一種利用聚電解質(zhì)刷固定蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用聚電解質(zhì)刷固定蛋白的方法。本發(fā)明采用具有3D結(jié)構(gòu)的聚電解質(zhì)刷為載體，在其對(duì)蛋白物理吸附有利的條件下吸附大量蛋白，然后通過偶聯(lián)化學(xué)手段將蛋白以化學(xué)鍵穩(wěn)定結(jié)合在聚電解質(zhì)刷載體上。本發(fā)明大大提高了蛋白的結(jié)合量，并且實(shí)現(xiàn)了聚電解質(zhì)刷對(duì)蛋白的穩(wěn)定結(jié)合，使其能夠高效應(yīng)用于下游的各種生物技術(shù)中。
【專利說(shuō)明】—種利用聚電解質(zhì)刷固定蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種蛋白的固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白的固定化過程在生物傳感器、蛋白分離純化、診斷檢測(cè)與分析、固定化酶催化等諸多生物技術(shù)中扮演著重要的角色。在很多應(yīng)用中，需要載體具有高的蛋白結(jié)合量以提高載體在分離、檢測(cè)、分析、催化等過程中的應(yīng)用性能。聚電解質(zhì)刷是一種新型的載體，它是由載體和接枝在載體表面聚電解質(zhì)鏈段所組成，由于接枝在載體表面的聚電解質(zhì)鏈段密度極高，在良溶劑中，聚電解質(zhì)鏈段在載體表面向外伸展呈現(xiàn)類似毛刷狀的結(jié)構(gòu)。根據(jù)載體的形狀可分為聚電解質(zhì)板刷和聚電解質(zhì)球刷。聚電解質(zhì)板刷最早由RUhe等人在1999年通過表面引發(fā)聚合手段合成，聚電解質(zhì)球刷也由Ballauff等在同一年合成。在這一載體中，單體在微球表面生長(zhǎng)形成向外舒展，具有“3D”結(jié)構(gòu)的聚電解質(zhì)刷結(jié)構(gòu)，為蛋白的結(jié)合提供了大量位點(diǎn)，具有實(shí)現(xiàn)多層蛋白結(jié)合，大幅提高蛋白結(jié)合量的潛在能力。另外，聚電解質(zhì)刷也可以通過先合成聚電解質(zhì)鏈段，然后嫁接到載體表面的方式形成。
[0003]對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Ballauff等在《Physical ChemistryChemicalPhysics))2003年第5卷1671~1677頁(yè)發(fā)表的《聚電解質(zhì)球刷在水溶液中對(duì)蛋白的吸附〉〉(Adsorption of proteins on spherical polyelectrolyte brushes in aqueoussolution, Phys.Chem.Chem.Phys., 2003, 5, 1671 - 1677)首次證明了聚電解質(zhì)球刷能以靜電吸附方式結(jié)合大量的蛋白。Bruening等在2006年發(fā)表于《Langmuir》的論文《聚丙烯酸刷及其衍生物對(duì)蛋白的高結(jié)合量固定化》(High-Capacity Binding of Proteins byPoly (Acrylic Acid) Brushes and Their Derivatives, Langmuir, 2006，22，42744281)中報(bào)道帶負(fù)電的聚丙烯酸板刷能夠以靜電吸附方式結(jié)合一種帶正電的蛋白——溶菌酶，其結(jié)合量高達(dá)80層。上述研究證明物理吸附作為一種簡(jiǎn)單有效的方法，能夠發(fā)揮聚電解質(zhì)刷大量結(jié)合蛋白的潛能。但是，物理吸附的特性決定了這種結(jié)合具有不穩(wěn)定性。上述文獻(xiàn)也表明，在較高的鹽濃度(例如生理環(huán)境)和環(huán)境pH改變的情況下，大量的蛋白會(huì)從聚電解質(zhì)刷載體上釋放出來(lái)。而在生物傳感器、診斷檢測(cè)與分析、固定化酶催化等實(shí)際應(yīng)用過程中，通常要求蛋白與載體的復(fù)合物在生理?xiàng)l件以及各種復(fù)雜環(huán)境和操作過程中具有高度的穩(wěn)定性，這使得單純通過物理吸附結(jié)合蛋白的載體無(wú)法勝任某些應(yīng)用。而化學(xué)結(jié)合恰恰能夠彌補(bǔ)這一不足。
