專利名稱：一種純化多酚類化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種純化多酚類化合物的方法，屬于天然產(chǎn)物活性成分分離提純技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多酚是指分子結(jié)構(gòu)中含有多羥基的一類生物活性小分子化合物的總稱，其相對分子質(zhì)量在500-3000范圍內(nèi)，是植物的次生代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在于水果、蔬菜、茶葉及中草藥中。多酚和生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖的結(jié)合以及與金屬離子的絡(luò)合等化學(xué)性質(zhì)使其具有多種生物活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌及抑菌等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，困擾人類的多種疾病如組織器官的老化，冠心病、動脈粥樣硬化及中風(fēng)等心腦血管疾病均與人體內(nèi)活性氧自由基的過剩(失衡)密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)植物源的多酚物質(zhì)具有很強(qiáng)的氧自由基清除能力及抑制脂質(zhì)體過氧化作用等，因而從植物中分離高效抗氧化多酚化合物成為當(dāng)前抗氧化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，多酚化合物的分離純化方法主要有大孔樹脂吸附、硅膠柱層析和逆流色譜分離等。大孔吸附樹脂吸附容量大、易于再生，但有機(jī)試劑用量大且目標(biāo)物純度不高；硅膠柱層析價格便宜，但操作繁瑣、得率較低；逆流色譜分離效果好、產(chǎn)品純度高，但其成本相對較高，且制備量小，不易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。所以，開發(fā)低生產(chǎn)成本、高純度的多酚類化合物分離純化方法，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。瓊脂糖具有良好的親水性、大孔性、非特異性和生物學(xué)相容性，表面帶有大量的羥基，是應(yīng)用最廣的一種多糖類色譜分離介質(zhì)。目前已開發(fā)出多種商品化低糖濃度(瓊脂糖基質(zhì)濃度為2%_6%)分離介質(zhì),如Sepharose 4FF、Sepharose 6FF以及以此為基質(zhì)偶聯(lián)不同配基所制備的一系列疏水、親和、離子交換等分離介質(zhì)，主要用于蛋白質(zhì)、核酸等大分子的分離，在生物制藥、食品工業(yè)及化工等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種純化多酚類化合物的方法，本發(fā)明使用高濃度的瓊脂糖凝膠微球作為分離介質(zhì)用于天然多酚類化合物分離純化。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下:
一種純化多酚類化合物的方法，包括如下步驟:
(1)將含有多酚類化合物的樣品溶解于體積百分含量為10.0-50.0%的乙醇水溶液中，所述的多酚類化合物為白藜蘆醇、虎杖苷、丹參素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯；
(2)上樣純化，等度模式洗脫，采用裝填有瓊脂糖凝膠微球的層析柱，洗脫液為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0-30.0%。上述方法多酚類化合物的質(zhì)量回收率大于95%，純度大于98%。所述的瓊脂糖凝膠微球中瓊脂糖的質(zhì)量百分含量為16 24%，微球的粒徑范圍為20-60 μ m，最大耐壓大于0.4MPa，其制備方法包括如下步驟: (1)將乳化劑與油相溶劑混勻，乳化劑質(zhì)量百分含量為0.05-1.0%，然后將質(zhì)量百分含量為16 24%的瓊脂糖水溶液加入到乳化劑與油相溶劑混合液中進(jìn)行懸浮乳化制球，混合液與瓊脂糖水溶液的體積比為3:1 6:1 ;
所述的乳化劑選自Tween 60>Span 80、NP-4、0P_500,油相溶劑選自石油醚、四氯化碳、液體石蠟、大豆油、菜籽油；
(2)將制得的微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化；
(3)加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，清洗篩分即可得到瓊脂糖凝膠微球，所述的交聯(lián)劑選自2，3- 二溴丙醇、二乙烯基苯、環(huán)氧氯丙烷、1，4- 丁二醇縮水甘油醚。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果:
(I)增大瓊脂糖基質(zhì)濃度可以提高制備的分離介質(zhì)羥基數(shù)目，從而對多酚類化合物具有很好的選擇性吸附作用，最優(yōu)條件下目標(biāo)物的質(zhì)量回收率和純度均高于95.0%和98.0%。高濃度瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)(瓊脂糖基質(zhì)濃度為16%-24%，為常規(guī)瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)的4-8倍)在天然產(chǎn)物活性物質(zhì)分離中的應(yīng)用潛力巨大。(2)采用乙醇-乙酸二元混合液為洗脫液，在等度模式下常壓分離，分辨率高、負(fù)載量大、操作簡單且溶劑條件無毒無害。


