iubricin)蛋白聚糖4PRG4
牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(dentin matrixDMPI
protein)!___
神經(jīng)蛋白聚糖(neurocan)CSPG3iican
多功能蛋白聚糖(versican)CSPG2vcan
軟骨蛋白聚糖(aggrecan)CSPGlacan
BainccanCSPG6smc3
SRPX2含Sushi重復(fù)的蛋白SRPX2
絲甘蛋白聚糖(serglycin)造血蛋白聚糖核心蛋白SRGN
核心蛋白聚糖(decorm)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家^ ^dcn
__m__
雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan) 小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家 bgn
__M__
基膜蛋白聚糖(Iumican)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家^ ^Ium
__M__
纖調(diào)蛋白(fibromoduliii)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家 fmod
__M__
角蛋白聚糖(keratocan)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家^ ^kera
__^__
Mimecan骨甘蛋白聚糖(osteoglycin)Ogn
[0042] 睪丸蛋白聚糖(teStiCan)l-3 細胞外鈣結(jié)合蛋白質(zhì)的SPOCKl
__BM-40/SPARC/骨結(jié)合素家族__
磷酸蛋白聚糖(phosphacan) 受體型酪氨酸酪氨酸蛋白磷酸酶PTPRZI
__ζ__
Leprecan亮氨酸脯氨酸富集蛋白聚糖i LEPREI
基底膜蛋白聚糖(perlecan) 基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白HSPG2 _聚糖核心蛋白__
[0043]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于分離生物樣品中表達⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的細胞如癌癥干細胞的方法，所述方法包括:
[0044]a)獲得包含表達⑶44、和/或CSPG4和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的細胞的生物樣品；
[0045]b)使所述生物樣品與任選地與固體支持物偶聯(lián)的如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物接觸；以及
[0046]c)純化或分離所述表達⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的細胞與所述蛋白片段或綴合物的復(fù)合物。
[0047]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種診斷方法，所述診斷方法用于檢測對惡性疾病(malignancy)或與不適當(dāng)?shù)腃SA表達相關(guān)的其他病癥做出反應(yīng)的體液如血液、血楽；、尿液、脊髓液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液、骨髓、胃液、糞便、精液、精子、前列腺液、唾液、眼液、肺吸出物、和淋巴液中升高的CSA水平，所述方法包括下列步驟:使所述體液與如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物接觸，以及檢測與所述體液中CSA形成的復(fù)合物。
[0048]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于純化生物樣品中⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的方法，所述方法包括:
[0049]a)獲得包含⑶44、和/或CSPG4和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的生物樣品；
[0050]b)使所述生物樣品與任選地與固體支持物偶聯(lián)的如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物接觸；以及
[0051]c)純化或分離所述⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖與所述蛋白片段或綴合物的復(fù)合物。
[0052]在進一步的方面中，本發(fā)明涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或綴合物、或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其與任何其他適合的抗癌藥組合。
[0053]發(fā)明詳述
[0054]本發(fā)明基于以下事實，一部分瘧疾蛋白，即通常所說的VAR2CSA，可以與癌癥特異性抗原和細胞外CSPG以非常高的特異性和非常高的結(jié)合強度結(jié)合。
[0055]VAR2CSA介導(dǎo)專門針對附著至孕婦胎盤中的蛋白聚糖(CSPG)的低硫酸化的硫酸軟骨素A(CSA)的寄生物粘附。已經(jīng)顯示重組蛋白與CSA以空前高的親和力和特異性結(jié)合。這可能歸因于與CSA的相互作用，其不僅取決于帶電的硫酸鹽而且還取決于CS骨架。本發(fā)明的發(fā)明人預(yù)見胎盤中存在的CS與包括癌癥干細胞在內(nèi)的多種癌細胞上出現(xiàn)的CS非常相似。這通過以下事實證實，表達VAR2CSA的瘧疾寄生物特異性地粘附至C32黑素瘤細胞上的CSA以及粘附至人類腦癌細胞。
[0056]因此，本發(fā)明依賴于VAR2CSA重組蛋白與低硫酸化的CSA之間的高親和力和特異性。通過標記這種蛋白，本發(fā)明可以用于包括體內(nèi)轉(zhuǎn)移的追蹤在內(nèi)的廣泛的應(yīng)用，并且用于診斷轉(zhuǎn)移性疾病。通過將VAR2CSA與細胞凋亡或細胞毒性試劑偶聯(lián)，本發(fā)明可以用于特異性地靶向并清除癌細胞和癌癥干細胞。借助使用VAR2CSA重組蛋白的簡單治療，將可以中和CSA的活性，從而抑制腫瘤發(fā)生和/或表達CSA的癌細胞的轉(zhuǎn)移。CSA可以存在于許多蛋白骨架上，例如CSPG4、CD44、雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)、核心蛋白聚糖(decorin)、多功能蛋白聚糖(versican)、軟骨蛋白聚糖(aggrecan)(軟骨中主要的CSPG)、基底膜蛋白聚糖(perlecan)、多配體蛋白聚糖(syndecan)、以及在表I中列出的其他物質(zhì)。
[0057]預(yù)見本發(fā)明與惡性黑素瘤癌癥特別相關(guān)，包括在黑素瘤細胞表面上具有含CSA鏈的CSPG4的皮膚、眼和結(jié)膜黑素瘤。據(jù)信這種GAG鏈參與有絲分裂和轉(zhuǎn)移。然而，CSPG4不只對黑素瘤是特異性的。發(fā)明人基于來自多組人類組織和細胞系的數(shù)據(jù)進行的微陣列和組織陣列分析提出，CSPG4和其他類型的含CSA蛋白聚糖可以存在于來源于全部三個細胞胚層的大范圍癌癥類型。這些癌癥類型包括癌(carcinoma)(乳腺癌(breast carcinoma)、膜腺癌(pancreatic carcinoma)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、肺癌(lung carcinoma)、結(jié)腸癌(colon carcinoma)、前列腺癌(prostate carcinoma)、宮頸癌(cervix carcinoma)、睪丸癌(testis carcinoma)、基底細胞皮膚癌(basal cell skincarcinoma)、透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma)、角化頭頸鱗狀細胞癌(kreatinized head and neck squamous cell carcinoma)、皮膚鱗狀細胞癌(skinsquamous cell carcinoma)、夕卜陰角化鱗狀細胞癌(vulvar kreatinized squamous cellcarcinoma)和外陰基底細胞癌(vulvar basal cell carcinoma)),肉瘤(sarcoma)(乳腺脂肪肉瘤(breast liposarcoma)、纖維肉瘤(fibrosarcoma)、去分化軟骨和脂肪肉瘤(dedifferentiated chondro-and liposarcoma)、平滑肌肉瘤(le1myosarcoma)、月旨肪肉瘤(liposarcoma)、粘液性脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)、子宮體平滑肌肉瘤(uterinecorpus le1myosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤因肉瘤(ewing sarcoma)、和橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma))，造血系統(tǒng)癌(hematopoietic cancer)(慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphatic leukaemia，CLL)、急性淋巴細胞白血病(acute lymphaticleukaemia，ALL)、急性髓細胞白血病(acute myeloid leukaemia AML)、B 細胞、T 細胞和大顆粒狀淋巴瘤(large granular lymphoma))，神經(jīng)上皮組織的腫瘤，如(星形細胞瘤(astrocytoma))(多形性黃色星形細胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma)、纖維型星形細胞瘤(fibrillary astrocytoma)、間變型星形細胞瘤(anaplasticastrocytoma)、多形性膠質(zhì)母細胞瘤(gl1blastoma multiforme))、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(oligodrendrogl1ma)、室管膜瘤(ependymoma)、脈絡(luò)叢腫瘤(choroid plexus turmor)、少星形細胞瘤(oligoastrocytoma)、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(gl1sarcoma)、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤(gangl1gl1ma)、視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma)、神經(jīng)細胞瘤(neurocytoma)、神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma)(嗅神經(jīng)母細胞瘤(esthes1neuroblastoma)和神經(jīng)節(jié)母細胞瘤(gangl1neuroblastoma))、髓母細胞瘤(medul1blastoma)、非典型畸胎樣橫紋肌樣腫瘤(atypical teratoid rhabdoid tumor)和所有類型的神經(jīng)內(nèi)分泌癌(neuroendocrinecancer)。
[0058]硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)還構(gòu)成包括眼睛在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和關(guān)節(jié)軟骨的細胞外基質(zhì)的重要組分。細胞外CSPG與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和神經(jīng)損傷后再生的缺失密切相關(guān)。細胞外CSPG的缺失對關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)病的發(fā)展至關(guān)重要，并且高局部濃度的細胞外CSPG阻止神經(jīng)損傷后的神經(jīng)向外生長。
[0059]VAR2CSA重組蛋白不僅可以用于治療與惡性生長相關(guān)的適應(yīng)證,如在癌癥中。增加或降低細胞外環(huán)境中存在的CSPG的療法可以用于治療關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病，并且用于增強包括多發(fā)性硬化在內(nèi)的神經(jīng)突觸損傷后的神經(jīng)恢復(fù)。對于這些策略來說，本發(fā)明的發(fā)明人預(yù)見，可以使用VAR2CSA作為直接抑制劑或作為將改變CSPG代謝的藥物靶向并維持至受感染組織的分子。
[0060]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)鑒別了以1nM以下的親和力結(jié)合胎盤絨毛間隙中的CSA的瘧疾蛋白。已經(jīng)以高產(chǎn)率制備了 VAR2CSA的較小重組部分，其以與全長和天然VAR2CSA蛋白相似的特征結(jié)合CSA。重組VAR2CSA蛋白不結(jié)合其他CS如硫酸軟骨素C(C6S)或高度硫酸化的GAG如硫酸乙酰肝素(HS)?？梢灾苽渲亟M蛋白，從而以高親和力結(jié)合在S2細胞、T.Ni細胞、CHO細胞以及包括BL21和Shuffle細胞的大腸桿菌菌株之間的各種表達系統(tǒng)中的 CSA(tm Lifetechnologies)。
[0061]本發(fā)明的發(fā)明人也已經(jīng)鑒別了以非常高的親和力(nM)和高特異性結(jié)合CSA的單一小型(75kDa)抗原。表3 (參見實施例2)列出了所有使用生物傳感器技術(shù)分析的VAR2CSA蛋白的CSA親和力。
[0062]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)示出，這種VAR2CSA重組蛋白在低濃度下強烈結(jié)合大范圍的癌細胞系，包括皮膚黑素瘤(C32、MeWo)、肺癌(lung carcinoma) (A549)、乳腺癌(breastcarcinoma) (HCC1395)、骨肉瘤(U20S、MNNG/H0S)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma) (RH30)和皮膚T細胞淋巴瘤(表4和5)。使用另一種VAR2CSA蛋白作為對照分子，除了分子的C端部位截短151個氨基酸之外，其與最小結(jié)合VAR2CSA構(gòu)建體相同。這種截短消除了 CSA結(jié)合。重組VAR2CSA結(jié)合所有表達CSPG4的細胞系和表達具有CSA鏈的其他CSPG分子的癌細胞系(例如T細胞淋巴瘤)。重組VAR2CSA蛋白不與人紅細胞和外周血單核細胞(PBMC)相互作用(表4)。
[0063]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)在本文中示出，瘧疾寄生物很可能通過CSPG4與VAR2CSA之間的特異性相互作用粘附至C32黑素瘤細胞。因此，預(yù)見可以將重組VAR2CSA及其綴合物用作靶向各種癌細胞上的CSA的治療性化合物。
[0064]利用VAR2CSA靶向癌細胞上的CSA超過其他當(dāng)前開發(fā)中的療法的優(yōu)點很多:
[0065]I) VAR2CSA與CSA之間的相互作用是空前高親和力的并且是高度特異性的。
[0066]2) VAR2CSA是進化的改進的瘧疾蛋白并且因此在患者中治療將破壞耐受并引起自身免疫反應(yīng)是不大可能的。
[0067]3) VAR2CSA是被充分表征的穩(wěn)定蛋白并且能夠在符合大規(guī)模蛋白生產(chǎn)的生物體中高度表達。
[0068]4)VAR2CSA是具有許多血清變體(serovariant)的多形態(tài)蛋白。可以由不同的血清變體提供重復(fù)的治療，以避免與中和抗體有關(guān)的問題。
[0069]5) VAR2CSA在細胞外自然暴露在惡性瘧原蟲感染的紅細胞上并且因此在人血清中本質(zhì)上是穩(wěn)定的蛋白，并且已經(jīng)顯示是高度蛋白酶抗性的。
[0070]本發(fā)明以VAR2CSA與CSA之間的相互作用為中心。這種相互作用是高親和力的相互作用并且主要用途是靶向表達CSA的癌細胞。
[0071]CSA還可能與其他疾病和病理病癥有關(guān)，比如，例如，在關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、多發(fā)性硬化、和神經(jīng)損傷后的愈合、軟骨修復(fù)、傷口愈合、和銀屑病中。因此，VAR2CSA多肽或綴合物可以用于任何這種疾病或病癥的治療。
[0072]此外，可以使用VAR2CSA與CSA之間的相互作用作為生物技術(shù)工具，例如用于蛋白純化和細胞分選測定。
[0073]因此，本發(fā)明的發(fā)明人預(yù)見本發(fā)明的多種用途:
[0074]I)可示蹤重組VAR2CSA多肽或綴合物可以用于示蹤癌癥患者中的腫瘤和轉(zhuǎn)移。
[0075]2)重組VAR2CSA多肽或綴合物可以用于直接靶向和中和癌細胞中的CSA活性。
[0076]3)重組VAR2CSA多肽或綴合物，如與細胞毒性分子偶聯(lián)的VAR2CSA多肽，可以用于以對CSA陰性組織最小的有害毒性來靶向癌細胞。
[0077]4)可以使用標記的重組VAR2CSA多肽或綴合物作為研究癌細胞上CSA的研究或臨床開發(fā)工具。
[0078]5)在生物技術(shù)和生命科學(xué)中，標記的重組VAR2CSA多肽或綴合物可以用于測定以分選CSA陽性細胞。這可以通過將重組VAR2CSA與樹脂偶聯(lián)而完成，以使其可以用于純化表達CSPG4的細胞，如癌癥干細胞，從而提供新型且有效的生物技術(shù)工具。
[0079]6)VAR2CSA多肽或綴合物可以用于表達CSPG4的細胞，如癌細胞的體外消耗(invitro deplet1n),作為自體移植的一部分。
[0080]7)VAR2CSA多肽或綴合物可以用于抗CSPG4疫苗。通過用CSPG4-VAR2CSA復(fù)合物或綴合物免疫動物，VAR2CSA可以以破壞對CSPG4的耐受為目的，起到作為用于針對CSPG4的免疫應(yīng)答的載體和加強物的作用。
[0081]8)VAR2CSA多肽或綴合物可以用于監(jiān)視對惡性疾病做出反應(yīng)的體液(即尿液、脊髓液、胸腔積液、關(guān)節(jié)、骨髓、和淋巴液)中增加的CSA水平。這是基于以下事實，VAR2CSA多肽對低硫酸化CSA具有特異性并且可以檢測由于未硫酸化CS (COS)的增加的比例的作用而引起的腫瘤進展。
[0082]9)VAR2CSA多肽或綴合物可以用于關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)病的治療。VAR2CSA多肽可以阻斷或靶向在關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)病期間阻斷蛋白酶介導(dǎo)的軟骨蛋白聚糖(aggrecan)降解的藥物。VAR2CSA多肽還可以用于將抗炎藥物靶向至受感染組織并且用于遞送抑制劑如ADAMTS4和-5抑制劑。VAR2CSA多肽可以用于靶向促進借助軟骨細胞的軟骨蛋白聚糖的產(chǎn)生的藥物。重復(fù)靜脈內(nèi)(1.v.)注射與VAR2CSA多肽偶聯(lián)的軟骨蛋白聚糖可以用于誘導(dǎo)對軟骨蛋白聚糖的耐受。
[0083]10)VAR2CSA多肽或綴合物可以通過與神經(jīng)突觸組織中的細胞外CSPG結(jié)合來消除對神經(jīng)突觸生長的CSPG作用，例如通過阻斷經(jīng)由酪氨酸磷酸酶σ受體的信號傳導(dǎo)。VAR2CSA肽可以靶向在受感染的神經(jīng)組織中降解CSPG或抑制CSPG產(chǎn)生的藥物。例如，下列藥物可以被認為與VAR2CSA偶聯(lián):軟骨素酶ABC，其切斷CSPG分子的蛋白核心的糖鏈。木糖苷(xylocide)，其減少CSPG的產(chǎn)生，或者抑制對CSPG產(chǎn)生重要的酶如軟骨素合酶或軟骨素聚合因子的藥物。此類藥物的實例包括:4_氟代-葡糖胺、對硝基苯基-β-D-木糖苷、4-甲基-傘形酮酸- β -D-卩比喃木糖苷(4-methyl-umbelliferyl-beta-D-xylopyranoside)。
[0084]11)VAR2CSA多肽或綴合物還可以用于靶向和維持細胞因子如ILl-α，其促進ADAMTS4的產(chǎn)生，所述ADAMTS4隨后裂解CSPG。
[0085]12)癌細胞上的CSPG4表達可以影響耐藥性。許多患者中腫瘤通常開始時對治療響應(yīng)，但是隨時間產(chǎn)生化學(xué)抗性以及癌癥進展。CSPG4表達與多重耐藥性有關(guān)并且通過其與PI3K途徑的整聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的活化關(guān)聯(lián)而介導(dǎo)。靶向癌細胞上的CSPG4的重組VAR2CSA多肽可以降低或阻止化學(xué)抗性，并且因此可以用于與例如PLX4032、BRAFV600E抑制劑的組合療法。
[0086]定義
[0087]如在本文中所使用的術(shù)語“VAR2CSA多肽”是指由與硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)相互作用的惡性瘧原蟲表達的特異性紅細胞膜蛋白I(PfEMPl)蛋白的細胞外部分，并且其特征在于具有SEQ ID N0:55或SEQ ID NO:56的序列或者其片段或變體，其具有結(jié)合可以在蛋白聚糖(CSPG)上出現(xiàn)的硫酸軟骨素A(CSA)的能力。
[0088]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽至少包含VAR2CSA蛋白片段，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb的連續(xù)氨基酸序列組成。
[0089]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽至少包含VAR2CSA的蛋白片段，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb、和c) ID2a的連續(xù)氨基酸序列組成。
[0090]包括在VAR2CSA多肽的定義之內(nèi)的是在Salanti A.等人Mol.Micro2003年7月；49 (I): 179-91 中，在 Khunrae P.等人，J Mol B1l.2010 年 4 月 2 日；397 (3): 826-34 中，在 Srivastava A.等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2010 年 3 月 16 日；107 (11):4884-9中，在DahlbackM.等人，J B1l Chem.2011 年 5 月 6 日；286 (18): 15908-17 中，或在Srivastava A.等人，PLoS One.2011 年；6 (5): e20270 中描述的多肽。
[0091]如在本文中所使用的術(shù)語“ID1”是指VAR2CSA的結(jié)構(gòu)域，其特征在于具有與鑒別為SEQ ID NO:1的1-152的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
[0092]如在本文中所使用的術(shù)語“DBL2Xb”是指VAR2CSA的結(jié)構(gòu)域，其特征在于具有與鑒別為SEQ ID NO:1的153-577的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
[0093]如在本文中所使用的術(shù)語“ID2a”是指VAR2CSA的結(jié)構(gòu)域，其特征在于具有從SEQID NO:1的氨基酸578-640的N端開始的至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少
25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少
56、至少57、至少58、至少59、至少60、至少61、或至少62、如63個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列與這種連續(xù)氨基酸的序列具有至少70%序列同一性。
[0094]在一些實施方案中，在本文中被稱為與鑒別為SEQ ID NO: 1_75的任一序列或其片段的至少70%的氨基酸序列同一性是指，與該序列具有至少71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或 99%序列同一性的序列。
[0095]如在本文中所使用的術(shù)語“變體”或“多個變體”是指具有SEQ ID N0:55或SEQID N0:56的氨基酸序列的VAR2CSA多肽，包含SEQ ID NO: 1_54的氨基酸序列的VAR2CSA多肽的片段，所述片段或變體保持結(jié)合蛋白聚糖(CSPG)上的硫酸軟骨素A(CSA)的能力，其中已經(jīng)用另一種氨基酸置換了一個或多個氨基酸，和/或其中已經(jīng)缺失了一個或多個氨基酸，和/或已經(jīng)將一個或多個氨基酸插入在多肽中，和/或已經(jīng)將一個或多個氨基酸加入至多肽中。這種加入可以發(fā)生在N端末端或在C端末端或者二者。在此定義內(nèi)的“變體”或“多個變體”在能夠結(jié)合硫酸軟骨素A(CSA)方面仍具有功能活性。在一些實施方案中，變體與 SEQ ID NO:1-75 的序列，如 SEQ ID NO: 1、3_5、10、11、29、34、36-38、41、43_45、48、53_56、60-70,72-75 的序列具有至少 70%，如至少 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或 99%序列同一性。
[0096]如在本文中所使用的短語“功能變體”、“功能片段”、和“功能衍生物”是指SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:56的變體、片段、截短形式、以及衍生物，如SEQ ID NO: 1、3_5、10、11、
29、34、36-38、41、43-45、48、53-56、60-70、72-75 中的任一個，該多肽包含 SEQ ID N0:55 或SEQ ID NO:56的基本結(jié)合序列部分并且至少具備結(jié)合硫酸軟骨素A(CSA)的能力。應(yīng)該理解的是，VAR2CSA功能變體或功能片段可以具有選自作為二者、變體、和/或片段和/或衍生物的兩種或三種特征。
[0097]當(dāng)如在本文中所描述的測定中測試時，VAR2CSA多肽的功能變體或片段包括表現(xiàn)出在相同細胞類型中產(chǎn)生的野生型VAR2CSA多肽的結(jié)合親和力的至少約25%、如至少約50%、如至少約75%、如至少約90%的那些。
[0098]如在本文中所使用的術(shù)語“免疫學(xué)片段”是指具備將要由抗體識別的基本相同的功能活性和相同的空間取向的氨基酸序列的片段。因此，特異性抗體將會結(jié)合多肽及其免疫學(xué)片段二者。
[0099]如在本文中所使用的術(shù)語“另一種氨基酸”意指與在該位置天然存在的氨基酸不同的一種氨基酸。這包括但不限于可以由多核苷酸編碼的氨基酸。在一些實施方案中，所述不同的氨基酸是天然L型的并且可以由多核苷酸編碼。
[0100]如在本文中所使用的術(shù)語“衍生物”意在表示相對于鑒別為SEQ ID NO:55或SEQID NO: 56的野生型VAR2CSA表現(xiàn)出基本相同或提高的生物活性的VAR2CSA多肽或其片段，其中已經(jīng)將親本肽的氨基酸中的一個或多個化學(xué)改性,例如通過烷基化、聚乙二醇化、酰基化、酯形成或酰胺形成等。
[0101]術(shù)語"構(gòu)建體"意在表示多核苷酸區(qū)段，其可以基于全部或部分天然存在的編碼目標多肽的核苷酸序列。構(gòu)建體可以任選地含有其他多核苷酸區(qū)段。以相似的方式，術(shù)語“可以由多核苷酸構(gòu)建體編碼的氨基酸”涵蓋可以由以上限定的多核苷酸構(gòu)建體編碼的氨基酸，即氨基酸如 Ala、Val、Leu、Ile>Met>Phe> Trp>Pro>Gly> Ser> Thr> Cys>Tyr> Asn>Glu>Lys、Arg、His、Asp 和 Gin。
[0102]如在本文中所使用的術(shù)語“載體”意指能夠在宿主細胞中擴增的任何核酸實體。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制與染色體復(fù)制獨立，例如質(zhì)粒。備選地，載體可以是當(dāng)被引入至宿主細胞時整合至宿主細胞基因組中并且與被其整合的一個或多個染色體一起復(fù)制的載體。載體的選擇通常應(yīng)取決于其將要引入至其中的宿主細胞。載體包括但不限于質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒或黏粒(cosmid)載體。載體通常含有復(fù)制起點和至少一個可選擇基因，即編碼容易被檢測或者其存在是細胞生長所必需的產(chǎn)物的基因。
[0103]如在本文中所使用的術(shù)語“適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基”意指含有細胞生長和編碼本發(fā)明的VAR2CSA多肽的核酸序列的表達所需的營養(yǎng)物質(zhì)和其他組分的培養(yǎng)基。
[0104]在上下文中，術(shù)語“治療”意指包括預(yù)防、治愈和緩解(如在癌癥中)涉及CSA的表達、如不適當(dāng)表達的疾病、紊亂或病癥的癥狀。根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽、綴合物或衍生物的預(yù)防性和治療性施用因此包括在術(shù)語“治療”中。
[0105]如在本文中所使用的術(shù)語“受試者”意指任何動物，尤其是哺乳動物，如人，并且在適當(dāng)時可以與術(shù)語“患者”互換使用。
[0106]如本領(lǐng)域中已知的術(shù)語“序列同一性”是指如通過比較序列而確定的、兩個以上多肽分子或兩個以上核酸分子的序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”也意指核酸分子之間或多肽之間的序列相關(guān)性程度，根據(jù)情況可以由兩個以上核苷酸殘基或兩個以上氨基酸殘基的字符串(string)之間的匹配數(shù)量而確定?！巴恍浴倍攘績蓚€以上序列中的較小者與空位比對(如果存在的話)之間的相同匹配的百分數(shù)，其通過特定的數(shù)學(xué)模型或計算機程序(即，“算法”)處理。
[0107]術(shù)語“相似性”是相關(guān)的概念，但是與“同一性”不同，是指包括相同匹配和保守性置換匹配二者的序列關(guān)系。如果兩個多肽序列具有例如(分數(shù)(10/20))相同的氨基酸，并且其余部分全部是非保守性置換，則百分比同一性和相似性將會均為50%。在相同的實例中，如果存在5個額外的具有保守性置換的位置，則百分比同一性仍為50%，但是百分比相似性將為75% (分數(shù)(15/20))。因此，在具有保守性置換的情況下，兩個多肽之間的相似性的程度將會高于這兩個多肽之間的百分比同一性。
[0108]對SEQ ID NO: 1_56、60_70、和72_75的氨基酸序列的保守性修飾(以及對編碼核苷酸的相對應(yīng)的修飾)將會產(chǎn)生具有與天然存在的VAR2CSA多肽的那些相似的功能和化學(xué)特性的VAR2CSA多肽。相比之下，VAR2CSA多肽的功能和/或化學(xué)特性的實質(zhì)性修飾可以通過在SEQ ID NO: 1-56、60-70、和72-75的氨基酸序列中選擇置換來完成，所述置換在它們對保持以下的作用中明顯不同:(a)在置換區(qū)域中的分子骨架的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊片或螺旋構(gòu)象、(b)在靶位點處的分子的電荷或疏水性、或(C)側(cè)鏈的體積。
[0109]例如，“保守性氨基酸置換”可以包括利用使得對在該位置的氨基酸殘基的極性或電荷幾乎沒有影響或沒有影響的非天然殘基置換天然氨基酸殘基。此外，還可以用丙氨酸置換多肽中的任何天然殘基，如之前已經(jīng)針對“丙氨酸掃描誘變(alanine scanningmutagenesis) ”描述的(參見,例如，討論丙氨酸掃描誘變的MacLennan等人，1998，ActaPhys1l.Scand.Suppl.643:55-67 ；Sasaki 等人,1998, Adv.B1phys.35:1-24)。
[0110]所需的氨基酸置換(無論是保守性或非保守性的)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在需要這種置換時確定。例如，氨基酸置換可以用于鑒別VAR2CSA多肽的重要殘基，或者用于增加或降低在本文中所描述的VAR2CSA多肽的親和力。
[0111]可以基于常見的側(cè)鏈性質(zhì)將天然存在的殘基分為多種類型:
[0112]I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ;
[0113]2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ;
[0114]3)酸性:Asp、Glu ;
[0115]4)堿性:His> Lys> Arg ；
[0116]5)影響鏈取向的殘基:Gly、Pro ;和
[0117]6)芳香性:Trp、Tyr、Phe。
[0118]例如，非保守性置換可以包括這些類型之一的成員與另一類型的成員交換?？梢詫⑦@種被置換的殘基引入至惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽的與非惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽同源的區(qū)域中，或者引入至分子的非同源區(qū)域中。
[0119]在進行這種變化時,可以考慮氨基酸的親水指數(shù)(hydropathic index)。每種氨基酸均基于其疏水性和電荷特性而指定親水指數(shù)，這些是:異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5) ο
[0120]在本領(lǐng)域中，了解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用的生物功能中的重要性(Kyte等人，J.Mol.B1l.，157:105-131 (1982))。已知的是，某些氨基酸可以置換具有相似的親水指數(shù)或評分的其他氨基酸，并且仍然保持相似的生物活性。在基于親水指數(shù)進行變化時，親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸的置換是優(yōu)選的，親水指數(shù)在±1以內(nèi)是特別優(yōu)選的，并且親水指數(shù)在±0.5以內(nèi)是甚至更特別優(yōu)選的。
[0121]在本領(lǐng)域中，還應(yīng)理解的是，可以基于親水性高效地進行相似氨基酸的置換，尤其是在由其產(chǎn)生的生物學(xué)功能上等價的蛋白質(zhì)或肽預(yù)期用于免疫學(xué)實施方案的情況下，如在本申請的情況下。由其相鄰氨基酸的親水性控制的蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。
[0122]已經(jīng)將下列親水性數(shù)值分配給氨基酸殘基:精氨酸(+3.0);賴氨酸(，3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。在基于相似的親水性數(shù)值進行變化時，親水性數(shù)值在±2以內(nèi)的氨基酸的置換是優(yōu)選的，親水性數(shù)值在±1以內(nèi)是特別優(yōu)選的，并且親水性數(shù)值在±0.5以內(nèi)是甚至更特別優(yōu)選的。還可以基于親水性從一級氨基酸序列鑒別表位。這些區(qū)域也被稱為“表位核心區(qū)域(epitopic core reg1ns) ”。
[0123]本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用公知的技術(shù)確定如在SEQ ID NO: 1_75中給出的多肽的適合的變體。為了鑒別可以被改變而不破壞活性的分子的適合的區(qū)域，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以靶向據(jù)信對活性不重要的區(qū)域。例如，當(dāng)已知來自相同物種或其他物種的具有相似活性的相似多肽時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將VAR2CSA多肽的氨基酸序列與這種相似多肽進行比較。通過這種比較，可以鑒別殘基和分子的在相似多肽之間保守的部分。應(yīng)該理解的是，VAR2CSA多肽的相對于這種相似多肽不保守的區(qū)域中的變化將不大可能對VAR2CSA多肽的生物活性和/或結(jié)構(gòu)造成負面影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將知道，即使在相對保守區(qū)域中，也可以在保持活性的同時用化學(xué)相似的氨基酸置換天然存在的殘基(保守性氨基酸殘基置換)。因此，在不破壞生物活性或不負面影響多肽結(jié)構(gòu)的情況下，甚至對生物活性或?qū)Y(jié)構(gòu)重要的區(qū)域也可以接受保守性氨基酸置換。
[0124]另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以回顧鑒別對活性或結(jié)構(gòu)重要的相似多肽中殘基的結(jié)構(gòu)功能研究?；谶@種比較，可以預(yù)測與相似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基相對應(yīng)的VAR2CSA多肽中氨基酸殘基的重要性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽的預(yù)測的重要氨基酸殘基的化學(xué)相似的氨基酸置換。
[0125]本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以分析相似多肽中的三維結(jié)構(gòu)和與該結(jié)構(gòu)有關(guān)的氨基酸序列。基于該信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測VAR2CSA多肽的氨基酸殘基的關(guān)于其三維結(jié)構(gòu)的比對。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇不對被預(yù)測在蛋白質(zhì)的表面上的氨基酸殘基進行根本性的改變，因為這種殘基可以參與同其他分子的重要相互作用。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生在每個所需的氨基酸殘基處含有單一氨基酸置換的試驗變體。之后可以使用如在本文中所描述的活性測定篩選變體。這種變體可以用于收集與適合的變體有關(guān)的信息。例如，如果發(fā)現(xiàn)對特定的氨基酸殘基的改變產(chǎn)生破壞的、不希望地降低的、或不適合的活性，則將避免具有這種改變的變體。換句話說，基于由這種常規(guī)實驗收集的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定在其中應(yīng)該單獨或與其他突變組合避免進一步置換的氨基酸。
[0126]許多科學(xué)出版物已經(jīng)致力于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。參見Moult J.，Curr.0p.1n B1tech., 7 (4):422-427 (1996), Chou 等人，B1chemistry (生物化學(xué))，13(2):222-245(1974) ;Chou 等人，B1chemistry(生物化學(xué))，113 (2):211-222 (1974) ；Chou 等人，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mo 1.B1l, 47:45-148(1978) ；Chou 等人，Ann.Rev.B1chem.，47:251-276 以及 Chou 等人，B1phys.J.，26:367-384(1979)。此外，目前計算機程序可用于輔助預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的一種方法基于同源模建(homology modeling)。例如，具有大于30%的序列同一性或大于40%的相似性的兩種多肽或蛋白質(zhì)通常具有相似的結(jié)構(gòu)拓撲(structural topology)。最近蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)的出現(xiàn)已經(jīng)提供了提高的二級結(jié)構(gòu)可預(yù)測性，包括多肽的或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)內(nèi)折疊的潛在數(shù)量。參見Ho I m等人,Nucl.Acid.Res., 27 (I): 244-247 (1999)。已經(jīng)提出(Brenner 等人,Curr.0p.Struct.B1l.,7(3): 369-376 (1997))，在給定的多肽或蛋白質(zhì)中存在有限數(shù)量的折疊，以及一旦已經(jīng)解析臨界數(shù)量的結(jié)構(gòu)，則結(jié)構(gòu)預(yù)測將會在準確性方面顯著提高。
[0127]預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的額外方法包括“串線(threading) ” (Jones, D.，Curr.0pin.Struct.B1l., 7 (3):377-87 (1997) ； S ippI 等人,Structure (結(jié)構(gòu))，4 ⑴:15-9 (1996)), “profile analysis (輪廓分析)” (Bowie 等人,Science (科學(xué))，253:164-170 (1991) ；Gribskov 等人，Meth.Enzymol.，183:146-159 (1990) ；Gribskov等人，Proc.Nat.Acad.Sc1., 84 (13):4355-4358 (1987)),以及“evolut1nary linkage (進化譜系)”(參見上述Home和上述Brenner)。
[0128]可以通過已知的方法方便地計算相關(guān)的多肽的同一性和相似性。這種方法包括但不限于在以下描述的那些:Computat1nal Molecular B1logy(計算分子生物學(xué)),Lesk, A.M., ed.,牛津大學(xué)出版社，紐約，1988 ；B1computing:1nformatics andGenome Projects (生物計算:信息學(xué)與基因組工程)，Smith, D.ff., ed., Academic Press,紐約，1993 ;Computer Analysis of Sequence Data, Part I (序列數(shù)據(jù)的計算機分析，第 I 部分)，Griffin, A.Μ.,和 Griffin, H.G., eds., Humana Press,新澤西,1994 ；SequenceAnalysis in Molecular B1logy (分子生物學(xué)中的序列分析)，von Heinje, G., AcademicPress, 1987 ；Sequence Analysis Primer (序列分析引物)，Gribskov, M.和Devereux, J., eds., M.Stockton Press,紐約，1991 ;以及 Carillo 等人，SIAM J.AppliedMath.,48:1073 (1988) ο
[0129]用于確定同一性和/或相似性的優(yōu)選的方法被設(shè)計為在所測試的序列之間提供最大的匹配。用于確定同一性和相似性的方法描述于可公開獲得的計算機程序中。用于確定兩個序列之間的同一性和相似性優(yōu)選的計算機程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括 GAP (Devereux 等人，Nucl.Acid.Res.，12:387 (1984) ；Genetics ComputerGroup (遺傳學(xué)計算機組)，University of Wisconsin, Madison, ffis.)、BLASTP> BLASTN、和 FASTA(Altschul 等人，J.Mol.B1l., 215:403-410 (1990))。BLASTX 程序可從 Nat1nalCenter for B1technology Informat1n(國家生物技術(shù)信息中心,NCBI)以及其他來源公開獲得(BLAST Manual (BLAST 手冊)，Altschul 等人，NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.20894 ;上述Altschul等人)。還可以使用公知的Smith Waterman算法確定同一性。
[0130]某些用于比對兩個氨基酸序列的比對方案可以僅產(chǎn)生兩個序列的短區(qū)域的匹配，并且盡管兩個全長序列之間不存在明顯的關(guān)系，但是這個小比對區(qū)域可以具有非常高的序列同一性。因此，在優(yōu)選實施方案中，選擇的比對方法(GAP程序)將會產(chǎn)生橫跨靶多肽的至少50個連續(xù)氨基酸的比對。
[0131]例如，使用計算機算法GAP (Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計算機組),University of Wisconsin, Madison, ffis.)，比對將要確定百分比序列同一性的兩個多肽，用于其各自氨基酸的最佳匹配(如通過算法確定的“匹配間距(matched span) ”)。開放空位罰分(gap opening penalty)(計算為平均對角線的3倍；其中“平均對角線”是使用的比較矩陣的對角線的平均值；“對角線”是通過具體比較矩陣為每個完美氨基酸匹配指定的得分或數(shù)字)和延伸空位罰分(gap extens1n penalty)(通常為開放空位罰分的{分數(shù)(1/10)}倍)，以及比較矩陣，如PAM 250或BLOSUM 62，與該算法一起使用。該算法也使用標準比較矩陣(關(guān)于PAM 250比較矩陣,參見Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequenceand Structure (蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖)，vol.5，supp.3 (1978);關(guān)于BLOSUM 62比較矩陣,參見 Henikoff 等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA, 89:10915-10919 (1992))。
[0132]多肽序列比較的優(yōu)選的參數(shù)包括下列:
[0133]算法:Needleman等人，J.Mol.B1l, 48:443-453 (1970);比較矩陣:BL0SUM 62，來自 Henikoff 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:10915-10919 (1992);空位罰分:12，空位長度罰分:4，相似性閾值:0。
[0134]GAP程序使用以上參數(shù)。對于使用GAP算法的多肽比較(末端空位無罰分)來說，前述參數(shù)是默認參數(shù)。
[0135]核酸分子序列比較的優(yōu)選的參數(shù)包括以下:算法=Needleman等人，J.MolB1l.,48:443-453(1970);比較矩陣:匹配=+10，錯配=0，空位罰分:50，空位長度罰分:3。
[0136]GAP程序也使用以上參數(shù)。對于核酸分子比較來說，前述參數(shù)是默認參數(shù)。
[0137]可以使用其他示例性算法、開放空位罰分、延伸空位罰分、比較矩陣、相似性閾值等，包括在 Program Manual, Wisconsin Package, Vers1n 9, 1997 年 9 月中給出的那些。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，做出特定的選擇將會是顯而易見的，并且該選擇將會取決于所要進行的特定比較，如DNA與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA ;并且此外，無論比較是在給定的序列對之間(在這種情況下，GAP或BestFit—般是優(yōu)選的)的還是在一個序列與大型序列數(shù)據(jù)庫之間(在這種情況下，F(xiàn)ASTA或BLASTA是優(yōu)選的)的比較。
[0138]本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)解決并發(fā)現(xiàn)對以下與PM中胎盤粘附之后的分子機制有關(guān)的關(guān)鍵問題的答案:1)所描述的差異CSA粘附是否與VAR2CSA序列有關(guān)2)對于VAR2CSA結(jié)合CSA來說，確切的最小結(jié)構(gòu)要求是什么3)VAR2CSA與CSA之間存在的化學(xué)相互作用的類型是什么以及最后4)此信息是否能夠用于設(shè)計最佳疫苗抗原？
[0139]通過表達相同的FCR3和3d7VAR2CSA截短物，本發(fā)明的發(fā)明人示出，VAR2CSA以相似的親和力和特異性結(jié)合CSA，而無論寄生物菌株來源如何。這兩個序列具有79.6%的序列同一性。本發(fā)明的發(fā)明人進一步說明，在多個較短片段中保留高CSA結(jié)合親和力，并且包含側(cè)翼結(jié)構(gòu)域間(flanking interdomain)的小區(qū)域的DBL2X形成含有高親和力CSA結(jié)合位點的致密核心。在計算機中，本發(fā)明的發(fā)明人限定了 VAR2CSA中推定的GAG結(jié)合部位，并且通過缺失和置換，本發(fā)明的發(fā)明人表明在這些部位中的突變對CSPG結(jié)合沒有影響。利用聚電解質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的理論，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)表明，VAR2CSA-CSA相互作用可以不只取決于離子相互作用。最后，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)表明，多個短VAR2CSA片段能夠誘導(dǎo)粘附阻斷性抗體的產(chǎn)生，并且抗粘附抗體靶向所提出的CSA結(jié)合區(qū)域。這些數(shù)據(jù)提供了針對PfEMPl分子與其配體之間相互作用的生物化學(xué)性質(zhì)的首次詳細的見解。
[0140]本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽的制備
[0141]本發(fā)明還涉及制備如上所述的本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽的方法。可以借助重組核酸技術(shù)來制備在本文中所描述的本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽。通常，修飾克隆的野生型VAR2CSA核酸序列以編碼所需的蛋白質(zhì)。之后將這種修飾的序列插入至表達載體中，進而將其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至宿主細胞中。可以將更高級的真核細胞，尤其是培養(yǎng)的哺乳動物細胞，用作宿主細胞。也可以使用原核細胞如乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)或大腸桿菌(E.coli)來表達多肽，只要這些原核生物能夠產(chǎn)生二硫鍵或者蛋白質(zhì)是或可以是正確地重折疊的即可。此外，也可以使用酵母菌株來表達蛋白質(zhì)，這里包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母屬(P.Pichia)。
[0142]可以通過多種技術(shù)實現(xiàn)氨基酸序列改變(alterat1n)。核酸序列的修飾可以借助定點誘變(site-specific mutagenesis)。用于定點誘變的技術(shù)是在本領(lǐng)域內(nèi)公知的并且描述于，例如，Zoller 和 Smith(DNA 3:479-488，1984)或“Splicing by extens1noverlap (借助延伸重疊的剪接)Norton等人，Gene77, 1989，pp.61-68。因此，使用VAR2CSA的核苷酸和氨基酸序列，可以引入選擇的一個或多個改變。同樣地，用于利用使用特定引物的聚合酶鏈式反應(yīng)制備DNA構(gòu)建體的過程對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(參考PCRProtocols (PCR 方案),1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。
[0143]本發(fā)明的多肽也可以包括非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括，但不限于，丙氨酸、脫氨基組氨酸、反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇脯氨酸、順式-4-羥基脯氨酸、反式-4-羥基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、別蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥乙基半胱氨酸、輕乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺(homoglutamine)、哌唳酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxyl ic acid)、脫氫脯氨酸、3_和4_甲基脯氨酸、3，3- 二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。在本領(lǐng)域中已知多種方法用于將非天然存在的氨基酸殘基結(jié)合至多肽中。例如，可以采用在其中使用化學(xué)氨基?；种莆飔RNA抑制無義突變的體外系統(tǒng)。用于合成氨基酸和將tRNA氨基?；姆椒ㄔ诒绢I(lǐng)域中是已知的。在包含大腸桿菌S30萃取物和可商購的酶和其他試劑的無細胞系統(tǒng)中進行含有無義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯。通過層析來純化多肽。參見，例如，Robertson 等人，J.Am.Chem.Soc.113:2722, 1991 ；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301, 1991 ；Chung 等人,Science (科學(xué))259:806-9，1993 ；以及 Chung 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:10145-9，1993)。在第二種方法中，通過突變mRNA和化學(xué)氨基?；囊种莆飔RNA的顯微注射,在爪蟾卵母細胞(Xenopus oocytes)中進行翻譯(Turcatti等人，J.B1l.Chem.271:19991-8，1996)。在第三種方法中，在不存在所要替換的天然氨基酸并且存在所需非天然存在的一種或多種氨基酸的情況下，培養(yǎng)大腸桿菌細胞(例如，2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)。將非天然存在的氨基酸結(jié)合至多肽中，以代替其天然氨基酸對應(yīng)物。參見Koide等人，B1chem.33:7470-6, 1994?？梢酝ㄟ^體外化學(xué)修飾將天然存在的氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為非天然存在的物種?？梢詫⒒瘜W(xué)修飾與定點誘變(site-directed mutagenesis)組合，以進一步擴大置換的范圍(Wynn 和 Richards, Protein Sc1.2:395-403，1993)。
[0144]編碼本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽的核酸構(gòu)建體可以適宜地屬于基因組或cDNA來源，例如通過準備基因組或cDNA文庫并且根據(jù)標準技術(shù)(參考Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)，第二版.ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，冷泉港，New York, 1989)借助使用合成寡核苷酸探針的雜交來篩選編碼全部或部分多肽的DNA序列獲得的。
[0145]編碼VAR2CSA多肽的核酸構(gòu)建體也可以以合成方式通過確立的標準方法制備，例如，由 Beaucage 和 Caruthers, Tetrahedron Letters (四面體通訊)22 (1981), 1859-1869 描述的亞磷酰胺法或者由Matthes等人，EMBO Journal 3 (1984)，801-805描述的方法。根據(jù)亞磷酰胺法，例如在自動DNA合成器中合成寡核苷酸，并且將其純化、退火、連接并在適合的載體中克隆。編碼本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列也可以通過使用特定引物的聚合酶鏈式反應(yīng)制備，例如，如在US 4，683，202、Saiki等人，Science (科學(xué))239 (1988)，487-491、或上述Sambrook等人中描述的。
[0146]此外，核酸構(gòu)建體可以屬于根據(jù)標準技術(shù)通過連接合成的、基因組的或cDNA來源的片段(適當(dāng)時)制備的混合的合成和基因組的、混合的合成的和cDNA或者混合的基因組和cDNA來源，所述片段對應(yīng)于整個核酸構(gòu)建體的多個部分。
[0147]核酸構(gòu)建體優(yōu)選為DNA構(gòu)建體。用于制備根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列通常將會在VAR2CSA的氨基端編碼前原多肽(pre-pro polypeptide)，以獲得適當(dāng)?shù)姆g后加工以及從宿主細胞的分泌。
[0148]通常將編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列插入至重組載體中，所述重組載體可以是可以方便地對其進行重組DNA操作的任何載體，并且載體的選擇通常將會取決于將要將其引入至其中的宿主細胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制與染色體復(fù)制獨立，例如質(zhì)粒。備選地，載體可以是當(dāng)被引入至宿主細胞時整合至宿主細胞基因組中并且與被其整合的一個或多個染色體一起復(fù)制的載體。
[0149]載體優(yōu)選為表達載體，其中編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列可操作地連接至DNA轉(zhuǎn)錄所需的另外的區(qū)段。通常，表達載體來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或者可以含有這兩種元件。術(shù)語“可操作地連接”表示，將區(qū)段布置成其發(fā)揮與其預(yù)期目的一致的作用，例如轉(zhuǎn)錄在啟動子中起始并且前進經(jīng)過編碼多肽的DNA序列。
[0150]用于表達根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽的表達載體將包含能夠指導(dǎo)克隆基因或cDNA的轉(zhuǎn)錄的啟動子。啟動子可以是任何DNA序列,其顯示所選擇的宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄活性，并且可以來源于編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
[0151]哺乳動物細胞中用于指導(dǎo)編碼惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子的實例是 SV40 啟動子(Subramani 等人，Mol.Cell B1l.1 (1981)，854-864)、MT-1 (金屬硫蛋白基因(metalloth1nein gene))啟動子(Palmiter 等人，Science (科學(xué))222 (1983)，809-814)、CMV 啟動子(Boshart 等人,Cell(細胞)41:521-530，1985)或者腺病毒 2 主要晚期啟動子(adenovirus 2 major late promoter) (Kaufman 和 Sharp, Mol.Cell.B1l, 2:1304-1319，1982)。
[0152]用于昆蟲細胞的適合的啟動子的實例是多角蛋白(polyhedrin)啟動子(US
4,745, 051 ;Vasuvedan 等人，F(xiàn)EBS Lett.311, (1992) 7-11)、P10 啟動子(J.Μ.Vlak 等人，J.Gen.Virology 69，1988，pp.765-776)、苜猜尺蠖(Autographa californica)多角體病毒(polyhedrosis virus)基本蛋白啟動子(EP397485)、桿狀病毒立即早期基因I啟動子(US
5,155,037 ；US 5，162，222)、或者桿狀病毒39K延遲早期基因啟動子(US 5, 155,037 ；US5，162，222)。
[0153]用于酵母宿主細胞的適合的啟動子的實例包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，J.B1l.Chem.255 (1980)，12073-12080 ；Alber 和 Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1 (1982), 419-434)或醇脫氫酶基因(Young 等人，在 Genetic Engineering ofMicroorganisms for Chemicals (用于化學(xué)的微生物的基因工程)(Hollaender等人編)中，Plenum Press, New York, 1982)的啟動子，或者 TPIl (US 4, 599, 311)或ADH2-4c (Russell 等人，Nature (自然)304 (1983)，652-654)啟動子。
[0154]用于絲狀真菌宿主細胞的適合的啟動子的實例是，例如，ADH3啟動子(McKnight等人，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA啟動子。其他可用的啟動子的實例是來源于編碼以下的基因的啟動子:米曲霉(A.0ryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α淀粉酶、黑曲霉(A.niger)酸穩(wěn)定性α淀粉酶、黑曲霉(A.niger)或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米曲霉(A.0ryzae)堿性蛋白酶、米曲霉(A.0ryzae)磷酸丙糖異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶。優(yōu)選的是TAKA淀粉酶和gluA啟動子。在例如EP 238023和EP 383779中，提及了適合的啟動子。
