基于g蛋白偶聯(lián)受體的哺乳動物細(xì)胞定向引導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型G蛋白偶聯(lián)受體，該新型受體由引起定向遷移效應(yīng)的第一G蛋白偶聯(lián)受體、以及第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域復(fù)合而成，其中第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域取代第一G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域。本發(fā)明還提供一種基于該新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，包括：采用引起定向遷移效應(yīng)的第一G蛋白偶聯(lián)受體構(gòu)建新型G蛋白偶聯(lián)受體；以及將新型G蛋白偶聯(lián)受體導(dǎo)入細(xì)胞，制備得到具有定向遷移效應(yīng)的工程細(xì)胞。通過替換引起定向遷移效應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域，從所制得的新型G蛋白偶聯(lián)受體可特異性結(jié)合區(qū)別于趨化因子的配體，并在特異性結(jié)合后使細(xì)胞朝向該配體富集的地方做定向移動，從而介導(dǎo)細(xì)胞的定向引導(dǎo)過程。
【專利說明】基于G蛋白偶聯(lián)受體的晡乳動物細(xì)胞定向引導(dǎo)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可控制細(xì)胞定向遷移的新型G蛋白偶聯(lián)受體，本發(fā)明還涉及一種 基于該新型G蛋白偶聯(lián)受體定向引導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞移動的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] G蛋白偶聯(lián)受體是細(xì)胞表面受體最為多樣的家族，介導(dǎo)無數(shù)胞外信號的細(xì)胞應(yīng)答。 細(xì)胞的信號傳導(dǎo)中，G蛋白偶聯(lián)受體接受細(xì)胞外的信號，并通過G蛋白的作用傳遞到相應(yīng)的 效應(yīng)器蛋白，完成細(xì)胞對外界信號的應(yīng)答。G蛋白是三聚體GTP結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白（trimeric GTP-binding regulatory protein)的簡稱，位于質(zhì)膜內(nèi)胞楽一側(cè)，主要作用是接受來自G 蛋白偶聯(lián)受體的信號，并傳遞給效應(yīng)器蛋白。G蛋白偶聯(lián)受體家族包括多種與蛋白質(zhì)類或肽 類激素、局部介質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸或脂肪酸衍生物等配體識別與結(jié)合的受體，以及哺乳 類嗅覺受體、味覺受體和視覺的光激活受體(視紫紅質(zhì)）等。
[0003] 所有的G蛋白偶聯(lián)受體都含有7個疏水肽段形成的跨膜a螺旋區(qū)和相似的三維 結(jié)構(gòu)，N端在細(xì)胞外側(cè)，C端在細(xì)胞質(zhì)側(cè)。在細(xì)胞外側(cè)的部分區(qū)段具有特異的氨基酸序列， 是G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合特定配體的結(jié)合功能域；在細(xì)胞質(zhì)側(cè)的部分區(qū)段具有效應(yīng)特異性， 可與G蛋白結(jié)合沖段有7個跨膜區(qū)，其中螺旋5和6 (圖1)之間的胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域?qū)τ谑?體與G蛋白之間的相互作用具有重要的作用。其結(jié)合功能域結(jié)合特異性配體后，G蛋白偶 聯(lián)受體的特異性效應(yīng)區(qū)被激活，然后通過G蛋白把信號傳遞給相應(yīng)的效應(yīng)器蛋白，從而將 胞外信號轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號，并使細(xì)胞做出相應(yīng)應(yīng)答。
[0004] 趨化因子受體是一類介導(dǎo)趨化因子行使功能的GTP蛋白耦連的跨膜受體（GPCR)， 通常表達(dá)于免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上。趨化因子受體除了具有一般G蛋白偶聯(lián)受體 的結(jié)構(gòu)和功能特點外，還具有自身的特點。趨化因子受體的結(jié)合功能域位于N端，與相應(yīng)的 趨化因子結(jié)合發(fā)生變構(gòu)并將信號傳遞給G蛋白，再由G蛋白激活多種信號分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞 內(nèi)的Ca 2+濃度，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白的改變引起細(xì)胞趨化性，控制細(xì)胞向趨化因子富集的地 方做定向遷移。因此，趨化因子與其受體的相互作用控制著細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)和組織器官間 定向移動。由于其N端結(jié)合功能性的結(jié)合特異性，趨化因子受體僅在匹配的趨化因子作用 下定向引導(dǎo)細(xì)胞，不能響應(yīng)除趨化因子以外的配體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對現(xiàn)有技術(shù)中趨化因子受體這一 G蛋白偶聯(lián)受 體僅在趨化因子作用下介導(dǎo)細(xì)胞定向遷移的局限性，提供一種可在諸如胰高血糖素的配體 作用下介導(dǎo)細(xì)胞定向遷移的新型G蛋白偶聯(lián)受體?；谠揋蛋白偶聯(lián)受體，本發(fā)明還提供 一種細(xì)胞定向引導(dǎo)方法。
