一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法。具體的說，就是以健康成年男性新鮮尿液為原料，經(jīng)過甲殼質(zhì)吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析、吸附柱層析以及親和層析等現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)來制備高純度的烏司他丁，可以將總收率提高到70％以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提升約50％。
【專利說明】一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及一種特異性樹脂處理再生提高柱效制備收率高、效價(jià)穩(wěn)定的烏司他丁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]烏司他丁(ULinastatin)系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強(qiáng)的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約37000-43000，屬于蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子(MDF)產(chǎn)生、清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對(duì)內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時(shí)的循環(huán)狀態(tài)等。
[0003]1909年歐洲首先報(bào)道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體受到感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)、給予糖皮質(zhì)激素等刺激時(shí)，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開發(fā)上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的治療藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。
[0004]本發(fā)明人自2008年開始對(duì)UTI的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，采用現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，使UTI的總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統(tǒng)方法提取烏司他丁收率過低、效價(jià)不高不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，采用特異性樹脂處理再生提高柱效法來純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁的收率，保證了效價(jià)的穩(wěn)定。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0007]—種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法，其特征在于:選用特異性樹脂處理再生法來純化烏司他丁，可以使總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提聞約50 。
[0008]該技術(shù)方案中，其技術(shù)特征還在于所述方法包括如下步驟:
[0009]I)烏司他丁粗加工
[0010]稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
`[0011]2)吸附柱層析(以0.25L DEAE樹脂柱為例)[0012]2.1)將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置，反復(fù)多次，純化水浸沒過夜。
[0013]2.2)將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5mol/L鹽酸浸沒，攪拌，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5mol/L NaOH溶液浸泡，攪拌，過濾，再用純化水洗至中性。
[0014]2.3)將上述經(jīng)處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復(fù)平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用。
[0015]2.4)將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱。
[0016]2.5)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60°C水浴攪拌加熱10小時(shí)；
[0017]2.6)將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在120_130mL/min左右；
[0018]2.7)用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120-130mL/min，得洗脫液；
[0019]2.8)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。 [0020]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
[0021]3.1)用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在
120-1 30mT,/mi η ；
[0022]3.2)上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，流速120-130mL/min左右，收集洗脫液；
[0023]3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120-130mL/min，密封待用；
[0024]3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至一定體積，超濾液中加入一定量磷酸氫二鈉溶液，繼續(xù)超濾至同一體積，然后再加入等量磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至相同體積。
[0025]4)沉淀
[0026]超濾液中按1: 6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0027]5)凍干
[0028]將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0029]經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率高達(dá)70%以上，按中國藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá)5000iu/mg以上，柱效提高約50%。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0031]選用樹脂再生提高柱效法純化烏司他丁，可以更有效的去除烏司他丁中的多種雜蛋白，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而使產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過工藝的不斷改進(jìn)和完善，使得烏司他丁總收率達(dá)到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，節(jié)約了成本，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制。
[0033]實(shí)施例1
[0034]I)烏司他丁粗加工
[0035]稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0036]2)吸附柱層析(以0.25L DEAE樹脂柱為例)
[0037]2.1)將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置I小時(shí)，傾去上清液及細(xì)小顆粒，反復(fù)三次，純化水浸沒過夜。
[0038]2.2)將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5mol/L鹽酸浸沒，攪拌I小時(shí)，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5mol/LNa0H溶液浸泡，攪拌I小時(shí)，過濾，再用純化水洗至中性。
[0039]2.3)將上述經(jīng)處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復(fù)平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用。
[0040]2.4)將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱
[0041]2.5)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60°C水浴攪拌加熱10小時(shí)；
