專利名稱：一種鏈霉親和素突變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程、蛋白質(zhì)工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種DNA分子的合成、克隆、突變和重組技術(shù)，尤其涉及一種鏈霉親和素突變體及其制備方法。
背景技術(shù)：
鏈霉親和素(Streptavidin,SA)是由鏈霉菌(Streptomyces avidinii)培養(yǎng)過程中分泌的一種小分子非糖基化蛋白質(zhì)，分子量15kD，其天然形式為同源四聚體，分子量60kD，SA的成熟活性結(jié)構(gòu)為127個氨基酸的多肽。1963年，Stapley在篩選抗菌素時首先發(fā)現(xiàn)，并予以報道。本世紀以來，SA由于其與生物素(Biotin，一種性能穩(wěn)定的小分子化合物，又稱維生素H、輔酶R)有非凡的親和力和極高的特異性而受到國際生物學(xué)和醫(yī)學(xué)界的高度重視。SA-Biotin復(fù)合物可以耐受變性劑(如鹽酸胍)、去垢劑(如SDS)、蛋白水解酶、極端溫度(4 90°C)和寬廣pH環(huán)境(pH2 8)。1993年，在德國杜邦-墨克制藥公司的L.D.Thompson和P.C.Weber (DuPontMerck Pharmaceutical C0., Wilmington, DE)兩人公開發(fā)表了他們?nèi)斯ず铣傻?、密碼子優(yōu)化的SA核心序列(從13 140aa的SA人工核酸和野生型氨基酸序列)，并克隆進IPTG誘導(dǎo)的pET3a原核表達載體，在大腸桿菌中進行了表達和制備[Gene，1993，Dec 22; 136(1-2):243-6]ο1998年,意大利Anna Gallizia等人用鏈霉菌cDNA重組克隆了 Streptavidin的核心序列(從15 159aa的SA野生型核酸和野生型氨基酸序列)，并且在T7-標簽下游實現(xiàn)了可溶性表達[Protein Expression and Purification, 1998,14 (20): 192-6]。2012年，肖齊世等人(上海普欣生物技術(shù)有限公司)，人工合成并優(yōu)化了 SA的核心氨基酸序列(從13 139aa的SA人工核酸和野生型氨基酸序列，見序列表中SEQ ID No:1和SEQ ID No: 2)，同樣進行了 pET原核表達載體構(gòu)建和IPTG誘導(dǎo)的原核表達、蛋白質(zhì)純化制備,表達產(chǎn)物為包涵體,制備產(chǎn)物為變性失活的SA,需要體外復(fù)性恢復(fù)活性,專利(申請?zhí)?201210159677.9)中未提到從變性蛋白到復(fù)性蛋白的幾個關(guān)鍵指標:復(fù)性回收率，復(fù)性SA的比活性，與野生可溶性SA的對比親和力等。然而，野生型SA (WtSA)分子的理化特性不是目前某些應(yīng)用領(lǐng)域的最佳選擇，因為其結(jié)合力不夠穩(wěn)定持久，這對需要連續(xù)長時間觀察的動態(tài)實驗(如細胞生物學(xué)領(lǐng)域)與影像研究較為不利。很多檢測研究中也希望結(jié)合-解離的平衡左移，并能保持較長時間。因而，WtSA目前有被各種分子改造的穩(wěn)定結(jié)合型突變體SA (mtSA)取代的跡象。盡管已經(jīng)報道有200多種突變型SA，但關(guān)于SA突變后提高結(jié)合穩(wěn)定性的研究很少。Mark Howarth, Oxford (GB)公開了穩(wěn)定性結(jié)合 SA 突變體研究(US 2012/0214970 Al),提出并測試和保護了 3個雙位點突變體S52G/R53D，S52G/R53N, S52G/R53S (見序列表中的SEQ ID No: 3，SEQ ID No: 4，SEQ ID No: 5)，其主體序列必須在第 23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128 與野生型 SA 相同。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種全人工基因合成加定點突變與隨機突變獲得的鏈霉親和素突變體SA122m5及其制備方法。本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn):
一種鏈霉親和素突變體，所述鏈霉親和素突變體的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:6所示,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:7所示。優(yōu)選的，上述的一種鏈霉親和素突變體，其中:所述鏈霉親和素突變體包含5個氨基酸的突變，分別為 E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D。一種上述的鏈霉親和素突變體的制備方法，包括以下步驟:
O已知的具有159個氨基酸 的鏈霉親和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID N0:8所示，取其中的121個氨基酸(13 133)作為合成對象，并且引入兩個氨基酸的突變:S52G、R53D，得到的121個氨基酸的突變序列如序列表中的SEQ ID N0:9所示；
2)將所述121個氨基酸的突變序列經(jīng)DNAWorks逆翻譯成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密碼子經(jīng)DNAWorks優(yōu)化(E.coli class II)，并且添加了起始密碼ATG和終止密碼TAA ；
3)添加了起始密碼ATG和終止密碼TAA的所述核苷酸序列通過PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列命名為SA122m2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:10所示，該人工DNA序列編碼122個氨基酸的定點突變型鏈霉親和素，所述定點突變是S52G、R53D ；