[0004]針對(duì)蛋白在聚電解質(zhì)球刷上的化學(xué)共價(jià)固定化，現(xiàn)有的技術(shù)方案中對(duì)于不同的蛋白和聚電解質(zhì)刷，得到的蛋白固定量差異巨大。例如，同樣采用基于水溶性碳二亞胺EDC的偶聯(lián)方法，Bruening等在其發(fā)表于《Langmuir》的論文中(High-Capacity Binding ofProteins by Poly (Acrylic Acid)Brushes and Their Derivatives, Langmuir, 2006, 22, 42744281)就提到聚丙烯酸板刷對(duì)BSA的固定化效率較低，其結(jié)合量低于單層蛋白結(jié)合量的2倍。另一篇文獻(xiàn)報(bào)道的采用聚合度為1000以上的聚丙烯酸刷用同樣的方法結(jié)合RNA酶(RNase A)結(jié)合量為單層結(jié)合量的 16 倍(Polymeric Brushes as Functional Templatesfor Immobilizing Ribonuclease A:Study of Binding Kinetics and Activity, Langmuir, 2008，24，913-920)，盡管結(jié)合量有所提升，但是對(duì)于如此高長(zhǎng)度的聚丙烯酸刷而言，其對(duì)刷子內(nèi)部空間利用率仍處于較低水平。因此，在這一領(lǐng)域中，亟需建立一種簡(jiǎn)便高效而具有普適性的化學(xué)共價(jià)固定化蛋白的方法，使得人們能夠以一種可控的方式，充分提升聚電解質(zhì)刷內(nèi)部空間大量位點(diǎn)的利用率，將大量蛋白穩(wěn)定結(jié)合到聚電解質(zhì)刷載體上，以提高其應(yīng)用性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，發(fā)明一種聚電解質(zhì)刷對(duì)蛋白的高結(jié)合量的化學(xué)共價(jià)固定化方法。
[0006]首先，在物理吸附有利的條件下，將蛋白吸附于聚電解質(zhì)刷上。對(duì)于某種聚電解質(zhì)刷和蛋白，通過控制體系的pH、鹽濃度和溫度等條件，使得蛋白能夠通過靜電、氫鍵、疏水作用或范德華力等作用力大量吸附到聚電解質(zhì)刷上。其次，在物理吸附有利的條件下進(jìn)行洗滌，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質(zhì)刷表面疏松結(jié)合的蛋白。再次，在物理吸附有利的條件下通過偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)將蛋白以化學(xué)鍵牢固結(jié)合在刷上。最后，洗滌除去過量反應(yīng)物并將聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物分別轉(zhuǎn)移至適應(yīng)其各自下游應(yīng)用所需的環(huán)境中。與在聚電解質(zhì)刷上采用物理吸附方式固定蛋白相比，采用本發(fā)明提出的蛋白化學(xué)共價(jià)固定法可以保證蛋白與聚電解質(zhì)刷穩(wěn)定結(jié)合，不會(huì)因pH、鹽濃度等外界環(huán)境改變而使得蛋白從聚電解質(zhì)刷上脫落或解離下來(lái)。另外，與現(xiàn)有直接進(jìn)行化學(xué)共價(jià)固定蛋白技術(shù)相比，采用本發(fā)明提出的化學(xué)共價(jià)結(jié)合蛋白方法在聚電解質(zhì)刷表面結(jié)合的蛋白量為在載體表面單層吸附量的數(shù)倍至數(shù)十倍，可以有效克服在聚電解質(zhì)刷上采用直接化學(xué)共價(jià)固定法固定的蛋白荷載量低且實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性不佳的問題。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來(lái)解決上述技術(shù)問題的:
[0008]本發(fā)明提供了一種利用聚電解質(zhì)刷固定蛋白的方法，可以在聚電解質(zhì)刷上實(shí)現(xiàn)超高蛋白荷載量的化學(xué)共價(jià)固定化，包括如下步驟，
[0009]步驟一、將聚電解質(zhì)刷分散于緩沖液中，將溶有蛋白的緩沖液加入上述聚電解質(zhì)刷分散液中，混合吸附2小時(shí)，蛋白吸附到聚電解質(zhì)刷上；
[0010]步驟二、離心洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物2~3次，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質(zhì)刷表面疏松結(jié)合的蛋白，將聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物重新懸浮于緩沖液中制得聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物體系；
[0011]步驟三、向含有聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物的體系中加入化學(xué)交聯(lián)試劑，混合后室溫反應(yīng)2小時(shí)；
[0012]步驟四、離心后洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物2~3次，以除去過量的化學(xué)交聯(lián)劑。
