專利名稱：一種富含胸腺肽α1的胸腺肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胸腺肽的制備方法。
背景技術(shù)：
胸腺肽(又名胸腺素、Thymosin)是一種免疫調(diào)節(jié)劑，是胸腺組織分泌的具有生理活性的一組多肽。胸腺肽可刺激外周血液淋巴細(xì)胞絲裂原來促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟，增加抗原或絲裂原激活后T細(xì)胞分泌的干擾素Cl、干擾素Y以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同時增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體水平。還可通過對CD4細(xì)胞的激活，增強異體和自體的人類混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。臨床上常用的胸腺肽是從小牛胸腺提取的小分子混合多肽，其主要活性成分是一種分子量為3108道爾頓的含有28個氨基酸殘基的多肽，專業(yè)名稱為胸腺肽α 1，胸腺肽α I的活性比例占總胸腺肽溶液的80%左右，但是目前國家藥品標(biāo)準(zhǔn)要求胸腺肽產(chǎn)品中的胸腺肽αI的含量比例為不低于1%，(參見:國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-042-2000-2003)，所以，目前國內(nèi)公開的有關(guān)胸腺肽溶液的專利都是在這一標(biāo)準(zhǔn)下提出的，如:公開號:CN1390853等。由于在傳統(tǒng)工藝中胸腺肽中活性成分含量低，僅為3%左右，相應(yīng)的非活性的肽類成分多，一方面在臨床應(yīng)用上療效受到一定影響，另一方面不良反應(yīng)發(fā)生率也會較高，因此，利用新技術(shù)和新工藝來提高胸腺肽溶液中胸腺肽αI的含量比例就成為了一個必要的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法生產(chǎn)的胸腺肽溶液中胸腺肽α I的含量低的問題，提供了一種富含胸腺肽α I的胸腺肽的制備方法。本發(fā)明一種富含胸腺肽α I的胸腺肽的制備方法，是通過以下步驟進(jìn)行的:一、冷水提取:取小牛胸腺，剔除筋膜，加入I 2倍重量的O 4°C的純化水，然后用質(zhì)量百分含量為10%的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2 3，再用勻漿器勻漿5 15min，然后在O 4°C下放置6 8h，得到提取液；二、熱處理:將步驟一的提取液經(jīng)水浴升溫至80°C，并保溫15min，然后冷卻到20 30°C，再離心15min，去除固相物，收集上清液，得到離心液；三、超濾:將步驟二的離心液，用質(zhì)量百分含量為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0，用截留分子量為5000道爾頓的超濾器超濾，收集分子量O 5000道爾頓的透過液，然后再用截留分子量為1000道爾頓的超濾器進(jìn)行透析，保留分子量為1000 5000道爾頓的液體，得到超濾液；四、精制:將步驟三的超濾液，上離子交換層析柱，收集洗脫液，采用注射用水將洗脫液稀釋至20mg/ml，得到富含胸腺肽α I的胸腺肽，經(jīng)0.22 μ m除菌過濾后保存。本發(fā)明在以傳統(tǒng)工藝為基礎(chǔ)的前提下，根據(jù)主要活性成分胸腺肽α I的等電點，用離子交換層析技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分離，去掉一些非活性物質(zhì)而獲得一種富含胸腺肽α I的胸腺肽，使胸腺肽α I在胸腺肽溶液中的比例達(dá)到10%以上， 遠(yuǎn)高于現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)中胸腺肽α I不得低于I %的要求。
具體實施例方式具體實施方式
一:本實施方式一種富含胸腺肽α I的胸腺肽的制備方法，是通過以下步驟進(jìn)行的:一、冷水提取:取小牛胸腺，剔除筋膜，加入I 2倍重量的O 4°C的純化水，然后用質(zhì)量百分含量為10%的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2 3，再用勻漿器勻漿5 15min，然后在O 4°C下放置6 8h，得到提取液；二、熱處理:將步驟一的提取液經(jīng)水浴升溫至80°C，并保溫15min，然后冷卻到20 30°C，再離心15min，去除固相物，收集上清液，得到離心液；三、超濾:將步驟二的離心液，用質(zhì)量百分含量為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0，用截留分子量為5000道爾頓的超濾器超濾，收集分子量O 5000道爾頓的透過液，然后再用截留分子量為1000道爾頓的超濾器進(jìn)行透析，保留分子量為1000 5000道爾頓的液體，得到超濾液；四、精制:將步驟三的超濾液，上離子交換層析柱，收集洗脫液，采用注射用水將洗脫液稀釋至20mg/ml，得到富含胸腺肽α I的胸腺肽，經(jīng)0.22 μ m除菌過濾后保存。本實施方式在以傳統(tǒng)工藝為基礎(chǔ)的前提下，根據(jù)主要活性成分胸腺肽α I的等電點，用離子交換層析技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分離，去掉一些非活性物質(zhì)而獲得一種富含胸腺肽α I的胸腺肽，使胸腺肽α I在胸腺肽溶液中的比例達(dá)到10%以上，遠(yuǎn)高于現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)中胸腺肽α I不得低于I %的要求。
具體實施方式
二:本實施方式與具體實施方式
