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一種艾塞那肽固相合成方法

文檔序號(hào):3589477閱讀:1022來源:國知局
專利名稱:一種艾塞那肽固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及多肽藥 物合成技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種艾塞那肽固相合成方法。
背景技術(shù)
糖尿病(diabetes mellitus)是由于胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足引起的以高血糖和多并發(fā)癥并存為特征的內(nèi)分泌代謝性常見病、多發(fā)病,據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新公布數(shù)據(jù)顯示,2007年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)I. 8億,且發(fā)病率仍逐年增加,預(yù)測到2025年,全球糖尿病患者人數(shù)將達(dá)3億,成為繼心腦血管和癌癥之后的人類第三大殺手。糖尿病主要分為I型(膜島素依賴型,insulin dependent diabetes, IDDM)和II型(非胰島素依賴型糖尿病,non-insulin dependent diabetes, NIDDM),其中II型糖尿病患者占90%以上。II型糖尿病患者多存在胰島素抵抗和胰島素分泌不足兩方面異常,在發(fā)病的中晚期往往出現(xiàn)胰島β細(xì)胞凋亡。目前臨床使用的口服降糖藥的作用機(jī)理多為增強(qiáng)胰島素敏感性或促進(jìn)胰島素分泌以穩(wěn)定血糖,均無法解決β細(xì)胞凋亡這一難題。然而,胰高血糖素樣肽-I (Glucagon-like peptide 1,GLP-1)及其類似物藥物的應(yīng)用使得II型糖尿病的治療獲得突破性進(jìn)展,有望為糖尿病治療提供全新的選擇方案。但由于GLP-I易被二肽酶(dipeptidyl pepidiase IV, DPP IV)迅速降解,在體內(nèi)半衰期只有2分鐘左右,故外源GLP-I難以獲得臨床使用。Exendin-4是一種從美洲希拉巨蜥(Heloderma suspectum)唾液中分離得到的含有39個(gè)氨基酸的天然多肽激素,與GLP-I有53%的序列同源性,不但具有類GLP-I促胰島素分泌的功能,而且其體內(nèi)穩(wěn)定性也遠(yuǎn)高于GLP-1。根據(jù)Exendin-4的這一特點(diǎn),美國Amylin公司和Eli Lilly公司聯(lián)合開發(fā)了化學(xué)合成的藥物Exendin_4(又稱Exenatide,式I化合物,中文名艾塞那肽,商品名Byetta)。Byetta是世界上首個(gè)腸促胰島素類似物藥物,于2005年4月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市。研究表明,艾塞那肽不僅能很好地控制血糖,還可促進(jìn)胰島細(xì)胞的新生和增殖,減少β細(xì)胞凋亡,改善β細(xì)胞功能,具有非常明顯的臨床應(yīng)用優(yōu)勢。此外,臨床研究中發(fā)現(xiàn)艾塞那肽還能夠減慢胃腸排空的速度,使人沒有饑餓感而減少攝入食物,從而使人的體重下降。其結(jié)構(gòu)式如下151015H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-20253035Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-PTo-Pro-Ser-NH2艾塞那肽的制備方法主要有生物合成法與化學(xué)合成法。生物合成法利用人工基因重組方式得到Exenatide全序列(如專利CN101501209A)?;瘜W(xué)合成法通??刹捎贸R?guī)的全固相合成(如專利W02008109079A2、CN101357938A、CN101538324A)技術(shù)。全固相合成操作簡單,對(duì)于一些片段較短的肽鏈?zhǔn)且粋€(gè)快捷高效的方法。然而,隨著肽鏈的延長,其中疏水性強(qiáng)的肽段形成β-折疊的可能性很大,固相合成方法往往導(dǎo)致出現(xiàn)困難序列。此外,固相肽合成中還存在肽鏈與樹脂載體之間的分子集聚(aggregation)現(xiàn)象,這都會(huì)造成偶聯(lián)和脫保護(hù)效率大大降低。在艾塞那肽的固相合成中,主要的挑戰(zhàn)有兩處。