[0013]本發(fā)明中，緩沖液優(yōu)選為對(duì)所用的聚電解質(zhì)刷及其擬吸附的蛋白是物理吸附有利的緩沖液。所述的對(duì)所用的聚電解質(zhì)刷及其擬吸附的蛋白是物理吸附有利的緩沖液是指，但不限于，
[0014]以所吸附的蛋白的等電點(diǎn)小于6.0為例，緩沖液的選擇規(guī)則如下:
[0015]針對(duì)含有羧酸功能基團(tuán)的聚電解質(zhì)刷，緩沖液可以選擇pH=4.0~6.0的MES緩沖液；
[0016]針對(duì)含有氨基的聚電解質(zhì)刷， 緩沖液可以選擇pH=7.0~8.0的磷酸鹽緩沖液；
[0017]針對(duì)含有羥基的聚電解質(zhì)刷，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液；
[0018]針對(duì)含有巰基的聚電解質(zhì)刷時(shí)，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液。
[0019]以所吸附的蛋白的等電點(diǎn)大于6.0為例，緩沖液的選擇規(guī)則如下:
[0020]針對(duì)含有羧酸功能基團(tuán)的聚電解質(zhì)刷，緩沖液可以選擇pH=5.0~7.0的MES緩沖液或磷酸鹽緩沖液；
[0021]針對(duì)含有氨基的聚電解質(zhì)刷，緩沖液可以選擇pH=7.0~9.0的硼酸鹽緩沖液；
[0022]針對(duì)含有羥基的聚電解質(zhì)刷，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液；
[0023]針對(duì)含有巰基的聚電解質(zhì)刷時(shí)，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液。
[0024]優(yōu)選的，緩沖液濃度為5mM-10mM，緩沖液中加入0.05%w/v的Tween-20。
[0025]步驟一中，聚電解質(zhì)刷由固相載體和接枝在載體表面的聚電解質(zhì)鏈段組成。聚電解質(zhì)鏈段的一端接枝在載體表面并向外伸展呈現(xiàn)刷子結(jié)構(gòu)。其中，載體可以是平板，或者是粒徑5納米至1000納米的微球，聚電解質(zhì)為帶有電荷且具有可反應(yīng)基團(tuán)的聚合物。
[0026]優(yōu)選地，步驟一中，聚電解質(zhì)刷為聚丙烯酸球刷或聚N- (2-氨基乙基)丙烯酰胺球刷。
[0027]優(yōu)選地，步驟一中，吸附溫度為25_37°C。
[0028]優(yōu)選地，步驟三中，化學(xué)交聯(lián)劑的選擇規(guī)則如下:針對(duì)聚丙烯酸等含有羧酸功能基團(tuán)的聚電解質(zhì)刷，優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)劑為I~20mMl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)的水溶液；針對(duì)含有氨基的聚電解質(zhì)刷，優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)劑為戊二醛水溶液；針對(duì)含有羥基的聚電解質(zhì)刷，優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)劑為高碘酸鈉水溶液；針對(duì)含有巰基的聚電解質(zhì)刷時(shí)，優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)劑為馬來(lái)酰亞胺試劑。
[0029]步驟四中，洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物的洗滌液優(yōu)選但不限于，與生理環(huán)境相似的等滲溶液，如PBS、生理鹽水、Tris-HCl等。
[0030]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施路線為，將聚電解質(zhì)刷置于對(duì)蛋白物理吸附有利的合適的pH和鹽濃度的水溶液中，將過量的蛋白溶解在相同的水溶液中加入上述聚電解質(zhì)刷的體系中，在合適的溫度下恒溫混合2小時(shí)，使蛋白吸附到聚電解質(zhì)刷上。用聚電解質(zhì)球刷吸附蛋白所用的水溶液洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物2~3次，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質(zhì)刷表面疏松結(jié)合的蛋白。