專(zhuān)利名稱(chēng)：一種固相合成glp-1類(lèi)似物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽固相合成領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種固相合成GLP-I (胰高血糖素樣肽-I)類(lèi)似物的方法。
背景技術(shù)：
隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，腸促胰素這層神秘的面紗被慢慢揭開(kāi)，研究證實(shí)， 腸促胰素是人體內(nèi)一種腸源性激素，腸促胰素以葡萄糖濃度依賴性方式促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，并減少胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素(glucagon)，從而降低血糖。正常人在進(jìn)餐后，腸促胰素開(kāi)始分泌，進(jìn)而促進(jìn)胰島素分泌，以減少餐后血糖的波動(dòng)。但對(duì)于2型糖尿病患者，其“腸促胰素效應(yīng)”受損，主要表現(xiàn)為進(jìn)餐后胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)濃度升高幅度較正常人有所減小，但其促進(jìn)胰島素分泌以及降血糖的作用并無(wú)明顯受損，因此GLP-I 及其類(lèi)似物可以作為2型糖尿病治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。GLP-I主要通過(guò)以下幾方面發(fā)揮降糖作用。GLP-I具有保護(hù)β細(xì)胞的作用GLP-I可作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、胰島素的合成和分泌，并可刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量。此外，GLP-I還可作用于胰島α細(xì)胞，強(qiáng)烈地抑制胰高血糖素的釋放， 并作用于胰島δ細(xì)胞，促進(jìn)生長(zhǎng)抑素的分泌，生長(zhǎng)抑素又可作為旁分泌激素參與抑制胰高血糖素的分泌。研究證明，GLP-I可通過(guò)多種機(jī)制明顯地改善2型糖尿病動(dòng)物模型或患者的血糖情況，其中促進(jìn)胰島β細(xì)胞的再生和修復(fù)，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量的作用尤為顯著， 這為2型糖尿病的治療提供了一個(gè)非常好的前景。
然而，要將GLP-I應(yīng)用于臨床也面臨著問(wèn)題，那就是人體自身產(chǎn)生的GLP-I極易被體內(nèi)的二肽基肽酶IV (DPP-IV)降解，其血漿半衰期不足2分鐘，必須持續(xù)靜脈滴注或持續(xù)皮下注射才能產(chǎn)生療效，這大大限制了 GLP-I的臨床應(yīng)用。為解決這一難題，學(xué)者們已經(jīng)提出兩種方案一是開(kāi)發(fā)GLP-I類(lèi)似物，讓其既保有GLP-I的功效，又能抵抗降解二是開(kāi)發(fā)DPP- IV抑制劑，使體內(nèi)自身分泌的GLP-I不被降解，維持GLP-I的功效。
目前市場(chǎng)上的GLP-I類(lèi)似物通用名為艾塞那肽，英文名Exenatide，化學(xué)結(jié)構(gòu)式 為His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A Ia-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 ;分子式=C184H282N50O60S ;分子量4186. 61。
傳統(tǒng)的固相逐步合成法都是將一個(gè)一個(gè)保護(hù)氨基酸順序偶聯(lián)。但是，在多肽合成時(shí)往往有一些位點(diǎn)由于多肽長(zhǎng)鏈的折疊和氨基酸的空間位置限制，往往使連接下一個(gè)氨基酸的反應(yīng)難以進(jìn)行或難以完全。在合成超過(guò)二十個(gè)氨基酸以后，特別是合成困難的多肽鍵時(shí)，產(chǎn)生以殘基缺失為主的寡肽副產(chǎn)品含量顯著增加并不斷積累，由于這些寡肽副產(chǎn)品與目標(biāo)肽在分子量、溶解性、極性和結(jié)構(gòu)上很相似，難以純化。