一處是肽鏈中部從第26到第19個(gè)氨基酸的序列中存在多個(gè)疏水性氨基 酸,形成第一個(gè)“困難序列”區(qū),固相合成實(shí)踐表明,第26位的Leu、第23位的He、第21位的Leu及第19位的Val縮合都非常困難,即便使用了改善的反應(yīng)條件,如變換縮合反應(yīng)體系、延長反應(yīng)時(shí)間、多次重復(fù)縮合等,結(jié)果亦收效甚微。第二個(gè)“困難序列”區(qū)涉及到三個(gè)連續(xù)的谷氨酸殘基。在固相合成中,重復(fù)的谷氨酸序列在帶上側(cè)鏈保護(hù)基后,疏水性大大增加,導(dǎo)致在樹脂上產(chǎn)生扭曲的部分,這使得難以在該重復(fù)的谷氨酸序列上繼續(xù)偶聯(lián)其他氨基酸以延長肽鏈。在化學(xué)合成法中,W02009053315A1公開了一種采用固相和液相結(jié)合合成艾塞那肽的方法。固液結(jié)合的方法因?yàn)榭s短了片段的長度,因此單個(gè)片段在固相上的合成較為容易,且純度較高,有利于最終產(chǎn)物的純化。然而,在液相中進(jìn)行片段縮合時(shí)容易出現(xiàn)片段溶解困難、C-端消旋化以及二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的縮合困難等問題。另外,每個(gè)片段的合成必須使用相對(duì)較貴的全保護(hù)肽樹脂,大大增加了成本。鑒于艾塞那肽重要的藥學(xué)應(yīng)用價(jià)值,有必要提供更有效的艾塞那肽合成方案,能夠克服以上方法的缺陷并適合工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種成本低、適于工業(yè)化生產(chǎn)的艾塞那肽的合成方法。技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于包括以下步驟(I)用固相合成方法由Fmoc-Ser (tBu)-OH和取代度為O. 3-1. 2mmol/g的氨基樹脂為起始原料,反應(yīng)制得Fmoc-Ser (tBu)-氨基樹脂;(2) Fmoc-Ser (tBu)-氨基樹脂在Fmoc脫保護(hù)試劑作用下脫去Fmoc后,在偶聯(lián)體系作用下于偶聯(lián)溶劑中依肽序依次連接Fmoc氨基酸以及至少一個(gè)氨基保護(hù)的Fmoc氨基酸或酰胺N上臨時(shí)取代的二肽,并在Fmoc脫保護(hù)試劑作用下依次脫去Fmoc,制得側(cè)鏈全保護(hù)的艾塞那妝氣基樹脂;(3)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)的艾塞那肽氨基樹脂在裂解體系作用下裂解脫除側(cè)鏈保護(hù)基,冰乙醚沉淀,即得艾塞那肽。其中,步驟(I)中,所述氨基樹脂為Rink Amide樹脂、Rink Amide-AM樹脂、RinkAmide-MBHA樹脂或Sieber Amide樹脂;氨基樹脂和Fmoc-Ser (tBu) -OH的質(zhì)量摩爾比為Ig : (O. 5-5) mmol ;反應(yīng)時(shí)間O. 5_2h,反應(yīng)溫度為10_40°C。其中,步驟(2)中,所述氨基保護(hù)的Fmoc氨基酸為2_羥基_4_甲氧基芐基(Hmb)、2,4- 二甲氧基芐基(Dmb)或2,4,6-三甲氧基芐基(Tmb)保護(hù)的氨基酸,所述酰胺N上臨時(shí)取代的二肽為偽脯氨酸或酰胺N上臨時(shí)取代基為2-羥基-4-甲氧基芐基、2,4- 二甲氧基芐基、2,4,6-三甲氧基芐基保護(hù)的二肽;其中,Hmb的結(jié)構(gòu)式為權(quán)利要求
1.一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于包括以下步驟 (1)用固相合成方法由Fmoc-Ser(tBu)-OH和取代度為O. 3-1. 2mmol/g的氨基樹脂為起始原料,反應(yīng)制得Fmoc-Ser (tBu)-氨基樹脂; (2)Fmoc-Ser (tBu) -氨基樹脂在Fmoc脫保護(hù)試劑作用下脫去Fmoc后,在偶聯(lián)體系作用下于偶聯(lián)溶劑中依肽序依次連接Fmoc氨基酸以及至少一個(gè)氨基保護(hù)的Fmoc氨基酸或酰胺N上臨時(shí)取代的二肽,并在Fmoc脫保護(hù)試劑作用下依次脫去Fmoc,制得側(cè)鏈全保護(hù)的艾塞那妝氣基樹脂; (3)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)的艾塞那肽氨基樹脂在裂解體系作用下裂解脫除側(cè)鏈保護(hù)基,冰乙醚沉淀,即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于步驟(I)中,所述氨基樹脂為 Rink Amide 樹脂、Rink Amide-AM樹脂、Rink Amide-MBHA樹脂或 Sieber Amide樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于步驟(2)中,所述氨基保護(hù)的Fmoc氨基酸為2-羥基-4-甲氧基芐基、2,4- 二甲氧基芐基或2,4,6-三甲氧基芐基保護(hù)的氨基酸,所述酰胺N上臨時(shí)取代的二肽為偽脯氨酸或酰胺N上臨時(shí)取代基為2-輕基-4-甲氧基節(jié)基、2,4- 二甲氧基節(jié)基、2,4, 6- 二甲氧基節(jié)基保護(hù)的二妝;其中, 2-羥基-4-甲氧基芐基的結(jié)構(gòu)式為