[0155]編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列也可以(如果需要的話)可操作地連接至適合的終止子，如人生長激素終止子(Palmiter等人,Science (科學(xué))222, 1983, pp.809-814)或 TPIl(Alber 和 Kawasaki, J.Mol.Appl.Gen.1，1982，pp.419-434)或 ADH3 (McKnight 等人，The EMBO J.4，1985，pp.2093-2099)終止子。表達載體還可以含有位于啟動子下游和VAR2CSA序列本身的插入位點上游的一組RNA剪接位點?？梢詮南俨《竞?或免疫球蛋白基因獲得優(yōu)選的RNA剪接位點。表達載體中還含有位于插入位點下游的多聚腺苷酸化信號。特別優(yōu)選的多聚腺苷酸化信號包括來自SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信號(Kaufman和Sharp，ibid.)、來自腺病毒5Elb區(qū)的多聚腺苷酸化信號、人生長激素基因終止子(DeNoto等人Nucl.AcidsRes.9:3719-3730, 1981)或來自惡性瘧原蟲、人或牛基因的多聚腺苷酸化信號。表達載體還可以包括非編碼病毒前導(dǎo)序列，如位于啟動子與RNA剪接位點之間的腺病毒2三聯(lián)前導(dǎo)序列；和增強子序列，如SV40增強子。
[0156]為了將本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽引導(dǎo)至宿主細胞的分泌途徑中，可以在重組載體中設(shè)置分泌信號序列(也被稱為前導(dǎo)序列、前原序列(preprosequence)或前序列)。以正確的閱讀框?qū)⒎置谛盘栃蛄信c編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列連接。分泌信號序列通常位于編碼肽的DNA序列的5’。分泌信號序列可以是與蛋白質(zhì)通常相關(guān)的序列，或者可以來自編碼另一種分泌性蛋白質(zhì)的基因。
[0157]對于來自酵母細胞的分泌來說，分泌信號序列可以編碼任何信號肽，其確保表達的根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽有效指向進入細胞分泌途徑。信號肽可以是天然存在的信號肽、或其功能部分，或者其可以是合成肽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了適合的信號肽為α因子信號肽(參考US4，870，008)、小鼠唾液淀粉酶的信號肽(參考0.Hagenbuchle等人，Nature (自然)289，1981，pp.643-646)、修飾的羧肽酶信號肽(參考L.A.Valls等A,Cell(細胞)48，1987，pp.887-897)、酵母 BARl 信號肽(參考 WO 87/02670)、或酵母天冬氨酸蛋白酶 3(YAP3)信號肽(參考 M.Egel-Mitani 等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)。
[0158]對于酵母中的有效分泌來說，還可以將編碼前導(dǎo)肽的序列插入信號序列的下游和編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列的上游。前導(dǎo)肽的功能是允許將表達的肽從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引導(dǎo)至高爾基體，并進一步引導(dǎo)至分泌小泡，以向培養(yǎng)基中分泌(即根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽橫跨細胞壁或至少經(jīng)由細胞膜向酵母細胞的周質(zhì)空間中輸出)。前導(dǎo)肽可以是酵母α因子前導(dǎo)序列(其用途描述于，例如US 4，546，082、US 4，870，008、EP 16201、EP 123294、EP 123544 和 EP 163529 中)。備選地，前導(dǎo)肽可以是合成前導(dǎo)肽，即未在自然中發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)肽。例如，可以如在WO 89/02463或WO 92/11378中描述的構(gòu)建合成前導(dǎo)肽。
[0159]對于在絲狀真菌中使用來說，信號肽可以方便地來源于編碼曲霉屬(Aspergillussp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶或蛋白酶或者柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因。信號肽優(yōu)選來源于編碼米曲霉(A.0ryzae)TAKA淀粉酶、黑曲霉(A.niger)中性α淀粉酶、黑曲霉(A.niger)酸穩(wěn)定性淀粉酶、或黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶的基因。在例如EP 238023和EP 215 594中公開了適合的信號肽。
[0160]對于在昆蟲細胞中使用來說，信號肽可以方便地來源于昆蟲基因(參考WO90/05783),如鱗翅類煙草夜蛾(Manduca sexta)脂動激素(adipokinetic hormone)前體信號肽(參考US 5，023, 328)。
[0161]用于連接編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列與啟動子和任選的終止子和/或分泌信號序列的操作，以及用于將其插入至含有復(fù)制所需信息的適合的載體的操作，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的(參考，例如，Samtoook等A , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)，冷泉港，NewYork,1989)。
[0162]轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞和表達引入至細胞中的DNA序列的方法描述于，例如Kaufman 和 Sharp, J.Mol.B1l.159(1982)，601-621 ;Southern 和 Berg,J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341 ；Loyter 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 79(1982)，422-426 ；Wigler 等人,Cell (細胞)14 (1978), 725 ；Corsaro 和 Pearson, Somatic Cell Genetics (體細胞遺傳學(xué))(體細胞遺傳學(xué))7 (1981)，603，Graham 和 van der Eb, Virology52 (1973)，456 ；以及 Neumann 等人，EMBO J.1 (1982)，841-845。
[0163]通過例如磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等人，Cell(細胞)14:725-732, 1978 ；Corsaro 和 Pearson, Somatic Cell Genetics (體細胞遺傳學(xué))7:603-616,1981 ；Graham 和 Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973)或電穿孔(Neumann 等人，EMBOJ.1:841-845，1982)，將克隆的DNA序列引入至培養(yǎng)的哺乳動物細胞中。為了鑒別和選擇表達外源DNA的細胞，通常將賦予可選擇表型(可選擇標記)的基因隨目標基因或cDNA—起引入至細胞中。優(yōu)選的可選擇標記包括賦予對藥物如新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、和甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性的基因?？蛇x擇標記可以是可擴增的可選擇標記。優(yōu)選的可擴增的可選擇標記是二氫葉酸還原酶(DHFR)序列。可選擇標記由 Thilly 綜述(Mammalian Cell Technology (哺乳動物細胞技術(shù))，ButterworthPublishers, Stoneham, MA,通過引用結(jié)合在本文中)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選擇適合的可選擇標記。
[0164]可以將可選擇標記與目標基因在分別的質(zhì)粒上同時引入至細胞中，或者可以在相同的質(zhì)粒上將它們引入。如果在相同的質(zhì)粒上，可選擇標記和目標基因可以處于不同啟動子或相同啟動子的控制下，后一種布置產(chǎn)生雙順反子信使(dicistronic message)。這種類型的構(gòu)建體在本領(lǐng)域中是已知的(例如,Levinson和Simonsen,美國4，713, 339)。將被稱為“載體DNA”的另外的DNA加入至被引入至細胞中的混合物中也可以是有利的。
[0165]在細胞已經(jīng)吸收DNA之后，使它們在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中生長，通常1-2天，以開始表達目標基因。如在本文中所使用的術(shù)語“適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基”意指含有細胞生長和目標惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽的表達所需的營養(yǎng)物質(zhì)和其他組分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通常包含碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、維生素、鹽、磷脂、蛋白質(zhì)和生長因子。之后進行藥物選擇以選擇以穩(wěn)定方式表達可選擇標記的細胞的生長。對于已經(jīng)用可擴增的可選擇標記轉(zhuǎn)染的細胞來說，可以增加藥物濃度以選擇增加的拷貝數(shù)的克隆序列，從而增加表達水平。之后篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞的克隆，以表達目標惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽。
[0166]向其中引入編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列的宿主細胞可以是任何細胞，其能夠產(chǎn)生翻譯后修飾的多肽并且包括酵母、真菌和更高級的真核細胞。
[0167]用于本發(fā)明的哺乳動物細胞系的實例是COS-UATCC CRL 1650)、幼倉鼠腎臟(BHK)和 293 (ATCC CRL 1573 ;Graham 等人，J.Gen.Virol.36:59-72，1977)細胞系。優(yōu)選的 BHK 細胞系是 tk_tsl3BHK 細胞系(Waechter 和 Baserga, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA79:1106-1110，1982，通過引用結(jié)合在本文中)，在下文中被稱為BHK 570細胞。BHK 570細胞系已經(jīng)以ATCC保藏編號CRL 10314存放在美國模式培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collect1n), 12301Parklawn Dr., Rockville, Md.20852? tk_tsl3 BHK 細胞系也可以以保藏編號CRL 1632從ATCC獲得。此外，在本發(fā)明中可以使用許多其他細胞系，包括大鼠H印I (大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠H印II (大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL9.1)、CHO (ATCCCCL 61)和 DUKX 細胞(Urlaub 和 Chasin, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 77:4216-4220，1980)。
[0168]適合的酵母細胞的實例包括酵母菌屬(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces spp.),尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)的菌株。用于利用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細胞并且由其產(chǎn)生異源多肽的方法描述于，例如 US 4，599，311、US4, 931，373、US 4，870，008,5, 037，743、和US 4，845，075，它們?nèi)客ㄟ^引用結(jié)合于此。通過由可選擇標記確定的表型來選擇轉(zhuǎn)化的細胞，可選擇標記通常是抗藥性或在不存在特定營養(yǎng)物(例如，亮氨酸)的情況下生長的能力。用于酵母的優(yōu)選的載體是US 4，931，373中公開的POTl載體。例如，如上所述的，編碼根據(jù)本發(fā)明的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列的前面可以是信號序列和任選的前導(dǎo)序列。適合的酵母細胞的另外的實例是下列菌株:克魯維酵母屬(Kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母(K.1actis),漢遜酵母屬(Hansenula)例如多形漢遜酵母(H.poIymorpha),或者畢赤酵母屬(Pichia)例如巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)(參考Gleeson 等人，J.Gen.Microb1l.132，1986，pp.3459-3465 ；US 4，882，279)。
[0169]其他真菌細胞的實例是絲狀真菌的細胞,例如曲霉屬(Aspergillus spp.)、鏈孢霉屬(Neurospora spp.)、鍵刀菌屬(Fusarium spp.)或木霉屬(Trichoderma spp.),尤其是下列的菌株:米曲霉(A.0ryzae)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。使用曲霉屬(Aspergillus spp.)表達蛋白質(zhì)描述于，例如，EP 272277,EP 238023,EP 184438。例如，如由Malardier等人，1989, Gene 78:147-156描述的,可以進行尖抱鍵刀菌(F.0xysporum)的轉(zhuǎn)化。例如，如在EP 244234中描述的,可以進行木霉屬(Trichoderma spp.)的轉(zhuǎn)化。
[0170]當(dāng)使用絲狀真菌作為宿主細胞時，可以方便地通過將DNA構(gòu)建體整合在宿主染色體中用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體將其轉(zhuǎn)化，以獲得重組宿主細胞。這種整合通常被認為是優(yōu)勢，因為DNA序列更有可能被穩(wěn)定地維持在細胞中。可以根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源重組,進行DNA構(gòu)建體向宿主染色體中的整合。
[0171]如在US 4, 745, 051 ；US 4, 879, 236 ；US 5, 155, 037 ；5, 162, 222 ；EP 397,485)中描述的，它們?nèi)客ㄟ^引用結(jié)合在本文中，可以進行昆蟲細胞的轉(zhuǎn)化和在其中異源多肽的制備。用作宿主的昆蟲細胞系可以適宜地為鱗翅目(L印idoptera)細胞系，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞(參考US5，077，214)。培養(yǎng)條件可以適宜地為，如在例如WO 89/01029或WO 89/01028，或者任何前述參考文獻中中描述的。
[0172]之后在允許惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽的表達的條件下在適合的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，之后可以從培養(yǎng)物中回收全部或部分得到的肽。用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是適用于使宿主細胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基，如基本培養(yǎng)基或含有適當(dāng)補充物的復(fù)合培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基可從供應(yīng)廠商獲得或者可以根據(jù)公開的配方制備(例如，在美國模式培養(yǎng)物保藏中心的目錄下的)。之后可以通過常規(guī)操作從培養(yǎng)基中回收由細胞產(chǎn)生的惡性瘧原蟲VAR2CSA多肽，所述操作包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細胞，借助鹽例如硫酸銨使上清液或濾液的蛋白質(zhì)水性組分沉淀，通過多種層析操作純化，例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等，這取決于所討論的多肽的類型。
[0173]可以采用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)制備本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽。優(yōu)選的是在宿主雌性哺乳動物的乳腺內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在乳腺中表達和隨后向乳汁中的分泌目標蛋白，克服了許多從其他來源分離蛋白所遇到的困難。乳汁可以容易大量收集，并且是在生物化學(xué)上充分表征的。此外，主要的乳汁蛋白以高濃度存在于乳汁中(通常約I至15g/l)。
[0174]從商業(yè)觀點來看，具有高乳汁產(chǎn)率的物種顯然優(yōu)選用作宿主。盡管可以使用較小的動物如小鼠和大鼠(并且在原理論證階段是優(yōu)選的)，但是優(yōu)選的是使用家畜哺乳動物，包括，但不限于，豬、山羊、綿羊和牛。綿羊是特別優(yōu)選的，這歸因于先前在此物種中轉(zhuǎn)基因的歷史、乳汁產(chǎn)率、成本和用于收集綿羊乳汁設(shè)備的易得性的因素(關(guān)于影響宿主物種選擇的因素的比較，參見，例如，WO 88/00239)。通常希望的是，選擇用于產(chǎn)奶用途繁殖的一個品種的宿主動物，如東弗里斯蘭(East Friesland)綿羊，或者通過在日后繁殖轉(zhuǎn)基因品系而引入產(chǎn)奶家畜。在任何情況下，應(yīng)該使用已知的、良好健康狀態(tài)的動物。
[0175]為了獲得在乳腺中的表達，使用來自乳汁蛋白基因的轉(zhuǎn)錄啟動子。乳汁蛋白基因包括編碼酪蛋白的那些基因(參見美國5，304，489)、β乳球蛋白、乳清蛋白、和乳清酸性蛋白。β乳球蛋白(BLG)啟動子是優(yōu)選的。在牛β乳球蛋白基因的情況中，通常將會使用基因的至少近端406bp的5’側(cè)翼序列(flanking sequence)的區(qū)域，盡管至多約5kbp的較大部分的5’側(cè)翼序列是優(yōu)選的，如包含β乳球蛋白基因的5’側(cè)翼啟動子和非編碼部分的約 4.25kbp DNA 區(qū)段(參見 Whitelaw 等人，B1chem.J.286:3139 (1992))。來自其他物種的啟動子DNA的相似片段也是適合的。
[0176]也可以將β乳球蛋白基因的其他區(qū)域結(jié)合在構(gòu)建體中，所要表達的基因的基因組區(qū)域也可以如此。在本領(lǐng)域中通常所接受的是，缺少內(nèi)含子的構(gòu)建體，例如，與含有這種DNA序列的那些相比表達得差(參見Brinster等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:836840(1988) ;Palmiter 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:478482(1991) ；Whitelaw等人，Transgenic Res.1:313(1991) ；W0 89/01343 ;以及WO 91/02318,其每一個通過引用結(jié)合在本文中)。就此而言，在可能的情況下，通常優(yōu)選的是，使用含有編碼目標蛋白質(zhì)或多肽的基因的天然內(nèi)含子中的全部或一些的基因組序列，因此進一步包含來自例如β乳球蛋白基因的至少一些內(nèi)含子是優(yōu)選的。一個這種區(qū)域是從牛β乳球蛋白基因的3’非編碼區(qū)域開始的允許內(nèi)含子剪接和RNA多聚腺苷酸化的DNA區(qū)段。當(dāng)置換基因天然3’非編碼序列時，這種牛β乳球蛋白區(qū)段可以同時增強和穩(wěn)定目標蛋白質(zhì)或多肽的表達水平。在其他實施方案內(nèi)，VAR2CSA序列的起始ATG周圍的區(qū)域被來自乳汁特異性蛋白基因的相應(yīng)序列替換。這種替換提供了用于增強表達的推定的組織特異性起始環(huán)境。方便的是，用例如BLG基因的那些替換整個VAR2CSA前原和5’非編碼序列，盡管可以替換較小的區(qū)域。
[0177]對于在轉(zhuǎn)基因動物中根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽的表達來說，編碼VAR2CSA的DNA區(qū)段可操作地連接至其表達所需的另外的DNA區(qū)段以產(chǎn)生表達單元。這種另外的區(qū)段包括上述啟動子，以及允許轉(zhuǎn)錄終止和mRNA的多聚腺苷酸化的序列。表達單元還將包括可操作地連接至編碼修飾VAR2CSA的區(qū)段的編碼分泌信號序列的DNA區(qū)段。分泌信號序列可以是天然分泌信號序列，或者可以是另一種蛋白質(zhì)如乳汁蛋白的序列(參見，例如，von Heijne, Nucl.Acids Res.14:46834690 (1986);以及 Meade 等人，U.S.4，873，316，其通過引用結(jié)合在本文中)。
[0178]通過將VAR2CSA序列插入至含有另外的DNA區(qū)段的質(zhì)?；蚴删w載體中，方便地進行用于轉(zhuǎn)基因動物的表達單元的構(gòu)建，盡管可以通過基本上任何連接的序列構(gòu)建表達單元。特別方便的是，提供含有編碼乳汁蛋白的DNA區(qū)段的載體以及將用于乳汁蛋白的編碼序列替換為VAR2CSA變體的編碼序列；從而創(chuàng)建包含乳汁蛋白基因的表達控制序列的基因融合。在任何情況下，質(zhì)?；蚱渌d體中表達單元的克隆均有助于VAR2CSA序列的擴增。方便地在細菌(例如大腸桿菌)宿主細胞中進行擴增，因此載體通常將會包含復(fù)制起點和在細菌宿主細胞中起作用的可選擇標記。之后將表達單元引入至所選擇的宿主物種的受精卵中(包括早期胚胎)?？梢酝ㄟ^多種途徑中的一種完成異源DNA的引入，所述途徑包括顯微注射(例如美國專利號4，873，191)、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Jaenisch, Science 240:14681474(1988))或者利用胚胎干(ES)細胞的定點整合(由Bradley等人綜述，B1/Technology 10:534539 (1992))。之后將卵植入假孕雌性的輸卵管或子宮中，并且使其發(fā)育足月。其種系中攜帶所引入的DNA的后代可以以正常的孟德爾遺傳方式(Mendelian fash1n)將該DNA傳遞給后代，允許轉(zhuǎn)基因畜群的發(fā)展。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的一般操作在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如，Hogan等人，Manipulatingthe Mouse Embryo: A Laboratory Manual (小鼠胚胎操作:實驗室手冊)，Cold SpringHarbor Laboratory (冷泉港實驗室)，1986 ；Simons 等人，B1/Technology 6:179183(1988) ;Wall 等人，B1l.Reprod.32:645 651(1985) ;Buhler 等人，B1/Technology8:140143 (1990) ；Ebert 等人，B1/Technology 9:835 838(1991) ；Krimpenfort 等人，B1/Technology 9:844 847(1991) ;Wall 等人，J.Cell.B1chem.49:113120 (1992)；U.S.4, 873, 191 ；U.S.4, 873, 316 ；W0 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757 ；以及 GB87/00458)。最初在小鼠中發(fā)展了用于將外部DNA序列引入至哺乳動物及其生殖細胞中的技術(shù)(參見，例如，Gordon 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 77:7380 7384(1980)；Gordon 和 Ruddle, Science214:1244 1246(1981) ；Palmiter 和 Brinster,Cell (細胞)41:343345(1985) ;Brinster 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:4438 4442(1985)；以及Hogan等人(ibid.))。這些技術(shù)隨后適用于較大的動物，包括家畜物種(參見，例如，WO 88/00239, WO 90/05188，和 WO 92/11757 ；和 Simons 等人,B1/Technology6:179183(1988))。綜上所述，在至今用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠或家畜的最有效的途徑中，根據(jù)已建立的技術(shù)，將數(shù)百個目標DNA的直鏈分子注射至受精卵的原核(pro nuclei)之一中。還可以采用將DNA注射至受精卵的細胞質(zhì)中。
[0179]還可以采用在轉(zhuǎn)基因植物中制備。表達可以推廣至或針對特定的器官，如塊莖(參見，Hiatt, Nature (自然)344:469 479 (1990) ；Edelbaum 等人，J.1nterferonRes.12:449 453(1992) ；Sijmons 等人，B1/Technology 8:217221(1990);以及 EP0255378)。
[0180]VAR2CSA 純化
[0181]可以從細胞培養(yǎng)基或乳汁中回收本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽。可以通過本領(lǐng)域中已知的多種操作來純化本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽，所述操作包括，但不限于，層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和尺寸排阻)、電泳操作(例如，制備型等電點聚焦(IEF)、差異溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、或萃取(參見，例如，ProteinPurificat1n (蛋白質(zhì)純化)，J.-C.Janson 和 Lars Ryden 編，VCH Publishers, NewYork, 1989)。優(yōu)選地，可以通過在抗VAR2CSA抗體柱上親和層析將其純化?？梢酝ㄟ^常規(guī)化學(xué)純化工具，如高效液相色譜，完成額外的純化。包括檸檬酸鋇沉淀在內(nèi)的其他純化方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且可以應(yīng)用于在本文中所描述的新型VAR2CSA多肽和其他多肽的純化(參見，例如，Scopes, R., Protein Purificat1n(蛋白質(zhì)純化)，Springer-Verlag, N.Y.，1982)。
[0182]出于治療目的，優(yōu)選的是，本發(fā)明的VAR2CSA多肽和其他多肽是基本上純的。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽和其他多肽被純化為至少約90至95 %的同質(zhì)性，優(yōu)選為至少約98%的同質(zhì)性?？梢酝ㄟ^例如凝膠電泳和氨基末端氨基酸測序來評估純度。
[0183]術(shù)語“分離的多肽”是指本發(fā)明的多肽，其⑴已經(jīng)與至少約50%的與其自然相關(guān)的多核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其他物質(zhì)(即，污染物)分離。優(yōu)選地，分離的多肽基本不含任何其他在自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的污染多肽或其他污染物，它們會干擾分離多肽的治療、診斷、預(yù)防或研究用途。
[0184]如在本文中所使用的術(shù)語“微生物”是指細菌、真菌、古生菌、原生生物；顯微植物和動物(如綠藻或浮游生物)、三腸蟲(planarian)和變形蟲(amoeba)。包括在此定義內(nèi)的是致病微生物。
[0185]施用與藥物組合物
[0186]組合治療
[0187]如在本說明書中定義的VAR2CSA多肽、衍生物、或綴合物可以與一種或多種其他癌癥藥物同時或順序施用，和/或用于與其他已知的療法的組合治療中。因子可以以單一劑型提供，其中單一劑型含有兩種化合物，或者以多部件試劑盒的形式提供，所述試劑盒包括作為第一單位劑型的VAR2CSA多肽制劑以及作為第二單位劑型的一種或多種其他化合物的制劑。無論是第一或第二或第三等，在整個說明書中所提及的單位劑量不表示施用的優(yōu)先順序，而僅是為了方便的目的。
[0188]可以與VAR2CSA多肽組合使用的適合的其他癌癥藥物或療法包括已經(jīng)上市面上存在的或在開發(fā)中的抗體，包括威羅菲尼(Vemurafenib) (Hoffmann - La Roche)、針對MCSP的人單克隆抗體、使用BiTE抗體平臺技術(shù)的治療性抗MCSP(Micromet Inc)、以及具有對MCSP的特異性的細胞毒性T細胞的過繼轉(zhuǎn)移(Adoptive transfer)。
[0189]VAR2CSA多肽的制劑和一種或多種其他化合物的制劑的“同時”給藥，意指以單一劑型施用化合物，或者施用第一藥劑，接著以不多于15分鐘、優(yōu)選10、更優(yōu)選的5、更優(yōu)選的2分鐘的時間間隔施用第二藥劑?？梢允紫仁┯萌我灰蜃?。
[0190]“順序”給藥，意指施用第一藥劑，接著以多于15分鐘的時間間隔施用第二藥劑?？梢允紫仁┯脙煞N單位劑型中的任意一個。優(yōu)選地，經(jīng)由相同的靜脈內(nèi)途徑注射兩種產(chǎn)品。
[0191]本發(fā)明的另一個目標是提供包含VAR2CSA多肽的藥物制劑，VAR2CSA多肽以O(shè)mg/ml至lmg/ml的血清/血漿濃度存在，并且其中制劑具有2.0至10.0的pH。制劑還可以包含緩沖系統(tǒng)、一種或多種防腐劑、一種或多種張度劑、一種或多種螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，藥物制劑是水性制劑，即包含水的制劑。這種制劑通常是溶液劑或混懸劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，藥物制劑是水溶液。術(shù)語“水性制劑”被定義為包含至少50% w/w水的制劑。同樣地，術(shù)語“水溶液”被定義為包含至少50% w/w水的溶液，并且術(shù)語“水性混懸劑”被定義為包含至少50% w/w水的混懸劑。
[0192]在其它實施方案中，藥物制劑是凍干劑，醫(yī)師或患者在使用前向其中加入溶劑和/或稀釋劑。
[0193]在其它實施方案中，藥物制劑是隨時使用而不需要事先溶解的干劑(例如冷凍干燥的或噴霧干燥的)。
[0194]在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含VAR2CSA多肽的水溶液和緩沖液的藥物制劑，其中VAR2CSA多肽以Ο-lmg/ml以上的血清/血漿濃度存在，并且其中制劑具有約2.0至約10.0 的 pH。
[0195]在本發(fā)明的其他實施方案中，制劑的pH選自由以下組成的列表:2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、
4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、
6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、
8.0 λ 8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、
9.9、和 10.00
[0196]在本發(fā)明的另一個實施方案中，緩沖液選自由以下組成的組:乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、雙甘氨肽、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、和三(羥甲基)_氨基甲烷、二羥乙基甘氨酸(bicine)、三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些特定緩沖液中的每一個構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。
[0197]在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含藥用防腐劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑選自由以下組成的組:苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、芐醇、氯丁醇、和硫柳萊(th1merosal)、溴硝醇(bronopol)、苯甲酸、伊咪脲(imidurea)、氯己唆(chlorohexidine)、脫氫乙酸鈉、氯甲酹、對輕基苯甲酸乙酯、節(jié)索氯銨(benzethoniumchloride)、氯苯甘醚(chlorphenesine) (3對氯苯氧基丙燒_1，2_ 二醇)或其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以0.lmg/ml至20mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以0.lmg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以5mg/ml至10mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以10mg/ml至20mg/ml的濃度存在。這些特定防腐劑中的每一個構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中使用防腐劑對技術(shù)人員來說是公知的。為了方便,參考Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy(雷明頓:藥物科學(xué)與實踐)，第19版，1995。
[0198]在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含等滲劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑選自由以下組成的組:鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、多元醇(alditol)(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(I, 2-propaned1l、propyleneglycol)、I, 3-丙二醇、I, 3- 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物?？梢允褂萌魏翁牵鐔翁?、二糖、或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、普魯蘭、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素鈉。在一些實施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇被定義為具有至少一個-OH基團的C4-C8烴，并且包括，例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇(dulcitol)、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一些實施方案中，糖醇添加劑是甘露糖醇。上述糖或糖醇可以獨立或組合使用。對于所使用的量沒有固定的限制，只要糖或糖醇在液體制劑中可溶并且不對使用本發(fā)明的方法獲得的穩(wěn)定效果造成負面影響即可。在一些實施方案中，糖或糖醇濃度在約lmg/ml至約150mg/ml之間。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑以lmg/ml至50mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑以lmg/ml至7mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑以8mg/ml至24mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑以25mg/ml至50mg/ml的濃度存在。這些特定等滲劑中的每一個構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中使用等滲劑對技術(shù)人員來說是公知的。為了方便,參考Remington:TheScience and Practice of Pharmacy (雷明頓:藥物科學(xué)與實踐)，第 19 版，1995。
[0199]在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含螯合劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、檸檬酸鹽和天冬氨酸鹽、和它們的混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑以0.lmg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑以0.lmg/ml至2mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑以2mg/ml至5mg/ml的濃度存在。這些特定螯合劑中的每一個構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中使用螯合劑對技術(shù)人員來說是公知的。為了方便,參考Remington:TheScience and Practice of Pharmacy (雷明頓:藥物科學(xué)與實踐)，第 19 版，1995。
[0200]在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含穩(wěn)定劑。在藥物組合物中使用穩(wěn)定劑對技術(shù)人員來說是公知的。為了方便，參考Remington:The Science and Practice ofPharmacy (雷明頓:藥物科學(xué)與實踐)，第19版，1995。
[0201]更具體地，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性組分包含多肽，該多肽可以在液體藥物制劑中儲存期間展現(xiàn)出聚集體形成。通過“聚集體形成”，意指多肽分子之間的物理相互作用，其引起可以保持可溶的低聚物的或者從溶液中沉淀的大的可見聚集體的形成。通過“儲存期間”，意指當(dāng)制備液體藥物組合物或制劑時，不立刻施用于受試者。相反，在制備后，將其包裝用于以液體形式、或以冷凍狀態(tài)、或以干燥形式儲存，以用于稍后重構(gòu)為適用于施用于受試者的液體形式或其他形式。通過“干燥形式”，意指液體藥物組合物或制劑通過下列方式干燥:冷凍干燥(即，凍干(Iyophilizat1n)；參見，例如，Williams 和 Polli (1984) J.Parenteral Sc1.Technol.38:48-59)、噴霧干燥(參見 Masters (1991)在 Spray-Drying Handbook (噴霧干燥手冊)中(5th ed ；LongmanScientific&Technical, Essez, U.Κ.), pp.491-676 ；Broadhead 等人(1992) Drug Devel.1nd.Pharm.18:1169-1206 ;以及 Mumenthaler 等人(1994) Pharm.Res.11:12-20)、或空氣干燥(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryob1logy (低溫生物學(xué))25:459-470 ；以及 Roser (1991)B1pharm.4:47-53)。歸因于液體藥物組合物儲存期間的多肽的聚集體形成可能會對所述多肽的生物活性造成負面影響，導(dǎo)致藥物組合物的治療功效的損失。此外，聚集體形成可能會引起其他問題，如當(dāng)使用輸注系統(tǒng)施用含多肽的藥物組合物時管道、膜、或泵的堵塞。
[0202]本發(fā)明的藥物組合物還可以包含足以降低歸因于組合物儲存期間的多肽的聚集體形成的量的氨基酸堿(amino acid base)。通過“氨基酸堿”，意指氨基酸或氨基酸的組合，其中任何給定的氨基酸以其游離堿的形式或以其鹽的形式存在。在使用氨基酸的組合的情況下，全部氨基酸都可以以其游離堿的形式存在，全部都可以以其鹽的形式存在，或者一些可以以其游離堿的形式存在而其他以其鹽的形式存在。在一些實施方案中，用于制備本發(fā)明的組合物的氨基酸是攜帶帶電側(cè)鏈的那些，如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。特定氨基酸(例如甘氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即，L、D、或DL異構(gòu)體)或者這些立體異構(gòu)體的組合，可以存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要特定氨基酸以其游離堿的形式或其鹽的形式存在即可。在一些實施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。還可以用這些氨基酸的類似物配制本發(fā)明的組合物。通過“氨基酸類似物”，意指產(chǎn)生減少歸因于本發(fā)明的液體藥物組合物儲存期間的多肽的聚集體形成的所需效果的天然存在的氨基酸的衍生物。適合的精氨酸類似物包括，例如，氨基胍、鳥氨酸和N-單乙基L-精氨酸，適合的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸，并且適合的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。對于其他氨基酸來說，將氨基酸類似物以其游離堿的形式或其鹽的形式結(jié)合至組合物中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，以足以防止或延緩蛋白質(zhì)的聚集的濃度使用氨基酸或氨基酸類似物。
[0203]在本發(fā)明的另一個實施方案中，當(dāng)充當(dāng)治療劑的多肽是包含至少一個對氧化敏感的甲硫氨酸殘基的多肽時，可以加入甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸類似物)以抑制甲硫氨酸殘基氧化為甲硫氨酸亞砜。通過“抑制”，意指甲硫氨酸氧化物種隨時間的最小累積。抑制甲硫氨酸氧化的結(jié)果是更多地保留在其適當(dāng)?shù)姆肿有问较碌亩嚯摹？梢允褂眉琢虬彼岬娜魏瘟Ⅲw異構(gòu)體(L、D、或DL異構(gòu)體)或它們的組合。所要加入的量應(yīng)該是足以抑制甲硫氨酸殘基的氧化從而使甲硫氨酸亞砜的量是管理機構(gòu)可接受的量。通常，這意味著，組合物含有不多于約10%至約30%的甲硫氨酸亞砜。通常，這可以通過加入使得加入至甲硫氨酸殘基的甲硫氨酸范圍為約1:1至約1000:1如10:1至約100:1的甲硫氨酸實現(xiàn)。
[0204]在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含選自高分子量聚合物或低分子化合物的組的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)如單硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇、以及不同的鹽(例如氯化鈉)。這些特定穩(wěn)定劑中的每一個構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。
[0205]藥物組合物還可以包含額外的穩(wěn)定劑，其進一步增強在其中的治療活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定劑包括，但不限于，甲硫氨酸和EDTA，其保護多肽不受甲硫氨酸氧化影響，以及非離子表面活性劑，其保護多肽不受與凍融或機械剪切相關(guān)的聚集的影響。
[0206]在本發(fā)明的另一個實施方案中，制劑還包含表面活性劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，表面活性劑選自洗滌劑、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙?；瘑胃视王?、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧亞乙基嵌段聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)如
Pluronicu F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、
聚氧乙烯和聚乙烯衍生物如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80和Brij-35)、單甘油酯或其乙氧基化衍生物、二甘油酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素和磷脂(例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(例如二棕櫚?；字?和溶血磷脂的衍生物(例如棕櫚?；苎字?L-絲氨酸以及乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的1-?；?sn-甘油-3-磷酸酯)以及溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰膽堿的月桂?；腿舛罐觉；苌?、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、和極性頭基團(即膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇)的修飾物，和帶正電的DODAC、DOTMA, DCP、BISHOP、溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸、和甘油磷脂(例如腦磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃型半乳糖苷)、鞘糖脂(例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二烷基磷酸膽堿、雞蛋溶血卵磷脂、夫西地酸衍生物(例如牛磺二氫夫西地酸鈉等)、長鏈脂肪酸及其C6-C12(例如油酸和辛酸)鹽、酰基肉堿及衍生物、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的N°-酰化衍生物、賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈?；苌?、包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸的任何組合的二肽的N°-?；苌铩行园被岷蛢蓚€帶電氨基酸的任何組合的三肽的N°-?；苌铩SS(多庫酯鈉，CAS登記號[577-11-7])、多庫酯鈣，CAS登記號[128-49-4])、多庫酯鉀，CAS登記號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸及其鹽和甘氨酸或?；撬峋Y合物、熊脫氧膽酸、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、N-十六烷基-N，N- 二甲基-3-氨溶基(amm0ni0)-l-丙磺酸鹽、陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽類)一價表面活性劑、兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N，N- 二甲基氨溶基-1-丙磺酸鹽、3-氯酰氨基-1-丙基二甲基氨溶基-1-丙磺酸鹽、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶)、非離子型表面活性劑(例如十二烷基β -D-吡喃葡萄糖苷)、poloxamine (例如Tetronic's)，其為衍生自依次將環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷加成至乙二胺的四官能嵌段共聚物，或者所述表面活性劑可以選自咪唑啉衍生物或其混合物。這些特定表面活性劑中的每一個構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。
[0207]在藥物組合物中使用表面活性劑對技術(shù)人員來說是公知的。為了方便，參考Remington:The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓:藥物科學(xué)與實踐)，第 19版，1995。
[0208]可能的是，在本發(fā)明的肽藥物制劑中可以存在其他成分。這種額外成分可以包括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張度改性劑、螯合劑、金屬離子、油脂載體、蛋白(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白類)和兩性離子(例如，氨基酸，如甜菜堿、?；撬帷⒕彼?、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。所述另外的成分無疑不應(yīng)對本發(fā)明藥物制劑的整體穩(wěn)定性造成負面影響。
[0209]含有根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽的藥物組合物可以在多種部位施用于需要這種治療的患者，例如在局部部位，例如皮膚和粘膜部位，在旁路吸收部位，例如施用于動脈中、靜脈中、心臟中，和在涉及吸收的部位，例如施用于皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹內(nèi)。
[0210]在與局部炎癥有關(guān)的病癥的治療中，如在與燒傷有關(guān)的炎癥或者與皮膚有關(guān)的其他病癥的治療中，局部施用可以是特別的優(yōu)勢。因此，在一些實施方案中，施用是通過局部施用。
[0211]在一些具體的實施方案中，在與眼睛有關(guān)的病癥中，如角膜炎，如彌漫性板層角膜炎(diffuse lamellar keratitis, DLK),可以使用滴眼液。
[0212]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的向需要這種治療的患者的施用可以經(jīng)由多種施用途徑，例如，舌部、舌下、含服、口腔內(nèi)、口服、胃腸內(nèi)、鼻部、肺部例如通過細支氣管和肺泡或其組合、表皮、皮膚、經(jīng)皮、陰道、直腸、眼部，例如經(jīng)由結(jié)膜、輸尿管和胃腸外。
[0213]可以以多種劑型施用本發(fā)明的組合物，例如作為溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù)合型乳齊?、泡沫齊?、藥膏、糊齊?、硬膏、軟膏、片齊?、包衣片齊?、沖洗齊?、膠囊例如硬膠囊和軟膠囊、栓劑、直腸用膠囊、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣霧劑、吸人劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼用沖洗劑、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏、注射液、原位轉(zhuǎn)化溶液劑例如原位膠凝劑、原位沉降齊U、原位沉淀劑、原位結(jié)晶劑、輸注液、和植入物。
[0214]本發(fā)明的組合物可以進一步例如通過共價、疏水和靜電相互作用復(fù)合或連接至藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)，以便進一步增強VAR2CSA多肽的穩(wěn)定性、提高生物利用度、增大溶解度、減少不良作用、實現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的時辰療法和提高患者順應(yīng)性或其任何組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)的實例包括，但不限于，聚合物例如纖維素及衍生物、多糖例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯聚合物和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白例如白蛋白、凝膠例如熱膠凝體系，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的嵌段共聚物體系、膠束、脂質(zhì)體、微球、納米顆粒、病毒狀顆粒、細菌狀顆粒、液晶及其分散體、脂質(zhì)-水體系中相特性領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的L2相及其分散體、聚合膠束、復(fù)合型乳劑、自乳化、自微乳化、環(huán)糊精及其衍生物，以及樹枝狀大分子(dendrimer)。
[0215]本發(fā)明的組合物可以用于配制用于肺部施用VAR2CSA多肽的固體制劑、半固體制齊?、散劑和溶液劑，肺部施用使用例如定量吸入器、干粉吸入器和噴霧器，所有這些裝置都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
[0216]本發(fā)明的組合物尤其可用于配制受控釋放、持續(xù)釋放、延釋、阻釋和緩釋的藥物遞送系統(tǒng)。更具體地，但不限于，組合物可用于配制本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的腸胃外受控釋放系統(tǒng)和緩釋系統(tǒng)(兩種系統(tǒng)均導(dǎo)致施用次數(shù)減少許多倍)。甚至更優(yōu)選的是，受控釋放系統(tǒng)和緩釋系統(tǒng)經(jīng)皮下施用。在不限制本發(fā)明范圍下，可用的受控釋放系統(tǒng)和組合物的實例為水凝膠、油凝膠、液晶、聚合膠束、微球和納米顆粒。
[0217]制備可用于本發(fā)明組合物的受控釋放系統(tǒng)的方法包括但不限于:結(jié)晶、冷凝、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓勻漿化、包囊化、噴霧干燥、微膠囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以制備微球、擠壓和超臨界流體法。一般參考Handbook of PharmaceuticalControlled Release (藥物受受控釋放放手冊)(Wise, D.L., ed.Marcel Dekker, NewYork, 2000)和 Drug and the Pharmaceutical Sciences (藥物與藥物科學(xué))vol.99:Protein Formulat1n and Delivery (蛋白制劑與遞送)(MacNally, E.J.，ed.Marcel Dekker, New York, 2000)。
[0218]腸胃外施用可以通過注射器、任選筆形注射器經(jīng)皮下注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射來進行。備選地，腸胃外施用可以借助輸液泵進行。另一個可選方案為以下組合物:其可以是鼻用噴霧或肺部噴霧形式施用VAR2CSA多肽的溶液劑或混懸劑。作為又一個可選方案，含有本發(fā)明VAR2CSA多肽的藥物組合物還可以適用于經(jīng)皮施用，例如通過無針注射或貼劑(任選離子電滲貼劑)來進行，或經(jīng)粘膜例如含服施用。
[0219]術(shù)語“穩(wěn)定制劑”是指物理穩(wěn)定性增力口、化學(xué)穩(wěn)定性增加或物理和化學(xué)穩(wěn)定性增加的制劑。
[0220]如在本文中所使用的術(shù)語蛋白制劑的“物理穩(wěn)定性”是指由于蛋白暴露至熱-機械應(yīng)力和/或與失穩(wěn)的界面和表面(例如疏水表面和界面)的相互作用，所述蛋白形成蛋白的生物失活和/或不溶性聚集體的趨勢。在將裝于合適的容器(例如藥筒或小瓶)中的制劑于不同溫度下暴露于機械/物理應(yīng)力(例如攪拌)中達各種時期后，通過目視檢查和/或濁度測定評估水性蛋白制劑的物理穩(wěn)定性。制劑的目視檢查在黑暗背景下于聚焦強光中進行。制劑的濁度通過將濁度分級為例如O至3等級的目視評分來表征(未呈現(xiàn)混濁的制劑對應(yīng)于目視評分O，而在日光中呈現(xiàn)可視混濁的制劑對應(yīng)于目視評分3)。當(dāng)其在日光中呈現(xiàn)可視混濁時，將制劑分級為相對于蛋白聚集的物理不穩(wěn)定。備選地，可通過技術(shù)人員公知的簡易濁度測量來評估制劑的濁度。水性蛋白制劑的物理穩(wěn)定性還可通過使用蛋白構(gòu)象狀態(tài)的光譜劑或光譜探針來評估。探針優(yōu)選為優(yōu)先結(jié)合至蛋白的非天然構(gòu)象異構(gòu)體的小分子。蛋白結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個實例為硫磺素(th1flavin)T。硫磺素T為已廣泛用于檢測淀粉狀原纖維的熒光染料。在存在原纖維以及也可能的其它蛋白構(gòu)型下，當(dāng)結(jié)合至原纖維蛋白形式時硫磺素T在約450nm下產(chǎn)生新的激發(fā)極值并在約482nm下發(fā)射增強。未結(jié)合的硫磺素T在所述波長下基本無熒光。
[0221]其它小分子可用作蛋白結(jié)構(gòu)從天然狀態(tài)向非天然狀態(tài)變化的探針。例如優(yōu)先結(jié)合至蛋白的外露疏水片(hydrophobic patch)的“疏水片”探針。疏水片通常埋藏于處于其天然狀態(tài)的蛋白三級結(jié)構(gòu)之內(nèi)，但隨著蛋白開始解折疊或變性而暴露。這些小分子光譜探針的實例為芳族疏水染料，例如蒽、吖啶、菲咯啉等。其它光譜探針為金屬-氨基酸絡(luò)合物，例如疏水氨基酸(例如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸)的鈷金屬絡(luò)合物坐寸ο
[0222]如在本文中所使用的蛋白制劑的術(shù)語“化學(xué)穩(wěn)定性”是指蛋白結(jié)構(gòu)的化學(xué)共價變化，所述變化導(dǎo)致形成與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比具有潛在較小生物潛能和/或潛在增加的免疫原性的化學(xué)降解產(chǎn)物。根據(jù)天然蛋白的類型和性質(zhì)以及所述蛋白所暴露的環(huán)境，可形成各種化學(xué)降解產(chǎn)物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，幾乎不可能完全避免化學(xué)降解的消除，并且在儲存和使用蛋白制劑期間常常見到化學(xué)降解產(chǎn)物的量不斷增加。多數(shù)蛋白容易發(fā)生脫酰胺作用，其中谷氨酰胺酰或天冬酰胺酰殘基的側(cè)鏈酰胺基被水解而形成游離羧酸的過程。其它降解途徑涉及高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成，其中兩個或更多個蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫化物相互作用相互共價結(jié)合，導(dǎo)致形成共價結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物(Stability of Protein Pharmaceuticals (蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性)，Ahern.T.J.和Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。可以提及氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)作為化學(xué)降解的另一種變體?？赏ㄟ^在暴露至不同環(huán)境條件(可通常通過例如增加溫度來加速降解產(chǎn)物的形成)下之后的各個時間點測量化學(xué)降解產(chǎn)物的量，來評估蛋白制劑的化學(xué)穩(wěn)定性。通常通過利用各種色譜技術(shù)(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)根據(jù)分子大小和/或電荷，將降解產(chǎn)物分離來測量各種降解產(chǎn)物的量。
[0223]因此，如上文所概述，“穩(wěn)定化制劑”是指物理穩(wěn)定性增加、化學(xué)穩(wěn)定性增加或物理和化學(xué)穩(wěn)定性增加的制劑。通常，在使用和儲存(依照推薦的使用和儲存條件)期間制劑必須穩(wěn)定直至達到失效期。
[0224]在本發(fā)明的一些實施方案中，包含VAR2CSA多肽的藥物制劑對于超過6周的使用和超過3年的儲存是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的其它實施方案中，包含VAR2CSA多肽的藥物制劑對于超過4周的使用和超過3年的儲存是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，包含VAR2CSA多肽的藥物制劑對于超過4周的使用和超過兩年的儲存是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的再另一個實施方案中，包含VAR2CSA多肽的藥物制劑對于超過2周的使用和超過兩年的儲存是穩(wěn)定的。
[0225]使用VAR2CSA多肽及其綴合物的適應(yīng)證