向含有聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物的體系中加入可使聚電解質(zhì)刷上的功能基團(tuán)與蛋白進(jìn)行化學(xué)共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)的含有化學(xué)交聯(lián)試劑的水溶液混合后室溫反應(yīng)2小時(shí)。所述的水溶液和聚電解質(zhì)刷吸附蛋白所用的水溶液相同。用洗滌液洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物2~3次，以除去過量的化學(xué)交聯(lián)劑，最終根據(jù)其下游應(yīng)用所需，將聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物分散在適應(yīng)其各自下游應(yīng)用所需的環(huán)境中。
[0031]優(yōu)選地但不限于，所述的聚電解質(zhì)刷采用的是《膠體與界面科學(xué)雜志》2013年第398卷82~87頁(yè)發(fā)表的表面引發(fā)RAFT聚合法得到具有可控聚電解質(zhì)毛刷鏈段厚度、聚電解質(zhì)鏈段分子量分布窄且球刷粒徑分布小的聚電解質(zhì)刷。
[0032]在本發(fā)明較佳的實(shí)施方式中，所述的物理吸附有利的條件是指具有合適pH、鹽濃度的溶液和合適的吸附溫度。溶液優(yōu)選濃度為10mM，pH=4.0~6.0的MES緩沖液。吸附溫度優(yōu)選為25 °C -37 °C。[0033]在本發(fā)明的具體的實(shí)施方式中，所述的化學(xué)交聯(lián)試劑是指但不限于，針對(duì)聚丙烯酸等含有羧酸功能基團(tuán)的聚電解質(zhì)刷，優(yōu)選使用I~20mMl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)的水溶液；針對(duì)含有氨基的聚電解質(zhì)刷，可以選用戊二醛等水溶液；針對(duì)含有羥基的聚電解質(zhì)刷，可以采用高碘酸鈉水溶液；針對(duì)含有巰基的聚電解質(zhì)刷時(shí)，可以采用馬來(lái)酰亞胺試劑等。
[0034]在本發(fā)明的具體的實(shí)施方式中，所需的應(yīng)用環(huán)境是指結(jié)合了蛋白的聚電解質(zhì)刷在后續(xù)的應(yīng)用中所需的環(huán)境?？梢允悄M體液環(huán)境的磷酸鹽緩沖液(PBS)生理鹽水或血清、血漿以及全血等生理環(huán)境。
[0035]在上述過程中，最終聚電解質(zhì)刷上的蛋白化學(xué)結(jié)合量可以通過BCA蛋白定量法分別測(cè)定加入的聚電解質(zhì)懸浮體系中的蛋白量以及未被結(jié)合到聚電解質(zhì)球刷上的反應(yīng)體系上清液和蛋白固定化洗滌過程中洗滌液中的蛋白含量，并通過加入蛋白前后的差減量計(jì)算得到。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。在實(shí)施例中，所采用的試劑除另有說(shuō)明外均為市售商品。
[0037]實(shí)施例1
[0038]采用聚丙烯酸球刷對(duì)小牛血清白蛋白(BSA蛋白)進(jìn)行化學(xué)固定化。
[0039]首先，采用《膠體與界面科學(xué)雜志》2013年第398卷82~87頁(yè)發(fā)表的表面引發(fā)RAFT聚合法制備得到球核為100納米的氧化硅，聚電解質(zhì)毛刷狀鏈段長(zhǎng)度為40納米，接枝密度為0.24nm_2的聚丙烯酸電解質(zhì)球刷。
[0040]采用離心-重懸的方式，將上述球刷用IOmM MES緩沖液(pH=5.0，含有0.05%w/v的Tween-20)洗滌2次，超聲分散在上述緩沖液中。同時(shí)，用該緩沖液溶解BSA蛋白配制成蛋白溶液，并加入到含有球刷的分散液中，均勻混合。最終球刷濃度為0.8mg/ml，蛋白濃度為 lmg/ml0
[0041]在25°C烘箱中恒溫孵育2小時(shí)，使蛋白充分吸附于聚電解質(zhì)毛刷鏈段表面。
[0042]離心，棄去上清，并用上述MES緩沖液洗滌產(chǎn)物2次。同時(shí)用該緩沖液溶解EDC配制成濃度為5mM的EDC溶液，并加入到含有產(chǎn)物的離心管中，混合均勻。繼續(xù)在25°C培養(yǎng)2小時(shí)，使吸附在球刷上的蛋白通過化學(xué)鍵連接在球刷上。
[0043]離心，棄去上清，用上述MES緩沖液洗滌產(chǎn)物2次除去過量的EDC，再用IOmM PBS緩沖液(pH=7.2)洗滌產(chǎn)物2次，并將產(chǎn)物分散在PBS中。
[0044]經(jīng)BCA法測(cè)試，用上述方法得到的聚丙烯酸球刷-BSA復(fù)合物的蛋白結(jié)合量為790 yg BSA/mg球刷，為單層飽和結(jié)合量的6倍，且復(fù)合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0045]實(shí)施例2
[0046]采用聚丙烯酸球刷對(duì)溶菌酶蛋白進(jìn)行化學(xué)固定化。