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于所述偽脯氨酸包括 Fmoc-Gly-Thr (vMe’MePro)-0H、Fmoc-Phe-Thr (vMe’MePro)-0H、Fmoc-Thr (tBu) -Ser ( ΨΜ0>MePro) -OH、Fmoc-Leu-Ser (iyMe’MePro) -OH、Fmoc-Pro-Ser ( vMe’MePro) -OH 和 Fmoc-Ser (tBu) -Ser ( ¥Me,MePro) -OH。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于所述2-羥基-4-甲氧基芐基、2,4-二甲氧基芐基或2,4,6-三甲氧基芐基保護(hù)的氨基酸包括 Fmoc-(Hmb) Gly-OH、Fmoc-(Hmb) Leu-OH、Fmoc- (Hmb) Ala-OH ;Fmoc_ (Dmb) Gly-OH、Fmoc-(Dmb) Leu-OH、Fmoc-(Dmb) Ala-OH、Fmoc-(Tmb) Gly-OH、Fmoc- (Tmb) Leu-OH 和Fmoc-(Tmb)Ala-OH。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于步驟(2)中,偶聯(lián)溶劑為DCM,DMF或NMP中的任意一個(gè)或一個(gè)以上的組合;偶聯(lián)體系為HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或多個(gè)與DIC的組合,或?yàn)镠OBt、HOAt, HOOBt或Cl-HOBt中的任意一個(gè)或多個(gè)與DPIEA或NMM中的任意一個(gè)或兩個(gè)與HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一個(gè)或多個(gè)的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于步驟(2)中,F(xiàn)moc脫保護(hù)試劑為哌啶,脫保護(hù)反應(yīng)溫度為10-50°C,反應(yīng)時(shí)間為5-60min,F(xiàn)moc脫保護(hù)試劑與偶聯(lián)溶劑的體積比為I: (3-5)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于步驟(3)中,所述裂解體系包括三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水和三異丙基硅烷的混合溶液,其體積比為(90-95)(2-5)(2-5) :(1_5)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法,其特征在于步驟(3)中,冰乙醚沉淀后,還包括純化步驟,具體為將艾塞那肽溶于乙酸水溶液中,過濾,濾液經(jīng)C18或CS柱梯度洗脫,流動(dòng)相為水和乙腈,凍干,即得艾塞那肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種艾塞那肽固相合成方法,包括以下步驟1)由Fmoc-Ser(tBu)-OH和取代度為0.3-1.2mmol/g的氨基樹脂為起始原料,得到Fmoc-Ser(tBu)-氨基樹脂;2)Fmoc-Ser(tBu)-氨基樹脂脫去Fmoc保護(hù)基后,依肽序依次連接Fmoc氨基酸以及至少一個(gè)氨基保護(hù)的Fmoc氨基酸或酰胺N上臨時(shí)取代的二肽,脫去Fmoc,制得側(cè)鏈全保護(hù)的艾塞那肽氨基樹脂;3)對(duì)樹脂脫除側(cè)鏈保護(hù)基,冰乙醚沉淀,即得艾塞那肽。該合成方法效率高、反應(yīng)操作簡單、后處理容易,適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/04GK102942625SQ201210504949
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者蘇賢斌, 錢依冰, 毛怡春, 葉青, 董海軍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué), 南京英沛生物技術(shù)有限公司
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