圖1為制備的高濃度瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)的掃描電鏡圖(1000X )；
圖2為高濃度瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)純化虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的色譜 圖3為白藜蘆醇和虎杖苷收樣組分的高分辨質(zhì)譜 圖4為白藜蘆醇和虎杖苷收樣組分的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1高濃度瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)的制備
(1)將160.0-240.0g瓊脂糖加入到1.0L超純水中，在壓力0.12- 0.18Mpa、溫度110-125°C的高壓反應(yīng)釜中保溫0.5-1.5h，完全溶解為水溶液；
(2)將乳化劑與油相溶劑混合均勻，乳化劑質(zhì)量百分含量為0.05-1.0%，然后將瓊脂糖水溶液加入到油相溶劑懸浮乳化制球，油水相比例為3:1- 6:1，體系溫度為60-80°C，轉(zhuǎn)速為600-1000rpm;其中油相溶劑選自石油醚、四氯化碳、液體石蠟、大豆油、菜籽油、二甲苯、二氯苯，乳化劑選自 Tween 60、Tween 20、Span 80、Span 40、Arlacel C、NP-4、0P-500 ;
(3)攪拌5-30min后將反應(yīng)體系置換為冰浴，待體系溫度降到20_40°C后，除去乳化劑清洗后將微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化，溫度為20_30°C，活化
0.5-1.0h ；
(4)加入交聯(lián)劑升溫到45-65°C進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)6.0-12.0h后，清洗篩分即可得到用于液相色譜的高濃度瓊脂糖凝膠微球，交聯(lián)劑選自2，3-二溴丙醇、二乙烯基苯、環(huán)氧氯丙烷、1，4- 丁二醇縮水甘油醚、三甲基丙烯酸甘油酯；
(5)制備的高濃度瓊脂糖凝膠微球粒徑范圍在20-60μ m之間(圖1)，尺寸分布均勻；最大耐壓大于0.4MPa，機(jī)械性能良好，易于清洗和重復(fù)使用。實(shí)施例2天然多酚活性物質(zhì)一白藜蘆醇和虎杖苷的分離純化
使用實(shí)施例1方法制備得到16%瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)，其中，油相溶劑為石油醚，乳化劑為Tween 60,交聯(lián)劑為2，3- 二溴丙醇。(I)稱取0.40g虎杖粗提物超聲溶解于20.0%的乙醇水溶液中，超聲助溶5min，
0.45 μ m濾膜過濾；
(2)流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為20.0%，0.45 μ m濾膜過濾后超聲脫氣15min，室溫靜置0.5h備用；
(3)將制備的高濃度瓊脂糖凝膠微球抽濾清洗，加入適量超純水后超聲分散15min，然后將分散均勻的微球裝入層析柱管(600mmX 16 mm id.),流動相平衡2個柱體積后進(jìn)樣；
(4)流速為3.0mL/min，檢測波長UV280nm，等度模式下進(jìn)行洗脫，根據(jù)分離圖譜收集各組分(圖2)；
(5)將白藜蘆醇、虎杖苷收樣組分和標(biāo)準(zhǔn)對照品進(jìn)行高分辨質(zhì)譜對比鑒定，采用配置UltiMate3000 HPLC (Dionex, US)的 MicrOTOF-MS Q II (Bruker, Germany)進(jìn)行分析，質(zhì)譜條件:負(fù)離子模式，噴霧電壓為5kV，保護(hù)氣為高純氦氣，毛細(xì)管溫度為275°C，分子量范圍為50-3000 amu，檢測信號采用Xcalibur軟件進(jìn)行記錄分析(圖3)；
(6)同時將虎杖粗提物、白藜蘆醇和虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)對照品及高濃度瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)純化后的收樣組分進(jìn)行HPLC定性定量分析，色譜條件:流動相為甲醇-水溶液(65:35，v/v, 0.5% HAc)，進(jìn)樣量 20 μ L，流速 lmL/min，檢測波長為 UV 280nm (圖 4)。(7)最優(yōu)條件下可得純度為99.1%的白藜蘆醇39.8mg，質(zhì)量回收率為98.5% ;純度為98.7%的虎杖苷20.6mg，質(zhì)量回收率為98.1%。實(shí)施例3天然多酚活性物質(zhì)——丹參素的分離純化
使用實(shí)施例1方法制備得到20%瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)，其中，油相溶劑為液體石蠟，乳化劑為Span 80，交聯(lián)劑為環(huán)氧氯丙烷。(I)稱取0.50g丹參粗提物超聲溶解于10.0%的乙醇水溶液中，超聲助溶5min，
0.45 μ m濾膜過濾；
(2)流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0%，0.45 μ m濾膜過濾后超聲脫氣15min,室溫靜置0.5h備用；