[0226]VAR2CSA多肽或其綴合物可以用于大范圍與CSA的表達、如不適當(dāng)?shù)谋磉_有關(guān)的適應(yīng)證，如在各種癌癥中，如轉(zhuǎn)移癌，包括黑素瘤(melanomas)，如C32黑素瘤、肉瘤(sarcomas)、肺癌(lung carcinomas)、寡樹突細胞瘤(oligodendrocytomas)、人腦腫瘤，包括膠質(zhì)瘤(gl1mas)、白血病(leukaemia),如成淋巴細胞性白血病(lymphoblasticleukemia)和急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia)、和癌(carcinoma),如鱗狀細胞癌(squamous cell carcinomas)和乳腺癌(breast carcinomas)、腎細胞癌(renalcell carcinomas)、軟骨肉瘤(chondrosarcomas)、和膜腺細胞癌(pancreatic cellcarcinomas) JAR2CSA多肽或其綴合物還可以用于癌干細胞并且因此在發(fā)展為癌癥之前靶向細胞。與CSA的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)的其他病癥是軟骨和/或疤痕組織發(fā)展的病癥。
[0227]VAR2CSA多肽或其綴合物可以用于鑒別、示蹤和靶向體內(nèi)遠距離的微轉(zhuǎn)移(micro-metastasis)?；旧先恐饕哪[瘤,包括造血系統(tǒng)的癌癥,具有發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病的可能性，這與患者的差的治療效果高度相關(guān)。
[0228]VAR2CSA多肽或其綴合物可以用于將防止細胞外CSPG降解或修復(fù)細胞外CSPG的化合物，如生長激素、抗炎化合物或蛋白質(zhì)抑制劑，靶向至軟骨組織、關(guān)節(jié)、和神經(jīng)組織。
[0229]VAR2CSA多肽或其綴合物可以用于靶向提高細胞外CSPG的降解或防止其產(chǎn)生的化合物，如軟骨素酶ABC，其切斷CSPG分子的蛋白核心的糖鏈。木糖苷(xylocide)，其減少CSPG的產(chǎn)生，或者抑制對CSPG產(chǎn)生重要的酶的藥物如軟骨素合酶或軟骨素聚合因子(如4-氟代-葡糖胺、對硝基苯基-β -D-木糖苷、4-甲基-傘形酮酰-β -D-吡喃木糖苷)，從而破壞神經(jīng)組織。
[0230]與核酸綴合的VAR2CSA可以用于移除編碼CSA呈遞分子的RNA，核酸包括小干擾RNA(siRNA)、反義肽核酸(PNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)和鎖核酸(LNA?)。
[0231]VAR2CSA多肽的綴合物
[0232]治療或診斷效應(yīng)部分，如細胞毒性和檢測部分
[0233]在本發(fā)明的一些方面中，提供如在本公開內(nèi)容中定義的VAR2CSA多肽、融合蛋白或綴合物，還包含治療效應(yīng)部分，如抗炎藥、類固醇激素、細胞毒性或檢測劑或部分，如有機分子、放射性核素、或細胞毒性酶。
[0234]在本發(fā)明的一些方面中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或VAR2CSA融合蛋白包含如由選自SEQ ID NO 57-59、和71的一個或多個序列或其功能變體或片段所定義的序列。
[0235]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或VAR2CSA融合蛋白可以在末端，如蛋白序列(如由SEQ ID Ν0:57所定義的序列)的N末端，包含蛋白酶抑制劑，如堿性胰蛋白酶抑制劑(BPTI)。
[0236]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽或VAR2CSA融合蛋白可以包含毒素蛋白序列，如由選自SEQ ID NO 58、59和71的一個或多個序列所定義的序列，如被優(yōu)化以使免疫原性變低的毒素蛋白序列，如由SEQ ID Ν0:59所定義的序列。在一些實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA融合蛋白中存在SEQ ID NO 58或59的信號序列KDEL，并且在一些實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA融合蛋白中不存在SEQ ID NO 58或59的信號序列KDEL。因此，對于根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體來說，信號序列KDEL可以是任選的。
[0237]可以與根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽融合或綴合的細胞毒性部分的非限制性實例是選自以下的適用于癌癥治療的化療藥物:剌孢霉素(calicheamycin)、順鉬(cisplatin)、阿霉素(adriamycin)、耳他汀(auristatin)、多柔比星(doxorubicin)、美坦生類化合物(maytansinoid)、紫杉醇(taxol)、海鞘素(ecteinascidin)、格爾德霉素(geldanamycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)及其衍生物、及其組合等。與VAR2CSA多肽融合的細胞毒性蛋白的實例是假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin) A、白喉毒素(diphtheria toxin)、菌麻毒蛋白毒素(ricin toxin)、美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweedantiviral protein)、肥阜草毒蛋白(saporin)、白樹毒蛋白(gelonin)及其變體。
[0238]已經(jīng)描述了用于癌癥的白蛋白與多柔比星(doxorubicin)的綴合物(Kratz等人，J Med Chem 45: 5523-33，2002)以及用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)的甲氨蝶呤(metotrexate) (Wunder 等人，J Immunol 170:4793-4801，2003) ?也已經(jīng)描述了增加反應(yīng)性氧物種的化合物，即蓽發(fā)酰胺(piperlongumine) (Raj等人，Nature(自然)475:231-234，2011)。而且，可以使用誘導(dǎo)細胞凋亡等從而提供靶向細胞毒性(即腫瘤細胞的殺傷)的治療性酶、試劑。
[0239]通過誘導(dǎo)補體依賴性細胞毒性(CDC)介導(dǎo)的溶解(lysis)、抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)介導(dǎo)的溶解、細胞凋亡、同型粘附、和/或吞嗷作用(phagocytosis)，如通過誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的溶解和/或ADCC介導(dǎo)的溶解，在本文中所描述的VAR2CSA多肽可以介導(dǎo)細胞的殺傷。在本文中所描述的VAR2CSA多肽可以與免疫系統(tǒng)的組分相互作用，優(yōu)選通過ADCC或CDC。然而，本發(fā)明的VAR2CSA多肽還可以簡單地通過與細胞表面上的腫瘤抗原結(jié)合而發(fā)揮作用，因此，例如阻斷細胞的增殖。
[0240]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“治療效應(yīng)部分”意指可以發(fā)揮治療效果的任何分子。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，治療效應(yīng)分子被選擇性地引導(dǎo)至表達CSA的細胞，并且包括抗癌藥、放射性同位素、毒素、細胞生長抑制或細胞溶解藥物等?？拱┧幇?，例如，蒽環(huán)類(多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone))，鉬基和非鉬基焼基化試劑(順鉬(cisplatin)、卡鉬(carboplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、氮芥(mechlorethamine)、環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、洛莫司汀(1mustine)、丙卡巴餅(procarbazine))，長春花屬生物堿類(Vinca alkaloid)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine))，紫杉焼類(taxane)(紫杉醇(taxol)和西紫杉醇(decetaxel))，拓撲異構(gòu)酶I抑制劑(topoisomerase I inhibitor)(喜樹減(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan))，拓撲異構(gòu)酶II抑制劑(topoisomerase II inhibitor)(安卩丫卩定(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、憐酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)和美國鬼臼屬植物(Mayapple)(盾葉鬼臼(Podophyllum peltatum))根中自然存在的其他生物堿衍生物，非蒽環(huán)細胞毒性抗生素(放線菌素D(dactinomycin)、博來霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)和絲裂霉素(mitomycin)),抗類固醇類(ant1-steroid)(如氨魯米特(aminoglutethimide)),核苷類似物(阿糖胞苷(cytarabidine)、氟尿喃唳(f Iuorouracil)和氟尿B密P定(mercaptopurine)),抗代謝藥(antimetabolite)(甲氨蝶呤(methotrexate)和硫鳥嘌呤(th1guanine)), 二氯二苯基三氯乙燒類似物(如米托坦(mitotane)),以及誘導(dǎo)反應(yīng)性氧物種(ROS)的化合物(包括但不限于蓽發(fā)酰胺(piperlongumine)和異硫氰酸β-苯基乙酷)。其他抗癌藥描述于，例如，Goodman和Gilman, “Pharmacological Basis ofTherapeutics (治療的藥理學(xué)基礎(chǔ))”，第8版，I99O1McGraw-Hill, Inc.，尤其是第52章(Antineoplastic Agents (抗腫瘤藥)(Paul Calabresi 和 Bruce A.Chabner)。毒素可以是蛋白質(zhì)，如美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、霍亂毒素(cholera toxin)、百日咳毒素(pertussis toxin)、蓖麻毒蛋白(ricin)、白樹毒蛋白(gelonin)、相思豆毒蛋白(abrin)、白喉外毒素(diphtheria exotoxin)或假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)。毒素殘基還可以是高能發(fā)射放射性核素如鈷-60。VAR2CSA多肽可以與細胞穿透肽(CPP) —起使用，以促進VAR2CSA多肽和任何與其連接的分子橫跨細胞質(zhì)膜的運輸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細胞穿透肽具有許多在藥物中作為在不同疾病的治療中的藥物遞送劑(包括癌抑制劑和病毒抑制劑)的用途。CPP的實例包括但不限于:來自人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)的反式激活轉(zhuǎn)錄活化劑(Tat) ；pep-l (Char1tTM)；R8、偶氮-R8 ;SMoC。(Okuyama M 等人，Nat Methods.2007 Feb ；4(2): 153-9M ；Soane L 和Fiskum GJ Neurochem.20050ct ；95(1):230-43 ；Loudet A 等人，0rg B1mol Chem.2008Dec21 ；6(24):4516-22)。
[0241]放射性核素
[0242]與聚氨基聚羧酸酯螯合劑偶聯(lián)的根據(jù)在本文中所描述的方面的VAR2CSA多肽、融合蛋白或綴合物可以用于提供由放射性螯合物組成的放射性標記的多肽，所述放射性螯合物具有與螯合劑偶聯(lián)的VAR2CSA多肽、融合蛋白或綴合物以及適用于醫(yī)學(xué)成像的放射性核素，所述放射性核素選自由下列各項組成的組:61CU、64CU、66Ga、67Ga、68Ga、n°In、mln、44SC、89Zr和86Y,或者具有適用于治療的放射性核素，所述放射性核素選自由下列各項組成的組:225Ac、212B1、213B1、67CU、166H0、mLU、212Pb、149Pm、153Sm、227Th 和 9°Y，其中放射性核素與 VAR2CSA 多肽復(fù)合，如通過螯合劑。
[0243]因此，根據(jù)在本文中所描述的方面的VAR2CSA多肽、融合蛋白或綴合物可以用于包括實體瘤或轉(zhuǎn)移在內(nèi)的癌細胞的放射成像，如在黑素瘤患者中。
[0244]在其實施方案中，也可以使用通常所說的間接標記使多肽被非金屬放射性同位素放射性標記。因此，對于用例如18F、76Br、不同的碘同位素和211At標記來說，中間“連接分子”用于標記。這種連接分子應(yīng)該含有兩個功能部分，一個提供快速且有效的放射性標記，而另一個實現(xiàn)快速且有效的與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)，例如與胺基偶聯(lián)，或者優(yōu)選與獨特半胱氨酸的硫醇基偶聯(lián)。例如，一個馬來酰亞胺基與硫基反應(yīng)形成一個穩(wěn)定的硫醚鍵?！斑B接分子”可以首先與放射性標記反應(yīng)，并且隨后與蛋白質(zhì)的巰基或硒代巰基(selenoth1l group)反應(yīng)。
[0245]其他備選的檢測部分包括熒光團或熒光染料，如選自下列各項的任一個:羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、級聯(lián)藍、太平洋藍、太平洋橙、熒光黃(Lucifer yellow),NBD, R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5 綴合物、PE_Cy7 綴合物、紅 613、PerCP, TruRed, FluorX、熒光素、B0DIPY-FL、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明(Lissamine Rhodamine)B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(allophycocyanin, APC)、和 APC_Cy7 綴合物。
[0246]此類具有包含熒光團或熒光染料的檢測部分的綴合物可以用于癌細胞或腫瘤的成像。
[0247]類固醇激素或抗炎藥
[0248]在根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案中，VAR2CSA多肽與包括類固醇激素在內(nèi)的抗炎藥三雙口 ο
[0249]已知軟骨和疤痕組織含有大量的CSPG。因此，可能吸引人的是，向此類組織引導(dǎo)抗炎藥如非類固醇抗炎化合物、疾病調(diào)節(jié)抗風(fēng)濕藥物(如甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azath1prine)、柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine)、環(huán)孢素(ciclosporine)、青霉胺(penniciIIamine)、來氟米特(Ieflunomide)、或金)、生物抗風(fēng)濕藥物(如腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor)抑制劑、白介素(interleukin)-1-受體拮抗劑、0)20-抗體、胰島素生長因子I)以及類固醇激素或備選的化合物。
[0250]在根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案中，VAR2CSA多肽與下列各項綴合:抗炎藥如非類固醇抗炎化合物、疾病調(diào)節(jié)抗風(fēng)濕藥物(如甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azath1prine)、柳氮橫胺卩比唳(sulfasalazine)、環(huán)抱素(ciclosporine)、青霉胺(pennicillamine)、來氟米特(Ieflunomide)、或金)、生物抗風(fēng)濕藥物(如腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor)抑制劑、白介素(interleukin)-1-受體拮抗劑、0)20-抗體、胰島素生長因子I)以及類固醇激素或備選的化合物。
[0251]與CSPG4的綴合物
[0252]在根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案中，VAR2CSA多肽與CSPG4綴合。
[0253]據(jù)推測，可以使用VAR2CSA多肽與CSPG4的綴合物作為免疫劑(immunizat1nagent)。出于這種用途的目的,據(jù)推測，VAR2CSA多肽可以發(fā)揮作為伴侶蛋白(chaperone)的功能，伴侶蛋白能夠促進CSPG4以將提供抗體的構(gòu)象向T細胞展現(xiàn)。因此，據(jù)推測，與CSPG4綴合的VAR2CSA多肽可以用于疫苗中。
[0254]如在本文中所使用的術(shù)語“CSPG4”是指由Uniprot鑒別為Q6UVK1 (CSPG4_HUMAN)的2322個氨基酸的全長人硫酸軟骨素蛋白聚糖4以及其變體、功能片段、和直向同源物(ortholog)。CSPG4也可以被稱為黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、高分子量黑素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)抗原2 (NG2)。
[0255]⑶44或其他蛋白聚糖的靶向
[0256]出于VAR2CSA多肽的綴合物在癌癥適應(yīng)證治療中用途的目的，據(jù)推測，根據(jù)本發(fā)明的綴合物可以用于不僅靶向表達CSPG4的腫瘤細胞而且還靶向表達CD44的細胞，如癌干細胞、和表達例示出的但不限于表I的那些的蛋白聚糖的細胞。這種靶向是通過在CD44抗原上結(jié)合CSA介導(dǎo)的。因此，根據(jù)本發(fā)明的綴合物可以用于靶向CSPG4陰性而CD44陽性的細胞。這可以用作對表達CSPG4的腫瘤細胞的靶向的備選方案，或者與表達CSPG4的腫瘤細胞的靶向同時使用。
[0257]在通過結(jié)合⑶44、和/或CSPG4、和/或其他蛋白聚糖(如表I中的那些)分離癌干細胞中的用途。
[0258]根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽的特異性和高親和力結(jié)合，如以VAR2CSA多肽的綴合物的形式，可以用于分離干細胞，如表達CD44和/或CSPG4的癌干細胞。
[0259]在通過結(jié)合含CSA蛋白聚糖分離或檢測循環(huán)腫瘤細胞(CTC)中的用途
[0260]根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽的特異性和高親和力結(jié)合，如以VAR2CSA多肽的綴合物的形式，可以用于分離或檢測上皮和非上皮來源的CTC，其表達一種或多種含CSA的蛋白聚糖，如表I中描述的那些。
[0261]抗獨特型抗體(ant1-1d1typicantibody)
[0262]作為VAR2CSA多肽用途的備選或補充，還可以使用抗獨特型抗體或者甚至模仿VAR2CSA的模擬表位。用于制備模仿抗原表位的抗獨特型抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并且提供結(jié)合VAR2CSA多肽的第一單克隆抗體接著隨后制備結(jié)合所述第一抗體的獨特型的第二抗體?？梢詮尼槍μ禺愋越Y(jié)合VAR2CSA多肽的抗體的噬菌體展示中篩選的隨機肽文庫中分離模擬表位。
[0263]還可以通過用抑制性宿主或患者衍生的針對VAR2CSA的抗體免疫來制備抗獨特型抗體，從而獲得并篩選多克隆和/或單克隆抗體，如針對并抑制宿主衍生的抗體的人抗體。盡管VAR2CSA通常是不大可能導(dǎo)致患者中自身免疫反應(yīng)的進化的改進的瘧疾蛋白，在一段時間治療之后不能排除這種免疫反應(yīng)。之后可以使用與VAR2CSA多肽組合使用的或者作為VAR2CSA多肽的備選方案的抗獨特型抗體。
[0264]本發(fā)明的具體實施方案
[0265]如在本文中所描述的，本發(fā)明涉及一種VAR2CSA的分離蛋白片段，所述片段由以下的連續(xù)氨基酸序列組成:
[0266]a) IDl 和
[0267]b)DBL2Xb，以及任選的
[0268]c) ID2a。
[0269]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA的分離蛋白片段包含ID2a。
[0270]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA的分離蛋白片段不包含ID2a。
[0271]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的VAR2CSA蛋白片段還在VAR2CSA蛋白片段的序列的N或C端中或序列之內(nèi)包含不多于100個氨基酸，如不多于90個氨基酸，如不多于80個氨基酸，如不多于70個氨基酸，如不多于60個氨基酸，如不多于50個氨基酸，如不多于40個氨基酸，如不多于30個氨基酸，如不多于20個氨基酸，如不多于18個氨基酸，如不多于16個氨基酸，如不多于14個氨基酸，如不多于12個氨基酸，如不多于10個氨基酸，如不多于8個氨基酸，如不多于6個氨基酸，如不多于4個氨基酸，如不多于2個氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列來源于如在本文中所定義的VAR2CSA多肽的任何部分，其不是IDl、DBL2Xb、或ID2a的一部分。
[0272]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的VAR2CSA蛋白片段還在VAR2CSA蛋白片段的序列的N或C端中或序列之內(nèi)包含不多于100個氨基酸，如不多于90個氨基酸，如不多于80個氨基酸，如不多于70個氨基酸，如不多于60個氨基酸，如不多于50個氨基酸，如不多于40個氨基酸，如不多于30個氨基酸，如不多于20個氨基酸，如不多于18個氨基酸，如不多于16個氨基酸，如不多于14個氨基酸，如不多于12個氨基酸，如不多于10個氨基酸，如不多于8個氨基酸，如不多于6個氨基酸，如不多于4個氨基酸，如不多于2個氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列不來源于如在本文中所定義的VAR2CSA多肽的任何部分。
[0273]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段結(jié)合在蛋白聚糖(CSPG)上的硫酸軟骨素A(CSA)，并且以Kd表示而測量的親和力為低于ΙΟΟηΜ，如低于80nM，如低于70nM，如低于60nM，如低于50nM，如低于40nM，如低于30nM，如低于26nM，如低于24nM，如低于22nM，如低于20nM，如低于18nM，如低于16nM，如低于14nM，如低于12nM，如低于ΙΟηΜ，如低于9nM，如低于8nM,如低于7nM,如低于6nM、或低于4nM。
[0274]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段包含與下列各項中的任一個氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的1-577,SEQ ID NO:3的1-592、SEQ ID NO:4 的 1-579、SEQ ID NO:5 的 1-576、SEQ ID NO: 10 的 1-586、SEQ ID NO: 11 的1-579、SEQ ID NO:29 的 1-565、SEQ ID NO:34 的 1-584、SEQ ID NO:36 的 1-569、SEQ IDNO:37 的 1-575、SEQ ID NO:38 的 1-592、SEQ ID NO:41 的 1-603、SEQ ID NO:43 的 1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ ID NO:53 的1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
[0275]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段包含與下列各項中的一個氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的578-640、SEQ ID NO: 3的593-656、SEQ ID NO:4 的 580-643、SEQ ID NO:5 的 577-640、SEQ ID NO: 10 的 587-650、SEQ ID NO: 11 的 580-643、SEQ IDNO:29 的 566-628、SEQ ID NO:34 的 585-647、SEQ IDNO:36 的 570-632、SEQ ID NO:37 的 576-639、SEQ ID NO:38 的 593-655、SEQ ID NO:41 的604-667、SEQ ID NO:43 的 589-652、SEQ ID NO:44 的 566-628、SEQ IDNO:45 的 590-653、SEQ ID NO:48 的 574-637、SEQ ID NO: 53 的 584-646、或 SEQ ID NO: 54 的 570-632。
[0276]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段包含與下列各項中的一個氨基酸序列具有至少 70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID N0:2、6、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、35、39、40、42、46、47、49、50、51、或 52。
[0277]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段由與下列各項中的任一個氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列組成:SEQ ID NO:1的1-577、SEQ ID N0:3的1-592、SEQ ID NO:4 的 1_579、SEQ ID NO: 5 的 1_576、SEQ ID NO: 10 的 1-586、SEQ ID NO: 11的 1-579,SEQ ID NO:29 的 1-565,SEQ ID NO:34 的 1-584,SEQ ID NO:36 的 1-569,SEQ IDNO:37 的 1-575、SEQ ID NO:38 的 1-592、SEQ ID NO:41 的 1-603、SEQ ID NO:43 的 1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ ID NO:53 的1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
[0278]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段由選自由下列各項組成的列表的氨基酸序列組成:SEQ ID N0:l、3-5、10、ll、29、34、36-38、41、43-45、48、53、和 54。
[0279]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段由以下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列長度為小于700個氨基酸,如小于690個氨基酸,如小于680個氨基酸,如小于670個氨基酸，如小于660個氨基酸，如小于650個氨基酸，如小于640個氨基酸，如小于630個氨基酸，如小于620個氨基酸，如小于610個氨基酸，如小于600個氨基酸，如小于590個氨基酸，如小于580個氨基酸，如小于570個氨基酸。
[0280]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段是基本純的。
[0281]在一些實施方案中，在SDS-PAGE上在非還原條件下，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段具有小于約10kDa的分子量。
[0282]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段是重組蛋白。
[0283]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段是非糖基化的。
[0284]本發(fā)明進一步涉及如在本文中所定義的蛋白片段、根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽、或綴合物，其用于治療與涉及CSA的表達如不適當(dāng)表達的病癥相關(guān)的任何適應(yīng)證，如在癌癥、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、和神經(jīng)損傷后的愈合、軟骨修復(fù)、傷口愈合中，以及在銀屑病中。
[0285]在一些實施方案中，VAR2CSA多肽、綴合物或融合蛋白是或包含根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA蛋白片段。
[0286]因此，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽、綴合物或融合蛋白可以包含與鑒別為SEQ IDNO: 1-75中的任一序列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
[0287]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的VAR2CSA多肽由選自SEQ ID NO:60-70.72-75的氨基酸序列組成。
[0288]在一些實施方案中，癌癥選自皮膚、眼或結(jié)膜黑素瘤。癌(carcinoma)(三陰性乳腺癌(triple negative breast carcinoma)和化生性乳腺癌(metaplastic breastcarcinoma)、膜腺癌(pancreatic carcinoma)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)、月干細胞癌(hepatocellular carcinoma)、月市癌(lungcarcinoma)、結(jié)腸癌(colon carcinoma)、前列腺癌(prostate carcinoma)、宮頸癌(cervix carcinoma)、睪丸癌(testis carcinoma)、基底細胞皮膚癌(basal cell skincarcinoma)、透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma)、角化頭頸鱗狀細胞癌(kreatinized head and neck squamous cell carcinoma)、皮膚鱗狀細胞癌(skinsquamous cell carcinoma)、夕卜陰角化鱗狀細胞癌(vulvar kreatinized squamous cellcarcinoma)和外陰基底細胞癌(vulvar basal cell carcinoma)),肉瘤(sarcoma)(乳腺脂肪肉瘤(breast liposarcoma)、纖維肉瘤(fibrosarcoma)、去分化軟骨和脂肪肉瘤(dedifferentiated chondro-and liposarcoma)、平滑肌肉瘤(le1myosarcoma)、月旨肪肉瘤(liposarcoma)、粘液性脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)、子宮體平滑肌肉瘤(uterinecorpus le1myosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤因肉瘤(ewing sarcoma)、和橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma))，造血系統(tǒng)癌(hematopoietic cancer)(慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphatic leukaemia，CLL)、急性淋巴細胞白血病(acute lymphaticleukaemia, ALL)、急性髓細胞白血病(acute myeloid leukaemia AML)、B 細胞、T 細胞和大顆粒狀淋巴瘤(large granular lymphoma))，神經(jīng)上皮組織的腫瘤，如星形細胞瘤(astrocytoma)(多形性黃色星形細胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma)、纖維型星形細胞瘤(fibrillary astrocytoma)、間變型星形細胞瘤(anaplasticastrocytoma)、多形性膠質(zhì)母細胞瘤(gl1blastoma multiforme))、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(oligodrendrogl1ma)、室管膜瘤(ependymoma)、脈絡(luò)叢腫瘤(choroid plexus turmor)、寡星形細胞瘤(oligoastrocytoma)、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(gl1sarcoma)、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤(gangl1gl1ma)、視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma)、神經(jīng)細胞瘤(neurocytoma)、神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma)(嗅神經(jīng)母細胞瘤(esthes1neuroblastoma)和神經(jīng)節(jié)母細胞瘤(gangl1neuroblastoma))、髓母細胞瘤(medul1blastoma)和非典型畸胎樣橫紋肌樣腫瘤(atypical teratoid rhabdoid tumor)，以及任何其他表達CSA的癌癥亞型。
[0289]在一些實施方案中，所述癌癥選自所有表達CSA的惡性疾病，包括癌(carcinoma)(包括但不限于乳腺癌(breast carcinoma)、胰腺癌(pancreatic carcinoma)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)、月干細胞癌(hepatocellularcarcinoma)、月市癌(lung carcinoma)、結(jié)腸癌(colon carcinoma)、前列腺癌(prostatecarcinoma)、宮頸癌(cervix carcinoma)、睪丸癌(testis carcinoma)、基底細胞皮膚癌(basal cell skin carcinoma)、透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma)、頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)、皮膚鱗狀細胞癌(skinsquamous cell carcinoma)、夕卜陰角化鱗狀細胞癌(vulvar kreatinized squamous cellcarcinoma)和外陰基底細胞癌(vulvar basal cell carcinoma)),肉瘤(包括但不限于纖維肉瘤(fibrosarcoma)、去分化軟骨和脂肪肉瘤(dedifferentiated chondro-andliposarcoma)、平滑肌肉瘤(le1myosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、粘液性脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)、子宮體平滑肌肉瘤(uterine corpus le1myosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤因肉瘤(ewing sarcoma)和橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)、孤立性纖維瘤(solitary fibrous tumor))，造血系統(tǒng)癌(包括但不限于慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓細胞白血病(AML)、B細胞、T細胞和大顆粒狀淋巴瘤)，神經(jīng)上皮組織的腫瘤，如但不限于星形細胞瘤(astrocytoma)(多形性黃色星形細胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma)、纖維型星形細胞瘤(fibrillary astrocytoma)、間變型星形細胞瘤(anaplasticastrocytoma)、多形性膠質(zhì)母細胞瘤(gl1blastoma multiforme))、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(oligodrendrogl1ma)、室管膜瘤(ependymoma)、脈絡(luò)叢腫瘤(choroid plexus turmor)、寡星形細胞瘤(oligoastrocytoma)、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(gl1sarcoma)、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤(gangl1gl1ma)、視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma)、神經(jīng)細胞瘤(neurocytoma)、神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma)(嗅神經(jīng)母細胞瘤(esthes1neuroblastoma)和神經(jīng)節(jié)母細胞瘤(gangl1neuroblastoma))、髓母細胞瘤(medul1blastoma)、非典型畸胎樣橫紋肌樣腫瘤(atypical teratoid rhabdoid tumor)和所有類型的神經(jīng)內(nèi)分泌癌(neuroendocrinecancer)0
[0290]序列，包括VAR2CSA多肽的序列:
[0291]> fcr3 745個氨基酸| 640aa ;下劃線的序列對應(yīng)于FCR3的IDl結(jié)構(gòu)域，粗體的序列對應(yīng)于FCR3的DBL2Xb結(jié)構(gòu)域。其余的序列是ID2a(SEQ ID NO:1)
[0292]NYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVGQAQTSGPSSNKTCITHS
SIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQK
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[0293]> gi |254952610|gb|ACT97135.1 |VAR2CSA[惡性瘧原蟲]|341aa(SEQ ID NO:2)
[0294]KCDKCKSGTSRSRKIWTWRKSSGNKEGLQEEYANTIGLSPRTQLLYLGNLRKLENVCEDVTDINFDTKEKFLAGCLIAAFHEGKNLKKRYLEKKKGDNNSKLCKDLKYSFADYGDLIKGTSIWDNDFTKDLELNLQQIFGKLFRKYIKKKNISTEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWLAMKHGAGMNSTTCSCSGDSSSGENQTNSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVEHFCEQRQAKVKDVITNCNSCKESGGTCNSDCEKKCKNKCDAYKTFIEDCKGVGGTGTAGSSWVKRWYQIY
MRYSKYIEDAKRNRKAGTKSCGTSSTTNVSVSTDENKCVQS-
[0295]> M24 745 個氨基酸 |656aa(SEQ ID NO:3)
[0296]
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GVKETKLPKKLNSPKLD
[0297]> KMWII 745 個氨基酸 |643aa(SEQ ID NO:4)
[0298]
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[0299]> 1248 74δ 個氨基酸 |640aa(SEQ ID NO:5)
[0300]
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[0301]> gi |254952618|gb|ACT97139.1 |VAR2CSA[惡性瘧原蟲]|358aa(SEQ ID NO:6)
[0302]KCEKCKSEQSKKNNNIWIWRKFPGNGEGLQKEYANTIGLPPRTHSLYLGNLPKLENVCKDVKDINFDTKEKFLAGCLIAAFHEGKNLKTTYPQNKNADNNSKLCKDLKYSFADYGDLIKGTSIWDNDFTKDLELNLQKIFGKLFRKYIKKNIASDENTLYSSLDELRESffffNTNKKYIWLAMKHGAEMNSTMCNGDGSVTGSSDSGSTTCS⑶NGSISCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVEHFCKQRQEKVKPVIENCKSCKNTSGERIIGGTCGSDCEKKCKGECDAYKKFIEECKGGGGGTGTAGSPWSKRWDQIYKRYSKYIEDAKRNRKAGTKSCGPSSTTNAAASTTESKCVQS
[0303]> gi |254952592|gb|ACT97126.1 |VAR2CSA[惡性瘧原蟲]|333aa(SEQ ID NO:7)
[0304]KCDKCKSEQSKKNNKNWIWKQFPGNGEGLQKEYANTTGLPPRTHSLYLGNLPKLENVCKGVTDINFDTKEKFLAGCLIAAFHEGKNLKTSHEKKKGDNGKKLCKDLKYSFADY⑶LIKGTSIWDNDFTKDLELNLQQIFGKLFRKYIKKNISAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWLAMKHGTTCSSGS⑶NGDGSVTGSGSSCDDMPTTDFIPQYLRFLQEffVEHFCKQRQEKVNAVITNCKSCKESGGTCNSDCEKKCKDECEKYKKFIEECRTAADGTAGSSWSKRWDQIYKMYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAENKCVQS
[0305]> gi I 90193467 | gb | ABD92329.1 紅細胞膜蛋白 I [惡性瘧原蟲]I 269aa (SEQ IDNO:8)
[0306]DYIKDDPYSKEYTTKLSFILNSSDANTSSGETANHNDEACNCNESEIASVEQASISDRSSQKAYITHSSIKTNKKKVCKYVKLGINNNDKVLRVCVIEDTSLSGVENCCFKDLLGILQENCSDNKRGSSFNDSCNNNNEEACQKKLEKVLASLTNGYKCEKCKSGTSRSKKKWIWKKSSGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCKGVTDINFDTKEKFLAGCLIAAFHEGKNLKPSHQNKNDDNNSKLCKDLKYSFADY
[0307]> gi |254952616|gb|ACT97138.1 |VAR2CSA[惡性瘧原蟲]|333aa(SEQ ID NO:9)
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[0309]> hb31 745 個氨基酸 |650aa(SEQ ID NO:10)
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[0311]> hb32 745 個氨基酸 |643aa(SEQ ID NO:11)
[0312]
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[0373]>gi I 254952634 |gb IACT97147.11VAR2CSA [惡性瘧原蟲]|348aa(SEQ ID NO:42)
[0374]KCDKCKSEQSKKNNKNWIWKKSSGNEKGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVVCLDEKEGKTQELKNIRTNS ELLKEWIIAAFHEGKNLKTSHEKKKGDNNSKLCKDLKYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFRKYI KKNIASDENTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWLAMKHGAGMNSTTCSSGSGSTTCSSGSGSTTCSSGS⑶SCDDMPTI DLIPQYLRFLQEWVEHFCKQRQEKVNAVIKNCNSCKESGGTCNGECKTECKNKCEAYKTFIEEFCTADGGTSGSPWS KRWDQIYKMYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGPSSTTNVSVSTDENKCVQS
[0375]> ghanal 745 個氨基酸 |652aa(SEQ ID NO:43)
[0376]
CNTHSSIKANKKKVCKHVKLGVRENDKDLKICVIEHTSLSGVENCCCQDFLRILQENCSDNKS
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[0377]> VlSl 745 個氨基酸 |628aa(SEQ ID NO:44)
[0378]
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[0379]> rajll6_var25 745 個氨基酸 |653aa(SEQ ID NO:45)
[0380]DYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDTENASETPSKYYDiACNPNESElASVEQAQTSG PSSNKTCITHSSI ICTNKKKECKDVKLGVRiNDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCFKDLLGILQENCSDNKRGSssndscnnnneeaceknldealasltngykcdkcksgtstvnkkwtwrkssgneeglqkeyaNTIGLPPRTQSLCLVCLHEKeGKTKHKTISTNSELLKEWIIAAFHEGKNLKTSHEKKNDDNGKKLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQKAFGKLFRKYIKKNNTAEQDTSYSSLDEL
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[0381]> gi |31323048|gb|AAP37940.1 |var2csa[惡性瘧原蟲]|490aa(SEQ ID NO:46)
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[0383]> gi|254952620|gb|ACT97140.l|VAR2CSA[惡性瘧原蟲]|335aa(SEQ ID NO:47)
[0384]KCEKCKSGTSTVNNKWIWRKSSGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCKGVTDIIYDTKEKFLSGCLIAAFHEGKNLKTTYLEKKNDDNGKKLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQKIFGKLFRKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWIAMKHGAGMNGTTCSSGS⑶SSNDIPTTDFIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKPVIENCNSCKESGGTCNGECKTKCKVACDAYKKFIDGTGSGGGSRPTGIAGSSWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGPSSITNVSVSTDENKCVQS
[0385]> T2C6 745 個氨基酸 |637aa(SEQ ID NO:48)
[0386]
NYIKDDPYSKEYVTKLSFIPNSSDANTSSEKIQKNNDEVCNPNESGISSVEQAQTSDPSSNKT
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[0387]> gi|254952632|gb|ACT97146.l|VAR2CSA[惡性瘧原蟲]|330aa(SEQ ID NO:49)
[0388]KCDKCKSEQSKKNNNKWIWRKFPGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVCLHEKEGKTQHKTISTNSELLKEffIIAAFHEGKNLKTTYLEKKNAENKKKLCKALKYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQKIFGKLFRKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAGMNGTMCNADGSVTGSGSSCDDMPTTDFIPQYLRFLQEWVEHFCKQRQAKVKDVIENCKSCKESGNKCKTECKNKCDAYKTFIEECGTAVGGTAGSSWVKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTAENKCVQS
[0389]> gi I 90193487 | gb | ABD92339.1 紅細胞膜蛋白 I [惡性瘧原蟲]I 269aa(SEQ IDNO:50)
[0390]NYIKDDPYSKEYVTKLSFILNSSDAENASETPSKYYDEACNCNESGISSVEQASISDRSSQKACNTHSFIGANKKKVCKHVKLGVRENDKDLKICVIEDDSLRGVENCCFKDFLRMLQEPRIDKNQRGSSSNDSCNNNNEEACEKNLDEALASLHNGYKNQKCKSEQSKKNNNKWIWKKSSGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVCLHEKEGKTQHKTISTNSELLKEffIIDAFHEGKNLKTTYLEKKKGDNGKKLCKALKYSFADY
[0391]> gi|254952646|gb|ACT97153.l|VAR2CSA[惡性瘧原蟲]|347aa(SEQ ID NO:51)
[0392]KCDKCKSEQSKKNNKNWTWKKSSGKEGGLQKEYANTIALPPRTQSLCLVVCLHEKEGKTQHKTISTNSELLKEWIIDAFHEGKNLKTTYLEKQNADNGKKNADNNSKLCKDLKYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQQIFGKLFRKYIKKNIASDENTLYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNGTTCSSGS⑶SSSGENQTNSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVEHFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGGTCNSDCKTKCKGECEKYKKFIEKCKGGGTEGTSGSSWVKRWYQIYMRYSKYIEDAKRNRKAGTKSCGTSSGANSGVTTTESKCVQS
[0393]> gi I 90193485 | gb | ABD92338.1 紅細胞膜蛋白 I [惡性瘧原蟲]I 269aa(SEQ IDNO:52)
[0394]DYIKDDPYSKEYTTKLSFILNSSDANTSSEKIQKNNDEVCNPNESEISSVEQAQTSRPSSNKTCITHSSIKANKKKVCKDVKLGVRENDKVLRVCVIEHTSLSGVENCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNGSCDKNSEEACEKNLDEALASLTNCYKNQKCKSEQSKKNNNKWIWKKSSGNEKGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVCLHEKEGKTQELKNISTNSELLKEffIIAAFHEGKNLKTTYPQNKNDDNGKKLFKDLKYSFADY
[0395]> MTSl 745 個氨基酸 |646aa(SEQ ID NO:53)
[0396]
DYXKDDPYSKEYTTKLSFILNSSDANTSSEKIQKNNDEVCNPNESEISSVEQAQTSRPSSNKTC
miSSIKANKKKVCKDVKLGVRENDKVLRVCVIEHTSLSGVENCCCQDLLGILQENCSDNKRG
SSSNGSCDKNSEEACEKNLDEALASLTNCYKNQKCKSEQSKKNNNKWZWKKSSGKEGGLQKE
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LKNSKLD
[0397]> Q8I639 (Q8I639_PLAF7)惡性瘧原蟲(分離株 3D7)，632aa 細胞外部分(SEQ IDNO:54)
[0398]
NYIKGDPYFAEYATKLSFaNSSDANNPSEKIQKNNDEVCNCNESGIASVEQiQISDPSSNKTC
ITHSSIKANKKKVCKHVKLGVRENDKOLRVCVIEHTSLSGVENCCCQDFLRILQENCSDNICSG
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YKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLD
[0399]> Q8I639(Q8I639_PLAF7)惡性瘧原蟲(分離株3D7)，全部2730aa細胞外部分(SEQ ID NO:55)
[0400]MDKSSIANKIEAYLGAKSDDSKIDQSLKADPSEVQYYGSGGDGYYLRKNICKITVNHSDSGTNDPCDRIVb
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RKTIRQLVWDAMQSGVRYAVEEKNENFPLCMGVEHIGIAKPQFIRffLEEffTNEFCEKYTKYFEDMKSKCDPPKRADT
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KAEDffffKTNKKSIffNAMLCGYKKSGNKIIDPSffCTIPTTETPPQFLRfflKEWGTNVCIQKQEHKEYVKSKCSNVTNL
GAQASESNNCTSEIKKYQEffSRKRSIRffETISKRYKKYKRMDILKDVKEPDANTYLREHCSKCPCGFNDMEEMNNNE
DNEKEAFKQIKEQVKIPAELEDVIYRIKHHEYDKGNDYICNKYKNIHDRMKKNNGNFVTDNFVKKSWEISNGVLIPP
RRKNLFLYIDPSKICEYKKDPKLFKDFIYWSAFTEVERLKKAYGGARAKVVHAMKYSFTDIGSIIKGDDMMEKNSSD
KIGKILGDTDGQNEKRKKWWDMNKYHIWESMLCGYREAEGDTETNENCRFPDIESVPQFLRWFQEWSENFCDRRQKL
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IYIYIYVCCICMYVCMYVCMYVCMYVCMYVCMHVCMLCVYVIYVFKICIYIEKEKRKK
[0403]>BPTI，蛋白酶抑制劑(SEQ ID NO:57)
[0404]RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA
[0405]> PE38，假單胞菌外毒素A(SEQ ID NO:58)，(KDEL的下劃線表示信號序列，其對于根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體來說可以是任選的)
[0406]RHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADS⑶ALLERNYPTGAEFLGDG⑶ISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIA⑶PALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGffPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRKDEL
[0407]> PE38LR，PE38的變體(SEQ ID NO:59) (KDEL的下劃線表示信號序列，其對于根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體來說可以是任選的)
[0408]RHRQPRGWEQLYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIA⑶PALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRKDEL
[0409]與假單胞菌外毒素A (PE38)的截短片段融合的VAR2CSA多肽的序列
[0410]融合VAR2CSA-PE38蛋白質(zhì)可以具有修飾，如在N端中的蛋白酶抑制劑(BPTI)和/或免疫原性較低的優(yōu)化的PE38序列(PE38LR)
[0411]> BPT1-1Dl-1D2aFCR3-PE38LR, (SEQ ID NO:60)下劃線的序列對應(yīng)于FCR3 的 IDl結(jié)構(gòu)域，粗體的序列對應(yīng)于FCR3的DBL2Xb結(jié)構(gòu)域，下劃線和粗體的序列是ID2a
[0412]RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGANYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSYGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFAS
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[0413]> BPT1-1Dl-1D2aFCR3-PE38(SEQ ID NO:61)
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〔0419〕 V BPT1-DBLl-1D2aFCR3-PE38LR(SEQ ID NO:64)
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[0431]> ID l-DBL2bFCR3-PE38LR(SEQ ID NO:70)
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[0435]與白喉毒素的截短片段融合的VAR2CSA多肽的序列
[0436]> DT388-DBLl-1D2a 3D7(SEQ ID NO:72)
[0437]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPMHEFHSDSGTNDPCDRIPPPYGDNDQWKCAIILSKVSEKPENVFVPPRRQRMCINNLEKLNVDKICN 104136041 A i^sdts/82 矧
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〔044SV DT388-1DllID2a 3D7 (SEQ ID NO:74)
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GVDVKPTTVRSNSSKLDSGR
[0442]> DT388-1Dl-1D2a FCR3(SEQ ID NO:75)
[0443]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPMHEFNYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFASLTNGYKCDKCKSGTSRSKKKWIWKKSSGNEEGLQEEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCEDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKNLKKRYPQNKNSGNKENLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNITTCNADGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYKKFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSNVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQSSDTLVVVNVPSPLGNTPYRYKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLDSGR
實施例
[0444]實施例1截短的重組VAR2CSA蛋白的制備
[0445]根據(jù)先前定義的結(jié)構(gòu)域邊界制備所有蛋白截短物(Dahlback M, JorgensenLM, Nielsen MA, Clausen TM, Ditlev SB 等人 J B1l Chem 286:15908-15917)。出于簡化的目的，我們已經(jīng)將CIDRpam結(jié)構(gòu)域分為兩個結(jié)構(gòu)域ID2a和ID2b，其中ID2a是CIDRpam的不含CIDR樣序列的N端部分，而ID2b對應(yīng)于CIDR樣序列。我們還使用了結(jié)合了 ID2a的93個氨基酸的新的DBL2X邊界。為了簡化，我們將此稱為DBL2Xb，同時舊的邊界將被稱為DBL2Xa。表2中列出了克隆中使用的引物。如在方法I中描述的，片段作為可溶性蛋白在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達。大多數(shù)蛋白基于FCR3基因型制備。一些FCR3片段不表達并且這些改為基于3D7基因型制備。在分析中蛋白可互換地使用，因為我們表明，來自兩種基因型的重組VAR2CSA均等地結(jié)合CSA。當(dāng)通過SDS-PAGE (方法2)比較還原的和非還原的樣品時，所有蛋白表現(xiàn)出凝膠遷移率的變動。這與分子內(nèi)二硫鍵的形成一致。一些蛋白形成了由非還原SDS-PAGE檢測出的高分子量復(fù)合物。這很可能歸因于未配對的半胱氨酸之間的分子內(nèi)二硫鍵的形成。這通過使用DTT將復(fù)合物還原為單體蛋白來確認。
[0446]
1-1
0
4^.1_I
表2:克隆引物


