一種手性分離多種基本氨基酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用反相高效液相色譜和手性固定相來手性分離一些基本氨基酸的方法，主要解決高效液相色譜法手性分離體系中使用的流動相體系比較繁瑣和手性色譜柱不穩(wěn)定的技術(shù)問題，該方法包括步驟：將配制的外消旋樣品用甲醇和水進行溶解過濾作為待測樣品。待手性色譜柱平衡好后，用微量注射器吸取濾液進入色譜儀，通過色譜工作站采集手性分離色譜圖，查看分離效果。此方法簡化了基本氨基酸的手性分離問題，提高了測試效率，只使用簡單流動相，分離速度快，并且分離的條件對于溫度也沒有特殊要求，分離過程中不需要柱溫箱，不增加儀器成本，使用范圍廣，有很好的經(jīng)濟價值。
【專利說明】
一種手性分離多種基本氨基酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用反相高效液相色譜和手性固定相來手性分離一些基本氨基酸的方法，利用手性固定相在高效液相色譜系統(tǒng)上手性分離一些基本氨基酸對映異構(gòu)體，DL-亮氨酸、DL-谷氨酰胺、DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-酪氨酸。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，自然界中已發(fā)現(xiàn)180多種氨基酸，其中參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸只有20多種，稱為基本氨基酸。由于許多藥物對映體之間在藥理、毒理和臨床療效等方面存在較大差異，因此建立快速而靈敏的分離和測定對映體化合物的方法十分重要。而且藥物治療多肽有副作用低，藥效高，針對性強，不會蓄積于體內(nèi)而引起中毒的優(yōu)點，越來越多的多肽藥物應(yīng)用到了癌癥，肝炎，糖尿病臨床治療中，目前國內(nèi)的藥物治療多肽發(fā)展迅速，藥物多肽合成方法中無論是液相合成，固相合成，片段連接都會使用到氨基酸作為原料，對于多肽合成來說，防止消旋化是一個十分重要的問題。為了保證合成產(chǎn)物的光學(xué)純度，除了在合成過程中嚴(yán)格控制消旋化的發(fā)生以外，還必須嚴(yán)格采用光學(xué)純的原料氨基酸。因此，氨基酸對映體的檢測對于光學(xué)活性多肽的合成至關(guān)重要。而一種快速，簡單，經(jīng)濟，應(yīng)用范圍廣的手性分離方法對工作效率的提高也是至關(guān)重要的。
[0003]很多時候，分離氨基酸對映體需要進行衍生化，這種方法比較復(fù)雜而且需要花費一定的額外成本，需要用到多種手性流動相來進行測試，增加了測試時間，因此，找到一種快速有效的氨基酸分離方法是很有必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用高效液相色譜法，同時使用替考拉寧鍵合手性固定相進行多種基本氨基酸的手性分離方法。此方法可以解決高效液相色譜法手性分離體系中使用的流動相體系比較繁瑣和手性色譜柱不穩(wěn)定的技術(shù)問題。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種手性分離多種基本氨基酸的方法，采用替考拉寧手性固定相的高效液相色譜方法，包括以下步驟:
將DL-亮氨酸、DL-谷氨酰胺、DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-酪氨酸等外消旋樣品配制成l-20mg/ml濃度,用甲醇和水進行溶解過濾作為待測樣品；
手性色譜柱=ChiroB1tic T (替考拉寧鍵合手性柱)，5 μ m，4.6 X 250mm(1.D)；
流動相 A:甲醇 B:7jC ；
流速:0.3-0.6ml/min (優(yōu)選 0.4ml/min)；
流動相的洗脫條件如下:
時間(min)A (體積百分比)B (體積百分比)
0.0140%60%
30.040%60%
檢測波長:210nm-220nm ； 以甲醇比水體積比4:6的比例平衡手性色譜柱，平衡40分鐘，待紫外檢測器的基線維持在零點左右時可以準(zhǔn)備分析樣品。
[0006]將配制好的樣品注射進入高效液相色譜系統(tǒng)，在手性固定相分離后，通過色譜工作站記錄分離色譜圖，查看相關(guān)數(shù)據(jù)，檢驗兩個色譜峰是否完全分離。
[0007]按照本發(fā)明，所述的手性分離多種基本氨基酸的方法，手性色譜柱使用的是以硅膠為基質(zhì)的，在硅膠基質(zhì)上化學(xué)鍵合大環(huán)抗生素-替考拉寧的手性色譜柱(Te1-CSP)。
[0008]本發(fā)明所用的樣品溶解條件為體積比，甲醇:水=4:6 ；
本發(fā)明所述的樣品在4.6mm內(nèi)徑的分析柱上的樣品濃度分別為:
DL-亮氨酸20mg/ml、DL-谷氨酰胺20mg/ml、DL_苯丙氨酸3mg/ml、DL_色氨酸Img/ml、DL-酪氨酸 lmg/ml。
