專利名稱：從紫花碎米薺中提取的黃酮苷及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種從紫花碎米薺中提取的黃酮苷及其制備方法。
背景技術(shù)：
紫花碎米莽是碎米莽屬(Cardamine)植物紫花碎米莽(Cardamine tangutorum)的干燥地上部分，分布于河北、山西、陜西、甘肅、青海、四川、云南等省。生于海拔2100-4400米的高山山溝草地及林下陰濕處。紫花碎米薺在民間以全草食用；亦供藥用，其味辛，性溫，具有清熱利濕，平肝潛陽的功效，可用于治療黃水瘡；花治筋骨疼痛。紫花碎米薺在我國分布廣泛，資源十分豐富，并且具有顯著和多樣的臨床作用和藥理活性。紫花碎米薺為何具有藥用價值，其活性成分如何提取，至今未見有公開報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從紫花碎米薺中提取的黃酮苷及其制備方法，可有效解決從紫花碎米薺中提取黃酮苷，并通過采用MTT法檢測該化合物對Con A刺激后的脾淋巴細(xì)胞和胸腺淋巴細(xì)胞增殖的影響，以觀察該化合物的免疫調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)的問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該提取的黃酮苷為山柰酚-3-0-[2" -Ο-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -O-(2" " -O-阿魏酰基-β-D-葡萄糖基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式是C43H48O24，結(jié)構(gòu)式如圖I所示；其比旋光度為[a ]D2°-17(c，0. 12，MeOH)，其制備方法是將干燥紫花碎米薺地上部分，室溫(15-25°C)下在閃式提取器中用紫花碎米薺重量10-12倍的體積濃度為50%丙酮組織破碎提取三次，每次15-20分鐘，合并提取液，于45°C減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂(Diaion HP-20)柱，用水沖柱至洗脫液流出無色、用體積濃度10%甲醇沖柱至洗脫液流出無色、用體積濃度20%甲醇沖柱至洗脫液流出無色、最后用體積濃度30%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集30%甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，用水充分溶解，離心，上清液上凝膠(Toyopearl HW-40C)柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢識合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A，組分A依次通過凝膠ToyopearlHW-40C 柱、凝膠 Sephadex LH-20 柱、娃膠柱、MCI Gel CHP-20 柱,反復(fù)分離純化，得到黃色固體，然后，采用MTT法檢測該化合物對Con A刺激后的脾淋巴細(xì)胞和胸腺淋巴細(xì)胞增殖活性的影響，發(fā)現(xiàn)具有較強的促增殖作用。本發(fā)明是一種從紫花碎米薺中提取的化合物，具有免疫調(diào)節(jié)作用，其制備方法新穎獨特，先進(jìn)、科學(xué)，操作方便，經(jīng)對河南、河北、山西的紫花碎米薺樣品按上述方法經(jīng)反復(fù)應(yīng)用制備，并通過MTT法檢測促增殖活性，均取得了相同或相近似的結(jié)果，表明本發(fā)明可靠性強，有效解決了對各地從紫花碎米薺中提取山柰酚-3-0-[2" -Ο-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -O-(2" " -O-阿魏酰基-β-D-葡萄糖基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，為紫花碎米薺的應(yīng)用提供了有利的技術(shù)手段和藥用價值，經(jīng)濟(jì)和社會效益巨大。

圖I為山柰酚-3-0-[2" -0-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏酰基-β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)圖。圖2為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏酰基-β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷的主要HMBC相關(guān)圖。圖3為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-i3-D-吡喃葡萄糖苷的1H-NMR圖譜。圖4為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏?；?β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷的13C-NMR圖譜。 圖5為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏?；?β -D-葡萄糖基)]_ β -D-吡喃葡萄糖苷的HSQC圖譜。圖6為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏?；?β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷的HMBC圖譜。圖7為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷的1H-1H COSY圖譜。圖8為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏酰基-β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷的TOCSY圖譜。圖9為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏?；?β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷的IR圖譜。圖10為山柰酚-3-0-[2〃 -O-β-D-卩比喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏?；?β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷的HR-ESI-MS圖譜。圖11為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-批喃葡萄糖基-6" _0-(2" " _0_阿魏酰基-β -D-葡萄糖基)]_β -D-吡喃葡萄糖苷對ConA刺激的脾淋巴細(xì)胞和胸腺淋巴細(xì)胞增