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：提供一種新型G蛋白偶聯(lián) 受體，所述新型G蛋白偶聯(lián)受體由引起定向遷移效應(yīng)的第一 G蛋白偶聯(lián)受體、以及第二G蛋 白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域復(fù)合而成，其中所述第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域取代所述 第一 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域。
[0007] 在上述新型G蛋白偶聯(lián)受體中，第一 G蛋白偶聯(lián)受體是趨化因子受體。
[0008] 在上述新型G蛋白偶聯(lián)受體中，趨化因子受體為CX3CR趨化因子受體。
[0009] 根據(jù)其所結(jié)合的配體可將趨化因子受體分為四個亞家族：CXC類受體（CXCR)、CC 類受體（CCR)、C類受體（CR)和CX3C類受體（CX3CR)。由以上敘述可知，本發(fā)明采用CX3CR 作為研究對象。另外，胞外信號結(jié)合趨化因子受體后，可由IP3_Ca2+信號通路產(chǎn)生鈣活化， 以此來檢測趨化因子與受體結(jié)合。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方 法，該方法包括：采用引起定向遷移效應(yīng)的第一 G蛋白偶聯(lián)受體與第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié) 合功能域構(gòu)建的新型G蛋白偶聯(lián)受體；以及將所述新型G蛋白偶聯(lián)受體導(dǎo)入細(xì)胞，制備得到 具有定向遷移效應(yīng)的工程細(xì)胞。
[0011] 在上述基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法中，所述新型G蛋白偶聯(lián)受 體由所述第一 G蛋白偶聯(lián)受體、以及第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域復(fù)合而成，其中由所 述第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域取代所述第一 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域。
[0012] 在上述基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法中，采用基因重組法構(gòu)建所 述新型G蛋白偶聯(lián)受體。
[0013] 在上述基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法中，采用基因重組法構(gòu)建所 述新型G蛋白偶聯(lián)受體包括以下步驟：
[0014] 制備編碼去除了結(jié)合功能域的第一 G蛋白偶聯(lián)受體的第一 DNA序列A和編碼第二 G蛋白偶聯(lián)受:體的結(jié)合功能域的DNA序列B ;
[0015] 把DNA序列B插入到DNA序列A的結(jié)合功能域部位，再裝配到病毒載體中構(gòu)建得 到能表達(dá)所述新型G蛋白偶聯(lián)受體的感染型病毒顆粒。
[0016] 采用所述感染型病毒顆粒感染細(xì)胞，制得具有定向遷移效應(yīng)的工程細(xì)胞。
[0017] 在上述基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法中，所述第一 G蛋白偶聯(lián)受 體為CX3CR趨化因子受體，所述第二G蛋白偶聯(lián)受體為胰高血糖素受體，所述病毒載體為腺 病毒載體或慢病毒載體。
[0018] 編碼去除結(jié)合功能域的CX3CR趨化因子受體的DNA序列的引物序列為：
[0019] IiiCX3CR-5，端引物（P5) :GAAITC ATCTTCCTGTCCGTCTTCTAC;
[0020] mCX3CR-3，端引物（P3) : CTCGAG TCAGAGCAGGAGAGACCCATC;
[0021] 編碼胰高血糖素受體的結(jié)合功能域的DNA序列的引物序列為：
[0022] mGLCR-5,引物（P5) :GCGGCCGC ATGCCCCTCACCCAGCTCCAC;
[0023] mGLCR-3,引物（P3) :GAATTC GCCCACGGTGTACATCACCTG ;
[0024] 在上述基于G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法中，所述方法還包括采用胰高血 糖素激活所述新型G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域，使帶有新型G蛋白偶聯(lián)受體的工程細(xì)胞 沿著胰高血糖素的濃度梯度由低到高的方向移動。