FCR3引物
Si^ 止向引物
IDl-1D2bAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ IDNO;76) CTTGTTGA'
DBLlX-1D2aCACAGCGATAGCGGCAAG (SEQ ID NO:78) GTCCAGC
IDl-1D2aAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ ID NO:80) GTCCAGC
IDl-DBL2XaAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ EDNO:82) AGCGGCC
IDl-DBL2XbAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ ID NO:84) GTACTTG
DBLlX-DBL2XbCACAGCGATAGCGGCAAG (SEQ ID NO;86) GTACTTG



3d7引物
S I so^ 正向引物
DBL2X-DBL4sCTGACCAACTGCTACAAG (SEQ ID NO:88) GGTCCAG,
iDl-l>BL3sC'rG'rCCT'rCA'i'CXn'GAAC (SEQ ID NO:9G) TTCAGCGT
ID1-DBL4hCTGTCCTTCATCCTGAAC (SEQ ID NO:92) GTCCAG/
DBLlX-1D2bCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ ID NO:94) AGAGGACTTi
Il)1-1l)2bC’l’G’rCC’nrATCC’mAAC (SKQII) N():%) Α(?Α(](?ΑΟ--(
DBLlX-1D2aCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ ID NO:98) GTCCAGC
IDl-1D2aCTGTCCTTCATCCTGAAC (SEQ ID NO: 100) GTCCAGC'
DRT/IX-DBT,2XaCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ TD NO:1 ()2) GGCGCtCG
IDl-DBL2XaCTGTCCTTCATCCTGAAC (SEQ ID NO: 104) GGCGGCG
DBLlX-DBUXbCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ ID N0:106) GTACTTG'
TDl -DHT,2XbCTGTCCTTCATCCTr丁AAC (SEQ Π) NO: 108) GTACTTG'O
C
至