殖的影響。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例及相關(guān)試驗對本發(fā)明的具體實施方式
作詳細(xì)說明。本發(fā)明所用的紫花碎米莽經(jīng)鑒定為十字花科(Cruciferae)碎米莽屬(Cardamine)植物紫花碎米莽(Cardamine tangutorum)。柱層析填料 Diaion HP-20 > MCIGel CHP-20為日本三菱化學(xué)公司生產(chǎn)，Toyopearl HW-40為日本TOSOH公司生產(chǎn)，S^hadexLH-20為Parmacia Biotech公司生產(chǎn)，柱層析所用硅膠H由青島海洋化工廠生產(chǎn)(160-200目)，薄層層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)(顆粒范圍10-40 μ m)，以0. 5%CMC-Na制板，陰干，105°C活化 0. 5h。RPMI-1640 培養(yǎng)基購自 Gibco Invitrogen 公司，MTT、DMS0 為 Amresco公司產(chǎn)品。核磁共振由DPX-400 (400MHz for IH-NMR and 100MHz for 13C-NMR)核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)，由鄭州大學(xué)分析測試中心代測。質(zhì)譜儀型號為APEX II，紅外分光光度計型號為Shimadzu FTIR-8201，均由河南省科學(xué)院化學(xué)研究所代測。N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，SHB-95B型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，DFZ-3型真空干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)，閃式提取器由北京金鼐科技發(fā)展有限公司提供。二氧化碳培養(yǎng)箱(REVCO)，倒置顯微鏡(NIKON ECLIPSE TS100)，超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán))，酶標(biāo)儀(BIO-RAD Model 680)，微量加樣器(Nichipet EXPLUS)。實驗動物清潔級Balb/c小鼠，雄性，8_10周齡，體重(20±2) g[河南省實驗動物中心,合格證號SCXK (豫)2010-0002]。實施例1
將河南產(chǎn)干燥紫花碎米薺地上部分2. 5kg，室溫20°C下在閃式提取器中用紫花碎米薺重量10倍的體積濃度為50%丙酮組織破碎提取三次，每次18分鐘，合并提取液，于45°C減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂Diaion HP-20柱，用水沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度10%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度20%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，最后用體積濃度30%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集30%甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉8. 9g，用水充分溶解，離心，上清液上凝膠Toyopearl HW-40C柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢識合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A,組分A依次通過凝膠Toyopearl HW-40C柱、凝膠Sephadex LH-20柱、娃膠柱、MCI Gel CHP-20柱，最后反復(fù)分離純化，得到山柰酚-3-0-[2" -Ο-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -O-(2" " -O-阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-i3-D-吡喃葡萄糖苷llmg。取實施例I所得的化合物，經(jīng)試驗證明，可顯著促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用，有關(guān)試驗情況如下稱取0. Img該化合物，力卩入RPMI-1640完全培養(yǎng)液(FBS : 10%，5. 5 X lCr3mg · ml/1 β - 二巰基乙醇，100U · ml/1青霉素和100 μ g · ml/1鏈霉素)超聲溶解，0. 22 μ m孔徑濾膜過濾除菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆?；各組均分為空白組；ConA(終濃度為5μ g · mL-1)刺激組；低、中、高劑量組；配成的藥物終濃度為0. UUlOyg-mL—1，將Balb/c小鼠頸椎脫白致死，無菌取出胸腺、脾臟分別放入盛有含青霉素(IOOU^mL-1)和鏈霉素(IOOyg^mr1)的冷PBS的培養(yǎng)皿中，用注射器針芯輕輕將其研碎，200目篩網(wǎng)過濾，離心，分別收集細(xì)胞；紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞2次，1500r · mirT1，離心IOmin ;分別用冷RPMI-1640不完全培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，備用；分別以3 X IO4個/孔和4X IO4個/孔的濃度接種于96孔板內(nèi)；加入不同濃度的用藥組，每孔終體積為200μ L，37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育；胸腺淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)24h，脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)48h，均在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入MTT溶液(5ug/ml) 20ul，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150ul DMS0,震蕩5 10分鐘，使結(jié)晶物完全溶解；以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在570nm下測定各孔吸光度(OD)值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用以檢測淋巴細(xì)胞的功能。細(xì)胞增殖(%)=(給藥組0D570nm-對照組0D570nm) /對照組0D570nmX 100%,采用