[0025] 實施本發(fā)明可以獲得以下有益效果：本發(fā)明采用另一 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能 域替換引起定向遷移效應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體的相同部位，從而使后者可特異性結(jié)合前者的 配體，并在特異性結(jié)合后使細(xì)胞朝向該配體富集的地方做定向移動，從而介導(dǎo)細(xì)胞的定向 引導(dǎo)過程，使細(xì)胞在指定區(qū)域執(zhí)行功能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。附圖中：
[0027] 圖1是新型G蛋白偶聯(lián)受體的改造示意圖；
[0028] 圖2是對pSHUTTLE-IRES-hrGFP質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定的結(jié)果；
[0029] 圖3是TCID5tl測定重組腺病毒滴度檢測結(jié)果。

【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明采用兩種G蛋白偶聯(lián)受體（以下分別稱為第一 G蛋白偶聯(lián)受體和第二G蛋 白偶聯(lián)受體)構(gòu)建特殊的新型G蛋白偶聯(lián)受體，其中第一 G蛋白偶聯(lián)受體可介導(dǎo)細(xì)胞定向遷 移，并且其結(jié)合功能域被第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域取代，從而可被第二G蛋白偶聯(lián) 受體的配體特異性激活，使帶有該新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞向該配體富集的方向移動。 具有上述定向遷移特性的細(xì)胞是本發(fā)明中可執(zhí)行特殊功能的工程細(xì)胞。
[0031] 為便于具體解釋本發(fā)明，優(yōu)選采用趨化因子受體作為引起定向遷移效應(yīng)的第一 G 蛋白偶聯(lián)受體，采用胰高血糖素受體作為第二G蛋白偶聯(lián)受體。胰高血糖素受體的結(jié)合功 能域能特異性的結(jié)合胰高血糖素，使細(xì)胞對胰高血糖素做出應(yīng)答。但強(qiáng)調(diào)的是，此處列舉該 具體示例并不是限制本發(fā)明僅可以此方式實施。以下詳細(xì)說明構(gòu)建該新型G蛋白偶聯(lián)受體 并基于此介導(dǎo)細(xì)胞定向引導(dǎo)的詳細(xì)過程。
[0032] 實施例一：基因重組法構(gòu)建新型G蛋白偶聯(lián)受體
[0033] 該方法的總體思路為：克隆出胰高血糖素受體的結(jié)合功能域DNA序列（S卩DNA序列 B)、以及去除結(jié)合功能域的趨化因子受體的DNA序列卿DNA序列A);把編碼胰高血糖素受 體的結(jié)合功能域的DNA序列插入到趨化因子受體的DNA序列的原結(jié)合功能域部位，隨后插 入到病毒載體(該實施例中采用腺病毒載體）中構(gòu)建可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特殊新型受體的感染 型病毒顆粒；用此感染型病毒顆粒在體外感染特定細(xì)胞，控制病毒在細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，使 細(xì)胞表面帶上特殊的受體，從而將細(xì)胞改造為可執(zhí)行特殊功能的工程細(xì)胞。
[0034] 某因克降：
[0035] 從小鼠的cDNA文庫中擴(kuò)增小鼠的胰高血糖素受體（mGLCR)的結(jié)合功能域的DNA 序列、以及小鼠的趨化因子受體UCX3CR)的DNA序列（除去對應(yīng)于結(jié)合功能域的序列部 分)。所得到的引物序列分別為：
[0036] mGLCR-5, ：GCGGCCGCATGCCCCTCACCCAGCTCCAC ;
[0037] mGLCR-3' ：GAATTCGCCCACGGTGTACATCACCTG ;
[0038] mCX3CR-5, ：GAATTCATCTTCCTGTCCGTCTTCTAC ；
[0039] mCX3CR-3, ： CTCGAGTCAGAGCAGGAGAGACCCATC ；
[0040] 為方便后續(xù)腺病毒載體的裝配，在mGLCR基因序列5'端引物設(shè)計添加 Not I酶 切位點（GCGGCCGC )，在mCX3CR基因序列3 '端引物設(shè)計添加 Xho I酶切位點（CTCGAG )， 在mGLCR基因序列3'端以及mCX3CR基因序列5'端引物上設(shè)計添加 EcoR I酶切位點 (gaattc)，以方便這兩端序列的后續(xù)連接。這些酶切位點的設(shè)計應(yīng)與后續(xù)腺病毒穿梭質(zhì)粒 上多克隆位點的酶切位點相適應(yīng)，同時也要注意添加的酶切位點不應(yīng)存在于要處理的DNA 序列中。目前，常見的腺病毒穿梭質(zhì)粒有pSHUTTLE、pSHUTTLE-CMV、pSHUTTLE-IRES-hrGFP-l 和pSHUTTLE-IRES-hrGFP-2等。本實施例采用的是pSHUTTLE-IRES-hrGFP-2腺病毒穿梭質(zhì) 粒。
[0041] PCR擴(kuò)增上述兩段DNA序列，瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行膠回收DNA，裝 入PMD18T載體中，轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌，篩選不同的細(xì)菌克隆，進(jìn)行測序。把所得序列與鼠基 因組文庫的序列進(jìn)行比對，選擇無錯誤的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取分別包含mGLCR基因片段和 mCX3CR基因片段的載體進(jìn)行下一步實驗。