[0047]采用的聚電解質(zhì)刷與實(shí)施例1中相同。
[0048]采用離心-重懸的方式，將上述球刷用IOmM MES緩沖液(pH=6.0，含有0.05%w/v的Tween-20)洗滌2次，超聲分散在上述緩沖液中。同時(shí)，用該緩沖液溶解溶菌酶蛋白配制成蛋白溶液，并加入到含有球刷的分散液中，均勻混合。最終球刷濃度為0.5mg/ml,蛋白濃度為 1.5mg/ml。
[0049]在37°C烘箱中恒溫培養(yǎng)2小時(shí)，使蛋白充分吸附于聚電解質(zhì)刷表面。
[0050]離心，棄去上清，并用上述MES緩沖液洗滌產(chǎn)物2次。同時(shí)用該緩沖液溶解EDC配制成濃度為2mM的EDC溶液，并加入到含有產(chǎn)物的離心管中，混合均勻。繼續(xù)在37°C培養(yǎng)2小時(shí)，使吸附在球刷上的蛋白通過化學(xué)鍵連接在球刷上。
[0051]離心，棄去上清，用上述MES緩沖液洗滌產(chǎn)物2次除去過量的EDC，再用IOmM PBS緩沖液(pH=7.2)洗滌產(chǎn)物2次，并將產(chǎn)物分散在PBS中。
[0052]經(jīng)BCA法測(cè)試，用上述方法得到的聚丙烯酸球刷-BSA復(fù)合物的蛋白結(jié)合量為2400 μ g BSA/mg球刷，為單層飽和結(jié)合量的35倍，且復(fù)合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0053]實(shí)施例3
[0054]采用聚N- (2-氨基乙基)丙烯酰胺球刷對(duì)BSA蛋白進(jìn)行化學(xué)固定化。
[0055]聚電解質(zhì)球刷的合成方法與實(shí)施例1和2相同，其中，將單體由丙烯酸替換為N- (2-氨基乙基)丙烯酰胺，得到球核為100納米氧化硅，聚電解質(zhì)毛刷鏈段長(zhǎng)度為60納米，接枝密度為0.15nm2的聚丙烯酸電解質(zhì)球刷。
[0056]球刷的化學(xué)固定化方法與實(shí)施例2相同，經(jīng)BCA法測(cè)試，得到的聚N- (2_氨基乙基)丙烯酰胺球刷-BSA復(fù)合物的蛋白結(jié)合量為1500 μ g BSA/mg球刷，為單層飽和結(jié)合量的11倍，且復(fù)合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0057]實(shí)施例4
[0058]采用硅平板接枝的聚丙烯酸板刷對(duì)BSA蛋白進(jìn)行化學(xué)固定化。
[0059]聚電解質(zhì)板刷的合成方法與實(shí)施例1~3基本相同。其中，將聚丙烯酸鏈段固定的載體由IOOnm氧化硅微球改為硅平板，得到聚電解質(zhì)鏈段長(zhǎng)度為100納米，接枝密度為
0.2nm2的聚丙烯酸板刷。
[0060]聚丙烯酸板刷對(duì)蛋白的化學(xué)固定化方法與實(shí)施例2相同，經(jīng)BCA法測(cè)試，得到的聚丙烯酸板刷-BSA復(fù)合物的蛋白固定密度為6.0 μ g/cm2，為單層飽和結(jié)合量的15倍，且復(fù)合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0061]實(shí)施例5
[0062]采用球核為1000納米的聚丙烯酸球刷對(duì)BSA蛋白進(jìn)行化學(xué)固定化。
[0063]聚電解質(zhì)球刷的合成方法與實(shí)施例1~4基本相同。其中，將例I~3中的球核由IOOnm氧化硅微球改為IOOOnm氧化硅微球，得到聚電解質(zhì)鏈段長(zhǎng)度為120nm，接枝密度為
0.55nm2的聚丙烯酸球刷。
[0064]球刷對(duì)蛋白的化學(xué)固定化方法與實(shí)施例2相同，經(jīng)BCA法測(cè)試，得到的聚丙烯酸板刷-BSA復(fù)合物的蛋白固定密度為450 μ g BSA/mg，為單層飽和結(jié)合量的36倍，且復(fù)合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在,不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0065]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術(shù)領(lǐng)域】中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù).方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用聚電解質(zhì)刷固定蛋白的方法，包括如下步驟: 步驟一、將聚電解質(zhì)刷分散于緩沖液中，將溶有蛋白的緩沖液加入上述聚電解質(zhì)刷分散液中，混合吸附2小時(shí)，蛋白吸附到聚電解質(zhì)刷上； 步驟二、離心洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物2~3次，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質(zhì)刷表面疏松結(jié)合的蛋白，將聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物重新懸浮于緩沖液中制得聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物體系； 步驟三、向含有聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物的體系中加入化學(xué)交聯(lián)劑，混合后室溫反應(yīng)2小時(shí)； 步驟四、離心后洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物2~3次，以除去過量的化學(xué)交聯(lián)劑；所述步驟一中，聚電解質(zhì)刷由固相載體和接枝在載體表面的聚電解質(zhì)鏈段組成，聚電解質(zhì)鏈段的一端接枝在載體表面并向外伸展呈現(xiàn)刷子結(jié)構(gòu)，其中，載體為平板，或者為粒徑5nm-1000nm的微球，聚電解質(zhì)鏈段為帶有電荷且具有可反應(yīng)基團(tuán)的聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述緩沖液選擇方法如下， 當(dāng)所吸附的蛋白的等電點(diǎn)小于6.0時(shí): 針對(duì)含有羧酸功能基團(tuán)的聚電解質(zhì)刷，選擇PH=4.0~6.0的MES緩沖液； 針對(duì)含有氨基的聚電解質(zhì)刷，選擇PH=7.0~8.0的磷酸鹽緩沖液； 針對(duì)含有羥基的聚電解質(zhì)刷，選擇PH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液； 針對(duì)含有巰基的聚電解質(zhì)刷，選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液；或者 當(dāng)所吸附的蛋白的等電點(diǎn)大于6.0時(shí): 針對(duì)含有羧酸功能基團(tuán)的聚電解質(zhì)刷，選擇pH=5.0~7.0的MES緩沖液或磷酸鹽緩沖液； 針對(duì)含有氨基的聚電解質(zhì)刷，選擇PH=7.0~9.0的硼酸鹽緩沖液； 針對(duì)含有羥基的聚電解質(zhì)刷，選擇PH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液； 針對(duì)含有巰基的聚電解質(zhì)刷，選擇PH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述緩沖液濃度為5mM-10mM，所述緩沖液中加入0.05%w/v 的 Tween-20。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟一中，聚電解質(zhì)刷為，聚丙烯酸刷或聚N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺刷。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟一中，吸附溫度為25-37°C。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟三中，化學(xué)交聯(lián)劑的選擇規(guī)則如下: 針對(duì)含有羧酸功能基團(tuán)的聚電解質(zhì)刷，化學(xué)交聯(lián)劑為1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液； 針對(duì)含有氨基的聚電解質(zhì)刷，化學(xué)交聯(lián)劑為戊二醛水溶液； 針對(duì)含有羥基的聚電解質(zhì)刷，化學(xué)交聯(lián)劑為高碘酸鈉水溶液； 針對(duì)含有巰基的聚電解質(zhì)刷時(shí)，化學(xué)交聯(lián)劑為馬來(lái)酰亞胺試劑。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟四中，洗滌聚電解質(zhì)刷-蛋白復(fù)合物的洗滌液為與生理環(huán)境相似的等滲溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述等滲溶液為PBS緩沖液、生理鹽水或Tris-HCl緩沖液。
9.如權(quán)利要求1所述 的方法，其中，所述蛋白為小牛血清白蛋白或溶菌酶蛋白。
【文檔編號(hào)】C07K17/08GK103467603SQ201310447554
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】徐宏, 瞿振元, 古宏晨 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)