申請(qǐng)?zhí)枮?00710044421.4的中國(guó)專(zhuān)利，公開(kāi)了一種固相多肽合成EXENATIDE的制備方法，該發(fā)明提供了一種固相多肽合成EXENATIDE的制備方法以RINK AMIDE樹(shù)脂、 RINKAMIDE AM樹(shù)脂或RINK AMIDE MBHA樹(shù)脂為起始原料，依次連接具有FMOC保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的三十九肽樹(shù)脂，其間依 次脫去FMOC-保護(hù)基團(tuán)，用縮合劑，進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的三十九肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得EXENATIDE粗品， 并經(jīng)C18或CS柱進(jìn)行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥，獲得產(chǎn)品。該發(fā)明的合成方法屬于傳統(tǒng)的一個(gè)一個(gè)保護(hù)氨基酸順序偶聯(lián)，沒(méi)有解決由于連接困難或是連接不完全而產(chǎn)生性質(zhì)非常相似的缺失肽等副反應(yīng)，導(dǎo)致純化困難等問(wèn)題。發(fā)明內(nèi)容
為解決固相合成GLP-I類(lèi)似物過(guò)程中氨基酸順序連接困難或不完全造成而產(chǎn)生性質(zhì)非常相似的缺失肽和副產(chǎn)品，導(dǎo)致后續(xù)純化的時(shí)不能分離副產(chǎn)品的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，該方法在難連接點(diǎn)，采用片段縮合和引入取代基的方法，提高了多肽合成的收率。
本發(fā)明是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，所述的合成方法為以下步驟(I)以Fmoc-Rink Amide PEG MBHA Resin作為起始的樹(shù)脂，在溶劑DCM或DMF作用下在容器中溶脹；起始樹(shù)脂F(xiàn)moc-Rink Amide PEG MBHA Resin 的取代度為 O. lmmol/g^O. Bmmol / g，作為優(yōu)選，取代度為O. 40mmol/g。溶劑的使用量為使起始樹(shù)脂全部浸在溶劑中的量，溶脹 O. 5^12小時(shí)。起始樹(shù)脂的溶脹是反應(yīng)試劑分子進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)部與功能基反應(yīng)的先決條件，在反應(yīng)進(jìn)行中固相載體的充分溶脹對(duì)反應(yīng)試劑分子、可溶的構(gòu)件分子的自由運(yùn)動(dòng)十分有利， 因而能達(dá)到充分反應(yīng)的效果。
(2)在容器中加入脫保護(hù)試劑后，然后對(duì)脫保護(hù)后的樹(shù)脂進(jìn)行沖洗備用；脫保護(hù)試劑選自Fmoc的脫保護(hù)試劑或者Boc的脫保護(hù)試劑，F(xiàn)moc的脫保護(hù)試劑選用體積濃度為20% 的哌啶/DMF溶液，Boc的脫保護(hù)試劑選自體積濃度為50%的TEA/DCM溶液，脫保護(hù)試劑的使用量為樹(shù)脂體積的2飛倍。脫保護(hù)反應(yīng)溫度為5 50°C，脫保護(hù)反應(yīng)時(shí)間為1(Γ30分鐘。
(3)以Fmoc或者Boc氨基保護(hù)的氨基酸或者肽片段溶液作為中間原料，在DMF溶劑中加入活化劑對(duì)羧基預(yù)活化；活化劑選自碳二亞胺型(DIC)、苯并三唑鎗鹽型(Β0Ρ)、_ 啶并三唑鎗鹽型(Α0Ρ)、磷酸酯型縮合試劑中一種，其中DIC與HoBt或者HoAt同時(shí)使用， BOP或者AOP與叔胺同時(shí)使用，目前，常規(guī)使用量為氨基酸或者肽片段溶液DIC =HoBt或者 HoAt的摩爾比為I :1 :1，氨基酸或者肽片段溶液B0P或者AOP :叔胺的摩爾比為1:1:1，磷酸酯型縮合試劑選自DPPA、DEPBT、FDPP中一種，活化劑的使用量與氨基酸及肽片段投料量的摩爾數(shù)相同，中間原料在冰浴中預(yù)活化5 15min，DMF溶劑的使用量為使溶質(zhì)溶解的量， 常規(guī)為溶質(zhì)與溶劑的質(zhì)量體積比為Ig以能夠完全溶解原料為宜,體積越小越好。