[0042]2.6)將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在120_130mL/min左右；
[0043]2.7)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；
[0044]2.8)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0045]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
[0046]3.1)用3.0L的洗脫 液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在 120mL/min ；
[0047]3.2)上樣結(jié)束后，用IOL的洗脫液C洗脫，流速120mL/min左右，收集洗脫液；
[0048]3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用5.0L的洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120mL/min，密封待用；
[0049]3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續(xù)超濾至170mL，然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至170mL。
[0050]4)沉淀
[0051]超濾液中按1: 6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0052]5)凍干
[0053]將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0054]經(jīng)核算，柱效提高51 %，所得烏司他丁總收率為72%，按中國藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá)5295iu/mg。
[0055]實(shí)施例2
[0056]I)烏司他丁粗加工
[0057]稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0058]2)吸附柱層析(以0.25L DEAE樹脂柱為例)
[0059]2.1)將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置I小時(shí)，傾去上清液及細(xì)小顆粒，反復(fù)三次，純化水浸沒過夜。[0060]2.2)將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5mol/L鹽酸浸沒，攪拌1小時(shí)，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5mol/LNa0H溶液浸泡，攪拌1小時(shí)，過濾，再用純化水洗至中性。
[0061]2.3)將上述經(jīng)處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復(fù)平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用。
[0062]2.4)將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱
[0063]2.5)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60°C水浴攪拌加熱10小時(shí)；
[0064]2.6)將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在120_130mL/min左右；
[0065]2.7)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130mL/min，得洗脫液；
[0066]2.8)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0067]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
[0068]3.1)用3.0L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在 130mL/min ；
[0069]3.2)上樣結(jié)束后，用IOL的洗脫液C洗脫，流速130mL/min左右，收集洗脫液；
[0070]3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用7.5L的洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在130mL/min，密封待用；
[0071]3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續(xù)超濾至170mL，然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至170mL。
[0072]4)沉淀
[0073]超濾液中按1: 6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0074]5)凍干
[0075]將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0076]經(jīng)核算，柱效提高48%，所得烏司他丁總收率為69%，按中國藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá)5102iu/mg。
[0077]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種純化烏司他丁的方法，該方法包括:將烏司他丁粗品通過吸附柱層析、超濾液沉淀、沉淀物凍干步驟進(jìn)行純化，所得純化后的烏司他丁的總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提升約50%。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述烏司他丁粗品是通過以男性尿液為原料，將原料依次經(jīng)過甲殼質(zhì)吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析制備得到的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述工序包括如下步驟: (1)用洗脫液A溶解烏司他丁粗品，攪拌、離心，留取離心液，所述洗脫液A為0.01-0.3mol/L的醋酸鹽緩沖液； (2)用洗脫液B平衡經(jīng)特異性處理再生的吸附柱，將上述離心液上柱，洗脫液B為0.01-0.5mol/L 醋酸鈉和 0.l_5mol/L NaCl 的緩沖液； (3)用洗脫液B洗脫吸附柱，收集洗脫液； (4)用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液上柱，洗脫液C為0.01-0.5mol/L甘氨酸和0.l-5mol/L NaCl 的緩沖液； (5)上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，收集洗脫液； (6)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，密封待用，洗脫液D為0.01-0.3mol/L鹽酸和0.l_5mol/L NaCl的緩沖液； (7)將洗脫液經(jīng)超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復(fù)超濾，得超濾液。 (8)超濾液中加入乙醇沉淀,離心，固體再用無水乙醇脫水,離心,棄去上清液，留取沉淀物； (9)將沉淀物凍干，即得烏司他丁。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.5mol/L0
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述吸附柱為陰離子交換柱。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換柱包括:強(qiáng)陰離子交換柱Q-Sephadex A-25,Q-S印hadex A-50,Q-S印hadex C-25,Q-Sephadex C-50 ;弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-CelluloseDE-52, DEAE-Cellulose DE-53。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的樹脂再生法即一定次序的水洗、酸洗、堿洗處理，提高樹脂柱的效率。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述親和層析柱包括:CM_SephadexA-25， CM-Sephadex A-50， CM-Sephadex C-25， CM-Sephadex C-50， SP-Sepharose2B,SP-Sepharose4B, SP_Sepharose6B， SP-Sepharose CL-2B， SP-Sepharose CL-4B，SP-Sepharose CL-6B。
9.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述超濾液沉淀步驟包括:超濾液中加入乙醇沉淀。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK103724428SQ201310625498
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月24日
【發(fā)明者】劉乃山, 林曉磊, 葛翠鳳, 劉翠珍 申請(qǐng)人:青島康原藥業(yè)有限公司