-漏
---合?'
ρπδΜΘα3οο)1Η0ν00Ι001100ν0310 (9e1MOIaws)ovvooooovlvoaovovo(3'?9-τ_09τ6?Η^qnsliME結(jié)多
(S1NQ 0HS) HHoycoHaoHloOVuaLO (寸NSN QcyHS) owoooaovlvoaDvavoate>l.(OS.6S-9SJM.1 氍城腔性 ^
pdQN Qcyds) ΗΗΟ<0ΟΗυοΗΗαο<0αΗ?__廣 ττ ιΟΝ ScyMs) owaooaovlvoaovoya__(水蠱 SSQSa1-Xnga_ 親驗
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8 9













4 4













4 4













0O













1_I I_I如果該差異與表達的VAR2CSA的序列差異有關(guān)，則可以使用該信息限定參與粘附過程的殘基。為了對此進行測試，我們制備了一系列的重疊3D7 VAR2CSA片段，其與我們前面已經(jīng)針對FCR3所測試的片段相同。
[0450]首先針對固相結(jié)合測定(ELISA)中的特異性CSPG結(jié)合篩選蛋白(方法3中描述的)。之后通過尺寸排阻層析進一步純化特異性結(jié)合CSPG的蛋白，以獲得純凈的單體蛋白，并且在石英晶體微量天平(Attana A100)上進行動力學(xué)分析(分別為方法2和方法4)。3D7VAR2CSA片段在固態(tài)結(jié)合測定中表現(xiàn)出與其FCR3對應(yīng)物非常相似的結(jié)合特性。在動力學(xué)分析中同樣如此(表3)。傳感圖示出了在不同蛋白濃度下收集的締合和解離數(shù)據(jù)。這使得能夠測定締合速率常數(shù)(km)、解離速率常數(shù)U、和平衡常數(shù)(Kd)。這些參數(shù)同峰值響應(yīng)水平一起提供了對CSPG結(jié)合親和力的估算。3D7與FCR3片段之間不存在明顯的差異。一些片段顯示出較低的親和力，但是在片段對應(yīng)物中也保持了這種特性。這表明3D7和FCR3VAR2CSA蛋白以相同的方式折疊和發(fā)揮作用。
[0451]表3:制備的VAR2CSA蛋白的CSA結(jié)合親和力。親和力作為在動力學(xué)實驗中使用石英晶體微量天平生物傳感器(Attana A100)測定的KD(nM)值給出。N/A:歸因于缺乏與CSA的結(jié)合，不能確定Kd值的蛋白。
[0452]