SPSS 13. O統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均用平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果顯示，ConA刺激后，該化合物可顯著促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用，與空白組相比有極顯著差異(p〈0. 01 )，與ConA組相比有極顯著差異(P〈0. 01)，且呈劑量依賴性；該化合物同樣可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，與空白組相比有極顯著差異(P〈0. 01)，與ConA組相比同樣具有極顯著差異(P〈0. 01)。實施例2
將河北產(chǎn)干燥紫花碎米薺地上部分2. 0kg，室溫23°C下在閃式提取器中用紫花碎米薺重量11倍的體積濃度為50%丙酮組織破碎提取三次，每次20分鐘，合并提取液，于45°C減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂Diaion HP-20柱，用水沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度10%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度20%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，最后用體積濃度30%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集30%甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉8. lg，用水充分溶解，離心，上清液上凝膠Toyopearl HW-40C柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢視合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A,組分A依次通過凝膠Toyopearl HW-40C柱、凝膠Sephadex LH-20柱、娃膠柱、MCI Gel CHP-20柱，最后反復(fù)分離純化，得到山柰酚-3-0-[2" -Ο-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -O-(2" " -O-阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-i3-D-吡喃葡萄糖苷12mg。 取實施例2所得的化合物，經(jīng)試驗證明，可顯著促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用，有關(guān)試驗情況如下稱取0. Img該化合物，力卩入RPMI-1640完全培養(yǎng)液(FBS : 10%，5. 5 X lCr3mg · ml/1 β - 二巰基乙醇，100U · ml/1青霉素和100 μ g · ml/1鏈霉素)超聲溶解，0. 22 μ m孔徑濾膜過濾除菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆?；各組均分為空白組；ConA(終濃度為5μ g · mL-1)刺激組；低、中、高劑量組；配成的藥物終濃度為O. UUlOyg · mL—1 ;將Balb/c小鼠頸椎脫白致死，無菌取出胸腺、脾臟分別放入盛有含青霉素(IOOU^mL-1)和鏈霉素(IOOyg^mr1)的冷PBS的培養(yǎng)皿中，用注射器針芯輕輕將其研碎，200目篩網(wǎng)過濾，離心，分別收集細(xì)胞；紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞2次，1500r · mirT1，離心IOmin ;分別用冷RPMI-1640不完全培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，備用；分別以3 X IO4個/孔和4X IO4個/孔的濃度接種于96孔板內(nèi)；加入不同濃度的用藥組，每孔終體積為200μ L，37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育；胸腺淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)24h，脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)48h，均在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入MTT溶液(5ug/ml) 20ul，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150ul DMS0,震蕩5 10分鐘，使結(jié)晶物完全溶解；以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在570nm下測定各孔吸光度(OD)值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用以檢測淋巴細(xì)胞的功能。細(xì)胞增殖(%)=(給藥組0D570nm-對照組0D570nm) /對照組0D570nmX 100%,采用