(4)將活化后的Fmoc或者Boc保護(hù)的氨基酸或者肽片段溶液與步驟(2)得到的產(chǎn)物混合，進(jìn)行縮合反應(yīng)；保護(hù)氨基酸及肽片段的投料量與步驟(2)產(chǎn)物的摩爾比為2飛1。 縮合反應(yīng)溫度為5 50°C，縮合反應(yīng)的時(shí)間為廣3小時(shí)，如果反應(yīng)不完全，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或是換液重新偶聯(lián)。將活化的Fmoc或者Boc保護(hù)氨基酸或者肽片段與經(jīng)溶脹、脫氨基保護(hù)的多肽固相樹(shù)脂混合，則樹(shù)脂上中間產(chǎn)物多肽的脫保護(hù)氨基與溶液中的帶保護(hù)氨基酸的活化羧基間發(fā)生縮合反應(yīng)，固相樹(shù)脂上形成更長(zhǎng)鏈的Fmoc或者Boc保護(hù)氨基的多肽片段。
(5 )抽取步驟(4 )的產(chǎn)物通過(guò)茚三酮監(jiān)測(cè)縮合反應(yīng)完成的程度，直到步驟(4 )完成反應(yīng)，然后對(duì)步驟(4)的產(chǎn)物進(jìn)行沖洗；通過(guò)茚三酮監(jiān)測(cè)縮合反應(yīng)完成的完成程度，直到反應(yīng)完成。經(jīng)洗滌，得到了具有更長(zhǎng)肽片段的Fmoc或者Boc保護(hù)氨基肽片段固相樹(shù)脂。茚三酮監(jiān)測(cè)步驟為茚三酮檢測(cè)液A、B、C液各兩滴，加熱到11(T12(TC并保持l_2min，如果溶液有蘭色，或固相樹(shù)脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，反應(yīng)尚未完成，否則說(shuō)明連接完全。
(6)將步驟(5)的產(chǎn)物放入容器中，重復(fù)步驟(2廠(5)，按照氨基酸序列從C端到 N端的順序進(jìn)行新的氨基酸或者肽片段的縮合，最后，經(jīng)過(guò)沖洗得到側(cè)鏈全保護(hù)的GLP-I類(lèi)似物-Rink Amide MBHA PEG固相樹(shù)脂；(7)對(duì)步驟(6)得到的側(cè)鏈全保護(hù)的GLP-I類(lèi)似物-Rink Amide MBHA PEG固相樹(shù)脂通過(guò)切割試劑進(jìn)行脫保護(hù)和切割反應(yīng)，然后采用冰乙醚沉淀得到GLP-I類(lèi)似物粗產(chǎn)品；脫保護(hù)和切割反應(yīng)的切割試劑的使用量為，Ig側(cè)鏈全保護(hù)的GLP-I類(lèi)似物-Rink Amide MBHA PEG固相樹(shù)脂添加切割試劑5 10ml，切割試劑中各組分的體積比為T(mén)FA =Thioanisole EDT =Phenol :H20=85 95 Γ5 Γ5 Γ5 :1 5，脫保護(hù)和切割時(shí)先冰浴O. 5 I小時(shí)，切割溫度 5 35°C，切割時(shí)間3 8小時(shí)，然后過(guò)濾，收集濾液并沖洗，最后在濾液中加入冰乙醚，得到的沉淀用濾紙過(guò)濾，即得到GLP-I類(lèi)似物粗產(chǎn)品，冰乙醚與濾液的體積比為5 10 :1。
(8)得到的GLP-I類(lèi)似物粗產(chǎn)品通過(guò)離子交換及逆相高效液相色譜進(jìn)行分離純化，最后通過(guò)冷凍干燥，得到GLP-I類(lèi)似物產(chǎn)品。
上述步驟中所述的沖洗均采用DMF及甲醇沖洗，先DMF洗滌若干次，再甲醇洗滌若干次，或者是DMF、甲醇間隔使用洗滌若干次。
作為優(yōu)選，步驟(4)中所述的肽片段選在Gly處、PiO處或是能形成類(lèi)Pro結(jié)構(gòu)處中的一處或幾處。
肽片段選在Gly處的肽片段選自帶有His的Gly處、Gly-Gly處中一處或兩處。帶有His的Gly處的肽片段選自Fmoc-His1 (Trt) -Gly2_0H、Fmoc-His1 (Trt) -Gly2-Glu3-Gly4-OH, Boc-His1 (Trt) -Gly2-OH, Boc-His1 (Trt) -Gly2-Glu3-Gly4-OH 中一種。帶有Gly-Gly處的肽片段為FmoC-Gly29-Gly3°-OH。
選在Pro處或是能形成類(lèi)Pro結(jié)構(gòu)處的肽片段選自 Fmoc-Thr7 (tBu) -Ser8 (Psi (Me, Me) pro) -OH、Fmoc-Leu10-Ser11 (Psi (Me, Me) pro) -OH 中一種或幾種。