FCR33D7
~桿狀病毒~~ 桿狀病毒
VAR2CSA片段大腸桿菌

(Baculo)(Baculo)
FV252^8^
ID1-DBL4S9Λ
IDl-DBL3s03^O
DBL2X-DBL4sIA^L2

DBL1-1mb
DBLl-1D2a8--5
IDl-1D2a76183 ' 5J
^DBLlX-DBL2XbΚβ
^DBLlX-DBL2XaNZA
IDl-DBL2Xb2L8
IDl-DBL2XaWA
[0453]* 蛋白公布于(Dahlback 等人，JBC, 2011)
[0454]實施例3-核心CSA結(jié)合位點位于DBL2X結(jié)構(gòu)域內(nèi)
[0455]已經(jīng)提出VAR2CSA中的最小CSA結(jié)合區(qū)域位于DBL2X_ID2b內(nèi)，并且需要側(cè)翼結(jié)構(gòu)域用于完全親和力結(jié)合(DahIbSck M, Jorgensen LM, Nielsen MA, Clausen TM, Ditlev SB等人J B1l Chem 286:15908-15917)。在這里，我們已經(jīng)分析了較短的VAR2CSA片段以進一步描繪CSA結(jié)合所需的區(qū)域。
[0456]首先在ELISA中針對與CSA蛋白聚糖(CSPG)的結(jié)合來篩選截短的蛋白質(zhì)，并且之后純化以獲得用于在石英晶體微量天平上檢驗的單體(分別為方法3、2和4)。最小結(jié)合區(qū)域是IDl-DBL2Xb (表3)。此區(qū)域表現(xiàn)出21.8nM的結(jié)合親和力，這可與全長VAR2CSA的結(jié)合親和力相比。
[0457]胎盤IE對低硫酸化胎盤CSPG是高度選擇性的。它們不粘附至任何其他糖胺聚糖(GAG)，如硫酸乙酰肝素(HS)。對于全長重組VAR2CSA蛋白來說同樣如此。固態(tài)結(jié)合測定顯示含有最小CSA結(jié)合區(qū)域的VAR2CSA片段特異性結(jié)合CSA。為了對此進行確認，針對與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的結(jié)合，進一步在石英晶體微量天平上測試最小結(jié)合片段(方法4)。所有片段都不結(jié)合HSPG。
[0458]實施例4-針對新的最小結(jié)合區(qū)域誘導(dǎo)的抗體誘導(dǎo)強效的寄生物抗粘附免疫應(yīng)答
[0459]針對PM的基于VAR2CSA的疫苗必須能夠誘導(dǎo)強力的保護性免疫應(yīng)答。在此，最重要的方面是形成能夠抑制胎盤隔離(sequestrat1n)的抗VAR2CSA IgG抗體。出于設(shè)計最佳的疫苗抗原目的，我們已經(jīng)檢驗了 VAR2CSA-CSA相互作用潛在的分子機制。為了測試我們制備的VAR2CSA重組片段是否表現(xiàn)出誘導(dǎo)粘附阻斷免疫應(yīng)答的能力，將它們用于大鼠免疫(方法6)。
[0460]針對抑制IE粘附至CSPG的能力，測試VAR2CSA片段特異性血清(方法11)。針對所有結(jié)合CSA的片段產(chǎn)生的抗體是非常強效的結(jié)合抑制劑。事實上，在所有情況中，幾乎100%地抑制結(jié)合。DBLlX-DBL2Xa和IDl_DBL2Xa不是良好的抑制劑，與這些片段缺乏CSA結(jié)合一致(表3)。該數(shù)據(jù)意味著，結(jié)合CSA的蛋白質(zhì)適當(dāng)?shù)卣郫B并且支持以上定義的最小結(jié)合區(qū)域的定位。
[0461]實施例5-引起抗粘附抗體的誘導(dǎo)的表位位于最小結(jié)合區(qū)域內(nèi)
[0462]為了檢驗抑制性抗FV2應(yīng)答是否是針對最小結(jié)合區(qū)域，我們親和純化了關(guān)于在前面描述的VAR2CSA片段中的四個的FV2抗體(方法7)。然后針對抑制表達VAR2CSA的寄生物與CSPG結(jié)合的能力，測試片段特異性抗體(方法11)。在固定化的ID1-DBL4 ε、DBLlX_ID2a和IDl-1D2a上純化的抗體完全抑制了寄生物粘附。此外，消耗的FV2樣品損失了其抑制能力的很大部分。這表明誘導(dǎo)抗粘附抗體的表位存在于這些片段內(nèi)。在DBLlX-DBL2Xa上純化的抗體顯示出降低的抑制能力，這與這種片段缺乏CSA結(jié)合一致(表3)。該數(shù)據(jù)提示，弓丨起抑制性抗體的誘導(dǎo)的表位位于最小結(jié)合區(qū)域內(nèi)(在這里通過IDl-1D2a闡明)。
[0463]實施例6-最小結(jié)合區(qū)域中突變推定的GAG結(jié)合位點對CSPG結(jié)合沒有影響
[0464]對于多價PM疫苗的設(shè)計來說，表征VAR2CSA與CSA之間的相互作用的性質(zhì)是重要的。在這方面，主要部分是特異性CSA結(jié)合位點的鑒別和潛在化學(xué)相互作用的表征。最小CSA結(jié)合區(qū)域的序列分析揭示了兩個保守的推定的GAG結(jié)合位點。一個位于IDl區(qū)域中并且具有典型的 Cardin-Weintraub XBBBXXBX 基序(Cardin, A.D.和 Weintraub, H.J.(1989) Arter1sclerosis 9，21-32) (458-NKKKECKD-465)。另一個，在 DBL2X 中，具有反向的相同的基序(625-GKNLKKRY-632)。也已經(jīng)假設(shè)的是，在DBL2X的N端部分中發(fā)現(xiàn)的二態(tài)(dimorphic)序列基序(DSM)參與結(jié)合 CSA(Sander, A.F.，Salanti, A.，Lavstsen, T.,Nielsen, M.A., Magistrado, P., Lusingu, J., Ndam, N.T.,和 Arnot, D.E.(2009) PLoS One4，e6667)。為了測試這些推定的位點是否對CSA結(jié)合有作用，我們用丙氨酸置換了典型的GAG結(jié)合位點中的堿性(basic)氨基酸并且在DSM區(qū)域內(nèi)的暴露表面的環(huán)的中間做出了十個氨基酸(590-KLENVCEDVK-603)的缺失。所有突變在DBLlX_ID2a片段中進行。
[0465]用丙氨酸置換在推定的IDl和DBL2X GAG結(jié)合位點中的堿性氨基酸對CSPG結(jié)合沒有影響。在ELISA中與野生型蛋白相比，沒有見到CSPG結(jié)合的降低(方法3)。具有四個丙氨酸置換的構(gòu)建體，丙氨酸Sub.K(459，460，461，464)，顯示出相當(dāng)高的HSPG結(jié)合，其可以由針對突變的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而引起。兩種突變體，丙氨酸Sub.K (626，629，630)，R(631)和丙氨酸Sub.K(459，460, 461，464)，顯示出與陽性對照相似的CSPG結(jié)合動力學(xué)(方法4)。這明顯是由于相似的Kd值和峰值響應(yīng)造成的。
[0466]DSM區(qū)域的缺失并未降低與CSPG的結(jié)合(方法3和4)。DSM敲除的突變體在ELISA中顯示出與HSPG相當(dāng)高的結(jié)合。這可能是由在其中缺失DBLlX的100氨基酸的錯誤的克隆引起的。重要的是，CSPG結(jié)合不受影響。
[0467]實施例7
[0468]與CSPG結(jié)合的VAR2CSA不依賴于離子相互作用
[0469]典型的Cardin-Weintraub GAG結(jié)合基序的突變對CSPG結(jié)合沒有影響。這表明VAR2CSA-CSA結(jié)合機制與典型的GAG結(jié)合模型中的硫酸鹽結(jié)合的一般方式不同。存在GAG結(jié)合蛋白的實例，顯示出對與硫酸化GAG結(jié)構(gòu)的離子相互作用幾乎沒有依賴。為了測試是否是這種情況，我們根據(jù)聚電解質(zhì)理論檢驗了離子依賴性(Record, Μ.Τ.，Jr.，Lohman, M.L.，和 De Haseth, P.(1976) J Mol B1l 107,145-158)。
[0470]類似于DNA，糖胺聚糖是被稱為聚電解質(zhì)的高度帶電的聚合物。帶負電的基團導(dǎo)致在每種聚合物內(nèi)的高程度的推斥能。單價陽離子，如Na+，與帶負電的基團相互作用以使推斥能最小化。堿性氨基酸與硫酸根基團的結(jié)合取代了結(jié)合的陽離子并且引起自由能的釋放。結(jié)合的Na+離子的有利的釋放被稱為聚電解質(zhì)效應(yīng)。
[0471]該理論宣稱，蛋白質(zhì)與GAG的結(jié)合可以描述為:
[0472]
蛋白質(zhì)+GAG(m個位點)η蛋H質(zhì)-GAG+m(l -f)Na+
[0473]其中m是在結(jié)合單個蛋白質(zhì)時所釋放的Na+離子的數(shù)量并且f是未被鈉離子掩蔽的陰離子的分數(shù)。根據(jù)該理論，所觀察到的Kd值與以下離子和非離子的貢獻有關(guān):
[0474]LogKD，觀察值=LogKD，非離子+m (l_f) Log [Na+]
[0475]其中是在不存在離子相互作用的情況下的解離常數(shù)。
Log[Na+]的曲線圖是線性的，斜率為m(l-f)。因此，如果未被掩蔽的陰離子(f)是已知的，則可以確定參與結(jié)合的離子相互作用的數(shù)量。對于肝素來說，(Ι-f)是0.8(01son，S.T., Halvorson, H.R.,和 Bjork, 1.(1991) J B1l Chem 266,6342-6352)。對于 CSA 來說，值是未知的，但是(ι-f)不能超過I。因此我們可以估算參與的離子相互作用的最大數(shù)量。此夕卜，當(dāng)[Na+] = IM時，Log[Na+] = O,這意味著在此Na+濃度下，LogKD，觀察值=LogKD，非離子。
[0476]我們在固態(tài)結(jié)合測定中在不同的NaCl濃度(150mM、200mM、250mM、300mM)下，通過在1:2稀釋系列中進行結(jié)合400nM-1.65nM蛋白質(zhì)的滴定，測試了 FV2、DBLlX_ID2a和IDl-1D2a與CSPG的結(jié)合(方法5)。觀察到的Kd值確定為提供半最大(B最大)響應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。這在Graphpad Prism中使用非線性回歸(最小平方與Hill斜率擬合)完成。在分析中不包括更高的鹽濃度，因為結(jié)合幾乎完全被抑制。這很可能歸因于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。此想法被LogKD，_§6<]對Log[Na+]僅在150mM和300mM之間是線性的事實所支持,提示在更高的NaCl濃度下其他因素發(fā)揮作用。
[0477]LogK11,觀察的對Log[Na+]顯示出線性關(guān)系。斜率m(l_f)的范圍在IDl_ID2a的2.7至全長(FV2)的3.4之間。我們不知道f的值，但是參與結(jié)合的離子相互作用的最大數(shù)量必須在2至3之間。有趣的是，全長蛋白質(zhì)的值高于短片段的值，表明該蛋白質(zhì)與CSPG進行額外的離子相互作用。將在150mM NaCl的Kd值作為我們的參照點，因為這是生理NaCl濃度。通過外推線性關(guān)系并且尋找I截距，我們發(fā)現(xiàn)FV2的KD，嫌=5.9 μ m，DBLlX_ID2a的KD，非離子=3.4 μ m，并且IDl-1D2a的KD，非離子=0.7 μ m。比較這些和參照點(150mM NaCl)的對數(shù)值，我們估算在25-35%之間的VAR2CSA結(jié)合可能是由離子相互作用引起的。這提示VAR2CSA的高CSA親和力不能單單由與硫酸化GAG結(jié)構(gòu)的離子相互作用解釋。高親和力可以通過與CSA碳水化合物骨架進行多價相互作用的復(fù)合物結(jié)合位點獲得。
[0478]實施例8
[0479]VAR2CSA最小CSA結(jié)合區(qū)域特異性結(jié)合大范圍的癌細胞
[0480]許多不同的癌細胞與蛋白聚糖CSPG4的高度表達有關(guān)。這種分子最初被描述為黑素瘤的標記，但是近來已經(jīng)許多癌形式中發(fā)現(xiàn)了它，包括癌干細胞。附著至CSPG4的CS鏈已知是主要的CSA。針對與一大組各種癌細胞系的結(jié)合，通過流式細胞儀分析最小的VAR2CSA片段之一(IDl-1D2a)(方法12a和12b)。使用非CSA結(jié)合蛋白質(zhì)IDl_DBL2Xa作為陰性對照。VAR2CSA重組蛋白(IDl-1D2a)在75nM下強烈結(jié)合所有轉(zhuǎn)錄CSPG4的癌細胞系(微陣列數(shù)據(jù))，包括皮膚黑素瘤(C32、MeWo)、肺癌(lung carcinoma) (A549)、乳腺癌(breastcarcinoma) (HCC1395)、骨肉瘤(U20S、MNNG/HOS)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma) (RH30)(表4和5)。這種蛋白還強烈結(jié)合不表達CSPG4的皮膚T細胞淋巴瘤(表4)。陰性對照蛋白IDl-DBL2Xa不結(jié)合任何所測試的細胞系(表4)。此外，IDl_ID2a不與用作對照細胞的人紅細胞相互作用。針對IDl-1D2a相互作用，還分析了野生型和GAG缺陷型中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。當(dāng)分析CH0-745細胞系(其中GAG合成被中斷)時，所看到的IDl_ID2a與野生型CHO細胞的強相互作用完全被消除。通過借助將VAR2CSA與CSA、CSC或HS預(yù)混合來抑制結(jié)合細胞的VAR2CSA，也證實了相互作用的CSA特異性。CSC和HS對結(jié)合沒有任何影響，然而CSA有效地消除了 VAR2CSA與癌細胞的結(jié)合。
[0481]根據(jù)這些結(jié)果，通過流式細胞儀使用VAR2CSA的DBLl_ID2a或IDl_ID2a片段篩選更大組的癌細胞(表6和7)。這種篩選的主要目的是鑒別適用于體內(nèi)異種移植模型(xenograft modelling)的細胞系。
[0482]表4.使用VAR2CSA的最小結(jié)合結(jié)構(gòu)域(IDl_ID2a)的癌細胞系和陰性對照細胞的染色。
[0483]僅用培養(yǎng)基(空白)或用重組蛋白(ID1-DBL2或IDl_ID2a)以75nM溫育細胞30分鐘，接著用抗V5-FITC (Invitrogen)以1:800溫育，在每次溫育之間將細胞洗滌三次。示出的是使用FC500流式細胞記錄儀(Becton Dickinson)從最少5000個細胞記錄的平均FITC熒光值。
[0484] 細胞炎咐ΨΓ\IDl-DBL2XaID1-1D2a
C325J76^9463.81
MyLa 2059?615^61145.35
MvLa 18505^875^6137.86
ChoWT3^094^3534J9
Cho 7454M4^29^38
PBMC?ΜUe?β?
紅細胞UiU7?β?
[0485]表5.使用重組VAR2CSA的癌細胞系的染色
[0486]僅用培養(yǎng)基(空白)或用重組蛋白(DBLl-1D2a或IDl-1D2a)以75nM溫育細胞30分鐘，接著用抗V5-FITC (Invit1gen)以1:800溫育，在每次溫育之間將細胞洗滌三次。示出的是使用HALlOOZeiss顯微鏡從最少4個高功率場圖像記錄的FITC熒光強度的中位數(shù)評分(medium score)。NS:無染色;+:弱;++:中等;+++:強;++++:非常強。
[0487]
細胞類型SiDBLl-m2a
U20SNS+++
MG63NS++++
MDA-MB-231NS+++
TC32NS+
TC71NS++
MNNGNS+++
CHLA9NS++
CHLAlONS++
RH30NS+++
RH18NS++
PC3NS+++
[0488]表6針對重組VAR2CSA結(jié)合的多種人癌細胞系的篩選(使用DBLl_ID2a或IDl-1D2a)。
[0489]按照方法12中所描述的通過流式細胞儀測量結(jié)合。
[0490]NS:無染色；+:弱；++:中等；+++:強；++++:非常強。
[0491]細胞系對照 75 nM150 nM 備注

YAR2CSA YAR2CSA
MeWoNS+++++++黑素瘤(MekmomaX成纖維細胞形態(tài)，來源于淋巴


結(jié))
A549NS++++++ 肺腺癌(lung adenocarcinomaXK-RasG12S)
HCC1395NS+++++++ 浸潤性導(dǎo)管乳腺癌(invasive ductal breast


carcinoma)TNM階段I等級3;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:


Her2明性、ER陰性、PR陰性(三明性)
RH30NS+++++++ 橫紋肌肉瘤(rhaMomyosarcoma)(TPp53 陰性；


PAX7-F0X01A融合陽性；高度基因組不穩(wěn)定(>50

染色體重排))
MNNGNS++++++骨肉瘤(osteosarcoma),來自13歲女性高加索人種


(TPR-Met 陽性)
U20SNS++++++骨肉瘤(osterosarcoma)，來自15歲女性高加索人種


(IGF-R1和IGFR-1I陽性；TPp53野生型、pRb野生型、P16陰性；高度非整倍性(aneuploid))
H1792NS++++ 肺腺癌(lung aderK>carcinoimXK-RasG12S:



TPp53het)
[0492]
MDA-MD-435 NS+++++ 黑色素細胞來源的乳腺癌(breast carcinoma)(ER 陰


性、Her2陽性、PR陽性)
MG63NS+++++++ 骨肉瘤(osteosarcoma)
TC3 2NS++++ 尤因肉瘤(E\\ ing’ s sarcoma)
CHLA9NS++++ 尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)
CHLAlONS++++ 尤因肉瘤(Ewing.s sarcoma)
TC71NS++++ 尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)
HOSNS+++++++ 骨肉瘤(osteosarcoma)
PC3NS++++ 前列腺癌(prostate carcinoma)
SKNMCNS+++++ 尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)
MCF-7NS+++ 乳腺癌(breast carcinoma)
[0493]表7針對重組VAR2CSA結(jié)合的更多種人細胞癌細胞系的篩選(使用DBLl_ID2a或IDl-1D2a)。
[0494]按照方法12中所描述的通過流式細胞儀測量結(jié)合。
[0495]所示出的值是利用200nM的蛋白質(zhì)濃度的平均熒光強度。
[0496] 細胞類型^ 陰性對照IDl-1D2a |備注
GP20221.63111.37胃癌(gastric carcinoma)
NC1-N877.18207.72胃癌(gastric carcinoma)
MKN454.2255.4胃癌(gastric carcinoma)
MKN286.9103.84胃癌(gastric carcinoma)
AGS7.2518.21胃癌(gastric carcinoma)
KatoIII7.3318.76胃癌(gastric carcinoma)
SNlJ-14.33155.79胃癌(gastric carcinoma)
SNIJ-6388.478.49胃癌(gastric carcinoma)
IPA2207.7213.67胃癌(gastric carcinoma)
MDA-2313.3963.43三陰性(triple negative)乳腺癌
T47D3.6348.13管腔型(Iiiminal)乳腺癌
LNCap6.5824.86前列腺癌
PC35.229.82前列腺癌
Ovc3161.897.24卵巢癌干細胞
細胞類型空白DBLl-1D2a


急性淋巴細胞白血病(acute lymphatic
NALM-66，198 Ileukaemia, ALL)
[0497]
~697^ 3^23 ^ 30,36ALL
AMO-12,6835,22骨髓瘤(myelomatosis)
KMM-12.8216,1骨髓瘤(myelomatosis)
MOLP-82,4419,24骨髓瘤(myelomatosis)
KMS-12-PE3.027,14骨髓瘤(myelomatosis)
KMS-12-BM2,23,25骨髓瘤(myelomatosis)


彌散性大B細胞淋巴瘤(diJTuse large B-cell
U2932416,83lvmphoma)(DLBCL)
SU-DHL8ND3J5DLBCL
SU-DHL52j§10,28DLBCL
Oci_Lyl933818,96DLBCL
HBLl6^339^3DLBCL
Farage2^83^28DLBCL
RIVA226332DLBCL


低級濾泡性小裂細胞淋巴瘤(low-grade follicular
WSU-FSCCL4,8922.32small cleaved cell lymphoma)