SPSS 13. O統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均用平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果顯示，ConA刺激后，該化合物可顯著促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用，與空白組相比有極顯著差異(p〈0. 01 )，與ConA組相比有極顯著差異(P〈0. 01)，且呈劑量依賴性；該化合物同樣可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，與空白組相比有極顯著差異(P〈0. 01)，與ConA組相比同樣具有極顯著差異(P〈0. 01)。實施例3將山西產(chǎn)干燥紫花碎米薺地上部分I. 5kg，室溫25°C下在閃式提取器中用紫花碎米薺重量12倍的體積濃度為50%丙酮組織破碎提取三次，每次20分鐘，合并提取液，于45°C減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂Diaion HP-20柱，用水沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度10%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度20%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，最后用體積濃度30%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集30%甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉7. 5g，用水充分溶解，離心，上清液上凝膠Toyopearl HW-40C柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢視合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A,組分A依次通過凝膠Toyopearl HW-40C柱、凝膠Sephadex LH-20柱、娃膠柱、MCI Gel CHP-20柱，最后反復(fù)分離純化，得到山柰酚-3-0-[2" -Ο-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -O-(2" " -O-阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-i3-D-吡喃葡萄糖苷10mg。取實施例3所得的化合物，經(jīng)試驗證明，可顯著促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用，有關(guān)試驗情況如下稱取O. Img該化合物，力卩入RPMI-1640完全培養(yǎng)液(FBS : 10%，5. 5 X lCr3mg · ml/1 β - 二巰基乙醇，100U · ml/1青霉素和100 μ g · ml/1鏈霉素)超聲溶解，0. 22 μ m孔徑濾膜過濾除菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆?；各組均分為空白組；ConA(終濃度為5μ g · mL-1)刺激組；低、中、高劑量組；配成的藥物終濃度為O. UUlOyg · mL—1 ;將Balb/ c小鼠頸椎脫白致死，無菌取出胸腺、脾臟分別放入盛有含青霉素(IOOU^mL-1)和鏈霉素(IOOyg^mr1)的冷PBS的培養(yǎng)皿中，用注射器針芯輕輕將其研碎，200目篩網(wǎng)過濾，離心，分別收集細(xì)胞；紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞2次，1500r · mirT1，離心IOmin ;分別用冷RPMI-1640不完全培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，備用；分別以3 X IO4個/孔和4X IO4個/孔的濃度接種于96孔板內(nèi)；加入不同濃度的用藥組，每孔終體積為200μ L，37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育；胸腺淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)24h，脾淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)48h，均在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入MTT溶液(5ug/ml) 20ul，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150ul DMS0,震蕩5 10分鐘，使結(jié)晶物完全溶解；以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在570nm下測定各孔吸光度(OD)值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用以檢測淋巴細(xì)胞的功能。細(xì)胞增殖(%)=(給藥組0D570nm-對照組0D570nm) /對照組0D570nmX 100%,采用
SPSS 13. O統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均用平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差P ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果顯示，ConA刺激后，該化合物可顯著促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用，與空白組相比有極顯著差異(p〈0. 01 )，與ConA組相比有極顯著差異(P〈0. 01)，且呈劑量依賴性；該化合物同樣可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，與空白組相比有極顯著差異(P〈0. 01)，與ConA組相比同樣具有極顯著差異(P〈0. 01)。本發(fā)明所得的化合物在結(jié)構(gòu)上經(jīng)對比研究和經(jīng)光譜學(xué)分析，確定為山柰酚-3-0-[2" -Ο-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0-(2" " -O-阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷，分子式是C43H48O24,結(jié)構(gòu)式如圖I所示，屬黃酮苷類，該化合物被稱為從紫花碎米薺中提取的一種黃酮苷，有關(guān)對比研究和光譜分析資料如下山柰酚-3-0-[2〃 -O-β-D-批喃葡萄糖基-6" _0-(2" " _0_阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-β- _卩比喃葡萄糖苷，黃色固體，其比旋光度為[a]D2°-12(c，0. 