(3)將制備的高濃度瓊脂糖凝膠微球抽濾清洗，加入適量超純水后超聲分散15min，然后將分散均勻的微球裝入層析柱管(600mmX 16 mm id.),流動相平衡2個柱體積后進(jìn)樣；
(4)流速為2.0mL/min，檢測波長UV280nm，等度模式下進(jìn)行洗脫，根據(jù)分離圖譜收集各組分；
(5)將丹參素收樣組分和標(biāo)準(zhǔn)對照品進(jìn)行高分辨質(zhì)譜對比鑒定，并用高效液相色譜進(jìn)行定性定量分析；
(6)最優(yōu)條件下可得純度為98.7%的丹參素47.6mg，質(zhì)量回收率為96.8%。實(shí)施例4天然多酚活性物質(zhì)一表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的分離純化 使用實(shí)施例1方法制備得到24%瓊脂糖凝膠分離介質(zhì)，其中，油相溶劑為1:1的液體石
蠟與菜籽油，乳化劑為0P-500，交聯(lián)劑為1，4- 丁二醇縮水甘油醚。(I)稱取0.45g茶多酚粗提物超聲溶解于30.0%的乙醇水溶液中，超聲助溶5min，
0.45 μ m濾膜過濾；
(2)流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為25.0%，0.45 μ m濾膜過濾后超聲脫氣15min，室溫靜置0.5h備用； (3)將制備的高濃度瓊脂糖凝膠微球抽濾清洗，加入適量超純水后超聲分散15min，然后將分散均勻的微球裝入層析柱管(600mmX 16 mm id.),流動相平衡2個柱體積后進(jìn)樣；
(4)流速為1.5mL/min，檢測波長UV280nm，等度模式下進(jìn)行洗脫，根據(jù)分離圖譜收集各組分；
(5)將表沒食子兒茶素沒食子酸酯的收樣組分和標(biāo)準(zhǔn)對照品進(jìn)行高分辨質(zhì)譜對比鑒定，并用高效液相色譜進(jìn)行定性定量分析；
(6)最優(yōu)條件下可得純度為98.2%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯58.2mg，質(zhì)量回收率為 95.2%ο
權(quán)利要求
1.一種純化多酚類化合物的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將含有多酚類化合物的樣品溶解于體積百分含量為10.0-50.0%的乙醇水溶液中； (2)上樣純化，等度模式洗脫，采用裝填有瓊脂糖凝膠微球的層析柱，流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0-30.0%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化多酚類化合物的方法，其特征在于:所述的多酚類化合物為白藜蘆醇、虎杖苷、丹參素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、黃芩甙或燈盞乙素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化多酚類化合物的方法，其特征在于:所述的瓊脂糖凝膠微球中瓊脂糖的質(zhì)量百分含量為16 24%,微球的粒徑范圍為20 60 μ m,最大耐壓大于0.4MPa0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化多酚類化合物的方法，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠微球制備方法包括如下步驟: (1)將乳化劑與油相溶劑混勻，乳化劑質(zhì)量百分含量為0.05 1.0%，然后將質(zhì)量百分含量為16 24%的瓊脂糖水溶液加入到乳化劑與油相溶劑混合液中進(jìn)行懸浮乳化制球，混合液與瓊脂糖水溶液的體積比為3:1 6:1 ; 所述的乳化劑選自 Tween 60、Tween 20、Span 80、Span 40、Arlacel C、NP-4、0P-500,油相溶劑選自石油醚、四氯化碳、液體石蠟、大豆油、菜籽油、二甲苯、二氯苯； (2)將制得的微球在含有1-5%的KBH4的30-45%的NaOH溶液中活化； (3)加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，清洗篩分即可得到瓊脂糖凝膠微球，所述的交聯(lián)劑選自2，3-二溴丙醇、二乙烯基苯、環(huán)氧氯丙烷、1，4-丁二醇縮水甘油醚、三甲基丙烯酸甘油酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述純化多酚類化合物的方法，其特征在于:多酚類化合物的質(zhì)量回收率大于95%，純度大于98%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化多酚類化合物的方法，將含有多酚類化合物的樣品溶解于體積百分含量為10.0-50.0%的乙醇水溶液中，上樣純化，等度模式洗脫，采用裝填有瓊脂糖凝膠微球的層析柱，流動相為乙醇、乙酸體積比為1:1的水溶液，其中乙醇和乙酸的體積百分含量分別為10.0-30.0%。本發(fā)明通過增大瓊脂糖基質(zhì)濃度可以提高制備的分離介質(zhì)羥基數(shù)目，從而對多酚類化合物具有很好的選擇性吸附作用，最優(yōu)條件下目標(biāo)物的質(zhì)量回收率和純度均高于95.0%和98.0%。
文檔編號C07C51/47GK103182199SQ20131009205
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者申燁華, 白斌, 趙彥鼎, 郭立安, 李聰 申請人:西北大學(xué), 西安交大保賽生物技術(shù)股份有限公司