成淋巴細胞性淋巴瘤(lymphoblastic lymphoma)
U-698-M7 ,4) 8)del(6)(ql5q22)
[0498]實施例9
[0499]重組VAR2CSA以高親和力結(jié)合癌細胞
[0500]使用石英晶體微量天平生物傳感器(Attana Cell200)分析重組VAR2CSA片段DBLl-1D2a與癌細胞系、C32黑素瘤和兩種Cho細胞系(實施例8中描述的)的結(jié)合親和力。針對與細胞表面的結(jié)合，在每次新的蛋白質(zhì)注射之間結(jié)合表面再生的情況下，分析2倍稀釋系列(25-400nM)的蛋白質(zhì)。估算結(jié)合親和力，處于與對純受體的結(jié)合親和力(表3)相似的納摩爾范圍(表8)內(nèi)。
[0501]表8.重組DBLl_ID2a (大腸桿菌)與表達CSA的癌細胞(C32和Cho WT)的估算的結(jié)合親和力(Kd)以及缺乏與CSA陰性細胞系(Cho 745)的結(jié)合
[0502]N/A:歸因于缺乏與細胞的結(jié)合，不能確定Kd。
[0503]
細胞類咁K? (nM)
C32黑色素細胞13
Cho WT1.4
Cho 745N/A
[0504]實施例10
[0505]重組VAR2CSA蛋白質(zhì)以高特異性結(jié)合癌組織
[0506]使用免疫組織化學(xué)(IHC)研究重組VAR2CSA與從人類患者獲得的原發(fā)癌組織的結(jié)合。使用人胎盤組織作為陽性對照以及扁桃體和肝臟組織作為陰性對照進行該方法。在無表位修復(fù)的情況下，在Ventana Discovery XT平臺上優(yōu)化染色方案。將點在載玻片上的石蠟包埋組織用0.l-500nM V5-VAR2CSA(IDl-1D2a)或V5-對照蛋白質(zhì)(DBL4)在室溫下溫育Ih,洗滌8分鐘，用1:700小鼠抗V5抗體溫育30分鐘，洗滌8分鐘。隨后使用UltraMap抗小鼠HRP檢測結(jié)合的抗V5。V5-VAR2CSA將人胎盤以0.5nM濃度染色，而在扁桃體或正常肝臟中無染色?？梢酝ㄟ^將200 μ g/μ I CSA加入至反應(yīng)緩沖液中來完全阻止染色。V5對照蛋白在任何所測試的濃度下都未將人胎盤組織染色。代表24個正常器官的多器官組織微陣列(TMA)當(dāng)用InM V5-VAR2CSA染色時顯示出低染色或不存在染色，而乳腺、結(jié)腸、直腸、前列腺、腎臟、肝臟、膀胱、胰腺、鱗狀細胞、肺、膽囊、胃、睪丸、卵巢、子宮、腎上腺、甲狀腺和胸腺、造血系統(tǒng)、和結(jié)締組織的癌癥樣本(肉瘤)以等于或高于人胎盤陽性對照組織的強度被陽性染色(表9)。
[0507]表9.使用重組VAR2CSA的原發(fā)人腫瘤樣本上CSA的檢測。表示出了如在實施例10中描述的針對主要癌癥組的陽性的數(shù)量/染色的情況的總數(shù)量。陽性染色被定義為等于或高于胎盤組織中觀察到的強度的強度。
[0508]
癌癥組I陽性比
膀月光癌(bladder carcinoma)44/56
前列腺癌(prostate carcinoma)71/76
乳腺癌(breast carcinoma)64/75
黑素瘤(melanoma)5/6
肉瘤(sarcoma)23/25
食道鱗狀細胞癌(esophagus squamous cell carcinoma)2/3
胃腺癌(stomach adenocarcinoma)3/3
結(jié)腸癌(colon carcinoma)2/3
直腸腺癌(rectal adenocarcinoma)3/3
肝癌(liver carcinoma)3/3
腎癌(renal carcinoma)3/3
月市癌(lung carcinoma)2/3
宮頸癌(cervix carcinoma)3/3
卵巢癌(prostate carcinoma)2/3
彌散性 B 細胞淋巴瘤(diffuse B-cell lymphoma)T/3
星形細胞瘤(astrocytoma)3/3
姨腺癌(pancreatic carcinoma)3/3
[0509]實施例11
[0510]借助重組VAR2CSA蛋白的體外轉(zhuǎn)化參數(shù)的抑制
[0511]通過三個不同的測定來研究未偶聯(lián)的VAR2CSA對體外腫瘤細胞形態(tài)的抑制作用:
[0512]i)軟瓊脂菌落形成測定解決了 VAR2CSA是否可以抑制癌細胞在三維基質(zhì)中增殖的能力。
[0513]ii)遷移測定解決了 VAR2CSA是否可以抑制癌細胞在博伊登室(boyden chamber)
中向化學(xué)引誘物垂直遷移的能力。
[0514]iii)侵入測定解決了 VAR2CSA是否可以抑制癌細胞通過人造基底膜侵入的能力。
[0515]軟瓊脂菌落形成測定:在接種在軟瓊脂基質(zhì)中之前用25-100nM VAR2CSA處理細胞24小時，并且在37°C靜置10-12天。圖像通過相差顯微鏡捕獲并通過ImageJ軟件量化。
在75和150nM之間的濃度中，重組VAR2CSA抑制MG63骨肉瘤(osteosarcoma)和RH30橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)細胞的軟瓊脂菌落形成。
[0516]基底膜提取物(BME)包被的細胞侵入測定:為了模擬侵入過程，我們根據(jù)廠商規(guī)程使用 CultreCoat?24 孔 BME 包被的細胞侵入(24Well BME-Coated Cell Invas1nplatform)平臺(Cedarlane),具有下列改變。細胞在測定前一天在25-lOOnM VAR2CSA存在或不存在的情況下進行血清饑餓。在第二天，將維持在以上條件下的細胞接種在平板的頂部室(IxlO5細胞/孔)中，而下室含有耗盡血清的培養(yǎng)基作為陰性對照或者補充有10%FBS的培養(yǎng)基。之后將細胞溫育額外18小時。使用含有在活細胞中轉(zhuǎn)化為高熒光化合物的鈣黃綠素(Calcein)AM的解離緩沖液，收集通過BME侵入的細胞。使用熒光板計數(shù)器測量發(fā)出的熒光，通過FLUOStar軟件分析，擬合標準曲線，并且轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的數(shù)量的細胞。
[0517]遷移測定。遷移測定是與基底膜提取物(BME)包被的細胞侵入測定基本上相同的過程，但是不用BME。
[0518]MG63 骨肉瘤(osteosarcoma)、RH30 橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、和MDA-MB-231三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer)的遷移和侵入能力受75-150nM 重組 VAR2CSA 抑制。
[0519]實施例12
[0520]分析控制癌癥細胞轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件-通過含CSA蛋白聚糖調(diào)節(jié)的參數(shù)。
[0521]CSPG4通過Ras、Racl和PI3激酶依賴性機制促進增殖、遷移和侵入。基于實施例10中得到的結(jié)果，我們將研究引起增殖、遷移和侵入的潛在的VAR2CSA介導(dǎo)的抑制的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件。這利用現(xiàn)有技術(shù)水平的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法完成，包括但不限于，Racl活化測定、通路組分的免疫印跡以及反應(yīng)性氧物種(ROS)生成的細胞內(nèi)測量。這一系列的實驗將會闡明受VAR2CSA結(jié)合含CSA蛋白聚糖影響的信號傳導(dǎo)通路。
[0522]Racl活性測定:根據(jù)廠商規(guī)程(Thermo Scientific)對未處理的或用重組VAR2CSA處理的適合的人癌細胞系進行Racl活性測定。
[0523]反應(yīng)性氧物種(ROS)測定:根據(jù)廠商指導(dǎo)通過CM_H2DCFDA(Invitrogen)測量粗ROS水平。將使用二氫乙錠(DHE)測量超氧化物水平。在超氧化物陰離子02_存在下，二氫乙錠被迅速氧化為氧乙錠(oxyethidium),其結(jié)合DNA并且當(dāng)在488nm激發(fā)時發(fā)出在570-580nm范圍內(nèi)的光。對于細胞培養(yǎng)來說，在適當(dāng)處理之后，將細胞在Hank平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solut1n, HBSS)中洗滌，在含有 10μΜ DHE 的 HBSS 中溫育 30-60分鐘，在HBSS中洗滌并且用落射熒光HAL100顯微鏡(Zeiss)直接分析氧乙錠熒光。對于腫瘤切片來說，使用低溫恒溫器將快速冷凍的腫瘤切為20 μ m切片，按照針對細胞系所描述的洗滌并且DHE處理，固定在蓋玻片上并且與細胞系一樣進行分析。分析氧乙錠生成并且使用ImageJ軟件量化。對于所有腫瘤樣本來說，使用標準方法一邊進行蘇木精和曙紅(H&E)染色一邊確認組織完整性和病理性。初步數(shù)據(jù)表明，重組VAR2CSA抑制MG63和U20S細胞中的ROS生成。
[0524]免疫檢測。對于免疫印跡來說，利用相關(guān)的一級抗體和適當(dāng)?shù)亩壙贵w、ECL蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)試劑(Thermo Scientific)、和膜(Kodak 和 Covance (HA)),檢測通過SDS-PAGE分離的并且轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜的蛋白質(zhì)。對于顯微鏡來說，將細胞固定在4%甲醛中，用適當(dāng)?shù)囊患壙贵w溫育，用適當(dāng)?shù)亩塅ITC綴合抗體溫育并且如實施例9中描述的通過顯微鏡分析。人癌細胞系(]\0從-]\^-231、]\^63、似03、1^32、1^71和冊30)與重組VAR2CSA(IDl-1D2a)或?qū)φ盏鞍?DBL4)進行血清饑餓24h和在將血清加回至細胞之后在0、1、2、3、4、5、6和12h制備裂解物。使用這種方法，10nM VAR2CSA有效地抑制原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src在T416的磷酸化、黏著斑激酶(FAK)在T397的磷酸化、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)在Thr202/Tyr204 (對于人ERKl來說)和Thrl85/Tyrl87 (對于人ERK2來說)的1-磷酸化和2-磷酸化。這提示重組VAR2CSA抑制癌細胞中典型的ERK信號傳導(dǎo)。
[0525]實施例13
[0526]通過重組VAR2CSA調(diào)節(jié)的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件的無偏倚分析。
[0527]可以使用表達微陣列技術(shù)分析VAR2CSA對細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件的廣泛影響。MG63骨肉瘤(osteosarcoma)細胞被血清饑餓24h而未經(jīng)處理，在血清加入Ih后收獲VAR2CSA
或?qū)φ?DBL4)和RNA。對總RNA進行質(zhì)量測試(RIN〈8)，將其用作用于Affymetrix?探針構(gòu)造的模板并且與Affymetrix U133Aplus 2.0?芯片系統(tǒng)雜交。這種讀數(shù)提供了在將血清加回Ih后活化或失活的信號傳導(dǎo)通路的快照(snapshot)。初步數(shù)據(jù)確認了對ERK信號傳導(dǎo)的抑制作用。
[0528]實施例14
[0529]借助重組VAR2CSA蛋白的癌細胞生長的體內(nèi)抑制
[0530]基于來自體外分析的結(jié)果，將選擇適當(dāng)?shù)募毎涤糜诿庖呤軗p的小鼠中的體內(nèi)皮下和轉(zhuǎn)移異種移植模型。體內(nèi)研究解決五個主要問題:
[0531]i)靜脈內(nèi)(1.V.)或腹膜內(nèi)(1.p.)施用的重組VAR2CSA能否在體內(nèi)示蹤并結(jié)合人癌細胞？
[0532]ii)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用重組VAR2CSA能否在體內(nèi)抑制腫瘤形成？
[0533]iii)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用重組VAR2CSA能否在體內(nèi)抑制已形成的腫瘤的生長？
[0534]iv)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用重組VAR2CSA能否在體內(nèi)抑制人癌細胞的轉(zhuǎn)移性擴散？
[0535]V)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用重組VAR2CSA是否在體內(nèi)改變?nèi)税┘毎泻珻SA蛋白聚糖控制的信號傳導(dǎo)事件(尸檢病理學(xué)和生物化學(xué))？
[0536]體內(nèi)模型:將所選擇的代表顯示出與VAR2CSA的強結(jié)合的癌癥類型的人癌細胞系以近似5xl06個細胞/動物皮下接種至Rag2m或SCID免疫受損的小鼠中。當(dāng)腫瘤形成時，小鼠接受賦形劑(鹽水)和重組VAR2CSA(lmg/kg)的第一注射。在近似30天的整個實驗階段中，每周一次重復(fù)處理。每隔二或三天測量動物體重和腫瘤體積，并且在終止時，將腫瘤摘除并分為兩半，一半在液氮中快速冷凍，而另一半固定在石蠟中。處理快速冷凍的腫瘤用于如在實施例11中描述的(DHE)超氧化物檢測(連同相同腫瘤樣本的相應(yīng)的蘇木精和曙紅[H&E]染色)。
[0537]實施例15
[0538]通過示蹤物偶聯(lián)的重組VAR2CSA肽在體內(nèi)示蹤微轉(zhuǎn)移。
[0539]重組VAR2CSA將與不同的適用的示蹤物分子偶聯(lián)，所述示蹤物分子是與外部合作伙伴合作的或者通過基于合同的協(xié)議外包的。針對其示蹤和報告異種移植和轉(zhuǎn)基因小鼠模型二者中的微轉(zhuǎn)移的能力，分析可示蹤重組VAR2CSA分子。按照在實施例12中描述的，建立體內(nèi)模型。為了體內(nèi)測試示蹤物偶聯(lián)的VAR2CSA，針對VAR2CSA示蹤和結(jié)合微轉(zhuǎn)移的能力，通過體內(nèi)成像分析患有轉(zhuǎn)移癌的小鼠。
[0540]實施例16
[0541 ] 重組VAR2CSA蛋白的內(nèi)在化
[0542]通過癌細胞將重組VAR2CSA內(nèi)在化。通過首先將VAR2CSA片段(DBLl_ID2a)與熒光團綴合，并且之后通過活體成像和基于固定的細胞二者分析VAR2CSA吸收，將其示出。將癌細胞系(C32黑素瘤和MDA-MB-231)接種并過夜生長至60-80%匯合。用熒光團綴合的VAR2CSA將細胞在4°C溫育10-15分鐘，以允許VAR2CSA的表面結(jié)合。之后洗滌細胞以移除未結(jié)合的VAR2CSA，并且隨后在37°C溫育以開始內(nèi)在化10分鐘、lh、2h、4h、并且至多22h。
[0543]熒光團綴合的運鐵蛋白用于跟蹤終結(jié)于溶酶體中的運鐵蛋白典型的網(wǎng)格蛋白依賴性吸收。此外，對于一些實驗來說，熒光團綴合的右旋糖苷用于檢測溶酶體?；铙w成像分析顯示，在大約4h后VAR2CSA開始達到溶酶體，并且在22h后，所有VAR2CSA都能位于溶酶體隔室。然而，VAR2CSA和運鐵蛋白的共定位(colocalizat1n)是少有的，并且VAR2CSA的吸收比運鐵蛋白慢得多。重組VAR2CSA被癌細胞吸收的事實使我們能夠?qū)AR2CSA與在癌細胞內(nèi)變成活性的細胞毒性化合物融合或綴合。表10總結(jié)了來自針對重組VAR2CSA內(nèi)在化測試的指定癌細胞系的結(jié)果。
[0544]表10.僅用培養(yǎng)基(空白)或用重組蛋白(DBLl_ID2a或IDl_ID2a)以75nM溫育細胞lh，接著用抗V5-FITC (Invitrogen)以1:800溫育，在每次溫育之間將細胞洗滌三次。示出的是使用HALlOOZeiss顯微鏡從最少4個高功率場圖像記錄的在細胞質(zhì)膜或細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的FITC突光強度的中位數(shù)評分(medium score)。
[0545]評分系統(tǒng)為:
[0546]+:弱；++:中等；+++:強；++++:非常強。
[0547]
細胞系I細胞質(zhì)膜定位(Ih后)I細胞內(nèi)定位(Ih后)
U20S+++++
RH30++++
MG63+++++
MeWo+++++
HOS++++
MDA-MB-231+++++
SKNMC++++T+)
RH18++++
TC71+++
TC3+++
[0548]實施例17
[0549]融合VAR2CSA毒素蛋白殺傷癌細胞
[0550]已經(jīng)將DBLl_ID2a和IDl_ID2a VAR2CSA基因片段與假單胞菌外毒素A和白喉毒素融合為各種構(gòu)建體(SEQ ID N0:60-70、72)。在大腸桿菌中表達這些融合的VAR2CSA毒素蛋白。已經(jīng)成功制備了基于來自VAR2CSA的IDl_ID2a和PE38的、被稱為BPT1-1Dl-1D2aFCR3-PE38LR的蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:60)，并且按照方法13中描述的針對結(jié)合癌細胞(表11)以及細胞毒活性進行分析。
[0551]初步數(shù)據(jù)顯示，這種融合VAR2CSA毒素蛋白結(jié)合表達CSA的癌細胞，并且能夠誘導(dǎo)細胞死亡(U20S細胞系的IC50為低于InM)。
[0552]表11.通過流式細胞儀分析的VAR2CSA-PE38與癌細胞的結(jié)合
[0553]用抗PENTA HIS抗體和抗小鼠FITC抗體檢測并通過流式細胞儀分析DBLl-1D2a(裸蛋白)和IDl_ID2a_PE38在200nM與Myla2059細胞(T細胞淋巴瘤)的結(jié)合。結(jié)合作為平均熒光強度(MFI)給出。a)用軟骨素酶ABC處理細胞以從細胞表面移除CS鏈，b)在加入至細胞之前，將蛋白與可溶性CSA(400ug/m)混合，c)對照與僅用第一和第二層抗體染色的細胞相同。
[0554]

DBLl-1D2aID1-1D2a-PE38對照c
結(jié)合細胞24.712.42.3
結(jié)合處理過的細胞a4.42.52.5
結(jié)合的抑制b-
[0555]實施例18
[0556]分析與重組VAR2CSA偶聯(lián)的細胞毒性化合物的抗腫瘤效果
[0557]基于實施例14中的結(jié)果，將要求重組VAR2CSA與相關(guān)的細胞毒性化合物偶聯(lián)并且在體內(nèi)測試性能。相關(guān)化合物與VAR2CSA的偶聯(lián)將會與外部合作伙伴合作或者通過基于合同的協(xié)議外包進行。尤其是，我們分析這些VAR2CSA:化合物融合體能否:
[0558]i)在體內(nèi)被特異性地遞送至腫瘤環(huán)境。
[0559]?)在體內(nèi)腫瘤環(huán)境中集中并且特異性地保留。
[0560]iii)在體內(nèi)以對正常組織最小的傷害殺傷腫瘤細胞。
[0561]按照在實施例12中描述的，建立體內(nèi)模型。用細胞毒性VAR2CSA綴合物處理小鼠，并且按照對于實施例12中未綴合蛋白所描述，測定效果。
[0562]實施例19
[0563]來自異質(zhì)細胞種群的表達CSA的干細胞的純化。
[0564]已經(jīng)報道多能干細胞表達高水平的CSPG4。干細胞還表達VAR2CSA可以結(jié)合的其他含CSA蛋白聚糖，如⑶44。因此，重組VAR2CSA將與適當(dāng)?shù)臉渲?珠)綴合，與除含干細胞或癌干細胞外的異質(zhì)細胞種群混合并且需要通過常規(guī)離心方案純化。針對多種干細胞標記的表達，包括CD44、CD31、CD4、0CT4、S0X2、巢蛋白(Nestin)和Nanog，將通過免疫印跡(與在實施例11中相同)、顯微鏡和FACS (如在實施例中9中)分析純化的細胞。癌干細胞的常見性狀是醛脫氫酶IA的高度表達(ALDH1高)。可以使用AldeFluor?試劑盒(StemCell Technologies)方便地對其進行測量。結(jié)合MDA-MB-231的重組VAR2CSA檢測ALDHl高細胞的亞群，提示VAR2CSA可以結(jié)合人癌干細胞。
[0565]實施例20
[0566]表達⑶44的癌干細胞的鑒別和靶向。
[0567]⑶44目前是用于癌干細胞的最普及的標記并且它是可以結(jié)合重組VAR2CSA的含CSA蛋白聚糖。通過使用與在實施例12-15中相同的方法，將研究未修飾的和修飾的重組VAR2CSA肽是否可以定位、結(jié)合、純化并且潛在地殺死高抗性⑶44陽性癌干細胞。
[0568]實施例21
[0569]循環(huán)腫瘤細胞的檢測
[0570]我們將檢驗重組VAR2CSA是否可以被用作針對癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后標記。癌細胞在從原發(fā)腫瘤脫離后通過血液系統(tǒng)擴散。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的發(fā)生的后續(xù)風(fēng)險是溢出和轉(zhuǎn)移。目前用于檢測CTC的測定靈敏度差并且不能直接找出與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險的相關(guān)性。使用VAR2CSA偶聯(lián)的磁珠和流式細胞儀，我們將研究檢測血流中表達CS的癌細胞的預(yù)后值?？梢允褂眠@種方法作為患者的快速且無痛的檢查。
[0571]實施例22
[0572]潛在的由VAR2CSA靶向的CSPG分子的鑒別
[0573]針對與表達>3000個人膜受體的一組轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的結(jié)合，篩選具有V5標簽的重組VAR2CSA蛋白(DBLl-1D2a)。已經(jīng)鑒別了一組25種受體作為VAR2CSA的潛在靶點(表12)。在HEK293系統(tǒng)和ELISA 二者中，借助結(jié)合特異性的分析通過用CSA和HS抑制，將進一步確認VAR2CSA與這些受體之間的相互作用。
[0574]表12.實驗鑒別為VAR2CSA的潛在靶點的受體。
[0575]基因 Π)名稱UniProt/Swis sProt
BCAN短蛋白聚糖(brman)PGCB HUMAN.096GW7
BDKRB2緩激肽(bradykimn)受體 B2BKRB2 HUMAN.P3Q411
CA9碳酸酐酶 IXCAH9 HUMAN.016790
CCRlO趨化性細胞因子(chemokme)(C-C 基序)受CCRlO HUMAN.P46Q92
體10
CD44CD44 分子C印度血型)CD44=HUMAN.P16070
CDH8I丐粘著蛋白(cadhenn)8，2 型CADH8 HUMAN.P55286
CFB補體因子 BCFAB HUMAN.VOOl51
GABBR2γ-氨基丁酸(GABA)B 受體，2GABR2 HUMAN.075899
GPC3磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypiCaii)3GPC3 HUMAN:P51654
GPC5鱗脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)5GPC5 HUMAN；P78333
GPR65G 蛋白偶聯(lián)受體 65PSYR HUMAN.Q8IYL9
GPRC5BG蛋白偶聯(lián)受體，C家族，5群，成員BGPC5B HUMAN, Q9NZH0
KCNA2鉀電壓門控通道，shaker相關(guān)亞家族，成KCNA2 HUMAN.P16389
PkD2多囊性腎病(polycystic kidney disease)2(常PKD2—HUMAN, 013563
染色體顯性)
PODXL2足糖萼蛋白類似物(podoCalyxm-like)2PDXL2 HUMAN.Q9NZ53
PTPRG蛋白酪氨酸磷酸酶，受體類型，GPTPRG HUMAN.P2347Q
S100A9SlOO 鈣結(jié)合蛋白 A9S1QA9 HUMAN.P06702
SDCl多配體蛋白聚糖(synckcan)ISDCl HUMAN.P18827
[0576]SDC4多配體蛋白聚糖(syndecanHSDC4 HUMAN.P31431
~^TX2突觸融合蛋白(syntaxra)2STX2 HUMAN.P32856
STXBP5突觸融合蛋白(syntaxm)結(jié)合蛋白STXB5 HUMAN, Q5T5CQ

5(tomosyn)
TGFBR3轉(zhuǎn)化生長因子，β 受體 IIITGBR3 HUMAN, Q03167
TMEFFl具有 EGF 樣和兩個卵泡抑制素(follistatm)TEFFl HUMAN.08IYR6
樣結(jié)構(gòu)域I的跨膜蛋白
TMEFF2/TENB2 具有 EGF 樣和兩個卵泡抑制素(follistatm)TEFF2 HUMAN.Q9UIK5
樣結(jié)構(gòu)域2的跨膜蛋白
TMEM154跨膜蛋白154(?
[0577]?λ? ID?\-ftiUniProt/SwissProt
BCAN短蛋白聚糖(bmvican)PGCB HUMAN.096GW7
BDKRB2緩激肽(bradykmm；)受體 B2BKRB2 HUMAN.P3Q411
CA9碳酸酐酶 IXCAH9 HUMAN.016790—
CCRlO趨化性細胞因子(chemokme)(C-C 基序:)受體 10CCRI O—HUMAN.P46092—
CD44CD44 分子(印度血型)CD44 HUMAN.P16Q7Q~
CDH8鈣粘著蛋白(Cadhenn)S，2 型CADH8 HUMAN, P55286
CFB補體因子 BCFAB HUMAN.PQQ751~
GABBR2γ-氨基丁酸(GABA)B 受體，2OABR2 HUMAN.Q75899~
GPC3磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glyp1Cmi)3GPC3 HUMAN.P51654~
GPC5磷脂酰肌醇蛋白聚糖(g〗y(tǒng)p1Can)5GPC5 HUMAN, P78333
GPR65G 蛋白偶聯(lián)受體 65PSYR HUMAN.Q8IYL9~
GPRC5BG蛋白偶聯(lián)受體，C家族，5群，成員BGPC5B HUMm





?.)9Ν/1 !O
KCNA2鉀電壓門控通道，shaker相關(guān)亞家族，成員2KCNA2 HUMAN, P16389
PKD2多囊性腎病(polycystic kidney disease)2(常染色體顯性) PKD2_HUMAN, Q13563
[0578] 15ODX1.2 足糖萼蛋白類似物(podocalyxm-hkePPDXL2 HUlMAM