12, MeOH)；易溶于甲醇；FeCl3-K3[Fe (CN)6]試劑噴霧后加熱顯淡藍(lán)色，提示該化合物中含有羥基；茴香醛-濃硫酸噴霧后加熱顯黃色(105。。)； HR-ESI-MS m/z:972. 2473 [M+Na+H] +( if算值972· 2512)，提示分子式為 C43H48O24 ；UV λ maxMe0Hnm(log ε ) :269、327nm ；IR(KBr) umaxcm_1: 3403, 2925, 1654, 1604, ,IlTSaOTe51H-NMR if 中，低場區(qū)，δ 8. 13 (2Η, d, J=8. 8Hz, H_2 ' ，6 ' ) ,6. 85 (2H, d, J=8. 8Hz, H_3 ' ，5 ')為 AA ' BB '系統(tǒng)的氫質(zhì)子信號；δ6· 19(lH，d，J=1.3Hz，H-6)，6.43(lH，d，J=1.3Hz，H-8)為苯環(huán)間位取代的氫質(zhì)子信號；S7.21(lH，d，J=l. 1Ηζ，Η-2 ""')’7.02(lH，d, J=L 1，8·0Ηζ，Η-6 " " ' )，6· 85 (1H, d, J=8. OHz, H_5 ""')為 ABX 系統(tǒng)的氫質(zhì)子信號；δ 7.54 (lH，d，J=15.8Hz，H-7 " " ' )，6· 16 (1Η，d，J=15. 8Hz，Η_8 "",)提示存在一個反式雙鍵，S3.95(3H，s)處為一個甲氧基氫信號，推測含有一個阿魏酸的結(jié)構(gòu)片段；另外，在S 2. 86-5. 35有21個氫質(zhì)子信號，提示結(jié)構(gòu)中可能含有三個糖，包括三個糖的端基氫的信號 S5.35(lH，d，J=7.5Hz，H-l" )，4· 72 (1H，d，J=6. 9Hz，H_l"")，
4.39 (1H，d，J=8. 0Hz，H-I " ' ) ;13C_NMR譜中，共出現(xiàn)43個碳信號，推測可能為黃酮苷類化合物，其中15個為母核上的碳信號，18個為糖上的碳信號，10個阿魏酰基上的碳信號。通過TOCSY，HSQC, HMBC對各個碳?xì)涞臄?shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬，TOCSY和HSQC譜指認(rèn)了三個糖的端基氫所對應(yīng)的碳信號，其中5 5. 35 (1H, d, J=7. δΗζ,Η-l")與δ 101. 5相關(guān)，5 4. 72 (1Η, d, J=6. 9Hz, H-I ;/ ')與 δ104·6 相關(guān)，δ 4. 39 (1Η, d, J=8. OHz, H_l"")與δ 101. 9 相關(guān)；HMBC 譜顯示 δ 8· 13(H-2 ' ,6')與 158. 8 (C_2)，161. 7 (C_4 ')有遠(yuǎn)程相關(guān)；δ 6· 85(H-3 ' , 5 ')與 122.5(01' )，161.7(C_4')有遠(yuǎn)程相關(guān)；δ 6. 43 (Η_8)與 100. 6(C-6)，105. 5(C-10)，158. 5(C-9)，163. 0(C-5)有遠(yuǎn)程相關(guān)；δ6·19(Η_6)與95. 4(C-8)，105.5(C-10)，167.0(C-7)，163. 0(C-5)有遠(yuǎn)程相關(guān)；Η-2 ""與 C_9 ""'有遠(yuǎn)程相關(guān)，提示阿魏?；B在Glc ""的2位上；H-I ""與C-6"有遠(yuǎn)程相關(guān)，提示Glc""的I位連在Glc"的6位上；H-I "'與C-2 "有遠(yuǎn)程相關(guān)，提示Glc"'的I位連在Glc"的2位上；此外，末端葡萄糖的端基氫H-I "與山柰酚母核3位碳(δ 134.8)有遠(yuǎn)程相關(guān)，說明末端葡萄糖端基氫與黃酮醇3位羥基縮合成苷；且與已知化合物2山柰酚-3-(2"，6" -二-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-卩比喃葡萄糖苷結(jié)構(gòu)相似，通過比較兩者的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了糖鏈的連接順序；綜上所述，該化合物結(jié)構(gòu)確定為山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-卩比喃葡萄糖基-6" -0-(2" " -O-阿魏酰基-β-D-葡萄糖基吡喃葡萄糖苷；經(jīng)文獻(xiàn)檢索未見報道，確定其為從紫花碎米薺中提取的化合物，屬于黃酮苷類。下表為化合物山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0_(2" " _0_阿魏酰基-β-D-葡萄糖基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷的1H-NmrgoomHz,cd3od)和13C-NMR(IOOMHz, CD3OD)數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種從紫花碎米薺中提取的黃酮苷，其特征在于，該黃酮苷為山柰酚-3-0-[2" -Ο-β-D-批喃葡萄糖基-6 " -0-(2" " -O-阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷，分子式是C4 H4 O 4，結(jié)構(gòu)式為