本發(fā)明提供了一種固相合成GLP-I類(lèi)似物Exenatide的方法。采用Fmoc/tBu策略，按照固相合成的方法依次接入帶Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸及帶Fmoc/Boc保護(hù)基團(tuán)的片段。期間依次脫去Fmoc或Boc保護(hù)基縮合帶保護(hù)基團(tuán)的氨基酸或肽片段，獲得帶保護(hù)的三十九肽樹(shù)脂，然后進(jìn)行切割脫去側(cè)鏈保護(hù)基得到Exenatide粗產(chǎn)品。得到的Exenatide 粗產(chǎn)品經(jīng)過(guò)離子交換及逆相高效液相色譜方法純化得到Exenatide產(chǎn)品。由于固相樹(shù)脂為合成的多肽羧基端提供了氨基保護(hù)，合成后通過(guò)胺解反應(yīng)將全保護(hù)肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)， 再通過(guò)切割脫去側(cè)鏈保護(hù)基，這樣也能保證多肽序列的羧基端為氨基。
本發(fā)明在難連位點(diǎn)采用了片段縮合方法和引入取代基的方法。多肽合成難連位點(diǎn)一般在連接的時(shí)候連接困難或是容易產(chǎn)生副反應(yīng)，或是連接不完全會(huì)產(chǎn)生性質(zhì)非常相似的缺失肽，導(dǎo)致后續(xù)純化的時(shí)候缺失肽雜質(zhì)不能分離。困難肽合成的關(guān)鍵在于破壞困難序列導(dǎo)致的折疊結(jié)構(gòu)，根據(jù)Pro殘基可以終止β-折疊結(jié)構(gòu)的原理，可在不含Pro的目標(biāo)肽分子中特定部位酰胺鍵N原子上引入具有一定體積的取代基，使該殘基成為二級(jí)胺型氨基6酸(類(lèi)Pro結(jié)構(gòu))，可防止β_折疊的形成。本發(fā)明是在Pro處或是能形成類(lèi)Pro結(jié)構(gòu)處引入取代基。
本發(fā)明在最容易發(fā)生消旋化的位點(diǎn)添加氨基酸空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的氨基酸Gly的肽片段，減少His消旋雜質(zhì)的產(chǎn)生。降低了純化難度并提高了純化收率、降低了生產(chǎn)成本，能夠帶來(lái)廣泛的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。His組氨酸是最容易發(fā)生消旋化的氨基酸，本發(fā)明所述的肽片段一般選取Gly處,通過(guò)His-Gly、His-Gly- Glu-Gly,肽片段的引入減少了 His消旋雜質(zhì)的產(chǎn)生。
本發(fā)明通過(guò)固相連接Gly-Gly片段取代傳統(tǒng)的單個(gè)氨基酸順序連接，這樣可以減少合成過(guò)程中產(chǎn)生Gly的缺失肽，而少Gly的缺失肽與目標(biāo)多肽性質(zhì)非常接近，這樣會(huì)導(dǎo)致后續(xù)很難將目標(biāo)肽與雜質(zhì)有效的分離，影響總的收率。通過(guò)選擇二肽片段引入Gly-Gly 片段合成策略，在合成過(guò)程中不僅Gly-Gly和一個(gè)Gly —樣連接容易，合成產(chǎn)率更高，而且 Gly-Gly的缺失肽比Gly的缺失肽更容易與目標(biāo)多肽分離提高了合成收益，降低了生產(chǎn)成本。
說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的縮寫(xiě)的含義列于下表中
權(quán)利要求
1.一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于所述的合成方法為以下步驟 (1)以Fmoc-RinkAmide PEG MBHA Resin作為起始樹(shù)脂，在DCM或DMF溶劑下在容器中溶脹； (2)在容器中加入脫保護(hù)試劑后，然后對(duì)脫保護(hù)后的樹(shù)脂進(jìn)行沖洗備用； (3)以Fmoc或者Boc氨基保護(hù)的氨基酸或者肽片段溶液作為中間原料，在DMF 溶劑中加入活化劑對(duì)羧基預(yù)活化備用； (4)將活化后的Fmoc或者Boc保護(hù)的氨基酸或者肽片段溶液與步驟(2)得到的脫保護(hù)產(chǎn)物混合，進(jìn)行縮合反應(yīng)； (5)抽取步驟(4)的產(chǎn)物通過(guò)茚三酮監(jiān)測(cè)縮合反應(yīng)完成的程度，直到步驟(4)完成反應(yīng)，然后對(duì)帶有產(chǎn)物的固相樹(shù)脂進(jìn)行沖洗； (6)將步驟(5)的產(chǎn)物放入容器中，重復(fù)步驟(2) (5)，按照氨基酸序列從C端到N端的順序進(jìn)行新的氨基酸或者肽片段的縮合，最后，經(jīng)過(guò)沖洗得到側(cè)鏈全保護(hù)的GLP-I類(lèi)似物-Rink Amide MBHA PEG 固相樹(shù)脂； (7)對(duì)步驟(6)得到的側(cè)鏈全保護(hù)的GLP-I類(lèi)似物-RinkAmide MBHA PEG固相樹(shù)脂進(jìn)行脫保護(hù)和切割反應(yīng)，然后采用冰乙醚沉淀、過(guò)濾得到GLP-I類(lèi)似物粗產(chǎn)品； (8)得到的GLP-I類(lèi)似物粗產(chǎn)品通過(guò)離子交換及反相高效液相色譜進(jìn)行分離純化，最后通過(guò)冷凍干燥，得到GLP-I類(lèi)似物產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，步驟(I)中起始樹(shù)脂 Fmoc-Rink Amide PEG MBHA Resin 的取代度為 0. lmmol/g-0. 