4)通過隨機突變PCR改造SA122m2，獲取其它氨基酸改變對其結(jié)合生物素功能的影響，從隨機突變產(chǎn)生的DNA文庫，選取了 I株突變體，命名為SA122m5，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，包含了 5個密碼子突變，產(chǎn)生了 5個天然氨基酸的改變，分別為E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D ；
5)構(gòu)建原核表達工程載體pET28a-SA122m5；
6)構(gòu)建原核表達工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5 ；
7)原核表達工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5的擴增、誘導(dǎo)表達；
8)SA122m5的提取與純化；
9)SA122m5的生物活性測定，所述SA122m5的突變包含T42Y，Y43T，由于Y43是SA-Biotin的重要結(jié)合位點之一，T42與Y43相鄰，故Y42、T43的改變可能影響SA122m5對配體生物素或其衍生物的結(jié)合能力。本發(fā)明的突出效果為:本發(fā)明提供了一種鏈霉親和素突變體及其制備方法，鏈霉親和素突變體SA122m5提高了對生物素衍生物(如2-亞氨基生物素)的親和力，有利于生物素化產(chǎn)物的檢測；延長了與生物素結(jié)合的半壽期，有利于需要長時間觀察的實驗與影像研究。以下便結(jié)合實施例附圖，對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。


圖1是本發(fā)明實施例的重組表達載體pET28a_SA122m5的物理結(jié)構(gòu) 圖2是本發(fā)明實施例的鏈霉親和素突變體SA122m5的SDS-PAGE，其中:1:蛋白分子量標志；2:空載體包含菌株；3:SA122m5菌株全菌裂解液；4:SA122m5菌株裂解液上清液。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例:
本實施例提供一種鏈霉親和素突變體及其制備方法。1.全人工基因合成和定點突變引入
1.1已知的具有159個氨基酸的鏈霉親和素成熟氨基酸(SEQ ID NO:8)，取其中的121個氨基酸(13 133)作為合成對象，并且引入兩個氨基酸的突變:S52G、R53D，得到的121個氨基酸的突變序列(SEQ ID N0:9)；
1.2將上述121個氨基酸的突變序列的N端加Met氨基酸作為起始密碼安置，形成122個氨基酸的序列，經(jīng)美國國家生化信息中心(NCBI)網(wǎng)上軟件DNAWorks逆翻譯成核苷酸序列，上述核苷酸序列的密碼子經(jīng)DNAWorks優(yōu)化(E.coli class II),在優(yōu)化后的核苷酸序列的3’ -端添加終止密碼TAA;
1.3添加了起始密碼ATG和終止密碼TAA的上述核苷酸序列通過PCR法人工合成，上述人工DNA序列命名為SA122m2(SEQ ID NO: 10)，該人工DNA序列編碼122個氨基酸的定點突變型鏈霉親和素，定點突變是S52G、R53D，將其克隆進盤古基因科技(蘇州)有限公司的5分鐘快速連接克隆測序載體TopFast pACK4a-Bs，通過DNA序列分析獲得了序列正確的SA122m2 克隆(命名為 pACK4a_SA122m2)。2.隨機突變PCR引入新的突變
以上述克隆pACK4a-SA122m2的SA122m2編碼區(qū)為模板，用盤古基因科技(蘇州)有限公司的rTaq加高濃度金屬離子作隨機突變PCR，將PCR產(chǎn)物再次克隆進pACK4a_Bs載體，挑取50個陽性克隆送DNA測序分析，挑取其中I個克隆pACK4a-SA122m5用于表達分析。3.亞克隆進pET28a原核表達載體
設(shè)計PCR引物，5’ -引物添加NcoI內(nèi)切酶識別位點，3’ -引物添加XhoI酶切位點，PCR產(chǎn)物用Ncol/Xhol雙酶切，同樣用Ncol/Xhol處理pET28a載體，連接轉(zhuǎn)化，挑取克隆，經(jīng)測序分析，取得pET28a-SA122m5重組表達載體(如圖1所示)，用該載體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)菌，取得表達菌株BL21-pET28a-SA122m5。4.測試表達
2XYT擴增細菌，IPTG誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)條件:IPTG 0.1mMole/L, 25°C誘導(dǎo)4小時，取ImL菌液，離心收集菌體，PBS洗滌I次，0.5mL PBS重懸浮，超聲裂解菌體，離心保留上清和沉淀，分別上樣SDA-PAGE，考馬斯亮藍染色-脫色，觀察表達，結(jié)果如圖2所示。5.SA122m5蛋白質(zhì)純化
LB+M9培養(yǎng)基2L，搖瓶擴菌，加IPTG，25°C誘導(dǎo)表達4小時，收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集上清，飽和硫酸銨(加至80%)共沉淀`,Sephadex G50分級分離和脫鹽,Mono-S陽離子交換，Mono-Q陰離子交換，Sephadex G-200脫鹽分離,超濾濃縮。6.SA122m5 活性測定BioCORE 100 生物傳感器測定親和力，SA122m5 與 Biotin 的 Kd = 1.2X 1(T14M/L，與2-亞氨基生物素的Kd = 2.2X 1(T8M/L。SA122m5 的比活性(Specific Activity)達到 15U/mg (wtSA 的比活性為 13 16U/mg, IU 結(jié)合 Biotin lM-g)0SA122m5與生物素結(jié)合的半壽期為11小時(據(jù)報道，wtSA為6.6小時，單體SA(Monomeric SA)為 3 分鐘)。本發(fā)明尚有多種實施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明 的保護范圍之內(nèi)。〈110〉盤古基因科技(蘇州)有限公司〈120〉一種鏈霉親和素突變體及其制備方法〈160〉 10
<210>1
<211>381