[0042] 腺病毒質(zhì)粒裝配：
[0043] 在pSHUITLE-IRES-hrGFP-2穿梭質(zhì)粒中裝配mGLCR基因片段和mCX3CR基因 片段。該過程可一步法進(jìn)行，即把mGLCR基因片段和mCX3CR基因片段同時裝配進(jìn)入 pSHUTTLE-IRES-hrGFP-2穿梭質(zhì)粒中；也可分步進(jìn)行，即先后裝入mCX3CR基因片段和mGLCR 基因片段這兩種基因片段。
[0044] 具體地，把提取的兩種分別包含mGLCR基因片段和mCX3CR基因片段的載體、以及 pSHUTTLE載體，按照表1的反應(yīng)體系配制酶切反應(yīng)物，37°C反應(yīng)2. Oh。
[0045] 表1腺病毒質(zhì)粒裝配的反應(yīng)體系
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種新型G蛋白偶聯(lián)受體，其特征在于，所述新受體由引起定向遷移效應(yīng)的第一G蛋 白偶聯(lián)受體、以及第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域復(fù)合而成，其中所述第二G蛋白偶聯(lián)受 體的結(jié)合功能域取代所述第一 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型G蛋白偶聯(lián)受體，其特征在于，所述第一 G蛋白偶聯(lián)受體 是趨化因子受體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型G蛋白偶聯(lián)受體，其特征在于，所述趨化因子受體為 CX3CR趨化因子受體。
4. 一種基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，其特征在于，包括： 采用引起定向遷移效應(yīng)的第一 G蛋白偶聯(lián)受體構(gòu)建新型G蛋白偶聯(lián)受體；以及將所述 新型G蛋白偶聯(lián)受體導(dǎo)入細(xì)胞，制備得到具有定向遷移效應(yīng)的工程細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，其特征在于， 所述新型G蛋白偶聯(lián)受體由所述第一 G蛋白偶聯(lián)受體、以及第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功 能域復(fù)合而成，其中由所述第二G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合功能域取代所述第一 G蛋白偶聯(lián)受 體的結(jié)合功能域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，其特征 在于，采用基因重組法構(gòu)建所述新型G蛋白偶聯(lián)受體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，其特征在于， 采用基因重組法構(gòu)建所述新型G蛋白偶聯(lián)受體包括以下步驟： 制備編碼去除了結(jié)合功能域的第一 G蛋白偶聯(lián)受體的DNA序列A和編碼第二G蛋白偶 聯(lián)受體的結(jié)合功能域的DNA序列B ; 把DNA序列B插入到DNA序列A的結(jié)合功能域部位，再裝配到病毒載體中構(gòu)建得到表 達(dá)所述新型G蛋白偶聯(lián)受體的感染病毒顆粒； 采用所述感染病毒顆粒感染細(xì)胞，制得具有定向遷移效應(yīng)的工程細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，其特征在于， 所述第一 G蛋白偶聯(lián)受體為CX3CR趨化因子受體，所述第二G蛋白偶聯(lián)受體為胰高血糖素 受體，所述病毒載體為腺病毒載體或慢病毒載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，其特征在于： (這條權(quán)利要求的保護(hù)是希望針對引物序列，因為引物序列引入了特殊的酶切位點，但最后 得到的CX3CR和胰高血糖素結(jié)合功能域的DNA序列是本領(lǐng)域已知的，則無需在此進(jìn)一步限 定） 編碼去除結(jié)合功能域的CX3CR趨化因子受體的DNA序列的引物序列為： mCX3CR-5' 端引物（P5) :GAATTC ATCTTCCTGTCCGTCTTCTAC; mCX3CR-3' 端引物（P3) :CTCGAG TCAGAGCAGGAGAGACCCATC; 編碼胰高血糖素受體的結(jié)合功能域的DNA序列的引物序列為： mGLCR-5,引物（P5):GCGGCCGC ATGCCCCTCACCCAGCTCCAC; mGLCR-3' 引物（P3):GAATTC GCCCACGGTGTACATCACCTG。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于新型G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞定向引導(dǎo)方法，其特征在 于，所述方法還包括激活所述新型G蛋白偶聯(lián)受體的胰高血糖素的結(jié)合功能域，使帶有新 型G蛋白偶聯(lián)受體的工程細(xì)胞向高濃度的胰高血糖素的方向移動。
【文檔編號】C07K14/705GK104277106SQ201310277232
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月3日
【發(fā)明者】買制剛, 蘇慶寧 申請人:深圳大學(xué)