6mmol/g,溶劑的使用量為使起始樹(shù)脂全部浸在溶劑中的量，溶脹0. 5^12小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，步驟(2)中脫保護(hù)試劑選自Fmoc的脫保護(hù)試劑或者Boc的脫保護(hù)試劑，F(xiàn)moc的脫保護(hù)試劑選用體積濃度為20%的哌啶/DMF溶液，BOC的脫保護(hù)試劑選自體積濃度為50% TEA/DCM，樹(shù)脂與脫保護(hù)試劑的質(zhì)量體積比為Ig :2 15ml，脫保護(hù)反應(yīng)溫度為5 50°C，脫保護(hù)反應(yīng)時(shí)間為1(T30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，步驟(3)中活化劑選自N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、苯并三唑鎗鹽型(B0P)、吡啶并三唑鎗鹽型(A0P)、磷酸酯型縮合試劑中一種，其中DIC與HoBt或者HOAt同時(shí)使用，BOP或者AOP與叔胺同時(shí)使用，磷酸酯型縮合試劑選自DPPA、DEPBT, FDPP中一種，活化劑的使用量與氨基酸及肽片段的投料量的摩爾數(shù)相同，DMF溶劑的使用量為使溶質(zhì)溶解的量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，步驟(4)中保護(hù)氨基酸及肽片段的投料量與步驟(2)產(chǎn)物的摩爾比為2飛1，縮合反應(yīng)溫度為5 50°C，縮合反應(yīng)的時(shí)間為廣3小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的肽片段選在Gly處、Pro處或是能形成類(lèi)Pro結(jié)構(gòu)處中的一處或幾處。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，所述的肽片段選自帶有His的Gly處、Gly-Gly處中一處或兩處。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，帶有His 的 Gly 處的肽片段選自 Fmoc-HiskTrtXlytOH'Fmoc-HiskTrtXlytGluLGlyLOH、Boc-His1 (Trt) -Gly2-OH^Boc-His1 (Trt)-Gly2-Glu3-Gly4-OH 中一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，Gly-Gly 處的肽片段為 FmoC-Gly29-Gly3°-OH。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種固相合成GLP-I類(lèi)似物的方法，其特征在于，選在Pro處或是能形成類(lèi)Pro結(jié)構(gòu)處的肽片段選自Fmoc-Thr7 (tBu) -Ser8 (Psi (Me, Me) pro) -OH、Fmoc-Leu10-Ser11 (Psi (Me, Me) pro) -OH 中一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽固相合成領(lǐng)域，為解決固相合成GLP-1類(lèi)似物過(guò)程中氨基酸順序連接困難或不完全造成而產(chǎn)生性質(zhì)非常相似的缺失肽和副產(chǎn)品，導(dǎo)致后續(xù)純化的時(shí)不能分離副產(chǎn)品的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種固相合成GLP-1類(lèi)似物的方法，本發(fā)明在難連位點(diǎn)采用了片段縮合方法和引入取代基的方法，提高了多肽合成的收率。
文檔編號(hào)C07K1/04GK102977204SQ20121045435
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者劉秀麗 申請(qǐng)人:吉林省敖騰生物科技有限責(zé)任公司