<212>DNA
〈213〉鏈霉親和素127個核心氨基酸<400>1
gcagaagcgg gcattaccgg tacctggtat aaccagctgg gcagcacgtt cattgtgact 60gcaggcgcgg atggtgcgct gaccggcacc tatgaaagcg cggtgggcaa cgcggaaagc 120cgttatgtgc tgaccggccg ttacgatagc gcaccggcga ccgatggtag cggcaccgcg 180ctgggctgga ccgtggcgtg gaagaacaac tatcgtaacg cgcatagcgc gaccacctgg 240agcggccagt atgttggcgg tgcggaagcg cgcatcaaca cccagtggct gctgaccagc 300ggcaccaccg aagcgaacgc gtggaagagc accctggtgg gccatgatac ctttaccaaa 360gtgaaaccga gcgcggcgag c381
<210>2
<211>127
<212>PRT
〈213〉鏈霉親和素127個核心氨基酸<400>2
Ala Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser151015
Thr Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr202530
Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr354045
Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala505560
Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His657075
Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala808590
Arg He Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala 95100105
Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys
權(quán)利要求
1.一種鏈霉親和素突變體，其特征在于:所述鏈霉親和素突變體的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:7所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鏈霉親和素突變體，其特征在于:所述鏈霉親和素突變體包含5個氨基酸的突變，分別為E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D。
3.一種基于權(quán)利要求1所述的鏈霉親和素突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O已知的具有159個氨基酸的鏈霉親和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID N0:8所示，取其中的121個氨基酸(13 133)作為合成對象，并且引入兩個氨基酸的突變:S52G、R53D，得到的121個氨基酸的突變序列如序列表中的SEQ ID N0:9所示； 2)將所述121個氨基酸的突變序列經(jīng)DNAWorks逆翻譯成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密碼子經(jīng)DNAWorks優(yōu)化，并且添加了起始密碼ATG和終止密碼TAA ； 3)添加了起始密碼ATG和終止密碼TAA的所述核苷酸序列通過PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列命名為SA122m2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 4)通過隨機突變PCR改造SA122m2，獲取其它氨基酸改變對其結(jié)合生物素功能的影響，從隨機突變產(chǎn)生的DNA文庫，選取了 I株突變體，命名為SA122m5，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，包含了 5個密碼子突變，產(chǎn)生了 5個天然氨基酸的改變，分別為E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D ； 5)構(gòu)建原核表達工程載體pET28a-SA122m5； 6)構(gòu)建原核表達工 程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5 ； 7)原核表達工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA122m5的擴增、誘導(dǎo)表達； 8)SA122m5的提取與純化； 9)SA122m5的生物活性測定。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種鏈霉親和素突變體及其制備方法，所述鏈霉親和素突變體的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:6所示，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:7所示，包含5個氨基酸的突變，分別為E14D、T42Y、Y43T、S52G、R53D。本發(fā)明提供了一種鏈霉親和素突變體及其制備方法，鏈霉親和素突變體SA122m5提高了對生物素衍生物(如2-亞氨基生物素)的親和力，有利于生物素化產(chǎn)物的檢測；延長了與生物素結(jié)合的半壽期，有利于需要長時間觀察的實驗與影像研究。
文檔編號C07K14/36GK103172713SQ20131006897
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者李萬波, 陜婧婧, 黃勇, 管春愛, 賈翔 申請人:盤古基因科技(蘇州)有限公司