[0009]本發(fā)明的有益效果:簡化了基本氨基酸的手性分離問題，提高了測試效率，本發(fā)明所述的手性分離方法，只使用簡單流動相，分離速度快，并且分離的條件對于溫度也沒有特殊要求，分離過程中不需要柱溫箱，不增加儀器成本，同時替考拉寧鍵合的手性柱穩(wěn)定性比較好，在手性分離上千次樣品后仍能得到很好的手性分離效果，同時這種手性柱也能用于其它類的氨基酸，肽，和手性藥物的手性分離，使用范圍廣，有很好的經(jīng)濟價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1:DL_亮氨酸消旋體的手性分離色譜圖。
[0011]圖2:DL-谷氨酰胺消旋體的手性分離色譜圖。
[0012]圖3:DL-苯丙氨酸消旋體的手性分離色譜圖。
[0013]圖4:DL-色氨酸消旋體的手性分離色譜圖。
[0014]圖5:DL-酪氨酸消旋體的手性分離色譜圖。

【具體實施方式】
[0015]實施例1-5如下:
將樣品溶解過濾:
1.精密稱取L-亮氨酸和D-亮氨酸各1mg于Iml樣品管中(相當(dāng)于20mg/ml )，用甲醇和水按體積比4:6超聲溶解,用0.45um濾頭過濾代用。
[0016]2.精密稱取L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺各1mg于Iml樣品管中(相當(dāng)于20mg/ml),用甲醇和水按體積比4:6超聲溶解,用0.45um濾頭過濾代用。
[0017]3.精密稱取L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸各15mg于1ml容量瓶中(相當(dāng)于3mg/ml),用甲醇和水按體積比4:6超聲溶解,用0.45um濾頭過濾代用。
[0018]4.精密稱取L-色氨酸和D-色氨酸各5mg于1ml容量瓶中(相當(dāng)于lmg/ml)，用甲醇和水按體積比4:6超聲溶解,用0.45um濾頭過濾代用。
[0019]5.精密稱取L-酪氨酸和D-酪氨酸各5mg于1ml容量瓶中(相當(dāng)于lmg/ml)，用甲醇和水按體積比4:6超聲溶解,用0.45um濾頭過濾代用。
[0020]色譜條件為:時間(min)A (體積百分比)B (體積百分比)
0.0140%60%
30.040%60% ； 色譜柱=ChiroB1tic T (替考拉寧鍵合手性柱)，5um，4.6X250mm(1.D)；
流速:0.4ml/min ；
檢測波長:210nm(DL_売氨酸、DL-谷氨酰胺)；220nm(DL-苯丙氨酸、DL-色氨酸、DL-酪氨酸)；
進樣量:5ul。
[0021]色譜圖見圖1 -圖5。圖1顯示L-亮氨酸和D-亮氨酸的兩個色譜峰完全分離，說明兩個亮氨酸對應(yīng)異構(gòu)體得到分離；圖2顯示L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺的兩個色譜峰完全分離，說明兩個谷氨酰胺對應(yīng)異構(gòu)體得到分離；圖3顯示L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸的兩個色譜峰完全分離，說明兩個苯丙氨酸對應(yīng)異構(gòu)體得到分離；圖4顯示L-色氨酸和D-色氨酸的兩個色譜峰完全分離，說明兩個色氨酸對應(yīng)異構(gòu)體得到分離；圖5顯示L-酪氨酸和D-酪氨酸的兩個色譜峰完全分離，說明兩個酪氨酸對應(yīng)異構(gòu)體得到分離。
【權(quán)利要求】
1.一種手性分離多種基本氨基酸的方法，其特征是包括如下步驟: 將配制的外消旋樣品用甲醇和水進行溶解過濾作為待測樣品，待手性色譜柱平衡好后，用微量注射器吸取濾液進入色譜儀，通過色譜工作站采集手性分離色譜圖，查看分離效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種手性分離多種基本氨基酸的方法，其特征是所述的外消旋體樣品為下述中的一種:0卜亮氨酸、0卜谷氨酰胺、0卜苯丙氨酸、0卜色氨酸、0卜酪氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種手性分離多種基本氨基酸的方法，其特征是所述的外消旋體樣品的濃度為1-201118/1111。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種手性分離多種基本氨基酸的方法，其特征是所述的色譜儀手性分離的色譜條件為: 手性色譜柱:替考拉寧鍵合手性柱 流動相:甲醇 8冰 流速:0.3-0.61111/111111 流動相的洗脫條件如下:
時間4 (體積百分比) 8 (體積百分比)0.01 11111140%60%
30.0 11111140%60% 檢測波長:210咖-22011111。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種手性分離多種基本氨基酸的方法，其特征是所述的流速:0.41111/111111。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種手性分離多種基本氨基酸的方法，其特征是所述的甲醇和水的體積比為4:6，手性色譜柱的平衡時間40分鐘。
【文檔編號】C07C227/40GK104275169SQ201310271925
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月1日
【發(fā)明者】喬立超, 巢慶, 張倩, 楊培, 張恒維, 朱國基 申請人:希施生物科技（上海）有限公司