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從紫花碎米薺中提取的黃酮苷，其特征在于，將干燥的紫花碎米薺地上部分2. 5kg，23°C下在閃式提取器中每次用紫花碎米薺重量10倍量的體積濃度為50%的丙酮提取三次，每次18分鐘，合并提取液，于45°C減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂Diaion HP-20柱，用水沖柱至洗脫液流出無色、用體積濃度10%甲醇沖柱至洗脫液流出無色、用體積濃度20%甲醇沖柱至洗脫液流出無色、最后用體積濃度30%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集30%甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥后，得到干粉8. 9g，用水溶解，離心，上清液上凝膠Toyopearl HW-40C柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢視合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A，組分A依次通過凝膠Toyopear 1HW-40C 柱、凝膠 Sephadex LH-20 柱、娃膠柱、MCI Gel CHP-20 柱，最后反復(fù)分離純化，得到黃色固體的山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0-(2" " -O-阿魏?；?β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷I lmg。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從紫花碎米薺中提取的黃酮苷，其特征在于，將干燥紫花碎米薺地上部分2. Okg,室溫23°C下在閃式提取器中用紫花碎米薺重量11倍的體積濃度為.50%丙酮組織破碎提取三次，每次20分鐘，合并提取液，于45°C減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂Diaion HP-20柱，用水沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度10%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度20%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，最后用體積濃度30%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集30%甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉8. lg，用水溶解，離心，上清液上凝膠Toyopearl HW-40C柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢視合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A，組分A依次通過凝膠 Toyopearl HW-40C 柱、凝膠 S印hadex LH-20 柱、硅膠柱、MCI Gel CHP-20 柱，最后反復(fù)分離純化，得到山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0-(2" " -O-阿魏?；?β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷12mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從旋蒴苣苔中提取的黃酮碳苷，其特征在于，將干燥紫花碎米薺地上部分I. 5kg，室溫25°C下在閃式提取器中用紫花碎米 薺重量12倍的體積濃度為50%丙酮組織破碎提取三次，每次20分鐘，合并提取液，于45°C減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂Diaion HP-20柱，用水沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度10%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，用體積濃度20%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，最后用體積濃度30%甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集30%甲醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥后得到干粉7. 5g，用水溶解，離心，上清液上凝膠Toyopearl HW-40C柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢視合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A，組分A依次通過凝膠 Toyopearl HW-40C 柱、凝膠 S印hadex LH-20 柱、硅膠柱、MCI Gel CHP-20 柱，最后反復(fù)分離純化，得到山柰酚-3-0-[2" -O-β-D-吡喃葡萄糖基-6" -0-(2" " -O-阿魏酰基-β -D-葡萄糖基)]-β -D-吡喃葡萄糖苷10mg。
5.權(quán)利要求I或2-4任何一項所述的從紫花碎米薺中提取的黃酮苷，在制備促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞和胸腺淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從紫花碎米薺中提取的黃酮苷及其制備方法，可有效解決從紫花碎米薺中提取黃酮苷的問題，該黃酮苷為山柰酚-3-O-[2″-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6″-O-(2″″-O-阿魏?；?β-D-葡萄糖基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式是C43H48O24，提取方法是，將干燥紫花碎米薺地上部分用丙酮組織破碎提取，提取液減壓回收，真空干燥后得到干粉，干粉用水溶解，離心，上清液上大孔吸附樹脂柱，依次用水、甲醇沖柱至洗脫液流出無色，收集洗脫液，減壓回收，真空干燥后得到干粉，用水溶解，離心，上清液上凝膠柱，用水沖柱，經(jīng)薄層色譜檢識合并含有目標(biāo)成分的流份，得到組分A，分離純化，即得，本發(fā)明化合物促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞和胸腺淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用，制備方法先進(jìn)、科學(xué)，操作方便，可靠性強。
文檔編號C07H1/08GK102659876SQ20121014852
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者馮衛(wèi)生, 張秋博, 王小蘭, 董誠明, 鄭曉珂 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院