一不同的是:步驟四中離子交換層析柱中的離子交換樹脂采用DEAE-S印hadex-A50，平衡液為50mM pH為6.5-7.0Nacl水溶液，洗脫液為200mM pH為6.5-7.0的Nacl水溶液，280nm波長檢測。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三:本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是:步驟四中的保存為O 4°C低溫保存或冷凍保存。其它與具體實施方式
一或二相同。通過以下試驗驗證本發(fā)明的有益效果:試驗1:本發(fā)明一種富含胸腺肽α I的胸腺肽的制備方法，是通過以下步驟進(jìn)行:一、冷水提取:取小牛胸腺100公斤(購`自哈爾濱市呼蘭區(qū)付江動物臟器經(jīng)銷部)，剔除筋膜，加入200公斤的4°C以下的純化水，然后用質(zhì)量百分含量為10%的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，再用勻漿器勻漿lOmin，然后在0-4°C下放置8h，得到提取液；二、熱處理:將步驟一的提取液經(jīng)水浴升溫至80°C，保溫15min，然后冷卻到30°C以下，再在3500r/min的條件下離心15min，去除固相物，收集上清液，得到260公斤離心液；三、超濾:將步驟二的260公斤離心液用質(zhì)量百分含量為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7，用截留分子量為5000道爾頓的超濾器超濾，收集分子量小于5000道爾頓的透過液190公斤，然后再用截留分子量為1000道爾頓的超濾器進(jìn)行透析，保留分子量為1000道爾頓以上的液體，得到100公斤超濾液；四、精制:將步驟三的超濾液，上離子交換層析柱，收集洗脫液，用注射用水將洗脫液稀釋調(diào)配到20mg/ml，得到富含胸腺肽α I的胸腺肽溶液15L，經(jīng)0.22 μ m除菌過濾后4°C低溫保存。對本試驗制備的富含胸腺肽α I的胸腺肽溶液進(jìn)行檢測:檢測方法采用中國藥典2010版二部附錄V D的高效液相色譜法測定，色譜條件為:用 TSK GEL2000SW17.8mm*300mm, 5 μ m);以三氟醋酸-乙腈-水(0.05: 10: 90)做為流動相:流速為每分鐘0.7ml ;檢測波長為214nm。理論板數(shù)應(yīng)不得低于5000，分離度按相鄰峰高與峰谷之比計算均不得小于3.0。采用外標(biāo)法，取胸腺肽Ci1標(biāo)準(zhǔn)品、用流動相制成每Iml中各含Img的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μ I注入液相色譜儀,記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣，其保留時間相對偏差不得大于2.0%。測定法:將本試驗制備的富含胸腺肽α I的胸腺肽溶液加流動相制成每Iml中含多肽Img的溶液，取20μ I注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計算供試品中對應(yīng)于胸腺肽αI的保留時間的峰的含量。測量結(jié)果:本試驗 制備的富含胸腺肽α I的胸腺肽溶液中胸腺肽α I含量為12.8%。
權(quán)利要求
1.一種富含胸腺肽α I的胸腺肽的制備方法，其特征在于富含胸腺肽α I的胸腺肽的備方法是通過以下步驟進(jìn)行的:一、冷水提取:取小牛胸腺，剔除筋膜，加入I 2倍重量的O 4°C的純化水，然后用質(zhì)量百分含量為10%的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2 3，再用勻漿器勻漿5 15min，然后在O 4°C下放置6 8h，得到提取液；二、熱處理:將步驟一的提取液經(jīng)水浴升溫至80°C，并保溫15min，然后冷卻到20 30°C，再離心15min，去除固相物，收集上清液，得到離心液；三、超濾:將步驟二的離心液，用質(zhì)量百分含量為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0，用截留分子量為5000道爾頓的超濾器超濾，收集分子量O 5000道爾頓的透過液，然后再用截留分子量為1000道爾頓的超濾器進(jìn)行透析，保留分子量為1000 5000道爾頓的液體，得到超濾液；四、精制:將步驟三的超濾液，上離子交換層析柱，收集洗脫液，采用注射用水將洗脫液稀釋至20mg/ml，得到富含胸腺肽α I的胸腺肽溶液，經(jīng)0.22 μ m除囷過濾后保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富含胸腺肽αI的胸腺肽的制備方法，其特征在于步驟四中離子交換層析柱中的離子交換樹脂采用DEAE-S印hadex-A50，平衡液為50mM Nacl水溶液，pH為6.5-7.0，洗脫液為200mM的Nacl水溶液，pH為6.5-7.0, 280nm波長檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富含胸腺肽αI的胸腺肽的制備方法，其特征在于步驟四中的保存為O 4° C低溫保存或冷凍保存。
全文摘要
一種富含胸腺肽α1的胸腺肽的制備方法，它涉及一種胸腺肽的制備方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法生產(chǎn)的胸腺肽溶液中胸腺肽α1的含量低的問題，具體方法為一、冷水提取；二、熱處理；三、超濾；四、精制將超濾液上離子交換層析柱，收集洗脫液，用注射用水將洗脫液稀釋調(diào)配到20mg/ml，得到富含胸腺肽α1的胸腺肽溶液，經(jīng)0.22μm除菌過濾后保存。本發(fā)明在以傳統(tǒng)工藝為基礎(chǔ)的前提下，根據(jù)主要活性成分胸腺肽α1的等電點，用離子交換層析技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分離，去掉一些非活性物質(zhì)而獲得一種富含胸腺肽α1的胸腺肽，使胸腺肽α1在胸腺肽溶液中的比例達(dá)到10％以上。本發(fā)明應(yīng)用于制藥領(lǐng)域。
文檔編號C07K14/575GK103172725SQ201310112930
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月2日
發(fā)明者董繼勝, 王金富, 馮文善, 李永久, 趙波 申請人:黑龍江迪龍制藥有限公司