OVNZ53
PTPRG蛋白酪氨酸磷酸酶.受體類型，GPTPRG HUMAN, P23470
S100A9SlOO 鈣結(jié)合蛋白 A9S10A9 HUMAN, P06702—
SDCl多配體蛋白聚糖(s:oideCan)lSDCl HUMAN, P18827
SDC4多配體蛋白聚糖(syndecan)4SDC4 HUMAN.P31431
STX2突觸融合蛋白(syntaxm)2STX2 HUMAN.P32856~
STXBP5突觸融合蛋白(syntaxm)結(jié)合蛋白 5(tomoSyn)STXB5 HUMAN, Q5T5C0
TGFBR3轉(zhuǎn)化生長因子，β 受體 IIITGBR3 HUMAN, 003167
TMEFFl具有ECiF樣和兩個卵洵抑制素(Tollistatm'i樣結(jié)構(gòu)域]的跨TEFFl HUMAN, Q8IYR6
膜蛋白
TMEFF2/TEN具有EClF樣和兩個卵泡抑制素(follistatm)樣結(jié)構(gòu)域2的路TEFF2 HUMAN, Q9U1K5
B2膜蛋白
TMEM154跨膜蛋白 154"(?)
THBD血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)TRBM HUMAN.P07204
CSPG5硫酸軟骨素蛋白聚糖5(神經(jīng)聚糖(neuroglycan)C)CSPG5 HUMAN, 095196
STXBP5突觸融合蛋白(syntaxm)結(jié)合蛋白 5(tomosyn；)STXB5 HUMAN.Q5T5C0
[0579]討論
[0580]瘧疾是最常見的感染性疾病之一和最嚴重的全球健康問題之一。孕婦尤其容易受到感染，即使之前獲得了免疫力。在本研究中，我們已經(jīng)解決了 PM中與VAR2CSA-CSA相互作用后的分子機制相關(guān)的關(guān)鍵問題。
[0581]前面的工作已經(jīng)提出，VAR2CSA中的最小CSA結(jié)合區(qū)域是DBL2X-1D2b，并且需要 DBLlX 或 DBL3X 用于完全親和力結(jié)合(Dahlback, M., Jorgensen, L.M., Nielsen, Μ.A., Clausen, T.M., Ditlev, S.B., Resende, M., Pinto, V.V., Arnot, D.E., Theander, T.G.,和Salanti, A.J B1l Chem 286,15908-15917)。在本工作的后續(xù)中，我們關(guān)注于DBL2X區(qū)域，對VAR2CSA做出了進一步截短。我們表明，核心CSA結(jié)合位點位于DBL2X結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其包括側(cè)翼結(jié)構(gòu)域間區(qū)域的小部分。如前面所提出的，結(jié)合并不依賴于ID2b區(qū)域或依賴于DBLlX或DBL3X側(cè)翼結(jié)構(gòu)域。根據(jù)IDl-1D2a與IDl-DBL2Xb的特異性CSPG結(jié)合(表3)，這是顯而易見的。最小結(jié)合區(qū)域是IDl-DBL2Xb，其以可與全長VAR2CSA相比的特性結(jié)合CSPG。
[0582]有趣的是，這些新數(shù)據(jù)將核心CSA結(jié)合位點描繪在單一結(jié)構(gòu)域上。前面已經(jīng)示出，DBL2X(和任何其他單一 DBL結(jié)構(gòu)域)與CSA的結(jié)合是非特異性的并且具有弱親和力(Resende, M., Ditlev, S.B., Nielsen, M.A., Bodevin, S., Bruun, S., Pinto, V.V., Clausen, H., Turner, L., Theander, T.G., Salanti, A.,和 Dahlback, M.(2009) Int J Parasitol39，1195-1204)。顯然，IDl和部分ID2a結(jié)構(gòu)域間對CSA結(jié)合來說是必需的。DBLlX_DBL2Xa和IDl-DBL2Xa不結(jié)合CSPG。兩個C端DBL2X邊界(DBL2Xa和DBL2Xb)相差93個氨基酸。因為這些氨基酸的缺失消除了結(jié)合，所以它們對CSA結(jié)合一定是重要的。
[0583]IDl_DBL2Xb最小結(jié)合區(qū)域比全長VAR2CSA小得多，其僅具有62kDa的分子量。VAR2CSA的進一步的大量截短不大可能會在結(jié)合CSA中起作用。我們的數(shù)據(jù)將DBL2X重新定義為較大的功能結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合了側(cè)翼IDl和ID2a結(jié)構(gòu)域間的部分。
[0584]針對PM的基于VAR2CSA的疫苗必須能夠誘導(dǎo)強力的保護性免疫應(yīng)答。在此，最重要的方面是能夠抑制胎盤特異性寄生物粘附的IgG抗體的生成。為了測試我們制備的片段的免疫原性特征，我們將其用于大鼠的免疫中。針對所有含有CSA結(jié)合位點的片段產(chǎn)生的血清抑制了對CSA的寄生物粘附。重要的是，針對IDl-1D2a產(chǎn)生的血清導(dǎo)致幾乎完全抑制。這提示，最小CSA結(jié)合片段保持誘導(dǎo)強抗粘附免疫應(yīng)答的能力。這種論斷由以下事實進一步支持:從IDl-1D2a上的抗FV2血清純化的抗體保留了大部分粘附阻斷活性，以及抗IDl-1D2a抗體消耗的抗FV2樣品喪失了其活性的大部分。這表明，用于誘導(dǎo)粘附阻斷抗體所需的表位位于該區(qū)域內(nèi)。
[0585]在本研究中，我們已經(jīng)在FCR3寄生物的同源抑制中測試了抗VAR2CSA血清與CSA的結(jié)合。重要的是，疫苗能夠抑制胎盤粘附而無論寄生物株系來源。因此對疫苗開發(fā)的主要擔(dān)憂是寄生物變體中的高的克隆間多樣性。盡管重組全長VAR2CSA免疫原性非常強，但是所制備的抗體不具有交叉抑制性(Avril, M., Hathaway, M.J., Srivastava, A., Dechavanne, S., Homme I, M., Beeson, J.G., Smith, J.D.,和 Gama in, B.PLoS One 6, el6622)。最近的研究表明，利用來自FCR3的ID1-DBL2X的DNA疫苗接種誘導(dǎo)具有交叉抑制性的抗體，抑制其他實驗室株系以及本領(lǐng)域中分離的寄生物的CSA粘附(Bordbar, B., Tuikue-Ndam, N., Bigey, P., Doritchamou, J., Scherman, D.,和 Deloron, P.Vaccine (疫苗))。這支持了這種小型片段在PM疫苗中的用途。
[0586]Cardin和Weintraub預(yù)測，GAG結(jié)合位點將會采取兩種形式之一(Cardin, A.D.,和 Weintraub, H.J.(1989)Arter1sclerosis 9,21-32)。它們是 X-B-B-X-B-X 和Χ-Β-Β-Β-Χ-Χ-Β-Χ，其中X是任何親水性殘基，并且B是任何堿性殘基，優(yōu)選精氨酸。二者都描述了針對硫酸化二糖的結(jié)合位點。盡管可以發(fā)生許多相互作用，帶負電的硫酸鹽與堿性氨基酸之間的離子相互作用被認為是最重要的。我們使在最小結(jié)合區(qū)域內(nèi)的這兩個位點突變；在 DBL2X 中的 625-GKNLKKRY-632 和在 IDl 中的 458-NKKKECKD-465。我們還刪除了位于DBL2X的N端部分中的二態(tài)序列基序(DSM)內(nèi)的一個大區(qū)域，因為已經(jīng)提示其具有結(jié)合功能。DSM區(qū)域的缺失對CSA結(jié)合沒有影響。推定的GAG結(jié)合位點中的任何置換也沒有影響。這清楚地表明，這些位點在CSA結(jié)合中具有很少作用或沒有作用。
[0587]已經(jīng)表明，對人CSA受體的最小結(jié)合要求是含有2-4C4硫酸化GalNAc單糖的十二糖(AlkhaliI, A., Achur, R.N., Valiyaveettil, M., Ockenhouse, C.F.,和 Gowda, D.C.(2000) J B1l Chem 275,40357-40364)。很明顯，表達VAR2CSA的寄生物在體內(nèi)對僅攜帶2-8% C4硫酸化二糖單元的CSA具有高特異性。為了檢驗VAR2CSA-CSA復(fù)合物形成是否取決于離子相互作用，我們在不同的鹽濃度下測試了結(jié)合。當(dāng)用Log對Log[Na+]作圖時，IDl-1D2a、DBLlX_ID2a 和 FV2 在 150mM-300mM NaCl 中的結(jié)合顯示出線性關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)結(jié)合取決于最大2-3個離子相互作用。有趣的是，全長蛋白質(zhì)的值高于較短片段的值，表明該蛋白質(zhì)與CSA進行額外的離子相互作用。在本研究中，我們已經(jīng)篩選了含有CSA特異性的高親和力結(jié)合區(qū)域的片段?？梢栽诘鞍椎南掠螀^(qū)域發(fā)生更多的相互作用，但是核心位點位于DBL2X內(nèi)。外推并尋找Y截距([Na+] = 1M> Log[Na+]=O)告訴我們，F(xiàn)V2的Kd,非離子=5.9μπι, DBLlX-1D2a的KD,非離子=3.4 μ m，并且IDl_ID2a的Kd,嫌=0.7 urn.這表明，僅25-30 %的VAR2CSA-CSA結(jié)合可能是由離子相互作用引起的。這與其他GAG結(jié)合蛋白不同，其他GAG結(jié)合蛋白在相似測定中已經(jīng)顯示出對離子相互作用的高達 80-90% 的依賴性(FalIer, B., Mely, Y., Gerard, D.,和 Bieth, J.G.(1992)B1chemistry 31, 8285-8290 ；Hileman, R.Ε., Fromm, J.R., ffeiler, J.M.,和 Linhardt, R.J.(1998) B1essays 20,156-167)。
[0588]我們的數(shù)據(jù)提示，VAR2CSA-CSA相互作用與常規(guī)的GAG蛋白相互作用不一致。我們假設(shè)，高CSA親和力是通過多價相互作用獲得的，其可以包括與CSA碳水化合物骨架發(fā)生非離子相互作用的多個結(jié)合位點。一些相互作用是離子相互作用并且一些程度的硫酸化對VAR2CSA結(jié)合來說是必需的。因此可能存在堿性氨基酸與硫酸鹽之間的相互作用，但是這種并非親和力的決定因素。
[0589]在本研究中，我們已經(jīng)定義了一種小型單一結(jié)構(gòu)域VAR2CSA片段，其可以在真核細胞中制備為功能性CSA結(jié)合蛋白，并且具有誘導(dǎo)高度粘附阻斷抗體的能力。這種片段具有成為針對PM的疫苗的有力候選物的潛力。
[0590]數(shù)據(jù)確定了特異性結(jié)合CSA從而介導(dǎo)感染的紅細胞的胎盤結(jié)合的VAR2CSA的小型重組部分。我們表明，通過與在CSPG4或在本研究中鑒別的其他蛋白骨架上存在的CSA的相互作用，這種VAR2CSA片段還特異性結(jié)合癌細胞。此外，我們發(fā)現(xiàn)基于這種小型片段的VAR2CSA多肽與癌細胞的結(jié)合抑制了細胞的遷移和侵入。這些VAR2CSA多肽還抑制了典型的ERK信號傳導(dǎo)，并且我們發(fā)現(xiàn)與毒素融合的VAR2CSA多肽有效殺死癌細胞。
[0591]方法
[0592]方法1-昆蟲細胞中的克隆和蛋白表達
[0593]由密碼子優(yōu)化的FCR3 (GenBank 編號⑶249598)或 3D7 (GenBank 編號 JQ247428)VAR2CSA基因，使用特異性引物(表2)，擴增VAR2CSA序列片段。在單步PCR中擴增簡單片段。在兩步PCR中制備氨基酸置換構(gòu)建體。第一 PCR由密碼子優(yōu)化的FCR3模板擴增兩個片段，含有重疊的互補端。第二 PCR利用兩個重疊片段作為模板，利用對外部邊界特異性的引物擴增總構(gòu)建體。對所有片段進行測序驗證。將片段克隆至桿狀病毒載體pAcGP67-A(BDB1sciences)，并修飾為在C端含有V5和His標簽。將在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達的蛋白作為可溶性蛋白分泌至細胞培養(yǎng)物上清液中。簡而言之，線性化的Bakpak6桿狀病毒DNA (BD B1sciences)與pAcGP67_A質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細胞中，以產(chǎn)生重組病毒顆粒。使用1ml的第二擴增物，在400ml無血清培養(yǎng)基(10486、GIBC0)中以IxlO6個細胞/ml的密度感染High-Five細胞。在初始感染3天后，從上清液中收獲分泌的重組蛋白。在蛋白純化前，將上清液過濾(0.2 μ m)、透析并濃縮。
[0594]方法2-蛋白純化與SDS-PAGE
[0595]使用ΑΧΤΑ橫向流(cross-flow) (GE Healthcare)將含有分泌的重組蛋白的過濾的上清液透析。透析在 1mM NaH2PO4(pH 7.4, Sigma-Aldrich)和 500mM NaCl 中進行。將得到的溶液過濾(0.2μπι)并且加入咪唑至最終濃度為15mM。之后在l_ml HisSelect柱(H8286, Sigma-Aldrich)上純化蛋白。用 1mM NaH2PO4(pH 7.4)、500mM NaCl、和 500mM咪唑?qū)⒔Y(jié)合的蛋白洗脫。通過使用HiLoad 16/60Superdex 200柱(GE Healthcare)的在20mM Tris (pH 8)和200mM NaCl中的尺寸排阻層析，進一步純化石英晶體微量天平測量和SAXS所需的蛋白，以得到單體。通過SDS-PAGE確認蛋白的純度和結(jié)構(gòu)完整性。
[0596]方法3-ELISA
[0597]對于CSPG (牛)(D8428，Sigma)或 HSPG (H4777，Sigma)在 3 μ g/ml 的濃度下，并且對于 CSA (C9819，Sigma)、CSC (400675，Seikagaku)、和 CSB(C3788, Sigma)在 100 μ g/ml 的濃度下，將Falcon微量滴定板(351172，BD B1sciences)在4°C下溫育過夜。之后用TSM結(jié)合緩沖液(25°C下的 20mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2、0.05% 吐溫-20、I % BSA、PH7.4)將平板在搖床上在37°C下封閉2小時。在TSM結(jié)合緩沖液中制備2倍稀釋系列(1.56mM-100mM)的蛋白，并且將其加入至平板，其在搖床上在37°C下溫育I小時。所有測量均以一式三份進行。將平板在TSM洗滌緩沖液中洗滌三次(25°C下的20mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2,0.05% 吐溫-20、ΡΗ7.4)。之后用 1:3000 抗 V5-HRP 抗體(R96125，Invitrogen)將平板在TSM結(jié)合緩沖液中在搖床上在37°C下溫育I小時。將平板在TSM洗滌緩沖液中洗滌三次。最終用鄰苯二胺底物(DAKO)使平板顯色15分鐘。用2.5M H2SO4使反應(yīng)猝滅。在490nm測量吸光度。
[0598]方法4-石英晶體微量天平(Attana A100)
[0599]使用鍍金的1MHz AT切割的石英晶體、聚苯乙烯芯片(3611_3103Attana AB)，在Attana AlOO (Attana AB)上進行實驗。將所有緩沖劑和試劑過濾至0.2 μ m。配體為CSPG (牛)(D8428，Sigma)或 HSPG(H4777，Sigma)，以 100 μ g/ml 的濃度包被。通過在室溫下加入配體溶液并溫育30分鐘以穩(wěn)定狀態(tài)完成包被。接著用含有0.1%無Ig BSA(BSA-50,Rockland)的PBS將平板在室溫下封閉30分鐘。在每次實驗前，使用制造商預(yù)定的每日洗滌程序，用1% SDS洗滌Attana AlOO0洗滌之后，將運行緩沖液切換為在25°C下的流量為25 μ I/分鐘的PBS，并且使機器穩(wěn)定在0.5Hz/分鐘的最大頻率變化。一旦穩(wěn)定，即多次注射PBS,以顯示注射過程最低限度地影響基線。在樣品注射前，注射PBS作為空白。以1:3稀釋系列(0.25 μ g/ml-60 μ g/ml)注射分析物，以最低濃度開始。將結(jié)合時間設(shè)定為84秒并且解離時間為5分鐘。歸因于高結(jié)合親和力，在注射之后不可能再生結(jié)合表面。在AttesterEvaluat1n軟件(Attana AB)中處理收集的數(shù)據(jù)。以簡單1:1模型擬合曲線。通過曲線擬合確定km和Iitxff,并且根據(jù)Kd = koff/kon計算Kd。
[0600]方法5-鹽滴定測定
[0601]在ELISA中基于結(jié)合測定對VAR2CSA-CSA結(jié)合的離子依賴性進行測試。以3 μ g/ml包被CSPG。以幾個不同的NaCl濃度(150mM、200mM、250mUP 300mM)加入1:2稀釋系列(400-1.56nM)的蛋白。所有實驗均以一式三份進行。在Graphpad Prism中使用非線性回歸(最小平方與hill斜率擬合)，針對每個滴定系列計算Kd值。
[0602]方法6-動物免疫與血清提取
[0603]所有動物免疫均符合國家和歐洲規(guī)定。用在弗氏完全佐劑(Freunds completeadjuvant) (F5881, Sigma-Aldrich)中的30 μ g重組蛋白對Wistar大鼠進行皮下注射。用在弗氏不完全佐劑(F5506，Sigma-Aldrich)中的15 μ g蛋白以3周的間隔加強免疫三次。在每次加強之后一周采集血液樣品，通過離心提取血清。
[0604]方法7-1gG親和純化
[0605]在Iml NHS 活化的 HP 柱(HiTrap NHS 活化的 HP，17-0716-01，GE Healthcare)上，親和純化來自用全長FCR3VAR2CSA (FV2)免疫的大鼠的血清儲備品，所述柱含有固定化多結(jié)構(gòu)域 FCR3 蛋白(DBLlX-DBL2Xa、DBLlX_ID2a、IDl_ID2a、或 ID1-DBL4 ε )和全長 FV2。根據(jù)制造商規(guī)程完成純化。簡而言之，通過將Iml偶聯(lián)緩沖液(0.2M NaHCO3,0.5M NaCl,pH 8.3)與配體(濃度0.5-10mg/ml)的1:1溶液加入至柱中，完成配體與柱的偶聯(lián)。將柱密封并在室溫下溫育30分鐘，接著在4°C下溫育過夜。用6ml緩沖液A (0.5M乙醇胺，0.5MNaCl，pH 8.3)、6ml緩沖液B (0.1M乙酸酯，0.5M NaCl，pH 4)以及最終6ml緩沖液A洗滌柱。在室溫下30分鐘的溫育階段之后，以相反的順序(緩沖液B、A、B)重復(fù)洗滌。在純化血清前，注射8-10ml PBS以調(diào)節(jié)pH。使樣品通過柱3_5次。在用1ml洗脫緩沖液(0.1M檸檬酸，pH 2.7)洗脫抗體前，用1ml PBS洗滌柱。
[0606]方法8-惡性瘧原蟲寄生物培養(yǎng)物
[0607]使用5%血細胞比容(人血型O Rh+)，在補充有25mM NaHC03、0.125 μ g/ml硫酸慶大霉素(gentamycin sulfate) (BE02012E，Lonza)、0.125 μ g/ml AlbuMAX 11(11021029，Invitrogen)和2%正常人血清的寄生物培養(yǎng)基RPM1- 1640 (BE12115F, Lonza)中，維持惡性瘧原蟲FCR3型寄生物的培養(yǎng)物。在BeWo細胞(CCL98，ATCC)上對IE反復(fù)淘選以維持CSA粘附表型。此外，分離株測試為支原體陰性并且通過使用嵌套GLURP (富含谷氨酸的蛋白)和MSP-2(裂殖子表面蛋白2)引物的PCR常規(guī)確定基因型。
[0608]方法9-晚期營養(yǎng)體的純化
[0609]針對晚期營養(yǎng)體和裂殖體階段，使用MACS CS柱(130-041-305，Miltenyi B1tec)和Var1-MACS磁體(Miltenyi B1tec)使寄生物培養(yǎng)物在強磁場中富集化。簡而言之，向柱施加寄生物培養(yǎng)物懸浮液。之后用在PBS中的2%胎牛血清(F6178，Sigma-Aldrich)洗滌柱。在從磁體中分離后，將晚期感染的紅細胞從柱中洗脫，旋轉(zhuǎn)沉淀并且在PBS中的2%胎牛血清中重懸并稀釋為2xl06IEs/ml的濃度。
[0610]方法10-流式細胞儀(FCM)
[0611]通過流式細胞儀(FCM)，測量與純化的晚期營養(yǎng)體感染的紅細胞上的天然VAR2CSA結(jié)合的抗體。用血清(針對非特異性結(jié)合，通過與未感染的紅細胞預(yù)溫育消耗的)標記在含有2% FCS的PBS中的濃度為2xl05IEs/ml的100 μ I純化的晚期寄生物，最終濃度為1:10。在含有2% FCS的PBS中洗滌細胞三次。之后用最終濃度為2 μ g/ml的溴化乙錠(15585011, Invitrogen)和 FITC 標記的二級抗大鼠 IgG 抗體(62-9511, Invitrogen)的1:100稀釋物進一步標記細胞。作為陰性對照，還利用來自用除VAR2CSA外的抗原并且僅用二級抗體免疫的大鼠的血清，溫育晚期寄生物。使用FC500流式細胞儀(BeckmannCoulter)收集來自5000個溴化乙錠陽性IE的數(shù)據(jù)。最終，使用WinList 5.0軟件(VerifySoftware House)確定中位數(shù)突光強度。
[0612]方法11-結(jié)合CSPG的寄生物的抑制
[0613]針對其抑制IE結(jié)合CSPG的能力，分析血清抗體。這利用機器人標準化洗滌方法，以96孔板形式完成。用2 μ g/ml CSPG(D8428，Sigma-Aldrich)包被孔。將在100 μ I中總計2χ105氚標記的(次黃嘌呤單鹽酸鹽，PerkinElmer, NET177005MC)晚期IE以一式三份加入至孔中。之后在37°C用血清將標記的IE溫育90分鐘。通過移液機器人(BeckmanCoulter)洗去未結(jié)合的IE。通過在Topcount NXT (Perkin -Elmer)上的液體閃爍計數(shù),確定粘附IE的比例。
[0614]方法12a_癌細胞結(jié)合測定
[0615]使用流式細胞儀(FCM)測試VAR2CSA最小結(jié)合多肽與在各種細胞系表面上表達的CSPG的反應(yīng)性。在補充有10%胎牛血清(CH0細胞，C32)的RPM1、維持在37°C下5%二氧化碳中或由(PD緩沖液中人血液樣品(人紅細胞)純化的Hams F12 (Beffo)中，培養(yǎng)細胞。在黑暗中、+4C、平靜攪拌的情況下，細胞的等分試樣(1X105)先后暴露于VAR2CSA最小結(jié)合多肽(150、75 或 37nM)和在 FACS2 (PBS+2 % FCS)中稀釋的 a -V5-FITC(1:800)(Invitrogen) 30分鐘。作為陰性對照，使用最小結(jié)合多肽的截短形式和FACS2緩沖液?；谇跋蚝蛡?cè)散射信號，門控(gated)完整的細胞。使用FC500流式細胞記錄儀(BeckmanCoulter)從最少5000個細胞獲得數(shù)據(jù)。在單一測定中處理并分析特定細胞系有關(guān)的所有樣品。
[0616]方法12b_癌細胞結(jié)合測定
[0617]作為以上流式細胞儀測定的備選方案，用VAR2CSA最小結(jié)合多肽和在HBSS中稀釋的a-V5-FITC (1:500) (Invitrogen)溫育細胞。以與上面所寫的相同的濃度使用VAR2CSA多肽。在a-V5-FITC染色之后，將細胞在HBSS中洗滌3次，在無酶細胞脫落緩沖液(Invitrogen)中收集并且在 FACS Calibur (BD B1sciences)上分析 FL-1 信號強度。
[0618]縮寫:CIDR，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域間區(qū)域；CSA，硫酸軟骨素A;CSPG，硫酸軟骨素蛋白聚糖，DBL, Duffy結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域；FCM，流式細胞儀；FV2，VAR2CSA蛋白的不含N端區(qū)段的全長胞外結(jié)構(gòu)域；HSPG，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；ID，結(jié)構(gòu)域間；IE，惡性瘧原蟲感染的紅細胞；NTS，N端區(qū)段；PM，胎盤瘧疾；PfEMPl，惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白I ;PM，胎盤瘧疾。
[0619]方法13-融合VAR2CSA毒素蛋白的體外細胞毒性測試
[0620]實驗前一天，將癌細胞系以500，O個細胞/孔接種在96孔板中。在實驗當(dāng)天，將融合VAR2CSA-毒素的10倍稀釋系列(范圍為10 μ g/ml至0.01ng/ml)和對照蛋白(不含毒素的VAR2CSA)加入至單獨的孔中。對于兩種蛋白，制備還含有400 μ g/ml的CSA的相似的稀釋系列并且加入至單獨的孔中。將具有蛋白的孔在37°C溫育72小時。通過MTT細胞增殖測定分析細胞死亡，其中讀數(shù)為在570nm的吸光度。
[0621 ] 方法14-石蠟包埋的人組織樣品的染色
[0622] 使用免疫組織化學(xué)(IHC)研究重組VAR2CSA與從人患者獲得的原發(fā)癌組織的結(jié)合。將點在未接受抗原修復(fù)(antigen retrieval)的載玻片上的石臘包埋的組織用
0.l-500nM V5-VAR2CSA變體或V5-對照蛋白質(zhì)(DBL4)在室溫下溫育lh，洗滌8分鐘，用I: 700小鼠抗V5抗體溫育30分鐘，洗滌8分鐘。隨后，使用UltraMap抗小鼠HRP，使用Ventana發(fā)現(xiàn)XT平臺，檢測結(jié)合的抗V5。
【權(quán)利要求】
1.一種VAR2CSA的分離的蛋白片段，所述片段由以下連續(xù)的氨基酸序列組成: a)IDl，和 b)DBL2Xb,以及任選地
c)ID2a。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的蛋白片段，所述片段以下述親和力結(jié)合在蛋白聚糖(CSPG)上的硫酸軟骨素A (CSA)，通過Kd測量的所述親和力低于ΙΟΟηΜ，如低于80nM，如低于70nM,如低于60nM，如低于50nM，如低于40nM，如低于30nM，如低于26nM，如低于24nM，如低于22nM，如低于20nM，如低于18nM，如低于16nM，如低于14nM，如低于12nM，如低于ΙΟηΜ，如低于9nM,如低于8nM,如低于7nM,如低于6nM、或低于4nM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項所述的分離的蛋白片段，所述片段包含與以下中的任一個氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的1-577、SEQ ID NO:3的 1-592、SEQ ID NO:4 的 1-579、SEQ ID NO:5 的 1-576、SEQ ID NO: 10 的 1-586、SEQ IDNO:11 的 1-579、SEQ ID NO:29 的 1-565、SEQ ID NO:34 的 1-584、SEQ ID NO:36 的 1-569、SEQ ID NO:37 的 1-575,SEQ ID NO:38 的 1-592,SEQ ID NO:41 的 1-603,SEQ ID NO:43 的1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ IDNO:53 的 1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的分離的蛋白片段，所述片段包含與以下中的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的578-640、SEQ ID NO:3的593-656、SEQ ID NO:4 的 580-643、SEQ ID NO:5 的 577-640、SEQ ID NO: 10 的 587-650、SEQ ID NO: 11 的 580-643、SEQ ID NO:29 的 566-628、SEQ ID NO:34 的 585-647、SEQ IDNO:36 的 570-632、SEQ ID NO:37 的 576-639、SEQ ID NO:38 的 593-655、SEQ ID NO:41 的604-667、SEQ ID NO:43 的 589-652、SEQ ID NO:44 的 566-628、SEQ ID NO:45 的 590-653、SEQ ID NO:48 的 574-637、SEQ ID NO: 53 的 584-646、或 SEQ ID NO: 54 的 570-632。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的分離的蛋白片段，所述片段包含與以下中的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID N0:2、6、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、35、39、40、42、46、47、49、50、51、或 52。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的分離的蛋白片段，所述片段由與以下中的任一個氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列組成:SEQ ID NO:1的1-577、SEQ IDNO:3 的 1-592、SEQ ID NO:4 的 1-579、SEQ ID NO:5 的 1-576、SEQ ID N0:10 的 1-586、SEQ ID NO:11 的 1-579,SEQ ID NO:29 的 1-565,SEQ ID NO:34 的 1-584,SEQ ID NO:36 的1-569、SEQ ID NO:37 的 1-575、SEQ ID NO:38 的 1-592、SEQ ID NO:41 的 1-603、SEQ IDNO:43 的 1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ ID NO:53 的 1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的蛋白片段，所述片段由選自由以下組成的列表的氨基酸序列組成:SEQ ID N0:l、3-5、10、ll、29、34、36-38、41、43-45、48、53、和 54。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的分離的蛋白片段，所述片段由以下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列長度小于700個氨基酸，如小于690個氨基酸，如小于680個氨基酸，如小于670個氨基酸，如小于660個氨基酸，如小于650個氨基酸，如小于640個氨基酸，如小于630個氨基酸，如小于620個氨基酸，如小于610個氨基酸，如小于600個氨基酸，如小于590個氨基酸，如小于580個氨基酸，如小于570個氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的分離的蛋白片段，所述片段是基本上純的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的分離的蛋白片段，其中在SDS-PAGE上在非還原條件下，所述蛋白片段具有小于約10kDa的分子量。
11.根據(jù)權(quán)利要求ι-?ο中任一項所述的分離的蛋白片段，其中所述蛋白片段是重組蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的分離的蛋白片段，其中所述蛋白片段是非糖基化的。
13.一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的蛋白片段。
14.一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的蛋白片段。
15.一種載體，所述載體包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的分離的核酸分子。
16.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含根據(jù)權(quán)利要求15所述的載體。
17.一種用于制備如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構(gòu)建體表達的條件下在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中培養(yǎng)如在權(quán)利要求16中所定義的細胞，以及從所述培養(yǎng)基中回收得到的蛋白片段。
18.一種綴合物或融合蛋白，所述綴合物或融合蛋白包含:VAR2CSA多肽；和治療或診斷效應(yīng)部分，如細胞毒性部分、螢光標記、和/或放射性標記。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的綴合物，其中所述VAR2CSA多肽是或包含如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19中任一項所述的綴合物，其中所述細胞毒性部分選自刺孢霉素、耳他汀、多柔比星、美坦生類化合物、紫杉醇、海鞘素、格爾德霉素、甲氨蝶呤及其衍生物、細胞毒性蛋白如假單胞菌(Pseudomonas)外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白毒素、美洲商陸抗病毒蛋白、肥皂草毒蛋白、白樹毒蛋白以及它們的功能變體、片段、和組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的綴合物，其中所述細胞毒性部分是并非衍生自天然存在的化合物的合成化學(xué)毒素。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項所述的綴合物，其中所述標記選自由以下組成的組:螢光染料和金屬、發(fā)色染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性核素和顆粒。
23.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的綴合物，其中所述治療或診斷效應(yīng)部分是抗炎藥。
24.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的綴合物，其中所述治療或診斷效應(yīng)部分是CSPG4、CD44、或表I中例舉的但不限于其的其他蛋白聚糖。
25.一種組合物，所述組合物包含如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物。
26.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物，其用作藥物或診斷劑。
27.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物，其用于診斷。
28.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物。
29.一種用于在生物樣品中檢測如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物的方法，所述方法包括: a)獲得生物樣品； b)使所述生物樣品與根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體接觸；以及 c)檢測所述抗體與所述蛋白片段或綴合物的復(fù)合物，如果存在的話； 作為所述樣品中存在所述蛋白片段或綴合物的指示。
30.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物用于制備藥物的用途。
31.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物，其用于治療如在癌癥、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、多發(fā)性硬化和神經(jīng)損傷后的愈合、軟骨修復(fù)、傷口愈合中，以及在銀屑病中與涉及CSA的表達、如不適當(dāng)?shù)谋磉_的病癥相關(guān)的任何適應(yīng)證。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的蛋白片段，其中所述癌癥選自所有表達CSA的惡性疾病，包括癌(包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細胞癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、宮頸癌、睪丸癌、基底細胞皮膚癌、透明細胞腎細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、外陰角化鱗狀細胞癌和外陰基底細胞癌)，肉瘤(包括但不限于纖維肉瘤、去分化軟骨和脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液性脂肪肉瘤、子宮體平滑肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤和橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、孤立性纖維瘤)，造血系統(tǒng)癌(包括但不限于慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓細胞白血病(AML)、B細胞、T細胞和大顆粒狀淋巴瘤)，神經(jīng)上皮組織的腫瘤，諸如但不限于星形細胞瘤(多形性黃色星形細胞瘤、纖維型星形細胞瘤、間變型星形細胞瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、脈絡(luò)叢腫瘤、少星形細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤(嗅神經(jīng)母細胞瘤和神經(jīng)節(jié)母細胞瘤)、髓母細胞瘤、非典型畸胎樣橫紋肌樣腫瘤和所有類型的神經(jīng)內(nèi)分泌癌，和任何其他的表達CSA的癌癥。
33.一種用于治療如在癌癥、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、多發(fā)性硬化、由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的病理病癥、軟骨和疤痕組織的病癥中，如在風(fēng)濕病、軟骨修復(fù)或傷口愈合中，或者在銀屑病中，與CSA的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)的任何適應(yīng)證的方法；所述方法包括向需要其的受試者施用治療上或預(yù)防上有效量的如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物。
34.一種用于預(yù)防如在癌癥、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的病理病癥、軟骨和疤痕組織的病癥中，如在風(fēng)濕病、軟骨修復(fù)或傷口愈合中，或者在銀屑病中，與CSA的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)的適應(yīng)證或病癥的發(fā)生的方法；所述方法包括向需要其的受試者施用治療上或預(yù)防上有效量的如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物。
35.一種核酸探針，所述核酸探針能夠在嚴格條件下與根據(jù)權(quán)利要求14-15中任一項所述的核酸分子雜交。
36.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物在體液如血液、血漿、尿液、唾液、糞便、腦脊液、淋巴液、胃液、胸膜液、軟骨液、精子、和/或組織中作為生物標記物用于適應(yīng)證或病癥的診斷和/或預(yù)后的用途，所述適應(yīng)證或病癥與CSA的表達、如不適當(dāng)表達相關(guān)，如惡性疾病、關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病、由神經(jīng)損傷導(dǎo)致的病理病癥、軟骨和疤痕組織的病癥，如在風(fēng)濕病或傷口愈合中，或者癌癥疾病，如腦腫瘤、肝腫瘤和生殖道中的腫瘤。
37.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求24所述的綴合物如在疫苗中用于免疫受試者的用途。
38.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求24所述的綴合物作為靶向部分用于分離細胞的用途，所述細胞表達CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖。
39.一種用于分離和/或檢測生物樣品中的細胞如癌癥干細胞或循環(huán)癌細胞(CTC)的方法，所述細胞表達CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖，所述方法包括: a)獲得包含表達⑶44和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的細胞的生物樣品； b)使所述生物樣品與任選地與固體支持物偶聯(lián)的如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物接觸；以及 c)純化、分離和/或檢測表達⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的所述細胞與所述蛋白片段或綴合物的復(fù)合物。
40.一種診斷方法，所述診斷方法用于檢測對惡性疾病做出反應(yīng)的體液如血液、血漿、尿液、脊髓液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液、骨髓、精液、精子、前列腺液、糞便、胃液、唾液、眼液、肺吸出物、和淋巴液中升高的CSA水平，所述方法包括下列步驟:使所述體液與如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物接觸，以及檢測與所述體液中CSA形成的復(fù)合物。
41.一種用于純化生物樣品中⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的方法，所述方法包括: a)獲得包含CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的生物樣品； b)使所述生物樣品與任選地與固體支持物偶聯(lián)的如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物接觸；以及 c)純化或分離所述CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖與所述蛋白片段或綴合物的復(fù)合物。
42.如在權(quán)利要求1-11中任一項所定義的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的綴合物、或根據(jù)權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其與任何其他適合的抗癌藥組合。
【文檔編號】C07K14/445GK104136041SQ201380008730
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月9日
【發(fā)明者】阿里·薩蘭蒂, 索爾·格倫特維·特安德, 馬斯·道高, 莫滕·尼爾森, 馬德琳·達爾貝克, 托馬斯·曼德爾·克勞森 申請人:Var2制藥有限公司